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Universit degli Studi di Torino

Facolt di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali


Corso di laurea in Chimica dellAmbiente
Via Pietro Giuria, 5

Analisi degli
inquinanti
con laboratorio
(12 CFU)
Revisione n 12 (26/02/14)
Anno accademico 2012/2013

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sommario

Sommario
NOTE DUTILIZZO E ALTRO (leggi pliis) .............................................................................................. I
1.0

Lo studio del problema analitico ............................................................................................ 1

2.0

Tecniche di estrazione di analiti non volatili da matrici liquide .................................. 5

2.1

Lestrazione liquido-liquido ....................................................................................................................5

2.2

Lestrazione in fase solida (SPE) ...........................................................................................................6

2.2.1

Le fasi sorbenti della SPE ............................................................................................ 7

2.2.2

Le tecniche di SPE pi utilizzate ............................................................................... 8

2.2.3

Sviluppo di un metodo SPE ....................................................................................... 11

2.2.4

Conclusioni sulla SPE ................................................................................................. 13

2.3

Microestrazione in fase solida (SPME) .......................................................................................... 14

2.3.1
3.0

Conclusioni sulla SPME .............................................................................................. 16

Il suolo ......................................................................................................................................... 16

3.1

Estrazione di composti non volatili da matrici solide.......................................................... 20

3.1.1

Estrazioni solido-liquido (Soxhlet) ........................................................................ 20

3.1.2

Estrazioni con ultrasuoni (USE) .............................................................................. 21

3.1.3

Estrazione in cartuccia in condizioni subcritiche (HPSE) ............................... 22

3.1.4

Estrazione accelerata con solventi organici (ASE) ............................................ 24

3.1.5

Estrazione in fluidi supercritici (SFE) ................................................................... 25

3.1.6

Estrazione con microonde (MAE) ........................................................................... 27

3.2
4.0

Ricapitolazione finale ............................................................................................................................... 29


Estrazione di analiti volatili da matrici solide e liquide ................................................ 29

4.1

Tecnica dello spazio di testa (HS-GC) statico (SHS) e dinamico (DHS)...................... 29

4.2

Tecnica del purge & trap ........................................................................................................................ 30

4.3

Purge & Membrane PAM/MS e PG-ATR/FTIR ........................................................................... 31

4.4

La preparazione degli standard dei VOCs (Composti Organici Volatili) .................. 33

5.0
5.1

GC e HPLC .................................................................................................................................... 34
Iniettori in gascromatografia .............................................................................................................. 34

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Sommario

5.2

Risoluzione ed equazione di Van Deemter ..................................................................................36

5.3

Colonne per GC e HPLC .............................................................................................................................39

5.4

Fast GC ................................................................................................................................................................41

5.5

GCxGC ..................................................................................................................................................................43

5.6

Fasi stazionarie in LC e in GC ................................................................................................................45

5.7

Classificazione della fasi stazionarie in base alla loro polarit .....................................47

6.0

Sorgenti di ionizzazione ......................................................................................................... 47

6.1

Il potere risolvente di uno spettrometro di massa ................................................................47

6.2

Sistemi per alto vuoto ...............................................................................................................................47

6.3

Sistemi di introduzione del campione ...........................................................................................49

6.4

Sistemi di ionizzazione ............................................................................................................................49

6.4.1

Ionizzazione elettronica (EI) ................................................................................... 50

6.4.2

Ionizzazione chimica (CI) ......................................................................................... 54

6.4.3

Ionizzazione di campo (Field ionization)............................................................. 57

6.4.4

Desorption Chemical Ionization (DCI) .................................................................. 58

6.4.5

Desorbimento di campo (Field Desorption) ....................................................... 58

6.4.6

MALDI............................................................................................................................. 59

6.4.7

Fast Ion Bombarder (FAB) ....................................................................................... 61

6.4.8

Desorbimento in plasma........................................................................................... 63

7.0

Laccoppiata Cromatografia/Massa ..................................................................................... 64

7.1

Interfacce di ionizzazione LC/MS ......................................................................................................64

7.1.1

Particle beam ............................................................................................................... 65

7.1.2

Thermospray ............................................................................................................... 65

7.1.3

FAB .................................................................................................................................. 65

7.1.4

MALDI............................................................................................................................. 65

7.1.5

Introduzione alle interfacce a pressione atmosferica (API) ........................... 66

7.1.6

ESI.................................................................................................................................... 66

7.1.7

APCI ................................................................................................................................ 70

7.1.8

APPI ................................................................................................................................ 73

7.1.9

DESI e DART ................................................................................................................. 74

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Sommario

8.0

Gli analizzatori di massa ......................................................................................................... 76

8.1

Quadrupolo ..................................................................................................................................................... 77

8.1.2

Traiettoria degli ioni. Analisi quantitativa .......................................................... 82

8.1.3

Triplo quadrupolo ...................................................................................................... 89

8.2

Trappola ionica ............................................................................................................................................... 92

8.2.1Traiettoria degli ioni. Analisi quantitativa ................................................................... 95


8.2.1.2 Iniezione o produzione di ioni nella trappola ......................................................... 98
8.2.1.3 Analisi degli ioni .............................................................................................................. 99
8.2.1.4 MSn .................................................................................................................................... 102
8.2.2

La trappola ionica lineare (LIT) ........................................................................... 104

8.3 Lanalizzatore magnetico a focalizzazione semplice........................................................................... 106


8.3.1 Analizzatori a doppia focalizzazione .......................................................................... 108
8.3

Tempo di volo (TOF) .............................................................................................................................. 109

8.4

Ciclotrone (ICR-FT) ................................................................................................................................. 115

8.5

Orbitrap.......................................................................................................................................................... 118

8.6

Ricapitolazione analizzatori di massa ........................................................................................ 120

8.7

Analizzatori di massa ibridi............................................................................................................... 120

Interpretazione degli spettri di massa ............................................................................ 123


9.1

Riconoscimento del picco dello ione molecolare ................................................................. 123

9.2

Determinazione di una formula molecolare ........................................................................... 124

9.2.2

Suggerimenti pratici per la determinazione della formula molecolare ... 125

9.3

La frammentazione ................................................................................................................................. 126

9.4

Spettri di massa di alcune classi di composti ......................................................................... 128

10

Spettroscopie molecolari..................................................................................................... 140

10.1

Spettroscopia a ionizzazione in risonanza............................................................................... 141

10.2

Spettroscopia UV-VIS ............................................................................................................................. 141

10.2.1 Configurazione degli spettrometri UV ..................................................................... 145


10.2.3 Spettri in derivata.......................................................................................................... 154
10.2.4 Tecniche multicanale ................................................................................................... 160
10.2.5 Analisi qualitativa nella spettroscopia UV/VIS ..................................................... 162

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Sommario

10.2.6 Analisi quantitativa nella spettroscopia UV/VIS ................................................... 164


10.2.7 Applicazioni UV-VIS in campo ambientale .............................................................. 167
10.2.8 Spettrometria ad alta sensibilit .............................................................................. 167
10.3

Spettroscopia IR ........................................................................................................................................ 168

10.3.1 Strumenti per spettroscopia infrarossa...................................................................170


10.3.1.1 Strumenti dispersivi ..................................................................................................171
10.3.1.2 Spettrometri in trasformata di Fourier ................................................................ 171
10.3.1.2.1 Linterferometro di Michelson e larchitettura di uno FTIR ........................ 172
10.3.1.3 Applicazioni qualitative della spettrofotometria IR ........................................177
10.3.1.3 Applicazioni quantitative della spettrofotometria IR .....................................178
10.3.1.4 Il problema dellaliasing ........................................................................................... 178
10.3.2
10.3.3
10.4

Spettroscopia fotoacustica (PAS) .........................................................................183


Open Path FTIR ..................................................................................................................................... 187

Spettroscopia Raman ................................................................................................................................. 191

10.4.1 Effetto Raman: derivazione classica .........................................................................195


10.4.2

Le regole di selezione .............................................................................................. 197

10.4.3

Raman di risonanza .................................................................................................204

10.4.4

Spettroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) ........................................205

10.4.5

Spettroscopia Raman inversa (IRS) ....................................................................206

10.4.6

Raman Microprobe ...................................................................................................206

10.4.7

Strumentazione Raman........................................................................................... 208

10.5

Spettroscopia UPS e XPS ....................................................................................................................... 209

10.6

Spettroscopia AES e XRF....................................................................................................................... 210

10.7

Spettroscopia XAS .................................................................................................................................... 210

10.8

Spettroscopia LEED ................................................................................................................................. 211

10.9

Spettroscopia EELS .................................................................................................................................. 211

10.10
11
11.1

Spettroscopia HREELS ...................................................................................................................... 212

Spettroscopia laser ................................................................................................................ 213


Le molecole elettronicamente eccitate possono rilassarsi dopo un certo numero di

processi ............................................................................................................................................................................. 213

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Sommario

11.2

Rate equation .............................................................................................................................................. 215

11.3

Un sistema a due livelli non pu raggiungere linversione di popolazione ........ 218

11.4

Linversione di popolazione .............................................................................................................. 219

11.5

Caratteristiche della radiazione laser......................................................................................... 221

11.6

Cosa c allinterno di un laser? ....................................................................................................... 222

11.7

Laser continui o a impulsi................................................................................................................... 227

11.8.1 Laser continui (CW) ...................................................................................................... 227


11.7.2

Laser pulsati .............................................................................................................. 227

11.8.2.1 Q-switching .................................................................................................................. 227


11.8.1.2 Mode locking ............................................................................................................... 228
11.8.1.3 Cavity dumping ......................................................................................................... 229
11.7

Classificazione dei laser ....................................................................................................................... 229

11.9.1

Laser He-Ne................................................................................................................ 229

11.9.2

Laser a ioni ................................................................................................................. 232

11.9.3

Laser a vapori metallici .......................................................................................... 232

11.9.4

Laser molecolari ....................................................................................................... 233

11.9.5

Laser chimici e a ecciplessi.................................................................................... 234

11.9.6

Laser a stato solido .................................................................................................. 235

11.9.7

Laser a semiconduttore .......................................................................................... 237

11.9.8

Laser a coloranti ....................................................................................................... 241

11.10

Strumentazione per misure di cinetica veloce................................................................. 242

11.11

Spettroscopia laser ad alta risoluzione ................................................................................ 244

11.12

Quasi elastic light scattering (DLS) ......................................................................................... 245

11.13

LIDAR .......................................................................................................................................................... 246

11.13.1 DIAL ............................................................................................................................. 248


11.3.2 LIDAR RAMAN ................................................................................................................. 250
11.3.3 I rivelatori di un LIDAR ................................................................................................ 252
11.13.2 Altre applicazioni del LIDAR ................................................................................. 252
12
12.1

Luminescenza ......................................................................................................................... 254


Fotoluminescenza .................................................................................................................................... 254

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Sommario

12.1.1 Il Quenching ..................................................................................................................... 258


12.1.2

Strumentazione per la valutazione della fluorescenza ..................................261

12.2.1 Applicazioni analitiche .................................................................................................263


12.2.1.1 Fluorescenza risolta nel tempo ............................................................................... 264
12.2.1.2 LIDAR in fluorescenza ............................................................................................. 266
12.2.1.3 Fluorescenza in HPLC .............................................................................................. 267
12.3

Chemiluminescenza ................................................................................................................................ 268

12.3.1
13

Applicazioni analitiche della chemiluminescenza ..........................................271

Metodi standard per la determinazione di inquinanti ................................................ 274

13.1

Campionamento dellaria .................................................................................................................... 274

13.3

Determinazione di composti con zolfo ....................................................................................... 276

13.4

Determinazione di composti con lazoto ................................................................................... 276

13.5

Determinazione dellozono ................................................................................................................ 278

13.6

Composti alogenati .................................................................................................................................. 279

13.7

Composti metallici ................................................................................................................................... 279

APPENDICE A .........................................................................................................................................280
APPENDICE B .........................................................................................................................................308
APPENDICE C .........................................................................................................................................309

Analisi degli inquinanti con laboratorio Note di utilizzo e alt

NOTE DUTILIZZO E ALTRO (leggi pliis)


Ho realizzato questa dispensa di circa 300 pagine complessive perch credo che, in
assenza di un unico libro di riferimento, fosse utile per chi deve sostenere questo
esame avere un appiglio oltre alle slides dei professori, naturalmente.
Per fare questa dispensa ho impiegato circa 1 mese, ho consultato pi di 200 siti web
(non Wikipedia) e circa 25 libri di testo. In alcuni casi quello che trovate scritto un
brutale copia & incolla di quanto ho trovato, spesso si tratta di mie rielaborazioni.
Ho utilizzato le slides dei professori per mantenere lo stesso schema che hanno
utilizzato loro a lezione e talvolta troverete le stesse immagini che vi hanno
presentato a lezione.
Probabilmente qualche altro studente vi avrebbe fatto pagare questa dispensa,
io trovo invece che questo sia un comportamento scorretto in virt del fatto che se si
fa pagare qualcosa si garantisce al 100% quello che c scritto. Non essendo un
professore, ma un semplice studente che ha realizzato questo lavoro in primis per s
stesso, non posso garantire un bel niente. Con questo non voglio dire che ci che
trovate qui sia sbagliato, ma potrebbe non essere tutto quello che c da sapere.
Se per vi siete trovati bene, accetto molto volentieri delle donazioni dellimporto
che volete (chennes siete una classe di 30 persone, una donazione di 1 uro a testa)
come una sorta di ringraziamento simbolico. Mi farebbe estremamente piacere e
penso che avrei fatto lo stesso se mi fossi trovato al vostro posto.
Potete quindi, se volete, farmi una ricarica PostePay alla carta numero:
4023 6005 6452 4736 intestata a Franois Burgay (che sono io).
Se non volete, pazienza Mi fa piacere ugualmente che utilizziate questo supporto
unitamente alle fondamentali slides dei professori. Periodicamente aggiorner
questa dispensa anche a seguito di alcune vostre segnalazioni, richieste di correzioni
o invio di materiale supplementare (potete inviare anche vostre integrazioni a
snooze89@gmail.com ). Adesso lunica cosa che vi posso dire : in bocca al lupo!

VII

Analisi degli inquinanti con laboratorio Il problema analitico

CAPITOLO 1
Il problema analitico

1.0

Lo studio del problema analitico

Prima di entrare nel dettaglio delle tecniche analitiche utili in campo ambientale
occorre affrontare inizialmente quelli che sono gli step di analisi:
1.

Valutare le propriet chimico-fisiche dellanalita che vogliamo trovare


(volatilit, polarit, fotosensibilit).
Questo uno step molto importante in quanto la matrice contenente
lanalita dovr essere trattata nei modi pi opportuni onde evitare di
perdere lanalita stesso. Il metodo di analisi scelto non deve portare
alla degradazione dellanalita stesso

2.

Numerosit dellanalita

3.

Livelli di concentrazione attesi.


Sono richieste eventuali tecniche di concentrazione dellanalita nel caso
in cui esso sia presente in traccia

4.

Tecniche di estrazione e purificazione del campione.

In particolare vediamo come deve essere trattato un campione:


1.

Campionamento

2.

Estrazione, purificazione e concentrazione degli analiti

3.

Analisi strumentale attraverso cromatografia o tecniche spettroscopiche

In questa prima parte del corso studieremo le tecniche estrattive e separative. In


effetti la separazione degli analiti risulta di estrema importanza per comprendere la
loro natura. Essa deve essere effettuata utilizzando la minima quantit di solvente
possibile, ottimizzando i tempi e i costi.

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Il problema analitico

La separazione degli analiti pu avvenire seguendo due metodologie:


1.

Attraverso la loro differente volatilit

2.

Attraverso le loro propriet acido-base e la loro idrofilicit e idrofobicit

Andiamo a vedere come si separano i composti in base alla loro differente volatilit:
-

Volatili: idrocarburi a catena corta e composti alogenati a basso peso


molecolare
Tecniche: purge and trap, spazio di testa, adsorbimento

Semi-volatili: fenoli, pesticidi organici


Tecniche: purge and trap, spazio di testa, adsorbimento

Non volatili a basso peso molecolare (< 500): amminoacidi, detergenti,


carboidrati
Tecniche: adsorbimento, osmosi inversa, evaporazione

Non volatili ad alto peso molecolare (> 500): acidi umici, polisaccaridi
Tecniche: ultrafiltrazione, gel filtrazione e cooprecipitazione

Andiamo ora a vedere laltra categoria andando dapprima a elencare i principali


costituenti di ciascuna categoria:
-

Acidi idrofilici: acidi carbossilici fino a 5 atomi di carbonio e acidi


polifunzionali

Acidi idrofobici: acidi carbossilici da 5 a 9 atomi di carbonio, acidi aromatici


con uno o due anelli, fenoli con uno o due anelli, acidi fulvici

Basi idrofiliche: ammine alifatiche fino a 9 atomi di carbonio, amminoacidi e


piridina

Basi idrofobiche: ammine aromatiche con uno a due anelli

Neutri idrofobici: idrocarburi, alcol alifatici, ammidi, esteri, chetoni, aldeidi


con un numero di atomi di carbonio maggiore di 5, acidi carbossilici alifatici
e ammine alifatiche con un numero di atomi di carbonio maggiore di 9

Neutri idrofilici: ammidi alifatiche, alcoli, aldeidi, esteri, chetoni con un


numero di atomi di carbonio maggiore di 5, alcoli polifunzionali

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Il problema analitico

La separazione di questi analiti da una matrice coinvolge, ovviamente, delle


variazioni di pH. Pertanto fondamentale conoscere le pKa dei composti pi
importanti in modo tale da conoscere il pH di lavoro pi opportuno (Tabella 1).
Gruppo funzionale

pKa

Acidi carbossilici

4-5

Amminoacidi

1,7-2,6
9-10,8

Acidi dicarbossilici

1,3-6,2

Fenoli

9-11

Tioli

10-11 (alifatici)
6-8 (aromatici)
Tabella 1 - Valori di pKa dei composti pi comuni

Premesso che gli analiti si separano in base alle loro propriet acido-base, si pu
effettuare unulteriore separazione in base al loro peso molecolare usando le
opportune tecniche ad esclusione dimensionale (setacci molecolari):
-

Acidi ad alto peso molecolare: acidi umici e fulvici, polifenoli

Acidi a basso peso molecolare: fenoli, acidi carbossilici

Basi ad alto peso molecolare: proteine

Basi a basso peso molecolare: amminoacidi

Neutri ad alto peso molecolare: polisaccaridi

Neutri a basso peso molecolare: zuccheri riducenti

Nello schema seguente illustriamo una semplice separazione di analiti in base alle
loro propriet acido-base, alla loro idrofilicit e idrofobicit e al loro peso
molecolare.

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Il problema analitico

Matrice

Idrofilici

Acidi

Basi

Idrofobici

Neutri

Acidi

Basi

Neutri

idi
Alto

Basso Alto

Basso

Alto

Basso

Alto

Basso

Alto

Basso

Alto

Basso

PM

PM

PM

PM

PM

PM

PM

PM

PM

PM

PM

PM

Le separazioni possono avvenire anche utilizzando colonne a scambio ionico


(cationico o anionico) e una colonna Sephodex utile a discriminare i diversi pesi
molecolari.
Dal momento che parliamo di pH e pKa, risulta utile rispolverare lequazione di
Henderson-Hassebach che stabilisce, ad un dato pH di lavoro e noto il pKa della
specie considerata, quela sar il rapporto tra specie deprotonata A- e protonata HA.
Se pH < pKa, prevale la specie in forma protonata:

Analisi degli inquinanti con laboratorio Estrazione di analiti non volatili da matrici
liquide

CAPITOLO 2
Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

2.0

Tecniche di estrazione di analiti non volatili da

matrici liquide
In questo capitolo vediamo i diversi metodi estrattivi da matrici liquide per analiti
non volatili. Le tecniche sono essenzialmente quattro, noi ci occuperemo in dettaglio
solo di due:
-

estrazione liquido-liquido

estrazione in fase solida (SPE)

microestrazione in fase solida (SPME)

stirr-bar extraction (SBSE)

2.1

Lestrazione liquido-liquido

Questo genere di estrazione si effettua utilizzando un


imbuto separatore. Tale tecnica sfrutta la diversa miscibilit
degli analiti nei solventi organici e in solventi acquosi tra
loro immiscibili. Aumentando il numero di estrazioni
migliora la separabilit (o ripartizione) delle specie.
Ricorda che tutti i solventi organici (escluso il CH2Cl2)
hanno una densit inferiore allacqua e per questo si
trovano sopra di essa (figura 1). Lo svantaggio di questa
Figura
1Imbuto
separatore. (1) la fase
organica, mentre (2) la
fase acquosa.

tecnica che si ricorre ad un massiccio uso di solvente e


per questo poco eco-friendly.

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

2.2 Lestrazione in fase solida (SPE)


La tecnica SPE permette di separare diversi composti appartenenti ad una matrice
(generalmente liquida) grazie alle diverse interazioni che questi hanno con la fase
stazionaria (solida). Tale tecnica utilizzata anche per concentrare e purificare
campioni per analisi successive. In particolare la si pu sfruttare per isolare analiti di
interesse da matrici complesse quali urine, sangue, acqua, suoli e tessuti animali.
Saranno o gli analiti di interesse o le impurit ad essere adsorbiti sulla fase
stazionaria, mentre la porzione che non stata ritenuta sar mantenuta o meno a
seconda che contenga, oppure no, gli analiti di interesse. Se gli analiti sono stati
ritenuti dalla fase stazionaria, essi possono essere successivamente eluiti utilizzando
un opportuno solvente. La fase solida costituita, a seconda dei volumi in gioco, da
cartucce o dischi. Vedremo successivamente i particolari della fase solida.
Le estrazioni SPE sono efficaci sia per sostanze presenti in grandi quantit (pensiamo
agli inquinanti alla foce di un fiume) sia per sostanze presenti in traccia (ng/l o pg/l).
Le nostre indagini saranno orientate verso il trattenimento delle impurezze (il fattore
di ritenzione, k, per lanalita dovr essere nullo, mentre dovr essere molto alto per
gli inteferenti) oppure verso il trattenimento del prodotto (k sar zero per gli
interferenti, mentre dovr essere alto per gli analiti).
Di seguito(figura 2) illustriamo un esempio di separazione SPE in cui gli analiti
vengono adsorbiti sulla fase stazionaria:

Figura 2 - SPE con trattenimento degli analiti (quadrati rossi) e successiva loro eluizione

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

Come gi illustrato in precedenza, se si desidera trattenere in colonna gli interferenti,


anzich gli analiti, sar sufficiente scegliere una fase solida con affinit per i
composti che si vogliono eliminare dal campione.
2.2.1 Le fasi sorbenti della SPE
I meccanismi su cui si basa il trattenimento delle specie sulla fase solida sono tre:
1. Adsorbimento dovuto alle interazioni di van der Waals, legami a
idrogeno e interazioni dipolo-dipolo
2. Ripartizione di un soluto tra due fasi immiscibili
3. Interazione colombiana tra cariche di segno opposto
Molto di frequente il meccanismo privilegiato quello di adsorbimento in fase
inversa, vale a dire dove la fase stazione apolare, mentre la fase mobile polare.
Una fase stazionaria apolare particolarmente usata come filtro per la rimozione di
numerosi interferenti idrofobici.
Le SPE a scambio ionico sono invece usate principalmente per il trattenimento di
analiti ionici o ionizzabili come pesticidi, erbicidi, tossine ecc
Le fasi sorbenti possono essere le pi diverse e devono essere specifiche verso
lanalita (nel caso in cui vogliamo che sia lui a essere trattenuto). Nello specifico
devono essere favorite le interazioni analita/adsorbente rispetto alle interazioni
analita/matrice.
Gli adsorbenti pi usati sono a base
di silice, molto polare a adatta per
estrarre da soluzioni non acquose
specie aventi polarit medio-basse.
Essa pu essere derivatizzata (figura
3) per renderla idrofobiche (LC-18).
Si tende a non effettuare reazioni di
Figura 3 - Silice derivatizzata senza reazioni di endcapping

end-capping in quanto in questo


modo le interazioni secondarie dei

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

silanoli liberi possono adsorbirsi a differenti impurit polari e trattenerle quindi in


colonna.
Oltre allallumina, Al2O3 la quale a
seconda della sua idratazione possiede
diversi gradi di attivit, citiamo unaltra
fase adsorbente particolarmente poco
polare: il carbonio grafitizzato. Esso
viene utilizzato per la selettivit che
dimostra verso composti aromatici o
con lunghe catene idrocarburiche. I
frammenti e gli zig-zag evidenziati in
Figura 4 - Struttura del carbonio grafitizzato.

figura 4 devono essere minimizzati per


garantire una ricopertura omogenea.

Per le applicazioni ambientali si usano principalmente adsorbenti polimerici


opportunamente funzionalizzati con diversi vantaggi:
1. materiali siffatti permettono di ottenere capacit adsorbenti maggiori rispetto
alla silice
2. il legame polimerico pi resistene a pH estremi, fattore assai importante
visto che variazioni di pH sono molto usate per la separazione degli analiti
stessi
3. facilit nella derivatizzazione dei polimeri che possono essere cos polari,
apolari o a scambio ionico.

2.2.2

Le tecniche di SPE pi utilizzate

Analizziamo ora le tre tecniche di SPE pi utilizzate:


-

SPE a fase inversa: si basa sulle interazioni non polari/non polari di van der
Waals. Le fasi adsorbenti pi utilizzate sono: la silice funzionalizzata (LC18), materiale carbonaceo, materiale polimerico (ottimo per i fenoli)

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

SPE a fase diretta: si basa su interazioni forti di tipo: legami a idrogeno,


interazioni -, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo indotto. Le fasi adsorbenti pi
usate sono: silice non derivatizzata, florisil, allumina (acida, pH 5, neutra
pH 6,5, basica, pH 8,5).

SPE a scambio ionico

Le SPE a scambio ionico possono essere a loro volta suddivise in quattro tipologie:
-

Scambio anionico forte, con ione ammonio quaternario (SAX)

Questa tecnica prevede lutilizzo di una fase sorbente contenente uno ione ammonio
quaternario che si presenta carico positivamente a qualsiasi pH. Un esempio di fase
sorbente : R2N+R2. In questo modo gli acidi forti (sempre in forma dissociata A-)
saranno sempre sorbiti sulla fase stazionaria, mentre gli acidi deboli saranno
trattenuti sono da pH > 4-5 (totalmente da pH = 6-7). Con questa configurazione sar
quindi possibile trattenere in primis tutti gli acidi lavorando a pH > 6-7, quindi,
cambiando pH (pH < 4-5) possibile il desorbimento selettivo dei soli acidi deboli
che si troveranno in forma associata HA.
-

Scambio anionico debole, con gruppo amminico primario (WAX)

La fase sorbente costituita da una molecola che presenta un gruppo amminico


primario RNH2 (pKa 10.1 e 10.9). Ci significa che con pH < 10.1-10.9 il
gruppo amminico si trova in forma protonata, mentre a pH maggiori si trova in
forma non protonata. Ci significa che a pH < 10.1 avremo un totale
adsorbimento degli acidi forti e tra 6 < pH < 9 un adsorbimento degli acidi
9

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

deboli. A pH < 6 avremo il desorbimento selettivo degli acidi deboli e a pH >


10.1-10.9 il desorbimento degli acidi forti.

Scambio cationico forte, acido solfonico RSO3H (SCX)

Lacido solfonico ha una pKa 1, ci significa che a pH > 1 esso si trover in forma
dissociata e potr adsorbire basi forti e basi deboli (fino a pH 9-10)

Scambio cationico debole, acido carbossilico RCOOH (WCX)

Si usa acido carbossilico che ha un pKa 4,8. Esso viene usato per trattenere a pH >
4.8 sia le basi forti sia le basi deboli (fino a pH 9-10).

10

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

Lavorando a pH > 9-10 avremo il desorbimento selettivo delle basi deboli e a pH <
4.9 avremo il desorbimento anche delle basi forti (che sar selettivo se quelle deboli
sono state preventivamente eluite).
2.2.3

Sviluppo di un metodo SPE

Dopo aver visto le caratteristiche principali di una SPE, vediamo di analizzare come
sviluppare un metodo in SPE off-line, senza che vi sia collegata alcuno strumento di
analisi ulteriore (es. HPLC).
Loutline da seguire costituito da cinque punti fondamentali:
1. Scelta fase stazionaria
2. Condizionamento della colonna
3. Caricamento del campione
4. Lavaggio
5. Eluizione
6. (opzionale) Ricostruzione
Andiamo a studiare ogni singolo step in maggiore dettaglio.
1 STEP Scelta della fase stazionaria
Per prima cosa occorre scegliere la tipologia di hardware da utilizzare: cartucce o
dischi? La scelta si fa a seconda dei volumi in gioco. In linea generale possiamo dire

11

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

che se il volume del campione minore di 1 litro si usano le cartucce, mentre se il


volume del campione maggiore di 1 litro si usano i dischi.
Si sceglie poi la composizione della fase stazionaria (silice, carbonio grafitizzato,)
in funzione della matrice e dellanalita.
2 STEP Condizionamento della colonna
La colonna va prima di tutto precondizionata con un solvente come il metanolo o
isopropanolo in modo da rimuovere eventuali tracce daria, eliminare impurezze e
attivare i leganti. Dopo questa prima fase, si procede al condizionamento della
colonna facendo passare in colonna un solvente di composizione simile a quella del
campione (simile pH, ) per rimuovere le tracce del solvente usato in fase di
precondizionamento.
Come per le flash-cromatografie, una volta terminato il condizionamento si procede
con il caricamento del campione. E bene non tirare a secco la colonna: come linea
guida si lasci 1 mm di liquido sopra lestremit superiore della fase stazionaria.
3 STEP Caricamento
Prima di caricare il campione in colonna possibile effettuare un pretrattamento
dello stesso in modo da minimizzare il numero di impurezze e massimizzare cos le
interazioni con una delle due fasi. A tal fine si esegue di norma un prefiltraggio o un
aggiustamento del pH.
Dopodich si trasferisce quantitativamente lanalita con una pipetta (o micro pipetta)
nella colonna. Per evitare scodamenti dei picchi si deve cercare di:
-

non eccedere nella quantit di solvente

non eccedere nella quantit di campione: ci sarebbe il rischio di saturare la


fase adsorbente. Talvolta per evitare questi problemi si introducono due
cartucce in serie.

mantenere un flusso basso (2 ml/min)

12

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

4 STEP Lavaggio
Dopo aver fatto eluire il campione siamo nella situazione in cui lanalita di interesse
adsorbito sulla colonna. Si procede quindi al lavaggio, la fase in assoluto pi
delicata dellintera sequenza. Essa serve per eliminare le componenti di matrice nel
liquido rimasto e per eluire le impurezze trattenute meno fortemente dellanalita. La
scelta dovr cadere su un solvente che abbia una forza intermedia (THF, acetone) tra
il campione (debole) ed il solvente di eluizione (forte).
Una valutazione errata potrebbe portare alla perdita dellanalita.
Esempi:
-

fase inversa: AcCN o MeOH/H2O 5-50%/95-50%

fase diretta: solvente polare addizionato di solente apolare

scambio ionico: tampone ad un dato pH

Anche il quantitativo di solvente fondamentale: di norma non pi di 1 ml ogni 100


mg di adsorbente.
5 STEP Eluizione
Si procede al desorbimento dellanalita. A questo punto si user un solvente forte,
molto spesso costituito da uan miscela dei diversi solventi. Ad esempio in fase
inversa: miscela AcCN + metanolo + acido. Per avere una migliore risposta analitica
occorrer usare un volume di eluente minimo e un basso flusso.
2.2.4

Conclusioni sulla SPE

Concludendo, le analisi SPE sono largamente usate, danno estratti puliti, riducono al
minimo il consumo di solventi, hanno un basso costo ed in letteratura possibile
trovare metodi validati per uninfinita di analisi.
La SPE usata per analiti non volatili, purificazioni e divisioni in classi di analiti
immersi in matrici complesse.

13

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

2.3 Microestrazione in fase solida (SPME)


La tecnica SPME una tecnica analitica che pu essere utilizzata sia in laboratorio
sia in situ e permette di eliminare del tutto lutilizzo di solventi. In altre parole
una tecnica solvent free.
LSPME prevede la presenza di una fibra rivestita da un materiale estraente (figura
5), tipicamente un sottile strato polimerico, sul quale si adsorbe lanalita. La tecnica
pu essere usata per estrazione di analiti da matrici acquose tal quali (acque minerali,
superficiali, potabili, di mare, scarichi, vino,) oppure dopo diluizioni (succhi
concentrati, miele, purea,). Gli analiti sono di norma composti organici volatili
(es. pesticidi o VOCs) oppure semi-volatili.

Figura 5 - Esempio di apparecchiatura usata per analisi SPME

Unanalisi SPME pu essere schematizzata in due fasi:


1. ripartizione degli analiti tra i campione ed il rivestimento della fibra
2. desorbimento degli analiti seguito da separazione in GC/HPLC e
determinazione quantitativa degli stessi
Esistono altres due tipologie di SPME: dello spazio di testa e diretta.

14

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

Nella SPME dello spazio di testa non vi contatto tra la fibra e la matrice
acquosa ed per questo una tecnica adatta per estrarre composti organici
volatili e semi-volatili sia da matrici liquide che solide (figura 6). Con
questa tecnica si forma un equilibrio trifasico: lanalita pu essere
ripartito nella matrice, nello spazio di testa e sulla parte adsorbente della
siringa:
C0Vs = CfVf + CtVt + CsVs
Figura 6 SPME
spazio di
testa

CfVf rappresenta la quantit di analita ripartita sulla fibra, C tVt


rappresenta la quantit di analita nello spazio di testa, mentre C sVs
rappresenta la quantit di analita nel campione.

La ripartizione dipende ovviamente dai rispettivi coefficienti di ripartizione:

Ci che noi andiamo a determinare n, dato da: C fVf.

I fattori che influenzano ladsorbimento per la SPME dallo spazio di testa sono:
-

rivestimento/spessore della fibra

tempo di estrazione (ottimale di circa 10 minuti)

agitazione della matrice

temperatura di estrazione (moderata) per favorire il rilascio degli analiti nello


spazio di testa

La SPME diretta (figura 7) avviene direttamente nella matrice (acqua). Lequilibrio


di ripartizione sar legato alla matrice e al rivestimento della fibra con la
conseguenza che lespressione per n scritta in precedenza dovr essere modificata
come segue:

15

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici liquide

Questo metodo estremamente sensibile (fino ai ppt) e proprio per


evitare di saturare la fibra, si usa solo quando noto che la
concentrazione dellanalita bassa. La matrice deve essere
perfettamente agitata in modo tale che lequilibrio di ripartizione possa
essere raggiunto facilmente. Tale tecnica usata principalmente per
lindividuazione di analiti poco volatili.

Per favorire un miglior adsorbimento sulla fibra occorre:

Figura 7 SPME
diretta

trovare il tempo di estrazione ottimale

aggiungere eventualmente degli aggiustatori di forza ionica

controllo pH per prevenire ionizzazione degli analiti

Lultimo passaggio comune a entrambe le tecniche di estrazione il desorbimento


che pu essere termico (composti volatili e fibra inserita in iniettore di un GC)
oppure con solvente (per composti non volatili o termicamente labili).
2.3.1

Conclusioni sulla SPME

La SPME una tecnica molto utile in quanto non richiede lutilizzo di solventi,
veloce e poco costosa, permette un analisi in situ ed facilmente accoppiabile ad un
gas-cromatografo.
Come tutte le tecniche analitiche presenta alcuni svantaggi, ta i quali il fatto che
analiti diversi richiedono fasi adsorbenti diverse, scarsa riproducibilit e fragilit
delle fibre.

16

Analisi degli inquinanti con laboratorio Estrazione di analiti non volatili da matrici solide

CAPITOLO 3
Il suolo ed estrazione di analiti non volatili da matrici
solide
3.0 Il suolo
Dopo aver parlato delle acque ci concentriamo ora sui suoli. Il suolo pu essere
inquinato principalmente dallacqua a differenti profondit: nelle aree superficiali
(acque superficiali, attivit microbica,) oppure nelle zone pi profonde chiamate
zone sature in cui si trovano le falde acquifere. Gli inquinanti possono migrare da
una zona allaltra: i micropori, di cui ci occuperemo brevemente pi avanti, sono i
maggiori responsabili del trasporto per capillarit dalla zona satura alla superficie.
Gli inquinanti quando permeano nel suolo, si diffondono sia verticalmente sia
orizzontalmente seguendo dei canali preferenziali e si ripartiscono seguendo gli
stessi principi validi in cromatografia.
Normalmente la contaminazione di tipo puntuale, cio localizzata. Una volta
permeato nel suolo, linquinante po subire diversi processi di trasformazione:
-

adsorbimento in particolare da parte degli acidi umici (presenti nei suoli


organici)

trasformazioni fotochimiche

trasformazioni batteriche

La velocit di migrazione dellinquinante strettamente legata alle tipologie di suolo


come la porosit (misura degli spazi vuoti del suolo) e permeabilit (che funzione
della grandezza delle particelle del suolo, dei pori). La porosit degli strati
superficiali maggiore rispetto a quella delle zone profonde. Inoltre, essendo i
micropori i maggiori responsabili del trasporto per capillarit degli inquinanti dalle
zone profonde alle aree superficiali, i terreni che terreni che ne presentano molti sono
quelli che rimarranno inquinati per periodi pi lunghi di tempo.
Un altro aspetto da tenere in considerazione la natura del suolo. Esso pu essere
16

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

inorganico: sabbioso, argilloso. Gli inquinanti sono sciolti prevalentemente


in acqua e non vi un significativo assorbimento da parte del suolo

organico: ricco di contenuto organico (materia umica). Il contaminante potr


adsorbirsi/complessarsi/trasformasi a contatto con il materiale organico

sedimenti: presentano caratteristiche molto simili a quelle dei suoli organici.


Questa tipologia di terreno presenta particolare condizioni riducenti.

Il suolo organico, come gi anticipato, caratterizzato dalla presenza di acidi umici i


quali sono degli ottimi complessanti specifici nei confronti dei cationi. In dettaglio
essi si:
-

legano ai metalli

tamponano il pH del suolo

assorbono sostanze organiche insolubili in H2O

assorbono alcuni inquinanti i quali non sono pi biodegradabili. Ne consegue


unelevata persistenza nellambiente.
Il

sistema

suolo

strettamente legato a tutti gli


altri comparti ambientali: aria
e acqua. Nella figura a fianco
possiamo

vedere

diverse

tutte

le

interazioni.

Limmagine

ci

permette

anche di capire che, proprio a


causa

di

connessioni,
inquinato
Figura 8 - Le interazioni con gli altri comparti ambientali

tutte

queste

un

suolo

rappresenta

un

pericolo molto importante per

la salute umana.
I fattori di contaminazione sono diversi, tra i pi importanti citiamo il particolato
atmosferico, le piogge acide, luso di pesticidi e fertilizzanti, i rifiuti e gli

17

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

sversamenti da parte di impianti industriali. Nel primo istante di contaminazione,


linquinante si diffonde nel suolo con una caratteristica forma a banana (figura 9):

Figura 9 - Diffusione del contaminante nel suolo negli istanti appena successivi alla sua immissione

Successivamente, anche a seconda delle caratteristiche del suolo stesso e


dellinquinante, la forma che assume la diffusione del contaminante nella terra
molto variabile. Ad esempio, per un inquinante persistente la diffusione verticale
con una forma a fagiolo.
Lo studio del leaching (lisciviazione) vale a dire il processo per cui gli elementi
solubili del suolo, per effetto dello scorrimento e della percolazione delle acque,
vengono trasportati o migrano negli strati pi profondi, pu essere effettuato o in situ
o in laboratorio. Con queste indagini si in grado di studiare come e se
linquinamento diffonde nel terreno. Se non dovesse diffondere significa che il
contaminante stato adsorbito dai costituenti del suolo stesso. Nel caso in cui
diffonda si pu calcolare il tempo di eluzione degli inquinanti e stimare la sua

18

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

mobilit nel suolo. Studiando i picchi cromatografici che scaturiscono da queste


analisi e in particolare studiare il mailing dei picchi, si pu concludere dicendo che:
-

se il picco regolare: il suolo non presenta cammini preferenziali

se il picco non regolare: i suolo irregolare e ricco di micropori.

Lo studio sul campo viene condotto grazie a dei lisimetri (misurano quanta acqua
stata assorbita dal suolo).
Prima

di

dettaglio

studiare
le

in

differenti

tecniche

analitiche,

terminiamo questa parte


introduttiva parlando del
fatto che la concentrazione
di contaminante nel suolo
legata alle caratteristiche
del

suolo

stesso,

in

particolare p legata alla


presenza

di

eventuali

batteri. Inoltre, studiando


la

decomposizione

di

composti nel suolo (come


la

terbutilazina

CBET),

pu capitare di notare che


Figura 10 - Decomposizione di un analita in un terreno (topsoil)

il bilancio di massa non


resta costante nel tempo

(figura 10). Questo pu essere spiegato dal fatto che parte del pesticida si
trasformato e unaltra parte si mineralizzata o stata intrappolata nella materia
organica. Ci che non torna nel bilancio di massa potrebbe essere:
-

residuo non estraibile (si formano legami covalenti con la materia organica)

intrappolamento nei pori

mineralizzazione

19

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

Per studiare questi composti che hanno subito il destino di cui sopra, si procede ad
una frammentazione del suolo in diverse frazioni con dimensioni differenti. La
frazione che presenta particelle con un diametro inferiore a 20 m viene separata con
tecniche acido-base in modo da favorire sia la liberazione degli analiti dai pori,
che, soprattutto, lidrolisi dei legami esterei che si sono instaurati tra gli acidi umici e
alcuni analiti. Si cos in grado di recuperare sia la frazione che stata classificata
come residuo non estraibile sia quella intrappolata nei pori.
Le frazioni separate vengono raccolte, quindi si effettua una SPE in cui gli analiti di
interesse vengono trattenuti in colonna. Dopo unopportuna eluizione si effettua
unanalisi HPLC.

3.1 Estrazione di composti non volatili da


matrici solide
In questa sezione passiamo in rassegna le tecniche usate per le estrazioni da matrici
solide di analiti non volatili.
3.1.1

Estrazioni solido-liquido (Soxhlet)

Figura 11 - Estrattore Soxhlet

20

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

Il materiale solido costituito da analiti da separare e da impurezze, viene inserito nel


ditale poroso, posizionato al centro dellestrattore. Il solvente viene portato a
ebollizione, attraversa il sifone e, a contatto con il refrigerante, condensa sul ditale
dove si carica di soluto. Attraverso un altro sifone esso poi ricade nel pallone.
Il solvente, al termine dellestrazione, viene evaporato con lausilio di un rotavapor.
Per questo genere di estrazione bene:
-

sminuzzare il pi possibile il suolo in modo da aumentare larea di contatto


tra solvente e soluto

il campione di suolo va preliminarmente disidratato con Na2SO4 prima di


essere collocato sul ditale.

Questa tecnica stata molto usata in passato ed considerata ad oggi la tecnica di


riferimento. Nonostante tutto presenta numerosi svantaggi:
-

sono richieste estrazioni multiple per ottenere rese di estrazione elevate (fino
a 48h)

discrete quantit di solventi (esano, DCM, etere,) spesso anche tossici

richiesto step di concentrazione e purificazione del campione

essendo richieste estrazioni multiple, possibile estrarre non solo lanalita (o


gli analiti) di interesse, ma anche diversi interferenti presenti nel suolo

perdita di tutta la frazione volatile e buona parte di quella semi-volatile

Quando il solvente condensa e cade nel ditale dove contenuto il campione di suolo,
la sua temperatura non particolarmente alta e questo determina una minore
solubilit degli analiti nel solvente. Anche per questa ragione sono necessarie
estrazioni multiple.
Nel caso in cui si utilizzino miscele azeotropiche (etanolo/acqua), si possono
generare delle schiume che rendono lestrazione pi difficoltosa.
3.1.2

Estrazioni con ultrasuoni (USE)

Questa tecnica fa ricorso alle frequenze degli ultrasuoni per estrarre gli analiti dalla
matrice. Permette di ridurre drasticamente i tempi di estrazione (0h30 1h00).
21

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

Le onde prodotte dal generatore di ultrasuoni si propagano uniformemente in tutto il


volume della vasca in cui contenuto lanalita e formano onde di compressione e
decompressione che danno origine a bolle di cavitazione che implodono
frammentando la matrice solida. Queste implosioni generano un riscaldamento locale
molto elevato (6000 K) il quale pu causare la scissione dellacqua nei radicali
corrispondenti. Questi possono a loro volta reagire con gli analiti degradandoli.
Per questo motivo nella messa a punto di un metodo che prevede unestrazione con
ultrasuoni occorre valutare con attenzione la durata della sonicazione. Per ovviare a
questo problema si opta per pi step di sonicazione di breve durata (in genere due o
tre). La quantit di solvente deve essere equilibrata: se ve n troppo c il rischio che
le onde non riescano a propagarsi, se ce n troppo poco gli analiti possono
degradarsi. Inoltre il solvente deve essere scelto molto attentamente in quanto piccole
variazioni di polarit possono comportare rese di estrazioni molto diverse.
In conclusione si tratta di un metodo piuttosto rapido, ma non sempre efficiente.
3.1.3

Estrazione in cartuccia in condizioni subcritiche


(HPSE)

Il solvente estraente utilizzato lacqua al di sotto del punto critico, quindi con una
temperatura compresa tra i 100C e i 300C e a pressioni tali da avere sempre
lacqua nello stato liquido.
Lutilizzo di tale tecnica pu portare ad alcuni problemi di cui occorre tenere conto:
-

ad alte temperature, lacqua diventa meno polare, cambia quindi il suo potere
estraente. Questo significa che aumenta la capacit di estrazione di analiti
meno polari.

ad alte temperatura, lacqua pu diventare corrosiva.

Il vantaggio che lavorando a cos alte temperatura migliora la solubilit degli analiti
stessi.
Lestrazione degli analiti dal suolo pu avvenire in due modi:

22

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

statico: lacqua viene lasciata a contatto con il suolo per circa 15-20 minuti e
poi viene fatta uscire trascinando con s gli analiti.

dinamico: lacqua fluisce nella cella e poi esce trascinando con s gli analiti.

Figura 12 - Schema di un HPSE. Si noti la presenza di un pompa che serve a "pescare" del solvente
organico.

Nel vial di raccolta (figura 12) si pu collocare un solvente organico per favorire la
ripartizione degli analiti non pi solubili in acqua alle condizioni standard. Si pu
anche sostituire il vial di raccolta con una SPE o con un modulatore di pH.
Il metodo HPSE permettere di ottenere alte rese, sicuramente maggiori di quelle
ottenibili da un estrattore Soxhlet.
Gli analiti che si riescono ad estrarre sono quelli polari o moderatamente apolari.
Con questo metodo si favoriscono step idrolitici degli analiti: molti di loro sono
infatti legati agli acidi umici che presentano dei gruppi carbossilici i quali possono
23

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

formare legami esterei con molti analiti. Se vero, come vero, che questa tecnica
favorisce lidrolisi, i legami esterei si rompono liberando gli analiti legati al suolo. Vi
quindi un recupero in toto.
3.1.4

Estrazione accelerata con solventi organici (ASE)

Questa tecnica (figura 13) concettualmente identica alla HPSE, con la differenza
che si utilizzano miscele di solventi organici in condizioni subcritiche. Dal momento
che si possono formare delle miscele di solventi, la polarit risulta estremamente
modulabile e questo fa s che si possa lavorare sia in maniera selettiva per
lindividuazione di specifici analiti, sia in maniera non selettiva.

Figura 13 - Estrazione accelerata con solventi organici (ASE)

Tra i parametri da monitorare vi sono: la temperatura, la pressione e la matrice. Le


alte temperature favoriscono una migliore solubilit e modificano la polarit dei
solventi oltre alla viscosit, tensione superficiale . Le alte pressioni servono
soprattutto in fase di pulizia e per mantenere il solvente in fase liquida. In ultimo, la
matrice va finemente suddivisa per favorire il contatto tra solventi e analita.

24

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

Anche in ASE si pu lavorare in modo statico o dinamico. Se si opta per la staticit,


al termine della solubilizzazione nella cella di estrazione, il solvente viene trascinato
via da un gas inerte, come lazoto.
Concludiamo con alcune considerazioni: lASE estrae troppo, addirittura pi del
Soxhlet e per questo sono richiesti degli step di purificazione del campione estratto.
3.1.5

Estrazione in fluidi supercritici (SFE)

I fluidi in condizioni supercritiche hanno propriet solventi (e densit) come nello


stato liquido, ma capacit diffusive tipiche dei gas (e viscosit). Questo significa
tempi di estrazione bassi. Gli svantaggi legati a questa tecnica sono essenzialmente
legati alla scarsa possibilit di sostanze che possono essere usate come fluidi
supercritici. Soltanto lanidride carbonica (Tc = 31C, Pc = 73 atm) viene utilizzata in
quanto altre molecole, come lammoniaca, letano ed esano, sono pericolose se
manipolate in condizioni cos drastiche. Non possibile utilizzare lacqua come
solvente in condizioni supercritiche in quanto le condizioni richieste sarebbero
troppo drastiche (Tc = 374C, Pc = 218 atm)
Lanidride carbonica presenta un potere solvatante paragonabile al benzene, quindi
apolare e adatto per estrarre analiti organici apolari. E possibile modificare la
polarit aggiungendo un modificatore organico (qualche percentuale di etanolo) in
modo tale che possano essere estratti anche composti non totalmente apolari.

Figura 14 - Un fluido si dice essere in uno stato supercritico (e si dice fluido supercritico) quando si trova
in condizioni di temperatura superiore alla temperatura critica e pressione superiore alla pressione critica.
In queste condizioni le propriet del fluido sono in parte analoghe a quelle di un liquido (ad esempio
la densit) ed in parte simili e quelle di un gas (ad esempio la viscosit).

25

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

Figura 15 - Estrazione utilizzando fluidi supercritici (SFE)

Anche con questa tecnica si pu lavorare in condizioni statiche o dinamiche.


Questultima risulta la strategia di lavoro preferita.
Lottimizzazione di questo metodo passa attraverso la scelta della temperatura
ottimale e della giusta percentuale di modificatore organico. Inoltre il campione va
completamente disidratato in quanto lumidit causa un netto abbassamento delle
rese di estrazione.
Concludendo possiamo dire che si osservato che le rese di estrazioni migliori si
ottenevano in condizioni appena inferiori al punto critico e per questa ragione si
tende a preferire lASE rispetto alla SFE.
I vantaggi principali della SFE sono:
-

tecnica solvent-free

veloce (circa 30)

automatizzabile

la selettivit modulabile

precisa

utilizzata per estrarre analiti sia da matrici solide che da matrici liquide

estrazione di composti termolabili

26

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

3.1.6

Estrazione con microonde (MAE)

Lultima tecnica che andiamo ad analizzare per quanto riguarda lestrazione di analiti
non volatili (o poco volatili) da matrici solide lestrazione con microonde (MAE).
In questo caso le microonde sono utilizzare per scaldare il campione e velocizzare la
velocit di estrazione (figura 16).
Le microonde sono delle onde che interagiscono con i dipoli delle molecole con
leffetto di risaldarle.
In questa tecnica risulta molto importante la scelta del solvente, ed in particolare
occorre valutare il fattore di dissipazione dato dal rapporto tra la perdita dielettrica
(vale a dire lefficienza con la quale lenergia assorbita E viene trasformata in
calore ) e della costante dielettrica (vale a dire quella grandezza che descrive la
polarizzabilit di una molecola in un campo elettrico):

Una fattore di dissipazione elevato significa che il solvente in grado di dissipare


calore. Si possono effettuare anche delle miscele di solventi in cui almeno uno dei
due abbia unelevata : acetone ( = 5555104 F/m) + esano ( = 0,10104 F/m).
I parametri da controllare sono:
-

solvente: valutare sia , sia la quantit. Se si usano piccole quantit di


solvente tali da ricoprire appena il solido, si pu evitare lo step di
purificazione

temperatura

tempo di estrazione: generalmente breve

presenza di acqua nella matrice: questo un fattore di aiuto in quanto il


processo di riscaldamento facilitato, dal momento che lacqua possiede un
= 1500104 F/m, quindi piuttosto alto

27

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

Figura 16 - Estrazione con microonde (MAE)

Concludiamo con i vantaggi:


-

dimensioni ridotte dellapparecchiatura.

minime possibilit di contaminazione

e con gli svantaggi:


-

attenzione alla tipologia di matrice organica di partenza in modo da evitare


esplosioni.

28

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti non volatili da matrici
solide

3.2 Ricapitolazione finale


Per quanto riguarda le tecniche illustrate nel capitolo 3, ci soffermiamo su alcuni
aspetti:
Tecnica

Quantit di solvente

Tempo di estrazione

Soxhlet

200-500 ml

4-48 h

Sonicazione

100-300 ml

30-1h

SFE

8-50 ml

30-2h

ASE

15-40 ml

12-18

La scelta del solvente risulta fondamentale nelle tecniche Soxhlet e ASE, mentre
indifferente nella sonicazione e nella SFE. Per queste due stesse tecniche anche
molto importante che la matrice sia stata preventivamente suddivisa in piccoli grani,
mentre non importante questo aspetto nella sonicazione e nella SFE.

29

Analisi degli inquinanti con laboratorio Estrazione di analiti volatili da matrici


solide e liquide

CAPITOLO 4
4.0 Estrazione di analiti volatili da matrici
solide e liquide

In questo capitolo trattiamo lestrazione di analiti volatili da matrici solide e liquide.


Le tecniche che analizzeremo sono valide per entrambe le tipologie di matrice con
alcuni accorgimenti che evidenzieremo nei diversi paragrafi.

4.1 Tecnica dello spazio di testa (HS-GC) statico


(SHS) e dinamico (DHS).

Figura 17 - Tecnica dello spazio di testa statico

Con la tecnica dello spazio di testa statico (SHS) si pone il campione in un vial
collocato su un bagno termostatato. Si introduce nello spazio soprastante la matrice
una siringa a tenuta di gas con un ago in grado di prelevare gli analiti di interesse.
Questi si ripartiranno tra fase gas e fase liquida fino al raggiungimento
dellequilibrio, momento in cui si estrae la siringa e si inietta il suo contenuto in un
Gas cromatografo.

29

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti volatili da matrici


solide e liquide

Il problema di questa tecnica legato al fatto che non esaustiva (si estraggono solo
gli analiti che si sono ripartiti in fase gas).

Figura 18 - Tecnica dello spazio di testa dinamico (DHS).

La tecnica dello spazio di testa dinamico (DHS), si basa su un principio simile alla
precedente. In particolare il campione viene introdotto in un recipiente di vetro in un
bagno termostatato. Si fa fluire un gas inerte che spinge gli analiti volatili verso una
trappola adsorbente. Dopo, gli analiti si desorbono e poi sono introdotti in un gascromatografo.
Rispetto alla tecnica SHS, la DHS permette di ottenere rese di estrazione pi elevate
e permette di trascinare nella trappola adsorbente anche analiti poco volatili.

4.2 Tecnica del purge & trap


Lestrazione con la tecnica del purge & trap (figura 19) viene utilizzata per estrarre
analiti volatili e concentrarli, E unestrazione per dislocazione (stripping) ottenuta
gorgogliando nella matrice un gas (chiamato gas di purging) che far uscire dalla
matrice stessa gli analiti pi volatili. Essi vengono poi adsorbiti su unapposita
trappola adsorbente composta da diversi strati con diverse propriet di adsorbimento.
Ed qui che si concentrano gli analiti.
Una volta concentrati gli analiti, si desorbono per riscaldamento a circa 200C e
vengono poi iniettati nel gas-cromatografo. La temperatura di desorbimento dipende
dalla natura della cartuccia adsorbente.
30

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti volatili da matrici


solide e liquide

La scelta del purge gas, ricade quasi sempre


sullElio in quanto, essendo inerte e poco
solubile, permette di dislocare tutte le specie
volatili dalla soluzione alla trappola di
adsorbimento.
Ci soffermiamo ora con un po pi di
dettaglio

sulla

tipologia

di

materiale

adsorbente presente nella trappola. Esso pu


essere di differenti tipi e permette di modulare
la selettivit. Ad esempio, lutilizzo di
polimeri porosi (tenax) permette di estratte
composti volatili da C4 a C24. Il tenax
Figura 19 - Schematizzazione di un estrazione
con tecnica purge & trap

modificato con grafite (multibeds) ha invece


una

sensibilit

inferiore

permette

ladsorbimento di analiti con diversa volatilit e peso molecolare. Fasi adsorbenti


come il carbotrap e il carboxen sono sensibili rispettivamente nei confronti di
molecole volatili da C5 a policlorobifenili e di molecole con un basso peso
molecolare (da C2 a C5).
Concludiamo dicendo che, sfortunatamente, lestrazione con tecnica purge & trap
non d rese di recupero molto alte.

4.3 Purge

&

Membrane

PAM/MS

PG-

ATR/FTIR
La tecnica purge & trap pu essere usata anche per estrarre analiti volatili da matrici
solide. In tale circostanza essa prende il nome di purge & membrane.
Il vial che contiene il suolo mantenuto in una camera termostatata a 80C. Gli
analiti vengono poi trasportati verso un apposito spettrometro di massa grazie
allazione di un gas inerte. Questo un metodo veloce, sensibile e che mantiene un
ampio range lineare. Lunica osservazione da fare che particolarmente sensibile

31

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti volatili da matrici


solide e liquide
allumidit: una notevole presenza di acqua finisce con labbassare le rese di
recupero. Per questa ragione il suolo deve essere preventivamente disidratato.
Unaltra tecnica di analisi per
analiti volatili la PG-ATR/FTIR
. Il campione si colloca in un
opportuno vial

riscaldato. Gli

analiti sono trasportati da un gas


inerte verso una cella di lettura di
ZnSe dove vengono adsorbiti per
via della presenza di un polimero
poli-isobutilenico.

Si

unanalisi in riflettenza

effettua
totale

attenuata.

Figura 20 - Diagramma schematico che illustra la tecnica PGATR/FTIR

I fattori da controllare sono essenzialmente due:


1. velocit con la quale gli analiti vengono rilasciati in fase gas
2. velocit del flusso
3. spessore dello strato adsorbente. Cristalli poco spessi hanno una minore
capacit adsorbente (rischiano di saturarsi in tempi brevi e di perdersi cos
parte degli analiti), ma in compenso hanno dei tempi di rilascio molto corti.
Se lo strato cristallino invece pi spesso, la quantit di analita adsorbito
maggiore, ma pu capitare che i tempi di rilascio siano pi lunghi e che non
tutto il target venga rilasciato.

32

Analisi degli inquinanti con laboratorio - Estrazione di analiti volatili da matrici


solide e liquide

4.4 La preparazione degli standard dei VOCs


(Composti Organici Volatili)
Risulta particolarmente difficile preparare degli standard di sostanze volatili, come
ad esempio i VOCs (Volatil Organic Compounds, Composti Organici Volatili). In
generale occorre lavorare a basse temperature (circa 5C), e usare dei solventi acidi
per lo stoccaggio dei campioni.
Nel caso specifico noi analizziamo tre strategie per la preparazione degli standard dei
VOC:
1.

Spiking con soluzione metanolica: si prende il suolo e si fanno delle


aggiunte controllate di standard in matrice metanolica. Il metodo molto
veloce, ma di scarsa riproducibilit.

2.

Fortificazione da fase vapore: si mettono i campioni di suolo in un


essiccatore e si anidrificano per circa 48h. Successivamente si toglie
lessiccante e lo si sostituisce con una soluzione madre di VOCs in
MeOH. Si lascia a riposo da 2 a 6 settimane a temperatura ambiente per
favorire una omogeneizzazione dei composti organici volatili. Infine, le
ampolle in cui sono stati messi i campioni di suolo vengono chiuse e
lasciate a riposo da 4 a 6 giorni a 4C.

3.

Incapsulamento in gelatina secca: si disperdono i VOCs in una


soluzione acquosa di gelatina a 40-60C fino a formare unemulsione.
Allemulsione si aggiunge un elettrolita (la gomma arabica) fino a
raggiungere un pH di 4-5. Lelettrolita e la gelatina presentano cariche
opposte e formano un gel intorno ai VOCs. Il film viene gelato e, per
rinforzarlo, si usa un agente reticolante come la glutaraldeide. Infine, si
essicca il tutto e si aggiungono le capsule cos ottenute al campione di
suolo.

33

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

CAPITOLO 5
5.0 GC e HPLC

5.1 Iniettori in gascromatografia


Liniettore permette di introdurre il
campione in fase vapore nella colonna.
La fase mobile gassosa costituita da
gas

inerti

attraversano

(N2,

He,

Ar)

liniettore

quali

vengono

collocati in una camera di riscaldamento


a temperature differenti a seconda della
tecnica che si utilizza.
Dal momento che il campione deve
essere vaporizzato, la camera riscaldante
avr una temperatura maggiore di una
ventina di gradi rispetto alla temperatura
di ebollizione del composto pi alto
bollente della miscela da analizzare. La
volatilizzazione deve avvenire nel pi
breve tempo possibile.
Distinguiamo tre tipologie di iniezione:
Figura 21 - Iniettore split. 1) siringa, 2) setto poroso,
3) zona di evaporazione del campione, 4) ingresso del
gas carrier, 5) corpo dell'iniettore, 6) camera di
miscelazione, 7) spurgo, 10) testa della colonna
capillare

split, splitless e in colonna.


Liniezione split, con parzializzazione,
utilizzata quando si ha a che fare con

colonne capillari. In questo caso il sistema di ripartizione di questo tipo di iniezione,

34

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

suddivide il campione iniettato in modo tale da inviarne solo una piccola frazione
nota in testa alla colonna e il rimanente allo scarico. I gas cromatografi che lavorano
con colonne capillari disponibili in commercio includono gi tali ripartitori; essi
consentono di suddividere il campione iniettato anche quando vengono usate colonne
impaccate. Lo splitter una camera di iniezione termostatata a circa 350C nella
quale il campione evapora. Si forma quindi una miscela omogenea tra gas di
trasporto e campione. Dal momento che una frazione del campione sar eliminata,
per avere dei dati attendibili, occorre che il campione sia il pi possibile omogeneo.
Questa tecnica adatta a campioni in cui gli analiti gli interesse solo circa lo 0,1%
del totale.
La tecnica splitless non prevede alcuna eliminazione di una parte del campione e in
generale il suo funzionamento simile a quello delliniezione split. In questo caso la
camera di riscaldamento generalmente ha delle temperature pi basse (220 C) con la
conseguenza che il campione trascorre pi tempo nelliniettore e adatta a colonne
impaccate. E una tecnica adatta a campioni in cui gli analiti di interesse sono <
0,01% del campione.
Liniezione direttamente in colonna si utilizza quando c il rischio di una
degradazione dellanalita nella camera di riscaldamento oppure quando lanalita
estremamente poco (es. gas rarefatti) e viene effettuata con siringe con aghi molto
lunghi e sottili.
Lultimo tipo di iniettore il PTV (Programmed Temperature Vaporizer) che pu
essere split a freddo, splitless a freddo o solvent vent. Il PTV una serpentina che
riscalda liniettore. In campioni sono iniettati in un inserto freddo, la T viene
aumentata per poter vaporizzare il campione. La split a freddo prevede
lintroduzione del campione (a freddo), linnalzamento della temperatura della
serpentina seguito dallintroduzione del campione in colonna, la cui temperatura
viene innalzata solo in un secondo momento. Tecnica adatta per campioni
concentrati, liquidi, gassosi o sporchi. Non adatta per analisi in tracce. La splitless a
freddo prevede lintroduzione del campione in una precisa finestra temporale e cio
dallinizio del riscaldamento della camera di vaporizzazione fino al momento in cui
si inizia il riscaldamento della colonna. Dopodich il campione non viene pi

35

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

iniettato. Adatta per campioni diluiti, liquidi (unicamente liquidi, non gassosi) o
sporchi. Non adatto per analisi in ultratracce. Infine la solvent vent prevede un
riscaldamento graduale della camera di vaporizzazione tenendo aperta lo spurgo per
favorire leliminazione del solvente (che deve essere opportumamente scelto il pi
basso bollente possibile: etere, diclorometano, pentano). Dopodich si chiude lo
spurgo e, sempre innalzando la temperatura si inietta in colonna.

5.2 Risoluzione ed equazione di Van Deemter


La colonna la componente pi interessante e la scelta della tipologia di fase
stazionaria, dello spessore e della lunghezza, sono caratteristiche fondamentali per
garantire una massima risoluzione intesa come minimizzazione della larghezza delle
bande cromatografiche (efficienza) e buona separazione degli analiti (selettivit).
La risoluzione data da:

dove N il numero di piatti teorici, il fattore di selettivit e k B il fattore di


ritenzione.
Il numero di piatti teorici legato alla larghezza del picco, quindi allefficienza. Ogni
analita stabilisce un equilibrio di ripartizione tra la fase mobile e la fase stazionaria e
ognuno di questi equilibri definisce il piatto teorico. Aumentando il numero di piatti
teorici, si ha un crescente numero di equilibri di ripartizione, quindi aumenta la
possibilit di separare un analita da un altro.
Il numero di piatti teorici solo uno dei parametri, come abbiamo anticipato, che
occorre considerare per definire la performance separativa della colonna. Gli altri
sono il fattore di capacit e la selettivit.
Il numero dei piatti teorici dipende dalla lunghezza del sistema separativo, per
questo utile ricavare laltezza equivalente del piatto teorico (HETP), che
generalmente si esprime in millimetri.

36

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

dove L la lunghezza della colonna e H laltezza del piatto teorico. Laltezza del
piatto teorico definita dallequazione di Van Deemter di cui ci occuperemo in
seguito.
Tornando allefficienza, possiamo stabilire che essa un indice di quanto si riesca ad
evitare lallargamento della banda durante la corsa cromatografica. Occorre
comunque considerare che allaumentare del tempo di residenza dellanalita nella
colonna, diventano sempre pi importanti fenomeni di diffusione laterale lungo la
colonna stessa e che quindi i picchi che escono a tempi di ritenzione elevati saranno
sempre pi larghi di quelli che escono prima. Esistono inoltre allargamento di banda
extra-colonna, dovuti alla diffusione laterale che avviene nei tubi di connessione e
nella cella del rivelatore, che devono essere ridotti al minimo mediante un opportuno
disegno strumentale.
Il fattore di capacit definito:

ed esprime il tempo di ritenzione di un composto corretto rispetto al tempo morto. Il


fattore di capacit simile ad una costante di equilibrio. Rappresenta la misura del
tempo trascorso in fase stazionaria rispetto al tempo di residenza nella fase mobile
durante il passaggio attraverso il sistema separativo. Maggiore il fattore di capacit,
maggiore sar il tempo trascorso in fase stazionaria e pi tardi il composto sar
eluito. Il fattore di capacit indipendente dalla velocit di flusso e dal sistema in
generale. E una funzione della capacit di ritenzione del sistema separativo
accoppiata alle interazioni della fase mobile.
La selettivit viene misurata mediante (fattore di separazione o ritenzione
relativa), che il rapporto dei fattori di capacit di due picchi. La selettivit misura le
differenze di interazioni tra i composti e la fase stazionaria. In particolare aumenta
allaumentare della separazione tra due picchi. Un valore basso di indica che la
separazione dei picchi molto difficoltosa e richiede unelevata efficienza.

37

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

Per capire come varia lefficienza al variare delle condizioni sperimentali, si ricorre
allequazione di Van Deemter:

Questa espressione mette in relazione laltezza del piatto teorico con la velocit della
fase mobile (u). La combinazione lineare di queste tre funzioni d la curva
rappresentata in figura 22:

Figura 22 - Equazione di Van Deemter

Il minimo in termini di altezza di piatti teorici, corrisponde ad un massimo di


efficienza. I parametri A, B e C possono essere modificati per abbassare
ulteriormente la curva, quindi laltezza del piatto teorico.
Il termine A un termine indipendente della velocit del flusso ed definito come
termine di cammino multiplo. La fase stazionaria pu generare dei percorsi diversi a
seconda della compattezza della stessa: ad esempio se tre molecole dello stesso
analita entrano nella fase stazionaria, non detto che escano tutte e tre
contemporaneamente. La loro uscita dipende dalla traiettoria seguita nella fase
stazionaria. In altre parole: pi disordinata la fase stazionaria, pi A sar alta e
peggiore sar lefficienza. A un parametro presente solo su fasi stazionarie in fase
granulare. Se la fase stazionaria non in forma granulare, A tender a zero.

38

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

Il termine B invece il termine di diffusione longitudinale dellanalita quando si


trova in fase mobile. Esso si basa sul fenomeno fisico della diffusione per la quale si
ha la migrazione degli analiti da aree di maggiore concentrazione ad aree a minore
concentrazione. In altre parole in colonna non distribuito in modo puntuale, ma
assume una forma allungata. Il termine inversamente proporzionale alla velocit
(maggiore la velocit, minore sar il tempo di permanenza in colonna e minore sar
la possibilit che lanalita diffonda) ed particolarmente importante in GC (velocit
di diffusione elevate) rispetto alla LC (velocit di diffusione ridotte).
Il termine C il termine di trasporto di massa e si divide in Cs (trasferimento di
massa in fase stazionaria) e Cm (t. di m. in fase mobile). Cs direttamente
proporzionale alla velocit, allo spessore del film e inversamente proporzionale alla
diffusione dellanalita in fase stazionaria. Cm invece inversamente proporzionale
alla diffusione in fase mobile e non ha una relazione di proporzionalit diretta con la
velocit di flusso in quanto risente di una complessa dipendenza dalla velocit del
solvente. E il termine pi importante dei tre presenti nellequazione e in generale
dipende dalla solubilit della sostanza nelle due fasi, dalla temperatura
Occorre quindi trovare una velocit che permetta di avere dei valori di B e C utili
allottenimento di una buona efficienza, che si traduce in una buona risoluzione.

5.3 Colonne per GC e HPLC

Figura 23 - Tipica colonna per GC

Le colonne capillari (figura 23) sono utilizzate esclusivamente in GC in quanto,


essendo la fase mobile un gas, si sfrutta la massima diffusivit dello stesso per far
interagire gli analiti con la fase stazionaria. Per mantenere un elevato numero di
piatti teorici, queste colonne possono essere lunghe anche 100 metri.

39

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

Figura 24 - Colonna impaccata per HPLC

In HPLC si usano invece le colonne impaccate (figura 24) per avere una migliore
ripartizione tra fase stazionaria e fase mobile.
In termini di risoluzione, le colonne capillari della GC sono migliori rispetto a quelle
per HPLC.
Se torniamo allequazione di Van Deemter illustrata in precedenza, alla luce di
quanto detto in questo paragrafo, possiamo dire che il termine A zero (figura 25)
per quanto riguarda la gas-cromatografia. In effetti, essendo la colonna capillare e
non essendoci alcuna fase stazionaria impaccata, il termine relativo ai cammini
multipli nullo. Lequazione specifica quella di Golay:

Figura 25 - Confronto tra equazione di Van Deemter e equazione di Golay

Allinterno dellequazione di Golay vi un termine relativo al diametro interno della


colonna che influisce fortemente sullaltezza dei piatti teorici: tanto pi piccolo
tanto minore sar laltezza dei piatti teorici (figura 26).
40

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

Figura 26 - Minor diametro interno significa minor altezza dei piatti teorici

5.4 Fast GC
Il diametro interno influisce fortemente sullaltezza dei piatti teorici. Questa
osservazione ha aperto le porte alla Fast GC, una tecnica che permette analisi in
pochi minuti e che prevede di utilizzare colonne dal diametro compreso tra i 0.10 e i
0.18 mm. Se si diminuisce ulteriormente il diametro (< 0.050 mm) si parla di Ultra
Fast GC.
Questo fa s che i temi di analisi diminuiscano drasticamente senza perdere in
risoluzione: vero che si verifica una perdita del numero dei piatti teorici (le colonne
sono pi corte), ma anche vero che questa diminuzione compensata dalla
riduzione dellaltezza dei piatti stessi. In altre parole: tempi di analisi pi brevi a
parit di risoluzione rispetto alle tecniche di GC tradizionali.
Laltezza dei piatti teorici
pu essere altres diminuita,
assottigliando il film di fase
stazionaria.

In

figura

visibile la differenza in
termini di HETP di una fase
stazionaria spessa 5 m e di
Figura 27 - HETP pi bassi per spessori pi bassi

una spessa 0.25 m.

41

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

In generale film pi spessi sono usati per composti volatili, mentre quelli pi sottili
sono utili nel caso in cui si stiano facendo analisi per composti alto bollenti. Si pu
vedere se lo spessore del film adeguato calcolando:

dove dc il diametro della colonna e df lo spessore del film. Se < 100, lo spessore
del film adatto per molecole piccole a basso peso molecolare, se compreso tra
100 e 400 di uso generale, mentre se maggiore di 400 adatto per molecole
grandi ad alto peso molecolare.
In Fast GC anche fondamentale controllare il tipo di gas carrier che si sceglie. In
particolare si pu osservare che la scelta di H2 piuttosto che He, riduca sensibilmente
laltezza dei piatti teorici (figura 27).

Figura 28 - La scelta del gas carrier influisce sull'altezza dei piatti teorici

Per concludere la parte legata alla Fast GC, occorre analizzare brevemente la
tipologia di rilevatore. Esso dovr rispondere molto rapidamente in quanto gli analiti
vengono eluiti piuttosto rapidamente. Il detector migliore il TOF (tempo di volo).

42

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

5.5 GCxGC

Figura 29 - La tecnica GCxGC

Una tecnica molto utilizzata quella della GCxGC che consiste nellassemblare in
serie due colonne per Gas Cromatografia. La GCxGC, o Comprehensive Twodimensional gas chromatography, stata descritta per la prima volta nel 1991 dal
Professor Phillips e da quel momento ha avuto grandi applicazioni per la risoluzione
di complessi problemi di separazione. Nella GCxGC due colonne sono collegate
sequenzialmente. Tipicamente la prima colonna ha dimensioni di una colonna
convenzionale usata in GC, mentre le dimensioni della seconda sono quelle di una
Fast GC (la separazione avviene molto rapidamente). Generalmente i meccanismi di
ritenzione delle due colonne sono ortogonali, ci significa che devono essere
completamente differenti: generalmente la prima colonna apolare (quindi ripartisce
le molecole in base al loro differente punto di ebollizione), la seconda polare
(quindi ripartisce le molecole in base alla loro polarit). Questo almeno il set-up
utilizzato per lisolamento e la caratterizzazione del petrolio.
Spieghiamoci meglio: con questo set-up sperimentale (prima colonna apolare,
seconda polare), la prima colonna seleziona le molecole in base alla loro volatilit. In
uscita quindi ci saranno diversi picchi ognuno dei quali conterr pi analiti aventi
la stessa volatilit (un picco contiene pi di un analita). Il modulatore, come vedremo
tra poco, fraziona il picco cromatografico in arrivo, condensa la frazione e la
focalizza verso la seconda colonna nella quale gli analiti contenuti nel picco

43

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

cromatografico proveniente dalla prima colonna saranno suddivisi cos in base alla
loro polarit.
Spieghiamoci ancora meglio. Quello che vedete nella figura seguente il primo
picco proveniente dalla prima colonna:
Come si pu notare un picco non perfettamente
simmetrico e questo significa che non contiene un
solo

analita.

Se

vogliamo

continuare

con

lesempio del petrolio, possiamo dire che questo


picco, essendo il primo eluito dalla prima colonna,
corrisponde alla frazione pi volatile. Esso
contiene pi di un analita volatile.
Entra in scena il modulatore. Supponiamo che il
picco eluisca completamente in sette secondi. Il
modulatore accumula materiale in arrivo ogni
secondo dividendo quindi il picco in sette frazioni.
Ognuna di queste frazioni va incontro ad un
processo

di

condensazione,

evaporazione

focalizzazione in una banda molto stretta verso la


seconda colonna dove vi sar
una

nuova,

rapida,

separazione cromatografica.

Il cromatogramma bidimensionale visibile nella


figura a fianco e in quella seguente in cui si evince
molto bene come siano stati separati i picchi
cromatografici contenuti nellunico picco in uscita
dalla prima colonna.

44

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

Figura 30 - Il picco proveniente dalla prima colonna stato suddiviso in sette frazioni (una raccolta ogni
secondo). Ognuna di esse stata inviata alla seconda colonna dove avvenuta quindi la separazione dei
due analiti (frazione 2 e 3). Le frazioni 1, 4, 5, 6 e 7 contenevano soltanto un analita.

Il detector, posto oltre la seconda colonna, generalmente il tempo di volo (TOF).

5.6 Fasi stazionarie in LC e in GC

Figura 31 - Il diametro interno delle particelle di fase stazionaria influisce sull'altezza dei piatti teorici

45

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

Ci addentriamo nello studio delle fasi stazionarie utilizzate in cromatografia liquida.


In questo campo si utilizzano colonne sempre pi miniaturizzate; per talune
applicazioni parliamo di diametri interni inferiori a 25 m (open tubular LC). Per
quanto riguarda il parametro HETP da ottimizzare, si tende a studiare la
miniaturizzazione delle particelle di fase stazionaria (figura 29).
In cromatografia liquida di adsorbimento, la fase stazionaria un solido poroso con
un diametro variabile compreso tra 5 e i 10 m che presentano dei canali interni di
diametro compreso tra i 100-500 A. Queste fasi stazionarie devono essere il pi
possibile compattate onde ridurre il pi possibile la capacit di cammini preferenziali
In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase liquida, che riveste la
superficie delle particelle di supporto, pi grosse.
La fase stazionaria liquida oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata al
supporto, detta bonded phase (BP). Il supporto (o matrice) generalmente costituito
da silice: i gruppi OH della silice (chiamati silanoli) vengono utilizzati per legare
chimicamente la fase stazionaria): Le fasi legate possono essere polari (ad esempio
con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale; oppure apolari
(ad esempio con una catena alchilica), usate in fase inversa.
La silice pu essere granulare o monolitica, dove la prima stata in assoluto la
favorita. Recentemente la silice monolitica la pi utilizzata. Essa ottenuta dalla
sinterizzazione di micro particelle di silice ad alte temperature e pressioni.
Utilizzando questa particolare tipologia di silice, limpaccamento risulta pi
efficiente: in altre parole si ha un miglioramento del termine A nellequazione di Van
Deempter in seguito ad una riduzione del numero di cammini multipli: i canali vuoti
che sono presenti allinterno di queste strutture monolitiche sono omogenei.
Passando dalla cromatografia liquida alla gas cromatografia, citiamo come possibili
fasi stazionarie i poliesteri, polieteri, polietilenglicoli (carbonax), polisilossani
Tutti questi composti sono accomunati da alcune caratteristiche quali, prima fra tutte,
la loro termo resistenza e non degradazione ad alte temperature. Seguono una bassa
volatilit e bassa viscosit

46

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

5.7 Classificazione della fasi stazionarie in base


alla loro polarit
Il grado di polarit di una fase stazionaria liquida, pu essere espresso
numericamente facendo riferimento ad un parametro empirico, lindice di Kovats.
Lindice di Kovats un numero puro, che esprime la ritenzione di una data sostanza
in relazione a quella di due alcani lineari eluiti rispettivamente prima e dopo di essa
su una determinata fase stazionaria. Se per esempio vogliamo identificare lIndice
di Kovats per il benzene possiamo procedere in questo modo (Figura 32). Facciamo
eluire in colonna due alcani a catena lineare (che rappresentano gli standard per
eccellenza in questo genere di analisi) avendo cura che uno di questi abbia un tempo
di ritenzione inferiore al benzene e uno superiore. Nella fattispecie troviamo che
esano ed eptano sono ottimi per questo scopo. A questo punto, ci registriamo il
tempo di eluizione di questi standard. Dopodich iniettiamo in colonna il benzene e
ci registriamo il tempo di eluizione di questa molecola. Esso dovr essere, visto che
lo abbiamo imposto, intermedio tra il tempo di ritenzione dellesano e il tempo di
ritenzione delleptano.
Utilizzando la seguente formula calcoliamo lindice di Kovats per il benzene:

dove tr sostanza sar il tempo di ritenzione del benzene, t r (idrocarburo inf.) sar il tempo
di ritenzione dellesano e tr

(idrocarburo sup)

sar il tempo di ritenzione delleptano. n

rappresenta il numero di atomi di carbonio dello standard con il tempo di ritenzione


inferiore rispetto al nostro analita (benzene). Quindi sar n=6 (lesano ha tempo di
ritenzione inferiore):

Riassumendo, si effettua prima unanalisi iniettando una miscela standard di


idrocarburi omologhi, a cui segue lanalisi del campione e dai tempi di ritenzione
ottenuti, e i relativi logaritmi, si calcolano gli indici di Kovats. Lindice I varia a

47

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

seconda della fase stazionaria, ma indipendente dalla geometria della colonna e


quindi pu essere usato per lanalisi qualitativa. Infatti, se due sostanze, una note e
una incognita, presentano gli stessi indici di ritenzione (o di Kovats) su due colonne
diverse ma con la stessa fase stazionaria, molto probabile che si tratti della stessa
sostanza. La scelta della serie idrocarburica come sostanze di riferimento valida
soprattutto se si utilizzano rivelatori a ionizzazione di fiamma (FID) e colonne
apolari. Lintroduzione di rivelatori specifici (ECD e NPD), poco sensibili agli
idrocarburi paraffinici, e limpiego di colonne polari hanno reso necessaria
lintroduzione di nuove serie omologhe; fra queste una delle pi usate la serie degli
esteri etilici degli acidi grassi.

Figura 32 Determinazione degli indici di Kovats

Le costanti di McReynolds sono utilizzate per valutare le polarit delle diverse fasi
stazionarie usando come standard di riferimento lo squalano. Lutilizzo di queste
costanti si basa sulla differenza () dellindice di Kovats di un composto standard su

48

Analisi degli inquinanti con laboratorio GC e HPLC

una certa fase stazionaria (per esempio il dinonilftalato) con lindice di Kovats dello
stesso composto su una fase di riferimento non polare, come detto, lo squalano.
Tanto maggiore questa differenza (Ir) tanto maggiori saranno i tempi di ritenzione
dei composti, ovvero tanto maggiore la polarit della fase stazionaria non standard.

Figura 33 - Determinazione degli indici di McReynolds

Quello che si valuta appunto la differenza in termini di indice di Kovats tra un


composto eluito in squalano oppure in dinonilftalato (figura 33). Nel caso
dellimmagine si vede che lanalita ha un Ir pari a 649 se eluito in squalano e pari a
733 se eluito in dinonilftalato. Il Ir = 84. Questo significa che la fase stazionaria non
standard (il dinonilftatalto) non polare (Ir < 100). Se invece: 100 < Ir < 400,
essa moderatamente polare, e se Ir > 400 altamente polare.

49

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

CAPITOLO 6
6.0 Sorgenti di ionizzazione

6.1 Il potere risolvente di uno spettrometro di


massa
Prima di addentrarsi pi nel dettaglio riguardo alle sorgenti di ionizzazione,
cerchiamo prima di comprendere il significato di potere risolvente.
Esso definito cos:

m la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m la massa nominale


del primo picco (o la media delle masse dei due picchi).
Due picchi sono considerati separati se laltezza della valle tra di essi inferiore ad
una certa percentuale della loro altezza (di solito il 10%).
Uno spettrometro con una risoluzione di 4000 risolver due picchi con valori di m/z
400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Risulta quindi chiaro che per separare frammenti
con alti pesi molecolari sono necessarie risoluzioni molto elevate.
Gli spettrometri commerciali hanno R che varia circa tra 500 e 500000.

6.2 Sistemi per alto vuoto


Negli ionizzatori occorre raggiungere un vuoto molto spinto, in particolare fino a 10-7
torr. Per ottenere vuoto spinto si accoppiano di solito due pompe:
1. pompa rotativa: permette di arrivare fino a 10-3 torr. Essa costituita da una
pala che ruota molto velocemente e che spinge i gas verso lesterno,

47

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

eliminando laria dal campione. Si possono accoppiare due pompe rotative in


serie dove la valvola di scarico della prima collegata con la bocca di
aspirazione della seconda.
2. pompa turbomolecolare: permette di arrivare fino a 10-11 torr. Le pompe
turbomolecolari sono delle pompe assiali a trascinamento in cui il rotore
formato da vari dischi equipaggiati di alette, i quali ruotano tra i dischi dello
statore, pure equipaggiati di alette inclinate in senso opposto. In pratica le
lamelle rotoriche urtano le molecole daria, spingendole verso quelle
statoriche successive; lurto contro queste, grazie al loro orientamento, fa
passare le molecole al rotore successivo dove il processo si ripete. Queste
lamelle sono orientate in maniera progressiva in modo da adattarsi alle
differenti pressioni presenti allinterno della turbomolecolare stessa. Sono
ottime per raggiungere il vuoto spinto in poche ore, ma queste pompe sono
estremamente delicate e hanno per questo brevi periodi di vita.
3. pompa diffusiva: permette di arrivare
fino a 10-7 torr. Il principio di funzionamento di
questo tipo di pompa il seguente: un fluido a
bassa tensione di vapore e elevata stabilit
termica (olio di silicone, mercurio ecc.) viene
scaldato allebollizione ed i vapori fuoriescono
da una serie di ugelli posizionati a diverse
altezze nella torre di distillazione contenuta
nella camera di aspirazione. Le molecole di gas
provenienti

dallattrezzatura

da

evacuare

diffondono nella corrente vapori del fluido e


Figura 34 - Pompa diffusiva

vengono trascinate da questa verso il basso

dove posta luscita della pompa. La torre di distillazione del fluido


sagomata in maniera tale che le molecole di gas trascinate dai vapori del
fluido subiscono una serie di compressioni successive prima di raggiungere
luscita. Il fluido condensa sulle pareti della camera di aspirazione e ritorna in
caldaia mentre il gas trascinato viene espulso dalluscita della pompa. Questa

48

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

pompa funziona associata ad una pompa rotativa. Il rischio che lolio pu


entrare nellanalizzatore.
In genere sia le turbomolecolari sia le diffusive lavorano accoppiate ad una
pompa rotativa che ha il compito di creare un pre-vuoto.

6.3 Sistemi di introduzione del campione


Il sistema di introduzione del campione consente di trasferire il campione dal suo
stato originario (solido, liquido o gassoso) ad una forma adatta alla ionizzazione.
Liniezione diretta per tutte le sostanze gassose o liquidi volatili. Se il liquido
poco volatile transiter per un serbatoio riscaldato che lo volatilizzer e lo invier
allo ionizzatore. Liniezione pu essere a sonda per solidi e liquidi non volatili. I
campioni, in questultimo caso, sono collocati in una camera di ionizzazione (sotto
alto vuoto e riscaldata) in modo tale da far sublimare i solidi ed evaporare i liquidi.
Entrambi questi metodi fanno parte delle iniezioni a carica dirette.

6.4 Sistemi di ionizzazione


Il sistema di ionizzazione quel dispositivo in cui si formano gli ioni gassosi degli
analiti o di loro frammenti. Lo ionizzatore deve essere scelto in funzione della
tipologia di analisi da effettuare. Essi si distinguono in base al meccanismo di
ionizzazione e in base alla fase in cui si trova lanalita. Per ioni in fase gas troviamo:
-

impatto elettronico

ionizzazione chimica

ionizzazione di campo

Le altre tecniche prevedono il desorbimento dellanalita da una matrice:


-

desorbimento di campo

bombardamento con atomi veloci

desorbimento in plasma

elettrospray

ionizzazione laser

49

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

La scelta del sistema di ionizzazione pi adatto dipende da:


-

energia adeguata per lanalisi: se si ha a che fare con specie incognite occorre
provvedere a dei processi di ionizzazione a bassa energia per evitare
frammentazioni. Al contrario si utilizzeranno sistemi ad alta energia per
elevate frammentazioni e per indagare le informazioni strutturali

volatil e polarit:
Introduzione

Ionizzazione

Volatili

GC

Impatto elettronico

Poco polari

GC

Impatto elettronico
Ionizzazione chimica

GC/LC

Polari

Impatto elettronico
Ionizzazione chimica
ESI
APCI

LC

Molto polari

6.4.1

ESI/APCI

Ionizzazione elettronica (EI)

La ionizzazione elettronica (EI) utilizzata per sostanze volatili a basso peso


molecolare, danno frammentazione estesa e hanno come agenti ionizzanti elettroni a
70 eV. Le condizioni di vuoto necessarie sono di circa 10-7 torr.
Un fascio di elettroni viene generato da un filamento riscaldato di W o Re ed
accelerato da una d.d.p. di circa 70 V. Il fascio di elettroni urta il fascio di molecole
del campione a 90.
I prodotti primari della collisione sono ioni positivi a carica unitaria (ioni molecolari,
M+), che si formano per repulsione elettrostatica:
M + e- M+ + 2eIl processo di ionizzazione ha unefficienza molto bassa (circa 1/10 6).

50

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

Gli ioni generati vengono attirati con una piccola d.d.p. verso la zona di
accelerazione, dove sono soggetti ad un potenziale di 103-104 V per raggiungere le
loro velocit finali prima di entrare nellanalizzatore di massa.
Il radical catione M+, essendo particolarmente instabile, tender a dare
frammentazione. In particolare, tanto pi alta lenergia di ionizzazione, tanto pi
sar importante la frammentazione (figura 34) che ha un massimo intorno ai 70 eV.

Figura 35 - Correlazione tra frammentazione ed energia di ionizzazione

Per comprendere come e se una molecola si frammenta occorre risalire alle curve di
energia potenziale. Analizziamo di seguito tre casi:
CASO 1 (figura 36)
Quando la curva di energia potenziale dello stato eccitato al di sotto del potenziale
di ionizzazione, dato dalla retta [X]+ + Y, non avviene alcuna frammentazione. Si
mantiene lo ione molecolare. Questa caratteristica tipica dei composti aromatici.

51

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

Figura 36 - Non avviene frammentazione.

CASO 2 (figura 37)


Quando lenergia potenziale dello stato eccitato sempre superiore al potenziale di
ionizzazione, si verifica una frammentazione totale. Non si mantiene lo ione
molecolare. Questa caratteristica tipica di composti idrocarburici e alcoli.

Figura 37 - Avviene la frammentazione

52

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

CASO 3 (figura 38)


Il caso 3 il caso ibrido, quello in cui solo una parte della curva relativa allo stato
eccitato superiore allenergia di ionizzazione. In questa circostanza la
frammentazione non sar totale e si conserver lo ione molecolare. Questa
caratteristica tipica di strutture aromatiche con alogeni o buoni gruppi uscenti.

Figura 38 - La frammentazione parziale e si conserva lo ione molecolare.

Tutti i processi di rottura dei legami sono estremamente veloci, cos come molto
rapido il contatto tra gli elettroni e la specie da ionizzare. I nuclei pertanto non
risentono di questi eventi. I prodotti di frammentazione sono formati in una serie di
reazioni unimolecolari competitive e consecutive.
In ionizzazione elettronica la formazione dei frammenti pu avvenire direttamente
oppure attraverso una trasposizione della molecola che porta alla formazione di un
complesso che successivamente si dissocer.
In EI si possono formare anche ioni bicarica nel caso in cui si superi lenergia di
seconda ionizzazione. A bassa risoluzione possibile confondersi: un picco a 45
relativo ad un rapporto m/z di 45/1 oppure 90/2? Per superare questo quesito si va a

53

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

cercare il segnale relativo al 13C: nel caso del monocarica (m = 45), il picco sar a
46 (dato da 46/1), mentre nellaltro caso sar a 45,5 (dato da 91/2).
In impatto elettronico possibile formare ioni negativi, anche se questo processo
meno efficiente. Per farlo sufficiente cambiare i potenziali in modo che lanalita
catturi elettroni. I processi possono essere di tre tipi:
1. cattura di risonanza: AB + e- AB2. cattura dissociativa: AB + e- A- + B
3. produzione di coppie ioniche: AB + e- A- + B+ + e-

6.4.2

Ionizzazione chimica (CI)

Le molecole del campione vengono ionizzate per collisione con gli ioni di un gas
reagente, ionizzato per impatto elettronico. E possibile generare anche ioni negativi.
Si impiega la stessa strumentazione della EI.
Nella zona di ionizzazione il gas reagente viene mantenuto alla pressione di circa 1
torr. Il gas impiegato pi comunemente il CH4.
Si tratta di una tecnica soft, nel senso che si ha poca frammentazione e per questo
motivo in quasi tutti i casi si conserva il picco molecolare che pu avere massa M+1,
M+2, M-1 o ance molto superiore. Non si lavora in condizioni di alto vuoto (circa 1
torr).
Come anticipato il gas reagente pi utilizzato il CH4. Esso impatter con gli
elettroni e former CH4+.
CH4 + e- CH4+ + 2eQuesto radical catione si frammenter per dare CH3+ + H, ma potr anche collidere
e reagire con le altre molecole di CH4 presenti in grande quantit dando origine a
diversi cationi che attaccheranno poi i nostri analiti come CH5+. Il CH3+ pu
anchesso reagire con altre molecole di metano e dare C2H5+.
La reazione che avviene tra analita e, ad esempio, CH5+ :

54

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

M + CH5+ MH+ + CH4


Questa reazione di ionizzazione pu essere vista come reazione acido-base. In effetti
CH5+ un acido fortissimo e CH4, base coniugata, una base debolissima.
Lequilibrio della seguente reazione sar quindi completamente spostato a destra
andando a determinare la formazione di tanto MH+ in quanto lacido forte tende a
cedere il suo ione H+:
CH5+ + M 1 MH+ + CH4
Un altro gas reagente piuttosto utilizzato il ter-butano che in seguito ad un impatto
elettronico d un carbocatione terziario piuttosto stabile. Ad ogni modo il gas che d
minori problemi di frammentazione lammoniaca, NH3. La mancanza, o quasi, di
frammentazione, imputabile al fatto che lNH3 una base forte rispetto allacqua e
lacido coniugato NH4+ molto debole. La reazione seguente sar quindi spostata
verso sinistra.
NH4+ + M 2 MH+ + NH3
Lammoniaca come gas reagente presenta essenzialmente due svantaggi: il primo
legato alla sua tossicit, il secondo al fatto che pu formare addotti: [M NH4]+
Per valutare se una reazione avviene oppure no dal punto di vista termodinamico,
occorre valutare il H di reazione associato alla reazione di perdita di un protone da
parte, per esempio, di CH5+ e il H di reazione associato alla reazione di acquisto di
un protone da parte di una generica specie (es. alcol).

La ionizzazione chimica, sebbene sia molto utilizzata, presenta un inconveniente


piuttosto rilevante: dal momento che non si lavora mai nelle medesime condizioni si
1

La freccia singola dovuta al fatto che non so come si facciano le frecce in equilibrio, ma questa
reazione una reazione allequilibrio spostata (molto) a destra
2
La freccia singola dovuta al fatto che non so come si facciano le frecce in equilibrio, ma questa
reazione una reazione allequilibrio spostata a sinistra

55

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

ottengono degli spettri scarsamente riproducibili e questo fa s che vi sia una minore
disponibilit di banche dati.
Le reazioni che avvengono in CI sono essenzialmente quattro, ma solo la prima e la
terza sono le pi comuni:
1. trasferimento di protone
2. trasferimento di carica
3. addizione elettrofila
4. estrazione di anione
Concludiamo questa parte legata
alla ionizzazione chimica, parlando
del destino degli elettroni che si
liberano dopo la collisione con il gas
reagente (vd. reazione allinizio del
paragrafo che coinvolge CH4 + e-).
Essi diventano via via pi lenti e
potrebbero essere catturati da quegli analiti che contengono gruppi elettron-affini: un
ottimo modo per analisi di SCAN negativi. Per favorire la ionizzazione negativa si
abbassa la temperatura fino a circa 150C; essa non deve essere eccessivamente
bassa in quanto occorre mantenere lanalita in fase gas. I composti con i quali si pu
lavorare sono quindi quelli che presentano gruppi aromatici, chinonici, alogeno
derivati, nitro e ciano-derivati, acidi ed esteri.
Di seguito una ricapitolazione delle due tecniche EI e CI:
EI

CI

Adatta per molecole con PM < 103 Da


Molecole volatili, moderatamente polari,

Molecole moderatamente polari, polari

polari
Spettri riproducibili adatti per confronti con

Spettri non riproducibili

database
Richiesto vuoto spinto (10-7 torr)

Vuoto non spinto: richiesto 1 torr

Frammentazione hard

Frammentazione soft

56

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

Informazioni strutturali estese

Poche informazioni strutturali

Picco molecolare pu non essere presente

Picco molecolare sempre presente

Se presente picco molecolare a M+

Se presente il picco molecolare pu trovarsi


a M+1, M-1 (reaz. di trasferimento di idruro
da analita a gas reagente), M+18 (addotto
con ione ammonio), M+23 (addotto con
sodio)

Analisi ioni negativi possibile

6.4.3

Analisi ioni negativi possibile

Ionizzazione di campo (Field ionization)

La ionizzazione di campo avviene quando un atomo o molecola in fase gassosa


sottoposta ad un campo elettrico dellordine di 10 8 V/cm. La rimozione di un
elettrone da una molecola tramite un elevato campo elettrico basata sulleffetto
tunnel quantomeccanico, ne consegue uno ione positivo con piccolissima energia
interna nella forma di eccitazione elettronica o vibrazionale; esso viene di solito
rivelato come ione molecolare stabile.
Fattore critico e differenziante questa sorgente dalla EI il disegno ed il materiale
dellelemento ionizzante. Questo consiste in una punta metallica aguzza o affilata
come anodo, mentre il catodo la fenditura di uscita della camera di ionizzazione.
Un potenziale di 5-20 kV applicato tra questi elementi molto ravvicinati
(nellordine dei millimetri).
I limiti di questa tecnica sono costruttivi: facilit di scariche, fragilit dellelemento
ionizzante, sensibilit di almeno un ordine di grandezza inferiore allEI e dipendente
dal tipo di composto.
In questa tecnica la sostanza deve essere allo stato gassoso.
La formazione degli ioni avviene su una vasta zona , per questo la focalizzazione
pi limitata. La sensibilit rispetto a un impatto elettronico minore. Il vantaggio di
questa tecnica per legato al fatto che la forza della ionizzazione, pi debole
rispetto alla EI, modulabile. Ottima per idrocarburi.

57

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

Figura 39 - Field ionisation

6.4.4

Desorption Chemical Ionization (DCI)

Abbiamo visto precedentemente che la ionizzazione in fase gassosa avveniva per


molecole volatili, termostabili e a basso PM. Negli altri casi si prediligono i metodi
di ionizzazione per desorbimento che permettono di analizzare delicate molecole di
interesse biochimico con pesi molecolari superiori a 100.000 Da. La forza di queste
tecniche quella di produrre in un solo passaggio ioni gassosi a partire da molecole
immerse in una matrice. Il primo che andiamo a studiare il DCI che per certi versi
leccezione che conferma la regola.

In questo caso infatti si assiste ad un

desorbimento dellanalita e sua volatilizzazione in seguito al contatto con un


filamento di Re o W riscaldato a cui segue una ionizzazione CI.
6.4.5

Desorbimento di campo (Field Desorption)

Nel metodo a desorbimento di campo, il campione viene deposto su un emettitore di


metallo sulla cui superficie si trovano microaghi di carbonio. I microaghi attivano la
superficie, che viene mantenuta sotto una tensione di accelerazione e funge da anodo.
Gradienti di tensione molto elevati sulla punta degli aghi rimuovo un elettrone dal
campione e il catione risultante viene espulso dallemettitore. Gli ioni generati

58

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

possiedono un piccolo eccesso di energia e pertanto si verifica una frammentazione


minima; lo ione molecolare , in genere, lunico ione significativamente visibile.
Il desorbimento di campo stato offuscato dallavvento del FAB (vedi in seguito).
Malgrado il fatto che il metodo sia spesso pi utile del FAB per composti non polari
e che non venga penalizzato dallalto livello di ioni di sottofondo tipico dei metodi di
desorbimento assistiti da matrice, il metodo FD non si diffuso quanto il FAB,
probabilmente per problemi di scelte industriali che hanno fortemente sostenuto in
FAB.
6.4.6

MALDI

In questo genere di analisi lanalita (solido o liquido e generalmente con un elevato


PM) intrappolato da una matrice cristallina la quale viene colpita da un laser. Si
assiste quindi ad una sublimazione della matrice e si libera il campione in forma
ionizzata. La matrice, in largo eccesso rispetto al campione,

ha il compito di

assorbire lenergia del laser in modo tale che essa non venga assorbita dallanalita,
eventualit che determinerebbe una frammentazione dello stesso. Lenergia viene
ceduta allanalita di interesse solo in un secondo momento e in modo controllato.

Figura 40 - Funzionamento del MALDI

I laser utilizzati sono diversi e hanno differenti energie:


-

laser a N2

M-YAG

IR

59

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

Dal momento che si una sorgente monoraggio come il laser, si possono distaccare
ioni anche da specifiche parti del campione. In tal modo possibile:
-

fare pi analisi sullo stesso campione

indagare precise porzioni del campione

Ad oggi le matrici che si usano sono solide, ma sono allo studio diverse alternative
liquide (figura 41). Ognuna di esse presenta delle applicazioni specifiche con diversa
selettivit. Per esempio il triidrossiacetofenone usato per la determinazione di
oligonucleotidi e peptidi, lacido 5-clorosalicilico per i polimeri non idrosolubili ecc

Le caratteristiche principali di una matrice, il cui ruolo ,


come gi anticipato, quello di minimizzare gli effetti del
laser e aumentare lefficacia di trasferimento energetico dal
laser allanalita, sono:

Figura 41 - Nuove matrici


per MALDI

elevata assorbivit alla lunghezza donda del laser

massa molare abbastanza bassa da sublimare

facilmente
-

bassa reattivit

stabilit al vuoto

I processi di frammentazione, non ancora del tutto noti, si possono classificare in tre
categorie:
-

frammentazione

immediata:

avviene

durante

il

processo

di

desorbimento/ionizzazione
-

frammentazione

veloce: avviene

dopo

la

ionizzazione

mai

prima

dellaccelerazione degli ioni verso lanalizzatore di massa


-

frammentazione per decadimento post-sorgente: avviene dopo laccelerazione


degli ioni (ad esempio nel TOF, analizzatore che si accoppia perfettamente).
In questo caso i frammenti non possono essere risolti dallo ione molecolare.

Lo spettro che ne risulter avr valori molto grandi in termini di m/z, pertanto
occorrer avere risoluzioni molto elevate.

60

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

Questa tecnica non potr mai essere utilizzata per analisi quantitative in quanto
alcune specie potrebbero non ionizzare (ionizzazione competitiva).
Concludiamo dicendo quali sono i vantaggi e gli svantaggi della tecnica MALDI:
I vantaggi sono:
-

poca sensibilit alle contaminazioni. Il campione richiede minimi passaggi di


purificazione

si possono analizzare velocemente miscele complesse

Gli svantaggi sono:


-

la ionizzazione un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di


pi analiti pu dare luogo ad interferenze

lanalisi quantitativa limitata dalla ridotta omogeneit del campione. Questo


fatto ha spinto la ricerca verso lo studio di nuove matrici miscelate con
ammine in soluzione metabolica. In tal modo si favorisce la formazione di
una coppia ionica tra ammine e matrice per poi evaporare il metanolo.

Lanalizzatore associato al MALDI il TOF, a tempo di volo, che lunico a non


avere un limite superiore di massa e offre anche delle ottime risoluzioni.
6.4.7

Fast Ion Bombarder (FAB)


Il bombardamento con atomi veloci (FAB)
impiega atomi di xeno o argon ad alta energia
(6-10 keV) per bombardare campioni disciolti in
un liquido avente bassa tensione di vapore (per
esempio, glicerolo). La matrice protegge il
campione da un eccessivo danno da radiazione.
Un metodo affine, la spettrometria liquidomassa di ioni secondari (LSIMS) impiega ioni
cesio a pi elevato contenuto di energia (10-30
keV).
Figura 42 - Meccanismo di funzionamento del
FAB

61

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

In entrambi i metodi si formano ioni positivi (derivanti dallatto di un catione


[M+1]+ o [M+23, Na]+) e ioni negativi (derivanti da deprotonazione [M-1]-);
entrambi i tipi di ioni possiedono generalmente una carica unitaria e,
compatibilmente con lo strumento impiegato, la tecnica FAB pu essere utilizzata in
modalit alta risoluzione. La tecnica FAB viene impiegata principalmente con
molecole non volatili di grandi dimensioni, soprattutto per determinare il peso
molecolare. Per la maggior parte delle classi di composti il resto dello spettro meno
utile, anche perch le regioni a valore di massa inferiore possono comprendere ioni
derivanti dalla matrice stessa. Lanalita desorbito spesso idratato, ma si verifica una
progressiva disidratazione che permette anche di dissipare lenergia residua il che fa
s che la frammentazione sia soft.
In generale gli analiti sono presenti gi carichi in soluzione, mentre se si trovano in
forma neutra si assiste ad un trasferimento di carica da matrice a solvente
Tuttavia, per certe classi di composti formati da subunit costitutive come
polisaccaridi e peptidi, possibile ottenere alcune informazioni strutturali in virt del
fatto che la frammentazione in genere interessa, rispettivamente, i legami glicosidico
e peptidico, fornendo, quindi, un metodo per sequenziale queste classi di composti.
Il limite di massa superiore per la ionizzazione FAB (per la LSIMS) compreso tra
10 e 20 kDa e la tecnica diventa conveniente in realt al di sopra di 6 kDa. La tecnica
FAB viene molto spesso impiegata in strumenti con sezione magnetica a doppia
focalizzazione che possiedono una risoluzione di circa 0.3 m/z sullintero intervallo
spettrale; la tecnica FAB, tuttavia, pu essere impiegata con la maggior parte degli
analizzatori di massa. Il maggior limite di tale tecnica sta nel fatto che lo spettro
presenta sempre un alto livello di ioni provenienti dalla matrice, cosa che da un lato
limita la sensibilit della tecnica, dallaltro pu impedire la rivelazione di importanti
frammenti ionici.
Riassumendo i vantaggi legati a questa tecnica sono:
-

si usa per peptidi e biomolecole

utile se abbinato ad analisi MS/MS, dove si possono ottenere informazioni


strutturali pi ampie

62

Analisi degli inquinanti con laboratorio Sorgenti di ionizzazione

la tecnica interfacciabile sia con la GC che con la LC

Gli svantaggi legati al FAB sono:


-

possibilit di contaminazione da parte della matrice, particolarmente evidente


per quelle molecole a basso peso molecolare (ed per questo che per tali
specie si tende ad evitare lutilizzo del FAB)

alto rumore di fondo

6.4.8

Desorbimento in plasma

La ionizzazione per desorbimento da plasma una tecnica altamente specialistica


utilizzata quasi esclusivamente con analizzatori di massa a tempo di volo. I prodotti
di fissione del californio 252 (252Cf), aventi energie comprese tra 80 e 100 MeV,
vengono impiegati per bombardare e ionizzare il campione. Ogni volta che un atomo
di 252Cf si divide, vengono prodotte due particelle che si muovo in direzioni opposte.
Una delle particelle colpisce un rivelatore a scatto (triggering detector) che d il
segnale di avvio. Laltra particella colpisce la matrice campione che emette alcuni
ioni del campione verso uno spettrometro di massa a tempo di volo (TOF-MS). Gli
ioni del campione vengono rilasciati, molto spesso, come specie protonate da una a
tre volte. Questi ioni possiedono unenergia decisamente bassa, per cui raramente si
osserva una frammentazione utile dal punto di vista strutturale e, nel caso di
polisaccaridi e polipeptidi, non possibile ottenere informazioni sulla sequenza.
Laccuratezza del metodo nella misurazione della massa limitata dallo spettrometro
di massa a tempo di volo. La tecnica utile per composto aventi peso molecolare
almeno fino a 45 kDa.

63

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

CAPITOLO 7
7.0 Laccoppiata Cromatografia/Massa
EI e CI, rispettivamente la ionizzazione per impatto elettronico e la ionizzazione
chimica, sono le interfacce di ionizzazione pi comuni per le GC-MS.
Adesso parliamo invece della strana coppia LC/MS. Si sono presentati fin da subito
dei problemi legati alla compatibilit dei flussi, in particolare il campione che esce
dallHPLC ha un flusso troppo elevato (1 ml/min che in fase vapore si trasforma in 1
l/min) e insostenibile per lo spettrometro di massa. In secondo luogo deve essere
garantita la vaporizzazione di tutto leluato, fatto particolarmente difficile dal
momento che si possono analizzare composti pi o meno volatili. Inoltre la
vaporizzazione coinvolgerebbe anche la matrice e per questo la necessit che la
fase trasferita allanalizzatore di massa sia per lo pi arricchita di analita piuttosto
che di fase eluente.

7.1 Interfacce di ionizzazione LC/MS


Per cercare di ovviare a queste problematiche si utilizzano delle interfacce in cui si
effettuano delle trasformazioni delleluato. Distinguiamo:
-

Interfacce pure: aiutano il campione a diventare gas seguite da un apparato di


ionizzazione, come gi visto:
o Introduzione diretta dei liquidi
o Particle beam
o FAB a flusso continuo

Interfacce con ionizzazione: garantiscono sia la vaporizzazione dellanalita


sia la formazione degli ioni:
o Thermospray
o Elettrospray Ionspray
o Ionizzazione chimica a pressione atmosferica
o Fotoionizzazione a pressione atmosferica

64

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

Affinch lanalita sia vaporizzato occorre che si trovi allinterfaccia tra il sistema LC
e lo spettrometro di massa. Esso si pu presentare o in forma neutra o gi ionizzato.
Se la specie non ancora ionizzata, subir dapprima levaporazione e poi una
ionizzazione, al contrario se lanalita gi carico vi sar un desorbimento
superficiale e la specie gi ionizzata andr direttamente verso lanalizzatore.
7.1.1

Particle beam

Il particle beam uninterfaccia pura che prevede la formazione di un aerosol in una


camera scaldata a temperature intermedie e a pressione atmosferica. Si assiste ad una
desolvatazione parziale della molecola. Gli aerosol vengono successivamente fatti
passare attraverso una fenditura in condizioni di vuoto via via sempre pi spinto. Il
risultato che esse si riducono sempre di pi in dimensioni e il soluto viene
completamente asciugato dal solvente. Le particelle vengono poi introdotte in una
camera di ionizzazione (es. EI) riscaldata e vengono cos trasformate in fase gas e
successivamente ionizzate.
Il particle beam lunico sistema che permette di associare lEI ad un sistema di LC.
Tutti gli altri presentano un sistema di ionizzazione soft.
7.1.2

Thermospray

Nel metodo thermospray una soluzione del campione viene introdotta nello
spettrometro di massa mediante un tubo capillare riscaldato. Il tubo nebulizza ed
evapora parzialmente il solvente producendo una corrente di fini goccioline che
entrano nella sorgente di ioni. Quando il solvente evapora completamente, gli ioni
del campione possono essere analizzati. Questo metodo stato largamente
soppiantato dalla tecnica elettrospray. Frammentazione soft.
7.1.3

FAB

Si addiziona alla fase eluente il glicerolo e segue gli stessi principi gi visti in
precedenza per il FAB associato ad un sistema GC-MS. I flussi bassi rappresentano
un forte svantaggio di questo metodo
7.1.4

MALDI

65

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

Si sta cercando di utilizzare la tecnologia MALDI anche in cromatografia liquida.


Attualmente la strumentazione off-line rispetto allHPLC, la sfida sar dunque
quella di accoppiare il MALDI al sistema di cromatografia liquida.
7.1.5

Introduzione alle interfacce a pressione atmosferica


(API)

Tra queste tecniche citiamo lelettrospray (ESI), una delle tecniche pi utilizzate, la
ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) e la fotoionizzazione a
pressione atmosferica (APPI). Prima di raggiungere lanalizzatore lanalita deve
passare da una condizione di pressione atmosferica ad un alto vuoto e questo viene
realizzato in diversi step collegati gli uni agli altri da strette fenditure. Per
convogliare correttamente gli ioni verso lanalizzatore si usa un gas inerte il quale ha
anche il ruolo di scindere eventuali cluster che si possono formare nelle fenditure.
7.1.6

ESI

La sorgente ionica elettrospray (ESI) opera a pressione atmosferica o quasi, ed per


questo motivo chiamata anche ionizzazione a pressione atmosferica (API). Il
campione in soluzione (in genere un solvente polare e volatile) entra nella sorgente
ionica attraverso un capillare di acciaio inossidabile (l/min) ed circondato da un
flusso coassiale di azoto, detto gas nebulizzante. Lestremit del capillare viene

66

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

mantenuta a un alto potenziale elettrico rispetto a un contro elettrodo. La differenza


di potenziale produce un gradiente di campo fino a 5kV/cm. Quando la soluzione
fuoriesce dal capillare, forma un aerosol di goccioline cariche elettricamente. La
forma che assume lo spray dopo lugello quella di un cono, che prende il nome di
cono di Taylor. La corrente di gas nebulizzatore (normalmente N2) dirige il flusso
verso lo spettrometro di massa e mantiene ristretta lampiezza del cono di Taylor.
Attualmente si tende ad utilizzare unevoluzione della tecnica elettrospray: lo
ionspray che si differenzia da questultima per lutilizzo di un ulteriore gas che
permette di limitare ulteriormente lampiezza del cono di Taylor, permette flussi pi
alti (paragonabili a quelli della LC) e garantisce una maggiore compatibilit con
lacqua.
Le goccioline nellaerosol si riducono di volume man mano che il solvente evapora
concentrando gli ioni del campione carico. Quando la repulsione elettrostatica tra le
specie cariche del campione raggiunge un punto critico (limite di Rayleigh), la
gocciolina subisce la cosiddetta esplosione di Coulomb. Gli ioni si possono
formare secondo due teorie:
1. Meccanismo di carica residuo. Si verifica una serie di scissioni che portano
alla formazione di piccole gocce che trasportano una o pi cariche in eccesso,
ma solamente una molecola di analita. Quando le gocce di solvente
evaporano, le cariche in eccesso presenti si dispongono sui siti dellanalita,
dando origine allo ione pi stabile in fase gas.

Figura 43 - Due modelli di formazione degli ioni

67

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

2. Evaporazione ionica. Avviene una vera e propria evaporazione ionica. La


gocciolina, di dimensioni molto limitate, costituita da molti ioni. Quando la
tensione della goccia risulta troppo elevata vi una vera e propria espulsione
di uno ione monocarica dalla goccia stessa.
La massa elettrospray ha conosciuto unesplosione di attivit a partire dal 1990 circa,
principalmente per composti che possiedono siti recanti una carica multipla. Nel caso
delle proteine, per esempio, spesso si formano ioni a carica multipla. Poich lo
spettrometro di massa misura il rapporto massa su carica (m/z) piuttosto che il valore
della massa, questi ioni a carica multipla vengono registrati da valori di massa
apparente pari a 1/2, 1/3, 1/n delle loro masse reali, dove n il numero di cariche
(z). Proteine di grandi dimensioni possono avere 40 cariche o pi, pertanto molecole
di peso fino a 100 kDa possono essere rivelate nellintervallo di utilizzo di
spettrometri di massa convenzionali a quadrupolo, a trappola ionica o a sezione
magnetica. Lo spettro si presenta come una serie crescente di picchi di massa
corrispondenti a ioni pseudo molecolari che possiedono, in sequenza, un protone in
meno e, quindi una carica in meno.

Figura 44 - Esempio di spettro ESI multicarica

68

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

La determinazione della massa reale dello ione richiede che sia nota la carica. Se si
riescono a identificare due picchi che differiscono per una singola carica, il calcolo si
riduce a una semplice operazione algebrica. Bisogna ricordare che ciascuno ione
della molecola (Ms) ha la forma generale (Ms + zH)z+, dove H la massa di un
protone (1.0079 Da). Nel caso di due ioni che differiscono per ununit di carica
avremo m1 = [Ms + (z+1)H]/(z+1) e m2 = [(Ms+zH)/z]. Risolvendo il sistema di due
equazioni in funzione di z si ottiene:

Un banale programma di computer automatizza il calcolo per ogni picco presente


nello spettro e calcola direttamente il valore della massa.
Molti produttori hanno introdotto sul mercato spettrometri di massa economici
dedicati allelettrospray per due motivi. Primo, il metodo molto efficace, pur
essendo molto semplice da impiegare. Secondo, lanalisi di proteine e di piccoli
peptidi ha acquistato importanza e probabilmente lelettrospray la tecnica di scelta
per lanalisi di queste classi molecolari.
Negli spettri ESI occorre sempre considerare la presenza di ioni in soluzione
acquosa, come ad esempio il sodio. Per questo possibile trovare dei picchi in
corrispondenza di [M+23]+ (addotto con il sodio), [M+18]+ (addotto con lacqua)
ecc Si possono formare addotti anche con HCOO- e CH3COO- nel caso di ESInegativa (usata soprattutto per lanalisi di acidi organici). Il picco molecolare si trova
sempre in corrispondenza di [M+1]+.
Affinch la tecnica funzioni, devono essere gi essere presenti in soluzioni ioni, o
meglio composti ionici: sali, zwitterioni, acidi o basi organici. [Occorre che ci sia
un equilibrio tra la concentrazione dellanalita e la concentrazione dei tamponi
ionici presenti in soluzione per avere una risposta lineare da parte dello strumento.
In particolare si osserva che se la concentrazione dellanalita molto maggiore
rispetto alla concentrazione del tampone, non si ha pi una risposta lineare, mentre
c una risposta lineare quando la concentrazione del tampone minore rispetto a
quella dellanalita. In altre parole la linearit garantita fino ad un certo limite,

69

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

normalmente pari a 10-6 M. La scelta degli ioni deve essere opportuna in quanto
potrebbero dare processi di competizione nella fase di desorbimento. In particolare
devono avere una bassa mobilit in soluzione per facilitare la migrazione
preferenziale dellanalita verso la superficie. ]
Lutilizzo del solvente influisce sulla formazione dello spray. La presenza di acqua
deve essere fortemente limitata in quanto genera delle gocce molto grosse e per
questa ragione pu non essere rimossa completamente e pu generare fastidiose
interferenze.
Gli svantaggi legati alla ionizzazione ESI sono legati al fatto che si applica a classi
limitate di composti e che restituisce limitate informazioni strutturali. I composti
adatti ad una ionizzazione ESI sono: composti organici ionici, composti anfoteri (es.
amminoacidi), composti organici a spiccato carattere acido o basico (es. acidi
carbossilici e ammine), molecole polari contenenti eteroatomi (es. carboidrati, esteri),
proteine, peptidi, oligonucleotidi, composti organometallici ionici.
Per ovviare allinconveniente legato alla scarsit di informazioni risultanti da
unanalisi ESI, possibile associare la

ESI/MS con un sistema ESI/MS/MS

attraverso la tecnica di dissociazione attivata da collisione (CAD). Questa tecnica


in assoluto la tecnica di attivazione pi diffusa in virt della sua semplicit di uso e
del livello di controllo. In generale, la dissociazione procede attraverso due step
discreti. In un primo momento gli ioni di interesse vanno incontro ad un aumento
della loro energia interna a causa dellurto anelastico con le molecole o gli atomi di
un gas inerte e parte della loro energia cinetica viene convertita in energia
vibrazionale. In un secondo step alleccitazione degli ioni fa seguito la loro
dissociazione unimolecolare e quindi la produzione dei frammenti che vengono poi
rivelati fornendo importanti informazioni strutturali sullanalita di interesse.
7.1.7

APCI

La tecnica APCI permette di analizzare campioni pi polari e con una massa pi


elevata. Ad ogni modo esiste un limite superiore per la massa, cosa che la ESI non
ha.

70

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

Il processo di ionizzazione avviene a pressione atmosferica. Primariamente si genera


un aerosol in una camera riscaldata, si assiste allevaporazione del solvente e alla
formazione delle specie neutre in stato gassoso. Successivamente si utilizza una
specie ionizzante per generare gli ioni che saranno inviati allanalizzatore. E una
tecnica non adatta a sostanze termolabili.
Una volta che le specie (M) sono nel loro stato gassoso in forma neutra, da un ago
escono elettroni che reagiscono con laria (formata da N2, O2 e H2O) per formare
ioni primari come N2+, oppure H2O+ che former successivamente ioni reagenti
H3O+.. La reazione sar:
H3O+ + M M-H+ + H2O
E possibile, come nella ESI, formare ioni negativi con lo stesso processo:
O2 + e- O2O2- lo ione primario che produrr OH- e HCO3- (in caso di reazione con CO2) come
ioni reagenti.
Si tratta di una tecnica soft, e quindi d spettri di frammentazione molto puliti.
Le caratteristiche principali dellAPCI sono:
-

sensibilit maggiori con flussi elevati rispetto allESI

sono possibili analisi di analiti con bassa o media polarit

formazione di ioni monocarica

La tabella seguente chiarir le idee riguardo il meccanismo di formazione degli ioni:

71

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

Tabella 2 - Riassunto formazione ioni in APCI

Concludiamo il discorso legato ad ESI e APCI con un grafico particolarmente


interessante che permette di visualizzare le regioni in cui queste sorgenti di
ionizzazione si possono applicare. Si pu osservare (figura) che la tecnica ESI
quella che permette lanalisi di composti in forma ionica senza alcun limite in termini
di peso molecolare. LAPCI copre un range di polarit maggiore rispetto allESI, ma
ha un limite di peso molecolare intorno ai 1000 Da. Infine, il Particle Beam copre la
regione scoperta dalla tecnica ESI ed per questo usato per molecole di medio-bassa
polarit con un elevato peso molecolare (> 1000 Da).

72

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

Un confronto tra ESI e APCI mette in rilievo la variazione di sensibilit della tecnica
in funzione della velocit di flusso. In particolare, allaumentare della velocit di
flusso, diminuisce la sensibilit in ESI, mentre aumenta in APCI.
7.1.8

APPI

Nella tecnica di ionizzazione APPI (Atmospheric Pressur PhotoIonization) il


campione viene nebulizzato con laiuto di un gas ausiliario (aria o azoto) e ionizzato
con una lampada ultravioletta. Le lampade comunemente usate sono quelle ad argon,
a kripton e a xeno. Spesso si aggiunge un dopante (acetone, toluene) al campione,
cio un composto che si ionizza per primo, ionizzando poi lanalita. La reazione di
fotoionizzazione :
M + h M+
La reazione di ionizzazione con un agente dopante (D, toluene o acetone) avviene
secondo questo meccanismo ed necessaria qualora la ionizzazione da sola non in
grado di interessare lanalita:
D + h D* D+
D+ + M D + M+
A questa reazione pu essercene unaltra parallela in cui lagente dopante (D)
reagisce con il solvente (S):
D+ + S SH+
SH+ + M S + MH+
Questo significa che negli spettri di massa in APPI possiamo avere la simultanea
presenza di picchi a M+ e a [M+1]+.
La ionizzazione avviene solo se lenergia di ionizzazione dellanalita minore del
potenziale di ionizzazione della lampada. Nel caso specifico delle tre lampade
disponibili si tende ad utilizzare la lampada di Kr (p.i. = 10.0 eV) che in grado di
ionizzare una grande quantit di specie organiche (dalla trietilammina, p.i. = 7,53 eV
alleptano, p.i. = 9.93 eV), mentre si tende ad escludere la lampada di Xe (p.i. = 8,4

73

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

eV) e la lampada di Ar (p.i. = 11,2 eV) in quanto rispettivamente non riescono a


ionizzare composti organici oppure ionizzano anche comuni solventi come acqua,
acetonitrile e metanolo.

7.1.9

DESI e DART

Le ultime tecniche nate sono la DESI e la DART. Esse cercano di emulare la


MALDI e la FAB senza per la necessit di avere degli step di preparazione del
campione e senza dover utilizzare alcun tipo di matrice, che potrebbe influenzare
fortemente i risultati.
La DESI, sfrutta i principi dellESI per ionizzare direttamente gli analiti e pu essere
utilizzata solo su campioni liquidi. Si depone il campione su una superficie inerte
(isolante) e viene spruzzato un solvente (H2O/CH3OH) caricato elettrostaticamente.
Le particelle cariche e accelerate colpiscono il campione posto sulla lastrina e
provocano il desorbimento delle molecole di analita che vengono direttamente
campionati da uno spettrometro di massa. Il fascio di ioni di solvente pu essere
spostato lungo la lastrina in modo da analizzare porzioni diverse del campione.
Questo pu essere utile, per esempio, se si vuole valutare la variazione di
concentrazione lungo un certo campione.
Si tratta di una tecnica di ionizzazione soft.

Figura 45- Funzionamento della DESI

74

Analisi degli inquinanti con laboratorio Laccoppiata LC/MS

La tecnica DART invece una tecnica di ionizzazione adatta per qualsiasi tipo di
analita sia esso in fase solida, liquida o gassosa e pu essere condotta in condizioni
ambientali.
Funziona con il principio della scarica a bagliore3, la quale colpisce un gas inerte (He
o N2) che successivamente colpisce il campione ionizzandolo. Si tratta di una tecnica
di ionizzazione soft .
La tecnica DESI e DART vedranno un campo di applicazione sempre crescente in
futuro e il loro studio sar fondamentale.

E una tecnica di ionizzazione usata in MS basata sul passaggio di corrente sul campione.

75

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

CAPITOLO 8
8.0 Gli analizzatori di massa
Possiamo classificare i vari tipi di analizzatori di massa in base al loro
funzionamento:

a scansione (settore magnetico, quadrupolo, trappola ionica)

senza scansione (tempo di volo)

oppure:

modo continuo (settore magnetico, quadrupolo)

modo pulsato (tempo di volo)

intrappolamento ionico (trappole quadrupolari, ciclotrone di risonanza a


trasformata di Fourier, orbitrap)

Ovviamente a seconda della tipologia di analizzatore che noi andremo ad utilizzare


avremo una accuratezza e un potere risolvente differenti. Per fare un esempio un FTICR-MS ha unaccuratezza di 0,1-1 ppm e un potere risolvere estremamente alto
(1000000) contro un trappola ionica che ha unaccuratezza di 50-200 ppm e un
potere risolvente di 1000.
Nella tabella seguente riportiamo le informazioni pi dettagliate:
Tabella 3 - Caratteristiche degli analizzatori di massa HR

Tipo

Accuratezza

Potere risolvente

FT-ICR-MS

0,1-1 ppm

1.000.000

Orbitrap

0,5-1 ppm

100.000

Settore magnetico

1-2 ppm

100.000

Tempo di volo

3-5 ppm

10.000

Quadrupolo

3-5 ppm

1.000

Trappola ionica

50-200 ppm

1.000

76

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

8.1 Quadrupolo

Figura 46 - Quadrupolo

Un quadrupolo costituito da una sorgente (ionization source), da delle lenti


focalizzatrici e da 4 elettrodi (idealmente iperbolici). Le barre opposte sono collegate
elettricamente tra loro, una coppia al polo positivo e unaltra al polo negativo; ad
ogni coppia di barre applicato un potenziale variabile in corrente alternata a
radiofrequenza, con uno sfasamento di 180 e un potenziale di corrente continua
(positivo per le barre positive e negativo per quelle negative). Di seguito riportiamo
schematicamente alcune specifiche tecniche:
Massimo valore m/z:

4000

Risoluzione:

3000
I quadrupolo sono strumenti a relativamente
bassa risoluzione sufficiente a risolvere ioni
che differiscono per una unit di massa)

Altre caratteristiche:

Leggero di dimensioni contenute


Facile da accoppiare alla cromatografia
Efficiente trasmissione di ioni
Necessaria

unelevata

precisione

nellallineamento delle barre degli elettrodi

77

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Il principio di funzionamento di un quadrupolo abbastanza semplice. Come


abbiamo anticipato esso costituito da quattro barre collegate elettricamente tra di
loro. Una coppia di barre collegata al polo positivo di un generatore di corrente
continua. Laltra coppia collegata al polo negativo dello stesso generatore. Ad ogni
coppia di barre applicata una corrente alternata a radiofrequenza sfasata di 180.
Uno ione positivo entra nel quadrupolo e sar attratto dalle barre cariche
negativamente. Prima che per questo si schianti contro di esse, viene invertito il
potenziale e lo ione cambier quindi direzione, risuonando allinterno del quadrupolo
stesso. Ad ogni istante solo gli ioni aventi un certo m/z raggiungono il rivelatore, gli
altri cadono sulle barre e si scaricano.

Figura 47 - Schema di funzionamento di un quadrupolo singolo

La figura 49 mostra in che modo sono alternati i campi applicati. Come si vede essi
sono sfasati.
Possiamo infine dire che le traiettorie stabili sono funzione, oltre che di m/z, anche
dellintensit dei potenziali RF (corrente alternata) e DC (continua), della
frequenza del potenziale RF e delle dimensioni del quadrupolo.

78

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Figura 48 - Potenziali applicati al quadrupolo (U corrente continua, V corrente alternata, sfasata di 180
tra le barre positive e quelle negative)

Gli ioni viaggiano lungo lasse z e sono


soggetti

al

campo

elettrico

(detto

quadrupolare) derivante dallapplicazione


di una corrente alternata alle barre del
quadrupolo.
Il potenziale applicato di modulo uguale
(lampiezza la stessa), ma di segno
opposto ed dato da:
Figura 49 - Quadrupolo con le barre iperboliche
ed i potenziai applicati. In alto a sinistra sono
rapresentante le linee ad equale potenziale.

0 = potenziale applicato alle barre


U = potenziale continuo
V = potenziale alternato
= frequenza angolare (=2 dove la frequenza del campo RF)
Prima di discutere matematicamente la traiettoria degli ioni allinterno del
quadrupolo, diamo una descrizione qualitativa del fenomeno.

79

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Prima di procedere con unanalisi quantitativa delle traiettorie, consideriamo in modo


qualitativo leffetto dei potenziali in corrente continua e alternata sulla traiettoria
degli ioni che percorrono il canale tra le barre.
Cominciamo col fissare lattenzione sulla coppia di barre positive disegnate nella
figura precedente a sinistra nel piano xz. In assenza del potenziale in corrente
continua, gli ioni che viaggiano lungo il canale tenderanno a convergere verso il
centro durante il semiciclo positivo del potenziale in corrente alternata, e a divergere
durante il semiciclo negativo. Se durante il semiciclo negativo uno ione colpisce una
barra, la sua carica viene neutralizzata e la molecola risultante sar trasportata via.
Che uno ione positivo colpisca o meno una delle barre dipende dalla velocit di
traslazione dello ione lungo lasse z, dal suo rapporto m/z, dalla frequenza e dal
valore del potenziale in corrente alternata.
Consideriamo ora leffetto di un potenziale positivo in corrente continua sovrapposto
al segnale in corrente alternata. Dalla fisica noto che il momento della quantit di
moto di ioni di uguale energia direttamente proporzionale alla radice quadrata delle
loro masse; dunque pi difficile deviare uno ione pi pesante rispetto ad uno pi
leggero. Se uno ione nel canale pesante o la frequenza del potenziale in corrente
alternata elevata, lo ione non risentir apprezzabilmente del potenziale in corrente
alternata e sar influenzato principalmente dal potenziale in corrente continua,
tenendo a rimanere confinato nello spazio tra le barre. Viceversa, se lo ione leggero
o la frequenza bassa, lo ione collider con la barra e sar eliminato durante
lescursione negativa del potenziale in corrente alternata. In conclusione, come
mostrato nella figura 53a, la coppia di barre positive costituisce un filtro di massa
passa-alto per gli ioni che viaggiano nel piano xz.

80

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Consideriamo ora la coppia di barre mantenute ad un potenziale negativo in corrente


continua (figura precedente a destra): in assenza del potenziale in corrente alternata
tutti gli ioni positivi tenderebbero ad essere trascinati verso le barre, dove verrebbero
eliminati. Tuttavia per gli ioni pi leggeri questo moto pu essere compensato
durante lescursione positiva del potenziale in corrente alternata; come mostrato in
figura 53b, le barre poste nel piano yz, si comportano allora come un filtro di massa
passa-basso.
Affinch uno ione attraversi il quadrupolo fino al rivelatore, necessario che abbia
una traiettoria stabile lungo entrambi i piani xz e yz, ovvero deve essere
sufficientemente pesante da non essere eliminato dal filtro passa-alto nel piano xy e
sufficientemente leggero da non essere rimosso dal filtro passa-basso nel piano yz.
Leffetto totale del quadrupolo, come mostrato in figura 53c, quello di trasmettere
solo gli ioni con un limitato intervallo di m/z; il centro della banda trasmessa pu
essere variato regolando i potenziali in corrente continua ed alternata.

Figura 50 - Quadrupolo come filtro passa alto (a), passa basso (b). L'unione restituisce quelle che sono le
masse che riescono a transitare indenni

81

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Figura 51 - Profilo di potenziale di uno ione positivo collocato al centro delle barre di un quadrupolo

8.1.2 Traiettoria degli ioni. Analisi quantitativa


Le equazioni differenziali che seguono descrivono il comportamento di ioni con
masse differenti allinterno di un quadrupolo e indicano che le oscillazioni di
particelle cariche in questo genere di analizzatore di massa possono essere di
ampiezza finita o di ampiezza crescente in modo esponenziale. Le variabili contenute
in queste equazioni sono il rapporto m/z, il potenziale in corrente continua U, la
frequenza ed il potenziale in corrente alternata (V). La risoluzione di un quadrupolo
dipende dal rapporto tra il potenziale in corrente alternata e continua, ed massima
per un valore leggermente inferiore a 6. La scansione di potenziali di corrente
alternata e continua parte da zero e arriva fino ad un valore massimo aumentando
simulatenamente sia V che U, mantenendo il rapporto circa uguale a 6. La durata di
ogni scansione di pochi millisecondi.
Uno ione che entra in un campo quadrupolare sar soggetto a delle forze lungo le
direzioni x e y, mentre non subir alcuna forza lungo lasse z (mantiene la sua
velocit costante su questo asse). Le forze lungo x e y sono dovute al campo
elettrico:

82

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Operando le opportune sostituzioni ed sapendo che una funzione di 0 si


ottengono le equazioni del moto, note anche come equazioni di Paul.

Le traiettorie degli ioni sono stabili se e solo se valori di x e y non saranno mai
uguali a r0: se cos fosse, significherebbe che lo ione colliderebbe con lelettrodo e si
annichilirebbe. Per conoscere il valore di x e y in funzione del tempo occorre
integrare le equazioni di Paul (che per non faremo).
Il fisico Mathieu, nel 1886, formul la seguente equazione, stranamente nota come
equazione di Mathieu, per descrivere la propagazione delle onde nelle membrane:

dove il termine u comprende sia x sia y. Possiamo ricondurre le equazioni di Paul


allequazione di Mathieu operando un semplice cambio di variabili. Definiamo
come:

Sostituito nelle equazioni di Paul e con qualche artifizio matematico, otteniamo:

83

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

I cambi di segni sono dovuti al fatto che il potenziale lungo x ha segno opposto di
quello lungo y.
Non si proceder allintegrazione delle precedenti equazioni, sufficiente tenere a
mente che esse esprimono una relazione tra le coordinate dello ione e il tempo. Se,
come abbiamo anticipato, sia x che y mantengono un valore inferiore a r 0, lo ione
risuoner allinterno del quadrupolo senza annichilirsi sugli elettrodi dello stesso.
Eventualit che potrebbe verificarsi qualora una delle due coordinate assuma un
valore pari a r0. In tale circostanza lo ione non sar rivelato.
Nella figura seguente sono mostrate le traiettorie stabili e quelle instabili:

Figura 52 - Traiettorie stabili ed instabili

La natura del moto degli ioni in un campo quadrupolare non dipende dalle
condizioni iniziali, ma dai valori di a e di q.

84

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Per un quadrupolo, r0 costante, cos come lo . Le variabili sono U e V. E


possibile esprimere la posizione x e y di uno ione in funzione di U e V ed quindi
anche possibile stabilire quali sono i valori di U e V per un dato ione con un certo
m/z necessari affinch n x n y siano uguali a r0. La figura seguente riporta un
diagramma au vs qu in cui sono messe in evidenza le aree tali per cui n x n y sono
uguali a r0 (i valori di a e q sono stati ottenuti grazie alle precedenti equazioni che
definivano a e q e grazie ai valori di U e V per i quali n x e n y fossero uguali a r0):

Figura 53 - Le aree di stabilit per uno ione lungo x o y (sopra) e lungo x e y (sotto); u rappresenta sia x sia
y. Le quattro aree di stabilit sono marcate dalle lettere A, B, C, D. L'area A quella usata comunemente
negli spettrometri di massa.

La Figura precedente permette quindi di vedere, come tra laltro sottolinea la


didascalia, quali sono le aree stabili lungo x e quali lungo y al variare dei parametri a
e q. La simmetria rispetto allasse q dovuta al fatto che i potenziali lungo x hanno
segno opposto rispetto a quelli lungo y. Nella figura centrale i due profili di stabilit
sono stati uniti e le aree di sovrapposizione sono effettivamente quelle in cui gli ioni
possiedono delle traiettorie stabili. Pi tardi analizzeremo meglio larea evidenziata
nella figura in basso a destra.
In un diagramma U vs V, definiti riarrangiando le espressioni a u e qu:

85

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

si pu notare che allaumentare del rapporto m/z le aree di stabilit sono


rappresentate da triangoli di area via via crescente, in maniera proporzionale. In
particolare nel grafico seguente si rappresentata larea A vista in precedenza su un
diagramma a vs q in un diagramma U vs V. In evidenza i triangoli crescenti
allaumentare della massa.

Figura 54 - Le aree di stabilit in funzione di U e V per ioni con masse differenti (m1<m2<m3)

Ogni triangolo rappresenta, come ormai dovrebbe essere acquisito, unarea di


stabilit (= traiettorie che permettono agli elettroni di non annichilirsi lungo le barre
del quadrupolo). La retta rappresentata nella figura quella della scansione effettuata
mantenendo il rapporto U/V costante. Si vede che questa retta incrocia il triangolo
m1, poi m2 ed infine m3 permettendo la loro identificazione. Tanto pi elevata la
pendenza (a patto che intersechi sempre le aree di stabilit), migliore sar la
risoluzione perch minore sar il percorso che la retta compier allinterno del
triangolo, quindi minore lintervallo di masse che saranno selezionate. Generalmente
il rapporto scelto 2U/V = a/q.

86

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Figura 55 - Si noti che maggiore la pendenza, migliore la risoluzione.

Figura 56 - Ulteriore esempio di come la pendenza della retta influenzi la risoluzione

Ad ogni modo, per quanto si cerchi di rendere la retta sempre pi pendente, lanalisi
con il quadrupolo non riuscir mai ad essere unanalisi ad alta risoluzione in quanto
riuscir al massimo a separare due picchi con una unit di massa di differenza. Sono
pertanto strumenti a bassa risoluzione.

Possiamo concludere la nostra carrellata relativa agli analizzatori quadrupolari


ricapitolando le caratteristiche base e cio che:

87

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

lavorano a risoluzione costante. Ioni con m/z 100 e 101 hanno la stessa
separazione di ioni 500 e 501.

ha una discreta risoluzione, ma lo svantaggio di avere un range di masse


limitato (3000-6000 Da)

un intero spettro di massa (10-800 m/z) pu essere acquisito in 1 secondo.

Rispetto allanalizzatore magnetico, il quadrupolo ha una risoluzione pi bassa


(<1000), ma tempi di scansione pi bassi ed un costo minore.
Il quadrupolo non dipende dallenergia cinetica degli ioni che provengono dalla
sorgente. Gli unici requisiti sono che:
1) il tempo di percorrenza dello ione entro le barre sia minore rispetto al tempo
necessario per passare da un m/z al successivo
2) lo ione deve comunque rimanere sufficientemente a lungo entro le barre del
quadrupolo affinch riesca ad annichilirsi nel caso in cui abbia una m/z non
conforme a quella che dovrebbe essere selezionata.

88

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

8.1.3 Triplo quadrupolo

Uno dei problemi del singolo quadrupolo era quello della non selettivit. Lostacolo
superato grazie al triplo quadrupolo (QqQ) che permette analisi MS/MS risolte
nello spazio. Presenta unelevata specificit e un ridotto rumore.

Figura 57 Schema di un QqQ

Il primo quadrupolo effettua la selezione degli ioni aventi un opportuno m/z,


dopodich si ha una camera di collisione (Collision Induced Dissociation, CID) ad
elio, ed infine il terzo quadrupolo funge da analizzatore vero e proprio.
In altre parole possiamo dire che, in questa configurazione, il primo ed il terzo
quadrupolo agiscono da filtri di massa, mentre il quadrupolo centrale, (con elio),
agisce come cella di collisione.
Le modalit di scansione possono essere quattro:
1) Scansione dello ione prodotto

89

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Il

primo quadrupolo seleziona uno ione di rapporto m/z fissato, dopo la

frammentazione il terzo quadrupolo effettua una scansione su un determinato range


di massa. In questo modo possibile dallanalisi dei frammenti avere informazioni
sullidentit di una molecola.

Pertanto, i campi del primo quadrupolo rimangono fissi, cos da analizzare soltanto
uno ione con un dato rapporto m/z, nella cella di collisione gli ioni selezionati
collidono con argon o elio a 10-2 mbar e danno dei sottoprodotti An+. A questo punto
gli ioni cos prodotti vengono inviati allultimo quadrupolo dove avviene la
scansione vera e propria.
2) Scansione dello ione precursore

In questo caso il terzo quadrupolo che sintonizzato permanentemente su un dato


m/z, mentre il primo quadrupolo lavora in scansione su un range di massa. Questa
modalit permette di individuare classi di molecole strutturalmente simili. La tecnica
risulta particolarmente utile per matrici sporche e per identificare una classe specifica
da un frammento caratteristico.

90

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Ad esempio posso selezionare m/z = 127, tipica delle molecole iodate, oppure m/z =
77 tipico dei fenili.
3) Scansione di perdita neutra

Entrambi i quadrupoli lavorano in scansione, ma tra il primo ed il terzo quadrupolo


mantenuta una differenza prefissata di m/z, in altre parole mentre il primo
quadrupolo sintonizzato su un determinato m/z il terzo si trova a (m/z x), ed x
mantenuto costante durante la scansione. possibile cos individuare facilmente
classi di molecole che hanno in comune una parte della struttura.
4) Monitoraggio di reazione selezionata

Una ulteriore modalit, single ion monitoring (SIM) viene utilizzata per lanalisi
quantitativa nei sistemi accoppiati con la cromatografia liquida o la gas
cromatografia. In questo caso lidentit della molecola nota a priori ed il primo
quadrupolo fissato su di un valore determinato di m/z, mentre il terzo su quello di
un frammento. Questa modalit permette di aumentare la specificit del sistema di
rivelazione. Nel caso venga selezionato pi di un frammento si parla di multiple
reaction monitoring (MRM).

91

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

8.2

Trappola ionica

Figura 58 Trappola ionica

La trappola ionica viene a volte considerata una variante del quadrupolo, poich
laspetto e il funzionamento dei due metodi simile. La trappola ionica, tuttavia,
potenzialmente molto pi versatile e possiede senza dubbio un maggiore potenziale
di sviluppo. Un tempo aveva una cattiva reputazione perch le primissime versioni
fornivano risultati addirittura inferiori rispetto ai quadrupoli. Tali risultati erano
spesso dipendenti dalla concentrazione; campioni piuttosto concentrati solitamente
producevano diversi picchi con massa pari a [ione+1], rendendo lo spettro cos
ottenuto inutilizzabile per una ricerca negli archivi di spettri EI standard. Questi
problemi sono stati superati e gli spettri EI ottenuti con una trappola ionica possono
ora essere impiegati nelle ricerche con gli archivi commerciali. Inoltre la trappola
ionica pi sensibile del quadrupolo e viene normalmente configurata per condurre
esperimenti tandem senza bisogno di unulteriore strumentazione.
In un certo senso, la denominazione trappola ionica appropriata perch, a
differenza del quadrupolo che agisce soltanto come filtro di massa, lo spettrometro in
esame pu intrappolare gli ioni per un periodo di tempo relativamente pi lungo, con
importanti conseguenze. Lutilizzo pi immediato degli ioni intrappolati consiste
nellinviarli, in sequenza, verso un rivelatore, producendo uno spettro di massa

92

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

convenzionale. Prima di descrivere brevemente gli altri impieghi degli ioni


intrappolati, sar utile dare uno sguardo pi da vicino alla trappola ionica stessa.
Tale apparato consiste,
generalmente,

di

tre

elettrodi: un elettrodo ad
anello con una superficie
interna iperbolica, e due
elettrodi a calotta alle due
estremit. Lelettrodo ad
anello funziona con un
Figura 59 - Schema trappola ionica

campo a radiofrequenza
sinusoidale (RF, vale a

dire corrente alternata con frequenza tra i 10 MHz e i 300 GHz), mentre gli elettrodi
a calotta o sono collegati a terra (U=0) oppure sono sottoposti a corrente continua.
Prima

dellingresso

ionica

gli

ioni

nella

trappola

provenienti

dalla

sorgente vengono focalizzati da uno o


pi ottapoli. Lingresso degli ioni nella
trappola non avviene continuamente:
opportune

le

lenti

elettrostatiche

operano come un cancello per gli


ioni, quando il loro potenziale diventa
negativo (se gli ioni sono positivi) il

Figura 60 - Traiettorie degli ioni all'interno della


trappola

cancello si apre, facendoli entrare. La


matematica che descrive il moto degli ioni allinterno della trappola fornita
dallequazione di Mathieu (i dettagli saranno discussi in seguito). Qualitativamente
possiamo dire ad un dato potenziale corrente alternata in radiofrequenza si generano
delle superfici di potenziale sulle quali gli ioni si muovo, restando intrappolati nello
spazio compreso fra i tre elettrodi, senza toccarne alcuno. Utilizzando un gas come
lHe (moderating gas, 10 -5 torr) possibile limitare le traiettorie degli ioni allinterno

93

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

della trappola e prevenire la perdita di ioni causata da eventuali collisioni. Quando


una traiettoria di uno ione diviene instabile, esso esce dalla trappola e viene rivelato.

Esistono tre modi fondamentali secondo i quali la trappola ionica pu funzionare.


Primo, quando la trappola funziona con una tensione costante RF applicata
allelettrodo ad anello. Cos verranno intrappolati tutti gli ioni al di sopra di un certo
valore di soglia del rapporto m/z. Aumentando la tensione RF, il valore di soglia m/z
viene incrementato in modo controllato e gli ioni vengono espulsi in sequenza e
rivelati. Il risultato il classico spettro di massa e questa procedura viene chiamata a
instabilit massa-selettiva. Il potenziale massimo RF che pu essere applicato tra
gli elettrodi limita lestremo superiore dellintervallo di massa per questa modalit.
Gli ioni di massa compresa oltre tale limite superiore vengono rimossi dopo che la
tensione RF viene riportata a zero.
La seconda modalit di funzionamento utilizza anche una corrente continua tra le
calotte; il risultato generale che esistono per gli ioni sia un valore di soglia m/z
inferiore, sia un valore superiore. Le potenzialit sperimentali in questa modalit di
funzionamento sono enormi: possibile selezionare persino una singola massa
ionica. Il controllo ionico selettivo unimportante applicazione di questa modalit
di utilizzo. Non esiste limite pratico al numero di masse che possono essere
selezionate.

94

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

La terza modalit di funzionamento simile alla seconda, con laggiunta di un


campo oscillante ausiliario tra gli elettrodi a calotta, in modo da incrementare
selettivamente lenergia cinetica di uno ione in particolare. Con un campo ausiliario
di piccola ampiezza gli ioni selezionati acquistano energia cinetica lentamente e,
durante

questo

periodo,

in

genere

subiscono

collisioni

che

producono

frammentazione; il risultato pu essere unefficienza MS-MS prossimo al 100%. Se


si considera la sensibilit della trappola ionica congiuntamente allefficienza MS-MS
tandem vicina al 100%, limpiego della trappola ionica per esperimenti di massa
tandem supera di gran lunga il cosiddetto triplo quadrupolo (vedi oltre).
Un altro modo di utilizzare questo incremento di energia cinetica quello di
respingere selettivamente gli ioni indesiderati nella trappola ionica. Questi
potrebbero essere ioni derivanti dal solvente o dalla matrice negli esperimenti FAB o
LSIMS. Un campo ad alta tensione a frequenza constante durante il periodo di
ionizzazione respinger selettivamente un singolo ione. In questo modo possono
essere selezionati anche ioni multipli.

8.2.1Traiettoria degli ioni. Analisi quantitativa


La trattazione quantitativa simile a quella gi vista per il quadrupolo, con lunica
eccezione che in questa circostanza non andiamo a studiare un moto in due
dimensioni, bens in tre. Fortunatamente possibile ridurre il tutto alle coordinate z e
r, considerando la simmetria cilindrica del sistema in esame tale per cui: x 2+y2 = r2.

Figura 61 - Schematizzazione di una trappola ionica tridimensionale

Le equazioni che descrivono il moto allinterno di una trappola ionica sono molto
simili a quelle viste in precedenza per il quadrupolo e possono per questo essere
ricondotte alla forma dellequazione di Mathieu con le opportune sostituzioni:

95

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

dove u sta sia per z che per r (le due nuove coordinate per questo tipo di sistema) e:

Affinch la traiettoria sia stabile, occorre che non raggiunga mai i valori di z 0 o r0.
Questa condizione si verifica quando si integra lequazione di Mathieu sfruttando il
metodo di Floquet e Fourier che richiede lintroduzione della funzione e(+i). Le
soluzioni reali indicano traiettorie instabili, mentre soltanto le soluzioni immaginarie
corrispondono a traiettorie stabili. Questo significa che i parametri e u
dellequazione di Mathieu devono valere rispettivamente 0 ed essere compresi tra 0 e
1.

Figura 62 - Sinistra: un esempio di traiettoria stabile che richiede contemporaneamente che =0 e 0<<1.
A destra un esempio di traiettoria instabile che pu corrispondere all'espulsione dello ione dalla trappola
(50%) verso il detector oppure l'espulsione nella direzione opposta.

Il parametro u pu essere calcolato a partire dai parametri q u e au dellequazione di


Mathieu e il suo valore pu essere approssimato a:

Come detto in precedenza il valore di deve essere compreso tra 0 e 1 (e =0)


affinch la traiettoria sia stabile. Nella figura seguente vengono mostrate le isolinee
=1 (linea piena) e =0 (linea tratteggiata) in un diagramma a vs q per le direzioni z
96

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

e r. Larea compresa tra queste linee rappresenta quei valori di a e q per i quali vi
una traiettoria stabile.

Figura 63 - Diagramma di stabilit lungo r e lungo z. Sono tracciate le isolinee per =0 (piene) e =1
(tratteggiate). L'area compresa tra queste due curve descrive le traiettorie stabili definite dalle coppie a e
q.

Analogamente alla discussione quantitativa del quadrupolo, anche in questo caso


possiamo sovrapporre i due grafici e vedere in quali punti le curve si sovrappongo. Si
allargata larea di stabilit maggiormente usata nelle trappole ioniche commerciali.

Figura 64 - Sovrapposizione dei due grafici precedenti

La raffigurazione ingrandita dellarea di stabilit quella della figura seguente che


mostra tutte le isolinee da =0 a =1.

97

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Queste aree possono anche essere mostrate in un diagramma in funzione di U e V. Le


aree in cui gli ioni sono stabili sono quelle in cui le traiettorie non superano la
dimensione della trappola (z0 ed r0).

8.2.1.2 Iniezione o produzione di ioni nella trappola


Sebbene esistano alcuni strumenti che presentano una sorgente di ionizzazione
interna alla trappola ionica, la maggior parte ne presenta una esterna come mostrato
nella figura seguente:

98

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Figura 65 - Esempio di analizzatore di massa a trappola ionica

Gli ioni prodotti dalla sorgente sono focalizzati verso due ottapoli collegati ad
altrettante pompe da vuoto (ricorda che invece la sorgente di ionizzazione si trova a
pressione ambientale). Da notare, dopo gli ottapoli, la presenza di un cancello
ionico che limita il numero di ioni che entrano nella trappola ionica. In effetti, un
numero eccessivo di ioni causa dei problemi relativi alla risoluzione, un numero
troppo basso di ioni causa dei problemi legati alla scarsa sensibilit. Sul cancello
dapprima applicato un potenziale negativo in modo tale da garantire laccesso agli
ioni, quindi, quando si raggiunto un numero di ioni sufficiente (generalmente 10 8),
viene applicato un potenziale positivo.

8.2.1.3 Analisi degli ioni


Una volta che gli ioni sono intrappolati nella trappola ionica aspettano di essere
analizzati in funzione della loro massa. Le trappole generalmente operano applicando
un voltaggio RF con una frequenza costante, ma con variazione dellampiezza V. In
assenza di un voltaggio DC au = 0 (U, da cui dipende au uguale a zero in quanto
esso rappresenta il potenziale diretto DC che, in questa nostra analisi uguale a
zero), quindi ci soffermeremo unicamente su qz, la cui espressione la seguente:

Se la frequenza, come anticipato, non varia nel tempo, allora = cost. Cos come
sono costanti anche r0, z0 ed e, dal momento che si sta studiando la carica elementare.
Pertanto qz strettamente legato a V e a m: al crescere di V cresce anche qz, mentre
diminuisce se m aumenta.

99

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Nella porzione rappresentata dal grafico seguente sono ben visibili le isolinee ad un
dato potenziale V1. Dal momento che dipende da q, possiamo dire che, per grossi
ioni (elevato valore di m), q diminuisce, quindi anche . Gli altri ioni pi leggeri
sono disposti su altre isolinee via via crescenti. Se applichiamo un potenziale V 2 >
V1 i valori di di tutte gli ioni aumenteranno (perch aumenta q. m rimane
ovviamente invariante per un dato ione). Questo porta cos alleliminazione dalla
trappola di quegli ioni pi leggeri che gi con V = V 1 avevano dei valori di
prossimi allunit. Il 50% degli ioni eliminati vengono convertiti in elettroni da un
dinodo ad alto voltaggio, quindi vengono amplificati da un fotomoltiplicatore.

Figura 66 - Descrizione dell'espulsione dalla trappola ionica di ioni con m/z crescente applicando un
potenziale V crescente

La pi elevata massa che pu essere analizzata dipende quindi dai potenziali che si
possono applicare che generalmente sono al massimo compresi tra 7000 e 8000 V.
Per una trappola ionica con un raggio r0 = 1 cm e operante alla frequenza di 1.1 MHz,
il valore pi alto di m/z = 650. Se per si fosse in grado di ridurre r0 e z0 a 7mm,
basterebbe una frequenza di 600 kHz che, per un potenziale di 8000 V si potrebbero
analizzare ioni fino a m/z = 3260.
Ad ogni modo leliminazione di uno ione pu avvenire anche per risonanza. Per
discutere di questa eliminazione necessario per introdurre la frequenza secolare:
100

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

dove la frequenza dellRF.


Questa formula ci permette di
vedere come in realt gli ioni non
oscillano alla frequenza a causa
della loro inerzia (della loro
massa) che li fa oscillare appunto
alla frequenza secolare f. In
particolare la relazione tra f e la
massa

la

seguente:

diminuisce allaumentare delle


masse. Ricorda altres che
aumenta se q aumenta e, di
Figura 67 - Esempio di espulsione per risonanza di uno ione da
una trappola ionica

conseguenza,

entrambi

diminuiscono al crescere del

rapporto m/z.
Schematicamente possiamo riassumere il tutto dicendo: se il rapporto m/z aumenta,
q diminuisce, quindi diminuisce anche e di conseguenza anche la frequenza
secolare f.
Se applichiamo una voltaggio di corrente alternata con frequenza pari a quella
secolare (f), se lampiezza di tale frequenza sufficiente, le oscillazioni dello ione
saranno cos ampie che sar destabilizzato e sar espulso dalla trappola lungo la
direzione z (Figura 70). Questo fa s che, se la frequenza applicata corrisponde ad un
valore di qz minore di quello critico (=0.908 che determina lespulsione dello ione in
condizioni normali), avremo unespulsione di uno ione in condizioni pi blande.
Per esempio per un valore di qz = 0.25 stato possibile espellere degli ioni con un
m/z = 6000.
Concludiamo questa parte elencando quelli che sono i vantaggi e gli svantaggi di una
trappola ionica. I vantaggi sono sicuramente quelli legati alla possibilit di poter fare
MSn (fino MS16), ottima sensibilit in scansione, buona velocit di scansione e bassi
101

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

costi. Gli svantaggi invece sono rappresentati dalle interferenze da matrice (a tal
proposito la trappola ionica pu essere utilizzata solo su matrici acquose, non per
matrici da terreni), limite di massa variabile, possibilit di accumulare al massimo
108 ione (in caso contrario perdita di risoluzione) e gli spettri non sono spesso
confrontabili con quelli di altri analizzatori.

8.2.1.4 MSn
Negli analizzatori di massa a trappola ionica possibile effettuare delle analisi di
MSn, come abbiamo avuto modo di vedere poco fa. Generalmente con la trappola
ionica si effettua una spettrometria tandem risolta nel tempo piuttosto che risolta
nello spazio e pu essere razionalizzata come segue:
1. Selezione di ioni con un dato m/z espellendo tutti gli altri dalla trappola
ionica per risonanza
2. Lo ione genitore collide con lHe sempre presente nella cella di collisione
dando ulteriore frammentazione. E possibile migliorare la frammentazione
irradiando la cella con alla frequenza secolare dello ione genitore.
3. Analizzare gli ioni con uno dei due metodi precedentemente descritti
4. E anche possibile selezionare un frammento con un dato rapporto m/z
allinterno della trappola e procedere con unulteriore frammentazione
ripartendo dal punto 1) per ottenere un MS3. E possibile continuare fino a
MS10.
Esistono almeno due modi per selezionare lo ione che deve essere portato a
successiva frammentazione.
Il primo quello
basato

sulla

selezione di quelli
ioni che si trovano
sullapice
Figura 68 - Solo lo ione con m/z=50 stabile a (339;38,4)

diagramma

del
di

stabilit (figura 67).


Questo avr una data coppia di valori di V e U, nel caso della figura stiamo
102

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

guardando quello segnalato dalla freccia (339;38,4) per i quali la traiettoria dello
ione sar stabile. Questi ioni frammentano nel tempo allinterno della trappola
(collisioni con He), la quale contiene quindi tutti gli ioni prodotto che verranno poi
analizzati mediante unespulsione selettiva.
Il

secondo

esempio

quello

raffigurato nellimmagine accanto


(figura 68). In questo caso
applicato soltanto un voltaggio RF e
non DC.
Nella figura 68A, abbiamo tutta una
serie di ioni con rapporti m/z
differenti.

Siamo

in

grado

di

selezionare unicamente quello che a


noi

interessa

applicando

la

frequenza di risonanza di quegli


ioni che a noi non interessano. 68B:
sono lo ione che abbiamo voluto
selezionare p rimasto.

68C:

eccitiamo lo ione applicando un


campo oscillante. 68D: gli ioni
frammento

prodotti

vengono

analizzati per espulsione selettiva.

Figura 69 - Esempio di selezione di uno ione con un dato


rapporto m/z

I vantaggi nellutilizzare un analizzatore di massa a trappola ionica sono che


possibile utilizzare un solo analizzatore che costa molto meno rispetto ad un triplo
quadrupolo e ci permette di effettuare della spettrometria tandem. Possiamo in pi

103

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

ripetere il ciclo numerose volte andando ad indagare frammenti con m/z sempre pi
ridotti. E possibile, infine, mantenere gli ioni in volo allinterno della camera anche
per diverse ore e possiamo studiare il decadimento degli ioni metastabili.
Gli svantaggi invece sono legati allattivazione collisionale, urti con atomi di He
che trasferiscono poca energia per collisione (posso prolungare i tempi di collisione).
Solo reazioni termodinamicamente favorite e cineticamente sfavorite possono essere
studiate. In EI vedo le altre (quelle termodinamicamente sfavorite e cineticamente
favorite). Pertanto, gli spettri MS/MS in trappola ionica sono pi poveri.
Concludiamo dicendo che oltre alle trappole ioniche tradizionali (3D) ne esistono
anche di lineari (2D); esse presentano una maggiore capacit di ion-storage, una
maggiore efficienza di intrappolamento e una maggiore sensibilit per via elle ridotte
perdite di ioni durante il processo di riempimento e svuotamento.

8.2.2 La trappola ionica lineare (LIT)

Un altro analizzatore in grado di eseguire analisi di spettrometria di massa tandem


la trappola ionica lineare. Questo strumento una sintesi tra un triplo quadrupolo e
una trappola ionica tridimensionale. In questo strumento gli ioni generati da una
sorgente ESI prima di entrare nel Q1 attraversano un primo quadrupolo (Q0) al quale
vengono applicate solo radiofrequenze. Come nel triplo quadrupolo classico il Q1
funziona da filtro di massa trasmettendo solo gli ioni di interesse alla cella di
collisione (q2); il Q3, allinterno del quale avviene la scansione selettiva degli ioni
frammento, pu funzionare come una trappola ionica tridimensionale, cio pu
intrappolare ed accumulare gli ioni al suo interno.
La trappola ionica lineare combina i vantaggi del triplo quadrupolo e della trappola
ionica tridimensionale in quanto questo strumento ha una sensibilit molto elevata
anche analizzando intervalli ampi di valori m/z; inoltre

104

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

consente di effettuare scansioni molto selettive degli ioni precursori.


I vantaggi di questo strumento consistono nella separazione spaziale degli step di
isolamento degli ioni precursori e di frammentazione di questi ultimi; si ha quindi la
possibilit di analizzare intervalli di massa pi ampi rispetto ad una trappola ionica
tridimensionale o ad un quadrupolo. Con la trappola ionica lineare si possono
eseguire le analisi possibili con un triplo quadrupolo e con una trappola ionica
tridimensionale; inoltre le modalit operative enhanced multiply charged scan e
time delayed fragmentation, che sono tipiche delle trappole ioniche lineari,
consentono analisi molto pi accurate.
La prima modalit consente di esaltare gli ioni doppia carica con conseguente
aumento della risoluzione e della sensibilit. Ci importante quando si lavora con
peptidi triptici poich in questo caso frequente avere frammenti recanti una doppia
carica, laddove i frammenti monocarica sono perlopi dovuti a impurezze del
campione. Con la modalit time delayed fragmentation, prima della scansione dei
frammenti nel Q3 si lasciano decadere gli ioni che hanno una energia cinetica al di
sopra di una certa soglia, allontanando cos gli ioni che hanno subito pi urti e che
perci sono frammentati in maniera insoddisfacente

105

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

8.3 Lanalizzatore magnetico a focalizzazione semplice

Figura 70 - Esempio di analizzatore magnetico

Uno ione di massa m e di carica q esce dalla sorgente ionica con una certa energia
cinetica:

Quindi entra in un campo magnetico e sar soggetto alle forze di Lorentz che
agiscono sempre su particelle cariche in moto allinterno di un campo magnetico:

Lo ione a questo punto inizier a muoversi seguendo una traiettoria circolare. Nel
bilancio delle forze che ne consegue occorrer pertanto introdurre il contributo della
forza centrifuga che funzione della massa della particella e della sua velocit:

106

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Possiamo notare che per ogni valore di B, gli ioni con la stessa carica e la stessa
quantit di moto (mv) si muoveranno lungo una traiettoria circolare di raggio r.
Possiamo quindi dire che lanalizzatore magnetico seleziona gli ioni dalla loro
quantit di moto. Se nella nostra trattazione introduciamo anche lenergia cinetica
che ha lo ione, otteniamo una relazione particolarmente interessante tra il rapporto
m/z, il campo magnetico B e il raggio di curvatura r:

dove V il potenziale di accelerazione degli ioni dalla sorgente di ionizzazione.


A questo punto possiamo dire che, fissato un raggio di curvatura r, che sar quello
che permette agli ioni di arrivare al detector e il valore di V, se moduliamo il valore
del campo magnetico B, avremo che solo un dato tipo di ione con uno specifico
rapporto m/q riuscir ad arrivare al rivelatore. Gli altri si scaricheranno sulle pareti
dellanalizzatore.
Purtroppo per lassunto fatto in partenza, e cio che gli ioni avessero la stessa
energia cinetica, non del tutto vero in accordo anche con la distribuzione delle
energie di Boltzmann. Nella fattispecie possibile che due ioni con lo stesso
rapporto m/z abbiano energie cinetiche differenti cos che il loro raggio di curvatura
(formula seguente) risulti differente. Leffetto della distribuzione non monovariata
dellenergia cinetica uninevitabile perdita di risoluzione.

Nonostante le crisi di pianto e urla isteriche, non il caso di allarmarsi: potete


dormire sonni tranquilli perch questo problema stato brillantemente superato dai
simpatici signori Mattauch-Herzog e Nier-Johnson che hanno progettato gli
analizzatori a doppia focalizzazione!!

107

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

8.3.1 Analizzatori a doppia focalizzazione

Per ridurre il pi possibile le precedenti dispersioni si tendono ad utilizzare, come si


era gi in un qualche modo anticipato, dei sistemi a doppia focalizzazione costituiti
da un settore elettrostatico che permette di selezionare gli ioni con la stessa
energia cinetica seguiti da un settore magnetico che seleziona gli ioni in base al loro
rapporto m/q. Analizzatori siffatti (focalizzazione energetica), del tipo MattauchHerzog (Figura 72), permettono di ottenere risoluzione fino a 10.000 e cio
permettono di distinguere due picchi a m/z = 100 e m/z=100,001.
Un altro tipo di analizzatore quello Nier-Johnson (Figura 73), che opera una
focalizzazione direzionale. In altre parole ioni che entrano in un analizzatore elettrico
o magnetico con raggi differenti vengono focalizzati in un punto specifico. Sul punto
di focalizzazione posto a valle del settore magnetico vi il collettore ionico.

Figura 71 - Analizzatore Mattau-Herzog

108

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Figura 72 - Analizzatore Nier-Johnson

Tra i vantaggi di questa tipologia di analizzatori vi troviamo sicuramente il fatto che


restituiscano degli spettri molto puliti, ad alta risoluzione e con masse fino a 10 000
u. I problemi sono legati alla complessit di gestione, agli alti costi e alla rivelazione
sequenziale.
Questi analizzatori di massa vengono impiegati per la determinazione, in campo
ambientale, delle diossine (richiesto per legge).

8.3

Tempo di volo (TOF)

Figura 73 - Schema di un TOF. Si noti l'area di accelerazione (applicazione di una forte ddp), e poi
lo spazio di volo dove gli ioni pi leggeri viaggiano pi velocemente rispetto a quelli pi pesanti.

109

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Lanalizzatore a tempo di volo (TOF) un analizzatore a limitata risoluzione (che


pu essere migliorata adottando opportuni artifizi che vedremo in seguito). E
costituito da una sorgente nella quale vengono prodotti gli ioni i quali vengono
sottoposti per un breve tratto ad una forte differenza di potenziale che ha lo scopo di
accelerarli. Dopo questo tratto lapplicazione del potenziale cessa e vengono lasciati
liberi fino a raggiungere il detector. La separazione avviene sulla base del fatto che
ioni pi leggeri si muovono pi velocemente rispetto a quelli pi pesanti e pertanto
raggiungeranno prima il detector.

Dato uno ione di massa m, la sua energia cinetica sar:

Da qui possiamo ricavarci la velocit v:

dove L la lunghezza del tubo entro il quale viaggiano i nostri ioni e t il tempo. Da
questa relazione risulta particolarmente semplice trovare il legame tra il tempo di
percorrenza e il rapporto m/z:

Da dove possibile ricavare:

Il problema di questo analizzatore legato al fatto che le energie cinetiche non sono
uguali per tutti gli ioni. Ne consegue che ioni pi pesanti, ma con energia cinetica pi
alta arrivano insieme a ioni pi leggeri con energia cinetica pi bassa, dando dei
problemi legati alla risoluzione. Il TOF concepito come quello della figura 73
quindi uno strumento a bassa risoluzione.
E possibile esprimere la risoluzione di un analizzatore TOF partendo dalla relazione
tra m/z e il tempo di volo, ottenendo:

110

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Per migliorare la risoluzione si pu quindi aumentare il tempo di volo e questo


possibile allungando lo spazio oppure diminuendo il dt, cio ridurre il tempo di
risposta del detector (ideale per la fast-GC).
Descriviamo di seguito lo stratagemma che si utilizzato per allungare il tempo di
volo aumentando lo spazio a disposizione degli ioni. Lo si fatto introducendo i
cosiddetti reflectron:

Figura 74 - TOF con reflectron

Il reflectron un insieme di lenti ioniche in grado di invertire la direzione del moto


di un fascio di ioni. Dopo il cammino nell'analizzatore gli ioni entrano in una zona
chiamata riflettore elettrostatico che li fa tornare indietro, pi gli ioni sono veloci, pi
in profondit entrano in questa zona e quindi percorrono un cammino maggiore. In
questo modo ioni di massa uguale ma velocit diversa arrivano al rivelatore allo
stesso tempo, questo serve a ristabilire la separazione degli ioni in base all'm/z che
pu non essere riuscita come desiderato a causa della lunghezza dell'impulso di
partenza.

111

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Lo stesso principio stato adottato per la realizzazione del TOF Ortogonale dove il
reflectron rallenta gli ioni i quali poi vengono accelerati ortogonalmente verso il
detector.
Per ridurre la dispersione di energia cinetica tra gli ioni che hanno lo stesso rapporto
m/z alluscita dalla sorgente possibile introdurre un sistema che permetta di
separare la fase di ionizzazione da quella di espulsione. In particolare: gli ioni sono
inizialmente formati e si muovono liberamente nella regione della sorgente, quindi,
dopo un certo intervallo di tempo (nanosecondi o microsecondi), si applica un
voltaggio per accelerarli al di fuori di essa. Questa metodologia si differenzia da
quella classica usata negli strumenti convenzionali nei quali lestrazione continua.
Dalla figura seguente emerge chiaramente che nel caso di unestrazione continua la
risoluzione peggiore in quanto gli ioni con lo stesso rapporto m/z, ma con energie
cinetiche differenti raggiungono il detector a tempi diversi causando uno slargamento
del picco. Sfruttando lestrazione pulsata, gli ioni hanno inizialmente una loro
distribuzione di energia cinetica nella regione della sorgente in cui sono confinati. Se
consideriamo ioni con lo stesso rapporto m/z, quelli che hanno unenergia cinetica
maggiore si muoveranno di pi verso il detector rispetto a quelli che hanno meno
energia, anche se rimangono confinati entro la regione della sorgente. In seguito
viene applicato un impulso che libera questi ioni e trasmetter pi energia a quelli
ioni che sono pi vicini alla sorgente. Di conseguenza, avremo un trasferimento di
ulteriore energia cinetica a quegli ioni che ne hanno di meno in modo tale che
possano raggiungere quegli ioni che inizialmente ne avevano di pi. In questo modo
si ha una correzione della dispersione di energia degli ioni che lasciano la sorgente
con lo stesso rapporto m/z con conseguente miglioramento della risoluzione.

112

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Figura 75 - Confronto tra l'estrazione continua e quella pulsata. I pallini pieni corrispondono a ioni con
energia cinetica pi alta rispetto a quelli bianchi. Tutti i pallini sono relativi ad uno ione con il medesimo
rapporto m/z. Nella delayed pulsed extraction abbiamo inizialmente la formazione di ioni pi veloci
(quelli neri) e ioni pi lenti (quelli bianchi). I pallini neri prendono vantaggio rispetto a quelli bianchi dal
momento che hanno unenergia cinetica maggiore (quindi, a parit di massa, una velocit pi alta), ma, dal
momento che si trovano pi lontani dalla sorgente di ionizzazione, nel momento in cui viene applicato un
impulso di accelerazione, guadagneranno meno energia rispetto a quelli bianchi. Pertanto si pu dire che si
assiste ad una ridistribuzione delle energie cinetiche cos che gli ioni bianchi e neri con lo stesso m/z
raggiungono il rivelatore contemporaneamente migliorando nettamente la risoluzione del TOF.

Lestrazione pulsate descritta in precedenza presenta per delle limitazioni tra le


quali una complicazione nella procedura di calibrazione delle masse. Per questo
motivo pu essere utile adottare direttamente una sorgente di tipo pulsato in grado di
generare di per s una distribuzione il pi possibile monodispersa di energia cinetica:
il MALDI. Non a caso il TOF unanalizzatore di massa molto spesso accoppiato
proprio con la sorgente di ionizzazione MALDI. Il MALDI-TOF particolarmente
usato per la determinazione di biomolecole, in particolar modo polipeptidi.

113

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Figura 76 - MALDI-TOF

In generale analizzatori di tipo TOF (indipendentemente dalla configurazione tra


quelle studiate) presentano unottima sensibilit e unaltissima velocit di scansione.
Sono privi di limiti di massa (m/z > 200 000). Non tuttavia possibile effettuare
esperimenti di MS/MS, la risoluzione non costante (varia con t2) e i costi sono
decisamente elevati.
In ultimo possiamo analizzare i sistemi TOF/TOF, un metodo della spettrometria di
massa tandem dove vengono usati due analizzatori di massa a tempo di volo
consecutivamente. Spesso accoppiato a sorgenti di ionizzazione quali MALDI ed

114

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

ESI. Il primo analizzatore di massa TOF (costituito da un normale tubo di volo)


isola gli usando un filtro di velocit, il secondo TOF (costituito da un tubo di volo
con reflectron) analizza gli ioni frammentati. La frammentazione ionica aggiuntiva
implementata in una cella di collisione ad alta energia pu essere aggiunta al sistema
(tra i due TOF) per aumentare il tasso di dissociazione degli ioni. Prima della cella ci
collisione (quadrupolo o esapolo) pu esservi collocato un cancello di potenziale in
modo da poter selezionare lo ione che si fa entrare nella cella di collisione, se
vogliamo analizzarne solo uno specifico.

8.4

Ciclotrone (ICR-FT)

Figura 77 - Esempio di spettrometro di massa a trasformata di Fourier

Gli spettrometri di massa a trasformata di Fourier (FT) non sono, al giorno doggi,
molto comuni, a causa del costo elevato; in futuro la loro diffusione potr aumentare
in funzione dei progressi nella produzione di magneti superconduttori. In uno
spettrometro di massa a trasformata di Fourier gli ioni vengono mantenuti in una
cella mediante un potenziale elettrico di intrappolamento allinterno di un potente

115

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

campo magnetico. Nella cella ogni ione orbita in direzione perpendicolare al campo
magnetico con una frequenza proporzionale al proprio rapporto m/z. La traiettoria
dello ione data dal bilanciamento di forza centripeta e forza centrifuga:

Sapendo che:

Dove la velocit angolare.


La frequenza di risonanza degli ioni data da:

La frequenza di risonanza di uno ione indipendente dalla sua velocit iniziale, ma


dipende unicamente dal rapporto qB/m.
Quando viene applicato un impulso di radiofrequenza pari a quella di risonanza degli
ioni con un dato m/z, detta frequenza di ciclotrone,

(che deve coprire un ampio

range di frequenze, generalmente da 11.5 kHz per m/z = 4000 a 1.65 MHz per m/z =
25 in un tempo dellordine dei ms) tra due piastre della cella che fungono da
trasmettitore (piastre di eccitazione), lenergia assorbita si traduce in un aumento
della velocit e conseguentemente del raggio dellorbita seguita dallo ione in
questione (

mantenuta costante). Quando limpulso di corrente alternata viene

interrotto, lo ione si muover su una nuova orbita circolate con un r e una velocit
aumentate rispetto alle condizioni di partenza.
Gli ioni con un dato m/z che ruotano sulla nuova orbita allargata generano un
debole segnale immagine (corrente immagine) che viene raccolto dalle piastre

116

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

della cella che agiscono come ricevitore. La frequenza della corrente generata da un
particolare ione uguale alla sua frequenza orbitale che a sua volta inversamente
correlata al suo rapporto m/z. Il segnale totale produce un interferogramma
concettualmente simile al segnale FID nellNMR o allinterferogramma generato
negli esperimento FT-IR. Linterferogramma, che uno spettro nel dominio del
tempo prodotto dalla somma di tutte le correnti immagine prodotte dagli ioni che
alternativamente sono stati colpiti dallimpulso di radiofrequenza pari alla loro
frequenza di ciclotrone

, viene convertito, mediante trasformata di Fourier, in uno

spettro nel dominio della frequenza, che poi fornisce lo spettro convenzionale m/z
(Figura 79). La spettrometria pulsata a trasformata di Fourier, come abbiamo visto,
sar applicata alla risonanza magnetica nucleare, di cui per non ci occuperemo in
questa sede.

Figura 78 - A sinistra un interferogramma che viene converito in uno spettro m/z applicando la
trasformata di Fourier

Poich lo strumento lavora a campo magnetico costante, possibile utilizzare


magneti superconduttori a campo estremamente alto. Inoltre, dato che lintervallo di
masse analizzabili direttamente proporzionale allintensit del campo magnetico,
possibile rivelare masse molto elevate. Infine, poich tutti gli ioni derivanti da una
singola ionizzazione possono essere intrappolati e analizzati, il metodo molto
sensibile e funziona bene con tecniche di ionizzazione pulsata oppure una ESI, ma
anche particle beam ed EI. In un esperimento ESI-ICR-FT stato possibile
determinare ioni con massa fino a 5 000 000 Da. Laspetto pi allettante del metodo
lelevata risoluzione raggiungibile, cosa che rende gli spettrometri di massa FT

117

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

uninteressante alternativa ad altri analizzatori di massa. Lo spettrometro di massa


FT pu essere interfacciato con apparati cromatografici e abbinato a vari metodi di
ionizzazione, il che significa che pu anche essere impiegato facilmente con
molecole di dimensioni ridotte.
Il moto degli ioni non deve essere influenzato da reazioni ione-molecola, per cui la
pressione nella trappola devessere molto bassa (tra 10-8 e 10-9 torr).
Come anticipato in precedenza, i vantaggi di uno strumento siffatto sono sicuramente
legati allelevata risoluzione (fino a 1 000 000) e a limiti di massa molto elevati.
Lunico contro quello del costo, ad oggi ancora proibitivo perch superiore al
milione di uro.

8.5

Orbitrap

Figura 79 - Profilo di una Orbitrap

Lorbitrap una trappola ionica che sfrutta la trasformata di Fourier per ottenere
degli spettri di massa (Figura 79). Essa caratterizzata da due elettrodi, uno esterno a
forma di barile dal diametro di circa 20 mm e uno interno a forma di fuso dal
diametro di circa 8 mm al quale applicato un potenziale negativo (circa -3200 V).
Gli ioni positivi, con unenergia cinetica di qualche keV (circa 1600 eV), vengono
introdotti tangenzialmente ed iniziano a ruotare a spirale e oscillano lungo lasse z
attorno allelettrodo interno sotto linfluenza di un campo elettrostatico quadro118

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

logaritmico (e non oscillante come nella trappola ionica quadrupolare) con


unampiezza uguale, ma con una frequenza variabile e data da:

Dove k rappresenta la curvatura del campo elettrostatico.


Queste frequenze sono misurate attraverso la corrente immagine e poi convertite dal
dominio dei tempi a quello delle masse attraverso una trasformata di Fourier.
La rilevazione degli ioni pu essere effettuata utilizzando unaltra configurazione che
prevede un rivelatore esterno allorbitrap. In questa circostanza, si applica un
potenziale tale per cui lo ione con un determinato rapporto di m/z si muove con una
traiettoria instabile e esce dall'analizzatore. Quello ione va al rivelatore, si pu fare
una scansione in questo modo facendo uscire uno alla volta tutti gli ioni. La
descrizione quantitativa delle traiettorie stabili/instabili lo stesso visto per la
trappola ionica (equazione di Mathieu).
Lorbitrap un analizzatore di massa con una risoluzione molto elevata (> 200 000)
e con un range dinamico compreso tra m/z = 50 e m/z = 4000.
E richiesto un vuoto molto spinto, analogamente allICR (10 -10 torr). Per questo
motivo prima dellanalizzatore vengono collocati diversi quadrupoli (con funzioni
che vanno dalla focalizzazione, al trasporto allo stoccaggio) a vuoti sempre crescenti.
Il quadrupolo di stoccaggio permette agli ioni di entrare nellanalizzatore
contemporaneamente.
Nella prima versione dellorbitrap (due cilindri concentrici + due elettrodi end-cap)
nota come trappola Kingdom, la risoluzione era scadente (paragonabile a quella di un
quadrupolo) in quanto non avveniva loscillazione lungo lasse z (indipendente
dallenergia cinetica) e di conseguenza avevamo una stretta dipendenza dalla
distribuzione dellenergia cinetica tra ioni anche aventi la stessa massa.

119

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

8.6

Ricapitolazione analizzatori di massa

Analizzatore Range

Risoluzione Sensibilit

Vantaggi

Svantaggi

100.000

Alta

Bassa

risoluzione

sensibilit,

massa
1-15000

Sezione

Bassa

magnetica

costoso
Quadrupolo

1-5000

1.000

Alta

Economico, Bassa
alta

risoluzione,

sensibilit

limitato
intervallo di
massa

1-5000

Trappola

1.000

Alta

ionica

Economico, Bassa
alta

risoluzione,

sensibilit,

limitato

MS/MS

intervallo di
massa

di Illimitato

Tempo

10.000

Alta

Ampio

Risoluzione

intervallo di non

volo

Trasformata Fino
di Fourier

a 1.000.000

Alta

70kDa

massa

elevatissima

Risoluzione

Molto

molto

costoso

elevata

ampio
intervallo di
massa

8.7

Analizzatori di massa ibridi


Alcuni spettrometri di massa combinano diversi tipi di
analizzatori. I pi comune includono due o pi dei seguenti

120
Figura 80 - BEqQ

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

analizzatori: quadrupoli (Q), trappole ioniche (IT), TOF, ICR o orbitrap. Questi
sono chiamati analizzatori di massa ibridi. Lobiettivo di questi strumenti quello di
unire le forze di ciascun analizzatore evitando la combinazione delle loro debolezze.
In questo modo lutilizzo di analizzatore ibridi permette di ottenere delle prestazioni
migliori rispetto a quelle di uno singolo.
Gli accoppiamenti pi utilizzati riguardano quelli con il quadrupolo il EBqQ (campo
elettromagnetico + doppio quadrupolo) stato uno dei primi ad essere costruiti. Di
seguito faremo una rapida carrellata di quelli pi importanti.

1) Quadrupolo + tempo di volo (QqTOF)


E un triplo quadrupolo dove al posto dellultimo quadrupolo stato inserito un TOF.
Proprio lintroduzione di questultimo permette di determinare la struttura di
composti sconosciuti in quanto fornisce la composizione elementare di tutti gli ioni
prodotti (massa esatta).

2) Trappola ionica + tempo di volo (TOF)

Figura 81 - IT-TOF

In questa configurazione la trappola ionica utilizzata per accumulare gli ioni che
vengono poi inviati al TOF. Pertanto, se utilizzando la semplice IT avevamo
unespulsione selettiva degli ioni che andavano verso il rivelatore, in questa
circostanza la IT ha come unico obiettivo quello di accumulare gli che vengono poi
separati in base al loro rapporto m/z dal TOF.

121

Analisi degli inquinanti con laboratorio Gli analizzatori di massa

Questa configurazione permette di avere sensibilit pi elevate in seguito


allaccumulo degli ioni nella trappola ionica se confrontata con il TOF semplice e in
pi permette tempi di analisi pi rapidi, range di massa pi ampi, una risoluzione
maggiore rispetto ed esperimenti di MSn molto pi accurati rispetto ad una trappola
ionica tradizionale.

3) Quadrupolo + trappola ionica lineare (QqIT)


E basato sul cammino ionico di uno spettrometro QqQ, ma usa come cella di
collisione LIT (trappola ionica lineare); estremamente costoso. Pu essere
utilizzato sia mantenendo i classici metodi di scan del QqQ (ione prodotto, perdita
neutra e ione precursore) che per fare MSn come con un normale IT. Non permette di
ottenere alte risoluzioni.

4) Trappola ionica lineare + orbitrap


Combina la capacit della trappola ionica lineare per fare esperimenti di MS n con a
capacit dellorbitrap di misurare la massa accurata e di avere unelevata risoluzione.

122

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

CAPITOLO 9
9

Interpretazione degli spettri di massa

Interpreteremo spettri che sono originati da una ionizzazione con tecnica EI che
prevede, lo ricordiamo, la rimozione di un elettrone dalla molecola target ad opera di
un fascio di elettroni ad alta energia (70 eV).
Il radicalcatione cos prodotto ha vita estremamente breve e d origine a
frammentazioni restituendo un radicale ed un catione. I cationi possono a loro volta
disgregarsi per dare frammenti pi piccoli. Pu capitare che il radicalcatione della
molecola intera sia particolarmente stabile e abbia una vita tale da permettergli di
raggiungere il rivelatore: sar cos che potremo ottenere il picco molecolare che ci d
linformazione sul peso molecolare dellanalita.
Il picco pi alto, che viene sempre normalizzato a intensit = 100%, prende il nome
di picco base. Capita, soprattutto nelle tecniche di ionizzazione pi soft, che il picco
molecolare sia anche picco base. Il picco molecolare quello a massa pi elevata se
si escludono i picchi isotopici

9.1

Riconoscimento del picco dello ione molecolare

Lindividuazione del picco molecolare pu talvolta generare dei problemi: esso pu


non apparire oppure pu essere facilmente confuso con i segnali relativi ad eventuali
impurezze. Per ovviare a tale problema normalmente si effettua preliminarmente una
ionizzazione chimica (CI) che dar un segnale molto intenso e difficilmente
confondibile a [M+1]+.
Le informazioni contenuti nel picco molecolare sono importanti: oltre a dirci qual il
peso molecolare dellanalita, ci permette di capire quanti atomi di azoto sono presenti
nella molecola. Se il picco molecolare dispari avremo un numero dispari di atomi
di azoto, se il picco molecolare pari abbiamo o nessuno o un numero pari di atomi
di carbonio.

123

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

Un utile corollario : un frammento ionico generato dalla rottura di un legame


singolo sar dispari se la molecola contiene un numero pari di atomi di carbonio,
mentre sar pari se la molecola contiene un numero dispari di atomi di carbonio.
Lintensit del picco molecolare dipende dalla stabilit della molecola. Se la
molecola stabile avremo un picco molecolare intenso e questo sar vero soprattutto
con i composti aromatici, gli alcheni coniugati e i composti ciclici. Sar meno
intenso per solfuri organici, alcani lineari a catena corta e mercaptani. Anche gli ioni
molecolari sono tanto pi intensi quanto pi stabile lo ione e i pi visibili sono in
genere prodotti, in ordine decrescente, da chetoni, ammine, esteri, eteri, acidi
carbossilici, aldeidi, ammidi e alogenuri.
La presenza di contaminazioni pu essere marcata dalla presenza di segnali in
corrispondenza da M-3 a M-14, mentre sono possibili segnali a M-1 e M-2. Sono
improbabili infine perdite di frammenti con masse comprese tra 4 e 14 e tra 21 e 25
con analisi effettuate in GC/MS.

9.2

Determinazione di una formula molecolare

Il primo compito che si deve espletare quello relativo alla determinazione della
formula bruta del composto incognito. Per farlo si guardano i picchi in posizione
M+1, M+2, M+4 e M+6.
Nello specifico, il picco relativo a M+1 comprende i contributi di

13

C, 2H, 1N e

17

P.

Essendo per labbondanza relativa degli isotopi di idrogeno azoto e fosforo


rispettivamente dello 0,016%, dello 0,38% e dello 0,04%, il picco in M+1 ci d
informazioni riguardo al numero di atomi di carbonio presenti. In effetti
labbondanza relativa di

13

C dell1,11%, nettamente maggiore rispetto a tutte le

altre specie contribuenti.


Alla luce di queste osservazioni, dato uno ione CnHm, varr la relazione:
I(M+1) n 1,1
Il picco a M+2, se visibile, ci d importantissime informazioni riguardo la presenza
di alogeni oppure di zolfo. Nel caso di un singolo atomo di zolfo,

34

S contribuisce

124

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

approssimativamente per il 4,40% al picco M+2. Se invece siamo in presenza di un


atomo di cloro o di bromo osserveremo rispettivamente un picco a M+2 alto
esattamente 1/3 rispetto al picco molecolare e uno esattamente identico al picco
molecolare.
In ultimo, anche i picchi a M+4 e M+6 sono importanti perch danno informazioni
sulla presenza di Br e Cl.
Unaltra indagine da svolgere quella relativa al numero di insaturazioni, inteso
come somma di anelli e doppi legami. Essa definita da:
A + DL = c- h/2 + n/2 +1
dove c rappresenta il numero di atomi del 14 gruppo (C, Si, ), h i numeri di atomi
di idrogeno e alogeni e n il numero di atomi del 15 gruppo (N, P, As, ).

9.2.2 Suggerimenti

pratici

per

la

determinazione della formula molecolare


Vediamo ora in termini pratici come si deve procedere per la determinazione della
formula molecolare. In linea generale: si trova il picco molecolare e si identifica la
sua intensit. Si individua il picco a M+1 e si identifica la sua intensit.
A questo punto si porta a 100 lintensit del picco molecolare e lintensit del
picco a M+1. Se ad esempio il picco molecolare ha intensit 45 e il picco a M+1 ha
intensit 3,5 avremo:
45:100 = 3,5: x
x = 7,77
A questo punto sfruttiamo
I(M+1) n 1,1

125

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

Dove I(M+1) = x = 7,77 e otteniamo che n, numero di atomi di carbonio uguale a 7


(7,7/1,1).
Valutando la disparit del picco molecolare saremo in grado di stabilire se vi la
presenza di N, mentre valutando lintensit del picco a M+2 possiamo stabilire se
sono presenti degli alogeni (Cl, Br) oppure un numero consistente di atomi di
ossigeno. Ricorda che se dovessi trovare un valore di atomi di ossigeno (fatto
possibile solo in assenza di alogeni) assolutamente sproporzionato, significa che
potrebbe esserci uno o pi atomi di zolfo. A questo punto controlla se il rapporto tra
lintensit del picco a M+2 e quello a M pari a circa il 4%.

9.3

La frammentazione

In questo paragrafo vediamo quali sono i fattori principali che influenzano


labbondanza degli ioni:
1. stabilit dello ione prodotto. Tanto pi lo ione stabile, tanto pi il suo picco
sar elevato
2. regola di Stevenson.
3. Distacco del radicale pi grande
4. Stabilit del prodotto neutro. Una frammentazione sar favorita se il risultato
leliminazione di un prodotto neutro (H2O, CO, NO, )
5. Effetti sterici
6. Regola di Field. Le molecole con elettroni pari tenderanno a frammentarsi
dando molecole neutre a basso peso molecolare.
Vediamo ora i principali meccanismi di frammentazione:
-

rottura : tipica per tutti quei frammenti di molecola che non posseggono
orbitali n o occupati ad alta energia. Tipica per idrocarburi saturi, alcheni
sostituiti con F, Cl, CN e NO2.

126

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

rottura : tipica per tutte le molecole che presentano un eteroatomo. Con


questo tipo di frammentazione la carica positiva rimane localizzata
sulleteroatomo.

rottura induttiva: tipica per quelle molecole con un numero pari di elettroni
(al contrario la precedente si verifica essenzialmente per quei composti con
numero dispari) e consiste nella migrazione di una coppia di elettroni di
legame verso latomo carico positivamente. Il risultato la formazione di un
frammento ionico pi piccolo e la liberazione di una molecola neutra.

retro Diels-Alder: tipica per quelle strutture cicliche che presentano


uninsaturazione. I frammenti si ricavano dallinverso della reazione di ciclo
addizione di Diels-Alder.

Riarrangiamenti: in particolare citiamo il riarrangiamento di McLafferty


che prevede la reazione tra leteroatomo con elettroni dispari e un atomo di
idrogeno collocato in posizione . Questi picchi possono essere riconosciuti,
in effetti una semplice frammentazione (senza riarrangiamento) di uno ione
molecolare con massa pari fornisce un frammento ionico avente massa
dispari e viceversa. Losservazione della massa di un frammento ionico che

127

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

differisce di ununit da quella attesa in base ad una frammentazione


semplice (per esempio un frammento a massa pari da uno ione molecolare a
massa pari) indica che durante la frammentazione avvenuto un
riarrangiamento riguardante un atomo di idrogeno. In base a ci, un picco a
massa pari derivante da uno ione molecolare a massa pari il risultato di due
scissioni, che possono coinvolgere un riarrangiamento.

9.4

Spettri di massa di alcune classi di composti

1. Idrocarburi saturi: il picco molecolare sempre presente, anche se di


debole intensit, soprattutto per quelle molecole lineari molto lunghe.
I picchi sono distanziati di unit 14 (-CH2) uno dallaltro. Il profilo di
frammentazione di idrocarburi saturi lineari caratterizzato da un profilo
Gaussiano con i picchi di maggiore intensit vero le unit C3 e C4 per poi
decrescere successivamente. Per questo genere di molecole il picco a M-15
quasi sempre assente.
Negli idrocarburi saturi ramificati si osserva una sostanziale differenza di
intensit rispetto al profilo tipico degli idrocarburi saturi lineari. In
particolare, i picchi che sono fuori dal profilo Gaussiano di cui sopra indicano
128

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

chiaramente i punti di ramificazione. In pi, la presenza di un picco a M-15


diagnostico per una ramificazione metilica.

Figura 82 - Confronto tra uno spettro di un alcano lineare e di un alcano ramificato

Se si ha un anello legato
ad

una

catena

idrocarburica, il picco
base sar quello relativo
alla rottura del legame
tra

catena

lineare

anello. In pi lanello, se
saturo,

dar

frammentazioni atte a
perdere unit C2H4 e
C2H5.

Concludiamo

dicendo che il picco base


per anelli saturi sempre
molto ben visibile.
Figura 83 - Spettro di massa per cicloesano e per un composto
ciclico legato ad una catena lineare

129

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

2
2. Alcheni (olefine): questi composti presentano un picco dello ione molecolare
quasi sempre visibile. E difficile localizzare il doppio legame a causa della
sua continua migrazione nei frammenti negli alcheni lineari, mentre nelle
strutture cicliche la sua posizione facilmente distinguibile perch si osserva
una scissione allilica della struttura.
Un classico pattern di frammentazione per gli alcheni rappresentato dalla
sequenza m/z = 41, 55 e 69 che corrisponde alla formula C nH2n-1 con n =
3,4,5 rispettivamente. Naturalmente il doppio legame considerato non deve
coniugato.
Gli alcheni ciclici presentano un picco molecolare distinguibile e presentano
una modalit di frammentazione nota come retro-Diels-Alder dando un
residuo neutro e un radicalcatione.
41

100

50
39
56
27

15

50 53

2
0
0

10

20

30

40

50

60

70

3. Idrocarburi aromatici: lo ione molecolare molto intenso. Un picco molto


importante quello relativo al m/z = 91 che sta ad indicare
130

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

inequivocabilmente un anello aromatico (ione tropilio). Se si osservano degli


incrementi di m/z = 14 dal picco a m/z = 91, significa che vi sono dei
sostituenti legati. Ad ogni modo, una loro assenza non esclude la possibilit
di ramificazioni. Unaltra spia per eventuali ramificazioni sullanello
aromatico il picco a m/z = 92: questo indica che legato allanello
benzenico un gruppo alchilico con almeno due atomi di carbonio.
Sottolineiamo infine il picco a m/z = 77 che si origina in seguito alla perdita
di un gruppo Cl, Br, I, C(=O)R, NO2, NR2 (non NH2). Pertanto possiamo dire
che la presenza di un gruppo m/z = 77 indica che i gruppi che si sono staccati
dallanello aromatico non lo hanno modificato, al contrario la presenza di un
picco a m/z = 91 indica che i gruppi (catene lineari) che si sono staccati
dallanello aromatico hanno alterato lanello.

Vediamo lesempio del metil benzene C7H8 , M = 92:

131

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

91

100

50

65

39
27

41

45

51

0
20

30

40

50

60

70

80

90

100

La frammentazione del legame C H in posizione rispetto all'anello aromatico


produce il catione tropilio, con m/z 91, che poi per perdita di acetilene d luogo al
catione ciclopentadienile, con m/z 65:

CH3

+
+

+ H

(91)

+ HC CH

(65)

132

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

4. Alogenuri alifatici: la presenza di alogeni nelle molecole , come si visto,


subordinata al tipico cluser isotopico. In particolare abbiamo visto che un
picco alto circa 1/3 rispetto al picco molecolare a M+2 indica la presenza di
un atomo di cloro e un picco alto quasi come il picco molecolare a M+2
indica la presenza di un atomo di bromo. Se vi sono pi atomi di cloro e
bromo, siamo in grado di stabilire la loro quantit andando ad analizzare il
numero di picchi che si vedono a M+4, M+6, M+8 ecc
Ad esempio, se vi sono 3 atomi di cloro vedr un picco estremamente intenso
(I = 97,8%) a M+2, uno a M+4 (I = 31,9%) e uno a M+6 (I = 3,5%). Lo
stesso discorso si pu applicare per il bromo: se nella mia molecola ho due
atomi di bromo, vedr un picco molto intenso a M+2 (I = 195%) e uno a M+4
(I = 95.5%). Talvolta pu capitare che, essendo i picchi troppo deboli
(soprattutto per quanto riguarda il picco a M+12 presente se nella molecola
abbiamo 6 atomi di cloro), non possono essere individuati facilmente.
Per quanto riguarda i cloruri alifatici si pu assistere ad una perdita di HCl
(M-36), oppure la formazione di un catione che restituisce un picco piuttosto
intenso per catene pi lunghe di 4 atomi di carbonio in seguito alla
formazione di una struttura ciclica a cinque termini: C 4H8Cl+.
Le stesse affermazioni fatte per i cloruri valgono anche per i bromuri.
Se abbiamo composti che contengono iodio, essi non presentano un cluster
isotopico in quanto lo iodio monoisotopico. La frammentazione degli ioduri
simile a quella dei cloruri e dei bromuri, ma il picco relativo ad una
struttura C4H8I+, non particolarmente evidente.
Infine arriviamo ai fluoruri alifatici. Essi presentano il picco molecolare meno
intenso tra tutti gli alogenuri. Anche il fluoro monoisotopico. I fluoruri
alifatici presentano picchi caratteristici a m/z = 69 derivante dallo ione CF3+ e
da un picco M F, visibile soprattutto nei composti contenenti pi di un
atomo di fluoro. Particolarmente evidente il picco legato alla pedita di un H
radicalico, relativo alla struttura R-CH+ - F.
Gli alogenuri benzilici presentano un picco molecolare evidente. In seguito
alla perdita di alogeno si forma sia uno ione benzile sia, talvolta, lo ione
tropilio.

133

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

5. Alcoli: presentano picchi molecolari di difficile individuazione, specialmente


per gli alcoli terziari dove sono assenti. Gli alcoli primari presentano un picco
di forte intensit a m/z = 31 in seguito alla formazione dello ione CH 2-OH.
Gli alcoli secondari e terziari presentano picchi di forte intensit in seguito
alla formazioni di +CHR-OH e +CRR-OH rispettivamente a m/z = 45,59,73,
ecc e a m/z = 59, 73, 87, ecc). Il picco a m/z = 31 abbastanza
diagnostico per alcoli secondari, a patto che sia pi intenso dei picchi a m/z =
45, 59, 73 Negli alcoli primari si osserva spesso un picco a M-18 (perdita
di H2O) e per alcoli con un numero di atomi di carbonio maggiore di 4 si
osserva la formazione di un picco a M-C2H4-H2O.
Alcoli ciclici possono essere individuati da tipici pattern quali m/z = 57 e m/z
= 71.
Passiamo in ultimo allanalisi degli spettri di alcoli aromatici: questi
presentano sempre un piccolo molecolare molto intenso seguito da picchi
pronunciati a M-1, M-2 e M-3 che derivano da sequenza piuttosto complesse.
Si assiste spesso alla perdita di OH (M-17). Inoltre, lalcol benzilico spesso si
frammenta a dare in successione lo ione M-1, lo ione C6H7+ per perdita di CO
e lo ione C6H5+ per perdita di H2. Il pattern di frammentazione sar quindi:
m/z = 108, 107, 79, 77.
La presenta di sostituenti in orto, permette la perdita di H2O in seguito al
cosiddetto effetto orto.
6. Fenoli: i fenoli sono caratterizzati da un picco molecolare molto intenso
preceduto da un picco a M-1 di debole intensit. Inoltre essi presentano molto
spesso un picco a m/z = 77 e picchi derivanti da perdite di CO (M-28) e CHO
(M-29). La perdita dacqua poco favorita, a meno che non si parli di fenoli
2-alchilsostituiti in cui il sostituente posto in orto. La perdita di acqua
avviene in tal caso per il gi visto effetto orto.In ultimo, fenoli alchil
sostituiti danno lo ione tropilio a m/z = 91, anche se non sempre di forte
intensit.
In ultimo, oltre alla perdita di acqua che testimonia un fenolo orto-sostituito,
andando ad analizzare lintensit del picco a M-1, siamo in grado di stabilire
se lalcol sar para o meta sostituito. Se il picco a M-1 pi alto del picco

134

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

molecolare allora abbiamo un alcol para-sostituito, se al contrario esso


meno intenso, avremo a che fare con un alcol meta-sostituito.
94

100

OH

50
66

39

50 55

27

63
74 79

42

0
10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Per perdita della molecola di CO si fo rma lo ione ciclopentadienile C 5H6+ con m/z
66 , che per successiva perdita di H d luogo a C5H5+ con m/z 65.
OH

CO +

H
+

(66)

+ H

(65)

7. Eteri: il picco molecolare di debole intensit. Si pu osservare la presenza


di un atomo di ossigeno in seguito ai picchi a m/z = 31, 45, 59, 73, Essi
rappresentano i frammenti a RO+, ROCH2+. Le frammentazioni pi comuni
negli eteri sono:
a) Rottura del legame adiacente allatomo di ossigeno. Segnali
intensi.

135

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

b) Rottura del legame C-O con ritenzione della carica sul frammento
alchilico. In questa circostanza lo spettro di eteri a lunga catena
dominato dal profilo di frammentazione degli idrocarburi.
Si in grado di identificare anche eventuali eteri aliciclici, vale a dire
composti ciclici contenenti un atomo di ossigeno allinterno. Questi sono
facilmente individuabili grazie alla presenza di un pattern di picchi a massa
pari allinterno di un pattern di picchi dispari. Le frammentazioni in tal caso
sono inizialmente con meccanismo , e successivamente con meccanismo
induttivo o eventualmente riarrangiamento di McLafferty.
Concludiamo con gli eteri aromatici che presentano uno ione molecolare
molto evidente e danno picchi di frammentazione a m/z = 93 (relativo
allanello aromatico legato ad un atomo di ossigeno recante la carica positiva)
e a m/z = 65 (relativo alla perdita sequenziale di un CO). Oppure un altro
pattern classico quello m/z = 78, 77. La differenza tra M e 93 ci d
informazioni sulla lunghezza della catena idrocarburica legata allatomo di
ossigeno.
8. Aldeidi e chetoni: aldeidi e chetoni alifatici danno un picco molecolare
molto intenso e danno una tipica frammentazione in seguito alla rottura del
gruppo posto in al carbonile. Le serie tipiche sono a m/z = 15, 29, 43, 57,
In particolare per le aldeidi si ha la simultanea presenza di un m/z = 29 e
di un picco a m/z = M-1. Sono possibili riarrangiamenti di McLafferty. Per
quanto riguarda i chetoni aromatici, il picco dello ione molecolare molto
pronunciato e si assiste alla formazione di un frammento caratteristico
ArCO+ a m/z = 105. La perdita del gruppo CO d il frammento a m/z = 77.
Altri ioni caratteristici sono quelli a m/z = M H e a M CHO.
Riarrangiamenti di McLafferty sono possibili con catene alchiliche pi
lunghe di tre atomi di carbonio. Per quanto riguarda le aldeidi aromatiche,
esse presentano un picco molecolare molto intenso e un picco a M-1 (ArCO)+ che pu talvolta essere superiore al picco dello ione molecolare. Lo
ione a M-1 pu a sua volta perdere CO e dare lo ione fenile (m/z = 77) che a
sua volta pu eliminare acetilene e dare lo ione a m/z = 51.

136

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

9. Acidi carbossilici: gli acidi alifatici sono caratterizzati da un picco dello ione
molecolare debole, ma comunque visibile. Il picco caratteristico, talvolta
anche picco base, quello a m/z = 60 dato da un riarrangiamento di
McLafferty sul gruppo COOH. Si possono anche osservare picchi pi o meno
pronunciati a M-OH e M-CO2H. Se lacido a lunga catena alifatica, esso
presenter uno spettro tipico degli idrocarburi con la serie di gruppi di picchi
intervallati di 14 unit di massa con (m/z = 45, 59, 73, 87, ) o senza (m/z =
29, 43, 57, 71, 85, ) frammento ossigenato. Gli acidi aromatici presentano
un picco molecolare piuttosto intenso e hanno anche picchi a M-OH e MCO2H. Si assiste ad una perdita di acqua (M-18) se presente in orto un
gruppo contenente idrogeno. Questo un classico esempio di effetto orto che
porta alla perdita di una molecola neutra come H2O, ROH o NH3.
In ultimo, la presenza di un picco a m/z = 60 da solo, ci dice che presente
un acido del tipo CH2=C(OH)2+
10. Anidridi: le anidridi sono particolarmente evidenti per via del fatto che
presentano un picco a M-CO2, diagnostico.
11. Esteri: gli esteri alifatici sono caratterizzati da un picco molecolare
abbastanza pronunciato a patto che non cada nella regione tra m/z = 1302000. Il picco pi caratteristico quello che viene fuori da un riarrangiamento
di McLafferty e dalla rottura di un legame C-C non adiacente al carbonile.
Alcuni picchi caratteristici sono quelli a m/z = 74 per esteri metilici, oppure a
m/z = 88 per esteri etilici ecc Per un estere generico R-C(=O)-OR il picco
dello ione R+ piuttosto pronunciato se la catena corta, ma decresce di
intensit molto rapidamente allallungarsi della catena stessa. Al contrario il
picco RCO+ risulta particolarmente evidente e, nel caso degli esteri metilici
cade a M-31. Per esteri a catena lineare si ritrover la sequenza di picchi
distanziati di 14 unit di massa con o senza ossigeno (vd. 9).
Per quanto riguarda gli esteri aromatici, citiamo i benzoati orto sostituiti che
tenderanno a perdere un gruppo R-OH per effetto orto.
12. Ammine: le ammine tendono a frammentarsi per meccanismo . Le ammine
alifatiche hanno sempre una massa pari (m/z = 30, 44, 58, 72, 86, 100) e
spesso lo ione molecolare assente. In particolare un picco a m/z = 30 d

137

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

buoni indizi sulla presenza di un ammina primaria a catena lineare. Tendono


a dare, in seguito alla perdita di un R dei cicli. La tipologia di ciclo sar
naturalmente determinata da quello pi stabile: in particolare si preferiscono
cicli a 6 atomi, piuttosto che a 5. Il picco base generalmente quello che
deriva dalla rottura del legame C-C adiacente allazoto. Quando non vi
alcuna ramificazione sul carbonio , diventa visibile un picco a M-1. Le
ammine aromatiche (aniline) danno invece delle perdite a M-1 e a M-CN.
13. Ammidi: le ammidi alifatiche a catena lineare presentano un picco
molecolare visibile. Ammidi primarie danno un picco intenso a m/z = 44
(O=C=+NH2), mentre un picco moderatamente intenso si trova a m/z = 86
generato dalla rottura del legame C-C in posizione - per formare un
composto ciclico. Sono possibile per ammidi secondarie e terziarie
riarrangiamenti di McLafferty.
14. Nitrocomposti. Nitriti, nitrati e nitrili: i nitro composti alifatici danno
difficilmente dei picchi molecolari distinguibili. La presenza di un nitro
gruppo marcata da picchi a m/z = 30 (pi intenso) e da uno a m/z = 46
(meno intenso). Al contrario, i nitro composti aromatici danno un picco molto
molecolare molto intenso cos come picchi a M-46 in seguito alla perdita di
un gruppo NO2, oppure a M-30 in seguito alla perdita di un gruppo NO. I
nitriti si differenziano dai nitro composti per via della presenza di un gruppo
m/z = 30 (NO+) e dellassenza del picco a m/z = 46.
I nitrati alifatici non presentano un picco molecolare, presentano un picco
piuttosto intenso in corrispondenza della rottura del legame C-C adiacente al
gruppo O-NO2. Si distinguono anche per la presenza di un picco a m/z = 46
(NO2+).
In ultimo vediamo i nitrili, caratterizzati da un gruppo CN. Quelli alifatici
danno un picco molecolare di modesta intensit e in pi presentano un picco
base a m/z = 41 se sono nitrili a catena lineare tra C4 e C9. Un altro picco
diagnostico quello a m/z = 97 caratteristico e molto intenso dei nitrili C8 e
omologhi.
15. Composti solforati: arriviamo alla conclusione di questa carrellata di
informazioni con lanalisi dei composti solforati. Innanzitutto la presenza di

138

Analisi degli inquinanti con laboratorio Interpretazione degli spettri di massa

zolfo marcata dal contribuito isotopico importante del

34

S (4,4%). In altre

parole, la presenza di un picco a M+2 pu aiutare nellidentificazione di un


composto solforato. I mercaptani alifatici hanno un picco molecolare intenso
e per questo facile valutare la presenza di zolfo. Essi frammentano con la
rottura del legame C-C adiacente allatomo di zolfo dando lo ione CH2=SH+
(m/z = 47) caratteristico. La rottura in , d un picco a m/z = 61 e cos via
con intensit decrescente. Mercaptani primari perdono H2S (M-32) e in
seguito etilene. La perdita di etilene continua fino al termine della catena
stessa.
I solfuri presentano un picco molecolare molto intenso e la frammentazione
riguarda principalmente il legame C-C , allatomo di zolfo. I frammenti
generati si rompono ulteriormente per trasferimento di idrogeno ed
eliminazione di un alchene. In ultimo, i disolfuri, presentano un picco
molecolare intenso e portano alla formazione di un frammento RSSH carico.

139

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

CAPITOLO 10
10 Spettroscopie molecolari
Le spettroscopie molecolari sono diverse e in questo capitolo ci soffermeremo
soprattutto su:
1. Spettroscopia a ionizzazione in risonanza
2. Spettroscopia UV (stati elettronici)
3. Spettroscopia RAMAN
4. Spettroscopia IR (stati vibro rotazionali)
5. Spettroscopia fotoacustica
Al termine del capitolo dedicheremo altres una sezione dedicata ad un rapido ripasso
di altre tecniche spettroscopiche incontrate in un altro corso (Analisi di superficie),
giusto per avere una quadratura del cerchio:
6. Spettroscopia XAS
7. Spettroscopia UPS
8. Spettroscopia XPS
9. Spettrofotometria XRF
10. Spettroscopia AES
11. Spettroscopia LEED
12. Spettroscopia EELS
13. Spettroscopia HREELS
Non parleremo della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) in quanto
trova scarse applicazioni nel campo chimico-ambientale. Invitiamo il lettore pi
curioso ad approfondire su altri testi questa spettroscopia a dir poco fondamentale il
altri rami della chimica, uno su tutti quelli organico sebbene interessanti
applicazioni sembrano poter provenire da sistemi SPE-HPLC-NMR-MS i quali per
trovano scarso impiego a causa dei prezzi esorbitanti (superiori al milione di euro).

123

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.1 Spettroscopia a ionizzazione in risonanza


La spettroscopia a ionizzazione in risonanza (RIS) un metodo analitico
estremamente sensibile e selettivo. Esso utilizza una sorgente laser ad una data
frequenza (opportunamente modulabile per analizzare atomi o molecole differenti in
uno stesso esperimento) per espellere elettroni da atomi o molecole generando cos
una coppia ione positivo ed elettrone libero. Questi ioni o elettroni possono essere
poi rilevati e quantificati cos da poter risalire alla concentrazione di questi composti
alinterno del campione.
Il metodo RIS venne inventato negli anni 70 ed oggi utilizzato in un crescente
numero di applicazioni in fisica, chimica e biologia. Il vantaggio principale di questa
tecnica la quasi assenza di rumore di fondo e la grande selettivit.
Un parametro particolarmente significativo la cross-section (in italiano sezione
durto) la quale deve essere ottimizzata e massimizzata dal momento che si riferisce
alla probabilit che i fotoni provenienti dalla sorgente causino lespulsione di un
elettrone dallatomo o molecola in esame.

10.2 Spettroscopia UV-VIS


Una molecola possiede orbitali molecolari che contengono elettroni. Se gli elettroni
sono collocati negli orbitali a pi bassa energia si ha lo stato fondamentale, se si
collocano in quelli a pi alta energia si hanno gli stati eccitati.
Per ogni livello energetico posso calcolarmi lenergia totale conoscendo:

energia cinetica degli elettroni (Te)

termine repulsivo interelettronico (Vel)

termine attrattivo nuclei-elettroni (Ven)

energia cinetica dei nuclei (Tn)

termine repulsivo internucleare (Vnn)

141

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

= Te + Vel + Vne + Tn + Tnn


Risolvendo lequazione di Schrodinger associata si trovano autovalori e auto vettori
corrispondenti. Purtroppo per la risoluzione dellequazione precedente troppo
complicata, per questo si ricorre allapprossimazione di Born-Oppenheimer: visto
che la massa degli elettroni circa 1/1000 della massa dei nuclei, questi si muovono
molto pi velocemente dei nuclei stessi cos che questi possono essere considerati
immobili durante il moto degli elettroni.
Ne consegue che:
el = Te + Vee + Vne + Vnn
dove Vnn = costante.
La risoluzione dellequazione di Schrodinger ci resituisce un profilo energetico in
funzione della distanza internucleare siffatto:

Figura 84 - Profili energetici di uno stato fondamentale (Eo) e di uno stato eccitato (E1).

142

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Il risultato qui raggiunto sconfessa di fatto lapprossimazione armonica che rimane


tuttavia adottabile per lo studio delle transizioni vibrazionali che avvengono a livelli
energetici bassi, in quella zona in cui sia la curva reale sia quella armonica sono
di fatto sovrapponibili.
La descrizione matematica della curva anarmonica della figura precedente data
dallequazione di Morse, una delle numerose funzioni empiriche formulate negli
anni:

dove Da lenergia che serve per rompere il legame, a identifica la forma della buca
di potenziale e Re rappresenta la distanza di legame di equilibrio della molecola.
Utilizzando lequazione di Morse e risolvendo lequazione di Schrodinger si ottiene
che i livelli vibrazionali non sono pi equispaziati, anzi tendono verso un E = 0
nella regione del continuo, nella quale la molecola si dissocia.
I livelli elettronici sono distanziati di unenergia circa pari a 10.000-20.000 cm-1,
contro una distanza di 100 cm-1 per quanto riguarda gli stati vibrazionali e di appena
50 cm-1 per quelli rotazionali. Questo implica che, affinch avvenga una transizione
elettronica siano necessari fotoni ad alta energia e cio con una circa di 500 nm
appartenente alla regione dellUV-VIS.
Eccitando una molecola con una che abbia unenergia pari a quella che differenzia
lo stato elettronico fondamentale da quello eccitato, possibile ottenere delle
transizioni. Esse prendono il nome di transizioni vibroniche.
In accordo con lequazione di Boltzmann sulla popolazione degli stati, si nota che lo
stato elettronico occupato esclusivamente quello fondamentale (n=0). Dal punto di
vista degli stati vibrazionali vale lo stesso discorso e cio che quello popolato
quello fondamentale (v=0).
Le regole di selezione definiscono quelle che sono le transizioni permesse:

non esistono vincoli per v


143

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

sono permesse solo transizioni che permettano un cambio di simmetria (u


g e g u sono permesse. Non lo sono uu e g g. Ricorda che u,
ungerade, una funzione dispari e cio la funzione donda muta di segno
rispetto al centro di simmetria. La funzione g, gerade, una funzione pari e
cio non muta di segno rispetto al centro di simmetria).

sono permesse solo transizioni che mantengano la stessa molteplicit di spin


(singoletto singoletto e tripletto tripletto sono permesse. Non lo sono le
singoletto tripletto).

Alla luce di queste regole possibile ipotizzare quali siano le transizioni elettroniche
permesse e cio quelle che permettono un balzo energetico dallo stato
fondamentale a quello eccitato (in accordo con lenergia incidente) che coinvolge
tutti gli stati vibrazionali: la progressione vibronica fondamentale. Sullo spettro noi
osserveremo una banda che racchiude tutta questa progressione. Le intensit dei
picchi delle singole transizioni vibroniche che andranno a definire la banda sono
proporzionali alla popolazione di un determinato stato vibrazionale eccitato (vedi
figura allinizio del capitolo). Per stabilirlo si ricorre al principio di Franck-Condon:

gli elettroni sono pi leggeri dei nuclei e si muovono pi velocemente

quando avviene una transizione elettronica i nuclei non hanno il tempo di


muoversi. La molecola in una transizione mantiene la stessa geometria dello
stato fondamentale. In una parola le transizioni sono verticali in quanto non
cambia la distanza internucleare.

Alla luce del secondo punto, la transizione partir dalla posizione pi probabile e
cio nello stato n=0 e v=0 e salir verticalmente agli stati eccitati: n=1, v=0, 1, 2, 3
Lintensit sar tanto maggiore quanto pi lo stato di arrivo sar probabile (definito
dalle funzioni donda per quel determinato stato).
Per capirlo occorre introdurre una particolarit e cio che gli stati elettronici
presentano delle curve non perfettamente sovrapposte a quelle dello stato
fondamentale in quanto negli stati eccitati il legame risulta meno rigido e tender
quindi ad allungarsi. Leffetto uno shift delle curve verso destra. Questo spiega il

144

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

perch la transizione pi intensa non la v=0 v=0, ma, ad esempio, la v=0


v=2.
In termini poco rigorosi si pu dire che la transizione visibile quando il segmento
verticale relativo alla transizione elettronica entra nella parabola. Lintensit poi
legata alla forma della funzione donda per un certo stato eccitato.
Per spiegare tutto questo in un modo pi rigoroso, introduciamo il momento di
transizione per una transizione i f :

dove

il momento di dipolo elettrico.

Si pu dimostrare che lintensit della transizione legata al grado di


sovrapposizione delle funzioni donda dello stato fondamentale e dello stato eccitato.
Concludiamo dicendo che non esistono regole di selezione per quanto riguarda v e
v, rispettivamente dello stato fondamentale e dello stato eccitato, perch le funzioni
donda vibrazionali appartengono a due set di differenti funzioni ortonormali (nel
senso che sono relative a due stati elettronici differenti).

10.2.1 Configurazione degli spettrometri UV

I componenti principali della strumentazione per spettrofometria UV/VIS e IR sono


simili, indipendentemente dalla radiazione che deve essere misurata. Ogni strumento
comprender i seguenti componenti:

sorgente di luce

cella per il campione

selettore di lunghezza donda

rivelatore

La loro tipologia e disposizione potranno per variare a seconda della radiazione in


esame e del metodo di misura utilizzato (assorbimento, emissione). Per esempio

145

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

un tipico spettrofotometro UV/VIS lavora in ottica diretta e cio possiede la seguente


configurazione:
Sorgente Selettore di lunghezza donda Campione Rivelatore
Un tipico spettrofotometro IR (gli analizzeremo pi avanti), lavora in ottica inversa e
cio possiede la seguente configurazione:
Sorgente Campione Selettore di lunghezza donda Rivelatore
Iniziamo la nostra rapida carrellata dalla sorgente. In generale una sorgente deve
produrre luce in un ampio ambito di lunghezze donda e deve avere il pi possibile
unintensit di emissione uniforme. Purtroppo le sorgenti ideali non esistono, ma si
dispone di sorgenti che presentano intensit di emissione differenti a seconda della
loro natura:
Tipologia di sorgente

Intervallo di utilizzazione

Lampada al tungsteno

350-2200 nm
Utilizzabile sia per VIS che per IR

Lampada al deuterio

160-380 nm

Successivamente abbiamo il selettore di lunghezza donda. Il suo ruolo quello di


fare in modo che al campione e/o al detector arrivi una specifica . Questo
componente fondamentale se:

si interessati ad una singola lunghezza donda

si devono esplorare in sequenza diverse lunghezze donda (scansione), ad


esempio per ottenere uno spettro di assorbimento.

I pi semplici selettori sono i filtri che sono progettati per selezionare (trasmettere)
un intervallo di lunghezze donda il pi stretto possibile. Sono essenzialmente di due
tipi: ad assorbimento e interferenziali. Quelli ad assorbimento sono costituiti da un
materiale che assorbe selettivamente alcune lunghezze donda. Posso trasmettere un
certo intervallo di lunghezze donda, oppure tutte le radiazioni con lunghezza donda
al di sopra o al di sotto di un determinato valore (passa-alto o passa-basso).
146

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

I filtri interferenziali, invece sono costituiti da due strati metallici semiriflettenti che
inglobano uno strato sottile di CaF2 o MgF2. La luce passa attraverso la superficie,
quando arriva sul secondo lato la luce viene riflessa allindietro. Si realizza
uninterferenza con la luce incidente, costruttiva o distruttiva, in funzione dello
spessore dello strato sottile. Potr essere trasmessa sono una lunghezza donda
specifica.

Figura 85 - Esempio di filtro interferenziale


I filtri sono relativamente economici e utili per ottenere singole bande strette. Se si
devono eseguire misure a diverse lunghezze donda per necessario utilizzare pi
filtri. Inoltre impossibile eseguire una scansione di lunghezze donda.
I monocromatori rappresentano unalternativa ai filtri. Mediante un monocromatore
possibile:

selezionare una qualsiasi lunghezza donda allinterno dellintervallo di


utilizzazione del monocromatore

effettuare una scansione di lunghezze donda

I monocromatori in uso attualmente sono:

prismi

reticoli

I prismi si basano sul fatto che lindice di rifrazione di un materiale funzione della
lunghezza donda e quindi diverse lunghezze donda verranno rifratte con diveri

147

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

angoli. Per spettroscopie UV-VIS si tende ad utilizzare il quarzo, mentre per lIR si
tende ad utilizzare NaCl e KCl. Attualmente, per, i prismi sono per lo pi stati
soppiantati dai reticoli di interferenza.
Dopo il prima si pone una fenditura di uscita la cui larghezza definisce la larghezza
della banda passante. Modificando la posizione del prisma, cambier la lunghezza
donda che passer attraverso la fenditura.

Figura 86 - Schema a blocchi: sorgente, prisma, fenditura di uscita


I prismi permettono di selezionare un ampio ambito di lunghezze donda e sono
relativamente economici. Daltro canto la luce deve passare attraverso il materiale
del prisma e ci limita lintervallo di applicazione del prisma (la radiazione infatti
non deve essere assorbita) e la dispersione minore a lunghezze donda maggiori,
quindi viene poco utilizzato per quanto riguarda la spettroscopia UV/VIS.
I reticoli sono attualmente i monocromatori pi utilizzati nella moderna
strumentazione analitica. Consistono di solito in una superficie riflettende contenente
una serie di incavi paralleli. Sono classificati in base al numero di linee/mm, che
varia in funzione dellintervallo di utilizzazione. Per esempio per lUV/VIS si hanno
da 300 a 2000 linee/mm, mentre per lIR si hanno da 10 a 200 linee/mm. Il loro

148

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

funzionamento basato sul fenomeno dellinterferenza cos che solo alcune


lunghezze donda vengono amplificate a vantaggio di altre che vengono annichilite.

Figura 87 - Schema di un reticolo


Un problema molto frequente quello legato alla luce diffusa e agli errori che
questo pu portare nella lettura dellassorbanza. La luce diffusa costituita da
radiazione di lunghezza donda diversa da quella selezionata Queste radiazioni
indesiderate sono originate da cause differenti; tra queste vi sono le riflessioni del
fascio da parte dei vari componenti ottici e dal contenitore del monocromatore; le
prime derivano da imperfezioni meccaniche nella lavorazione, in particolare dei
reticoli. La dispersione dovuta a particelle di polvere nellatmosfera o sulle superfici
delle parti ottiche causa anchessa radiazioni estranee che raggiungono la fenditura
duscita.
In ultimo vediamo i rivelatori, i quali devono essere in grado di convertire la luce in
un segnale misurabile. Essi si basano su diversi principi fisici in funzione della
lunghezza donda della radiazione incidente. I pi comuni sono:
Tipo di rivelatore

Intervallo di

Propriet misurata

Uso tipico

Fototubo

150-1000 nm

Int. corrente

UV

Fotomoltiplicatore 150-1000 nm

Int. corrente

UV/VIS

Stato solido

350-3000 nm

Varie

Varie

Termocoppia

600-20000 nm

Int. corrente

IR

Termistore

600-20000 nm

Int. corrente

IR

149

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Il fototubo si basa sulleffetto fotoelettrico: un


fotone incide sul catodo rivestito di un materiale
fotosensibile,

provocando

lemissione

di

un

elettrone. Si ottiene una corrente proporzionale alla


intensit della radiazione incidente. I fototubi sono
soggetti ad un rumore di fondo causato da effetti
termici.
Figura 88 - Un fototubo

I fotomoltiplicatori sono simili ai fototubi: la


radiazione

colpisce

infatti

un

catodo

iniziale,

provocando lemissione di elettroni. Questi vengono


per moltiplicati attraverso la collisione con una serie
di dinodi intermedi. La corrente misurata cos
amplificata, rispetto a quella iniziale, di un fattore
molto elevato (106-107).

Figura 89 - Fotomoltiplicatore

Fototubi e fotomoltiplicatori non possono essere usati


come rivelatori nellIR perch lenergia dei fotoni

nellinfrarosso non sufficiente a causare lemissione di un elettrone dal catodo


fotosensibile.
Esiste unaltra tipologia di detector: i fotodiodi. Quando si applica un opportuno
potenziale ad un cristallo di Si drogato si ottengono due aree: n (ricca di elettroni) e p
(ricche di cariche positive). In condizioni di riposo non si ha passaggio di corrente.
Quando il fotodiodo viene esposto alla luce, la radiazione incidente produce nuove
coppie di cariche positive e negative allinterno del materiale permettendo il
passaggio di corrente. Lintensit di corrente proporzionale alla quantit di luce
incidente. Un fotodiodo pi sensibile di un fototubo e costa meno di un
fotomoltiplicatore.

150

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

E possibile ottenere una serie di fotodiodi (array di fotodiodi), ricavati ad intervalli


di spazio regolari su di un microchip. Inserito in uno strumento con unottica
opportuna, questo tipo di rivelatore permette di misurare simultaneamente radiazioni
di diverse lunghezze donda (10.2.4).
Tra i rivelatori IR citiamo le termocoppie e i termistori. Questi sistemi basano il loro
funzionamento sul riscaldamento di un elemento metallico. Nellesempio delle
termocoppie, si uniscono due elementi differenti che, assorbendo la radiazione IR, si
riscaldano in modo diverso. Questa differenza di temperatura (nellordine anche dei
milionesimi di Kelvin) viene rivelata e trasformata in una differenza di potenziale.
Dopo aver visto quali sono le componenti di uno spettrofotometro vediamo
brevemente come possono essere assemblati. Essi si possono suddividere nelle
seguenti categorie:

singolo raggio

doppio raggio

multicanale (sar approfondito in seguito)

Lo spettrofotometro a singolo raggio lavora ad una singola lunghezza donda


selezionata. E utilizzato normalmente per effettuare analisi che prevedono misure ad
una sola lunghezza donda e per soluzioni con un solo analita. Non adatto a misure
da effettuarsi a differenti lunghezze donda o alla costruzione di spettri di
assorbimento, in quanto non possibile tenere conto delle variazioni della emissione
della sorgente, dellassorbimento del solvente e della cella e della risposta al detector
al variare della lunghezza donda.

Figura 90 - Schema di uno spettrofotometro a singolo raggio

151

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Uno spettrofotometro a doppio raggio misura contemporaneamente lassorbimento


della radiazione da parte del campione e del riferimento. Il rapporto fra queste due
grandezze rappresenta lassorbimento dovuto allanalita, ed indipendente da tutte le
altre variabili legate alla variazione della lunghezza donda. Esistono due tipi di
spettrofotometri a doppio raggio:
1) spettrofotometri a doppio raggio nel tempo
2) spettrofotometri a doppio raggio nello spazio
Uno spettrofotometro a doppio raggio nel tempo utilizza un chopper (di solito
uno specchio rotante) per inviare alternativamente la radiazione attraverso il
campione ed attraverso il riferimento. La radiazione alternativamente trasmessa da
campione e riferimento viene poi misurata da un unico rivelatore.

Figura 91 - Spettrofotometro a doppio raggio nel tempo

Questo approccio riduce gli errori legati a variazioni nellemissione della lampada e
nella risposta del rivelatore, poich lassorbimento del campione viene misurato
relativamente a quello del riferimento.

152

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Il rumore (noise) viene inoltre ridotto utilizzando un amplificatore lock-in che


misura solo i segnali con la giusta frequenza, cio quella con la quale il fascio di
radiazione viene alternato fra campione e riferimento (la frequenza di rotazione del
chopper).
Pertanto, con uno spettrofotometro a doppio raggio nel tempo si possono ottenere
facilmente spettri, ed il rumore di fondo viene notevolmente ridotto. Esistono per
alcune limitazioni: ad esempio non possibile misurare correttamente variazioni di
assorbanza che avvengono a velocit confrontabili o maggiori di quella di rotazione
del chopper. Non quindi possibile effettuare studi cinetici che coinvolgono reazioni
veloci.
In uno spettrofotometro a doppio raggio nello spazio il fascio di radiazione viene
diviso in due parti mediante uno specchio fisso, ed i due fasci vengono inviati
rispettivamente sul campione e sul riferimento. Non esistono parti mobili, ed
possibile studiare anche processi molto veloci. Sono per necessari due rivelatori
distinti che devono pertanto avere caratteristiche simili.

Figura 92 - Spettrofometro a doppio raggio nello spazio

In conclusione di tutta questa carrellata di informazioni, alcune magari gi note,


possiamo elencare alcune caratteristiche fondamentali da tenere in considerazione
per qualsiasi tipologia di analisi con uno spettrofotometro:
153

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

a) di primaria importanza la definizione della banda passante attraverso delle


opportune fenditure poste a valle dellelemento disperdente (che sia un
prisma od un reticolo). Essa deve essere la pi stretta possibile (fino a 0,1
nm) in modo da ridurre lerrore associato alla misura e deve essere relativa
sempre ad un massimo di assorbanza (per lo stesso motivo). Il problema
che, pi stretta la banda passante, meno luce raggiunger il detector e
questo restituisce dei problemi di risoluzione spettrale.
b) La spettroscopia UV/VIS estremamente sensibile (fino a ppb), ma ha una
bassa selettivit il che significa che non possiamo, a meno di avere in un
campione un solo analita, ottenere delle informazioni qualitative.
c) La quantificazione avviene attraverso la legge di Lamber Beer la quale deve
essere applicata in un intervallo di linearit. E bene non tenere in
considerazione valori di assorbanza (-Log T, dove T la trasmittanza) troppo
bassi (potrebbero essere dovuti al fondo, ad uninterferenza o ad una
mancanza di sensibilit) o troppo alti (potrebbero essere dovuti ad un autoassorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la
soluzione).
d) La legge di Lambert Beer : A = bc, dove indica la probabilit di
avvenire di una certa transizione. Esso non potr essere infinito, ma potr
arrivare fino ad un massimo di 150.000 (limite teorico).

10.2.3 Spettri in derivata

Lo spettro UV convenzionale un grafico di assorbanza (A) contro la lunghezza


donda (). Questo spettro, detto anche di ordine zero, pu essere convertito nello
spettro in derivata prima (primo ordine), nel quale la pendenza dello spettro normale
dA/d riportato contro . Similarmente lo spettro in derivata seconda (secondo
ordine) un grafico di d2A/d2 contro . Questa conversione da spettro in
assorbimento a spettro in derivata illustrata nella figura 93, dove sono riportate le
derivate prima, seconda, terza e quarta di una banda di assorbimento ideale di tipo
gaussiano. Come si pu osservare, la derivata prima presenta un punto di zero in

154

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

corrispondenza del massimo dello spettro convenzionale, mentre la derivata seconda


caratterizzata da due massimi satelliti e da un minimo corrispondente al massimo di
ordine zero.
Lo spettro UV in derivata rispetto a quello convenzionale presenta due principali
vantaggi:
1) Migliore risoluzione delle bande spettrali parzialmente sovrapposte. Questo
mostrato in Figura 94 dove sono riportati gli spettri in assorbanza (a) ed in
derivata seconda (b) di miconazolo nitrato, composto caratterizzato da uno
spettro UV di tipo benzenoide con una parziale struttura fine vibrazionale.
Come si pu osservare, flessi e spalle presenti nello spettro di ordine zero
vengono convertiti in strette ed intense bande nello spettro in derivata
seconda. Questo potenziamento della risoluzione porta ad una migliore
impronta digitale per la identificazione del composto in esame ed anche alla
possibilit di determinare selettivamente un composto in presenza di un altro.

Figura 93 - Derivate dal primo (1D) al quarto (4D) ordine di una banda di assorbimento (A) gaussiana ed
indicazione di alcune ampiezze (D) dei picchi utili per determinazioni quantitative.

155

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Figura 94 - Spettro UV di ordine zero (a) ed in derivata seconda (b) di miconazolo nitrato

Questa potenziata capacit risolutiva consente anche di determinare impurezze in


presenza del principio attivo di un farmaco per esempio. E noto, a titolo di esempio,
che lacido acetilsalicilico pu contenere lacido salicilico come impurezza da
idrolisi. In figura 95 a sinistra riportato lo spettro convenzionale dellacido
acetilsalicilico (ASA) puro e quello di ASA contenente 2% di acido salicilico (SA).
Il primo rappresentato da una linea continua, il secondo da una linea tratteggiata;
nella stessa figura a destra sono riportati i corrispondenti spettri UV in derivata
prima. Come si pu osservare, tracce di acido salicilico determinano solo una
evidente alterazione (spalla) del profilo dello spettro di ASA, mentre lo spettro in
derivata presenta un distinto massimo a 318 nm. Questo massimo cade ad una
lunghezza donda alla quale la derivata prima di ASA zero e quindi consente di
valutare selettivamente il contenuto dellimpurezza di SA.

156

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Figura 95 - A sinistra: spettro UV di acido acetilsalicilico (linea continua) e di acetico acetilsalicilico


contenente il 2% di acido salicilico (line atratteggiata). A destra: spettro UV in derivata prima di acido
acetilsalicilico contentente il 2% di acido salicilico (linea tratteggiata)

2) Un altro aspetto utile della spettroscopia UV in derivata la sua capacit di


valorizzare le bande spettrali strette rispetto a quelle larghe; infatti,
lampiezza del picco in derivata (D) inversamente proporzionale
allampiezza della banda spettrale fondamentale (w) secondo lespressione
D (1/w)n, dove n lordine della derivata. Questa discriminazione a favore
delle bade strette contente di:
a. acquisire buona sensibilit anche con composti benzenoidi a struttura
fine (efedrina, miconazolo nitrato, ecc..), caratterizzati da bassi valori
di A;
b. eliminare linterferenza di larghe bande di assorbimento dovute alla
matrice (per esempio eccipienti di una formulazione farmaceutica).
Nello spettro di ordine zero questo assorbimento di fondo contribuisce
ad aumentare lassorbanza e quindi porta ad errori in eccesso nella
determinazione quantitativa di un analita.
Da un punto di vista quantitativo tutti i picchi sono proporzionali alla concentrazione.
Gli svantaggi di questa tecnica sono legati ad una diminuzione del rapporto
segnale/rumore. Per questo motivo possibile effettuare fare degli spettri in derivata

157

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

soltanto se lo spettro fondamentale risulta particolarmente pulito (esempio ottenuto


da uno spettrofotometro a doppio raggio nel tempo).
Per generare le derivate degli spettri ci si pu servire di metodi ottici, elettronici e
matematici. Sebbene le tecniche ottiche ed elettroniche abbiano costituito le basi
della prima spettroscopia UV-visibile, oggi sono state ampiamente sostituite dai
metodi matematici.
Per calcolare la derivata a una particolare lunghezza donda (), si seleziona una
finestra di n punti di dati e vi si inserisce una funzione polinomiale

con il metodo dei minimi quadrati. I coefficienti a0 al a ciascuna lunghezza


donda sono i valori delle derivate, dove a 1 la derivata prima, a2 la derivata
seconda e cos via. Savitzky e Golay svilupparono un metodo di esecuzione dei
calcoli molto efficace che oggi costituisce la base dellalgoritmo di derivatizzazione
nella maggior parte degli strumenti commerciali. Questo metodo serve anche per
livellare i dati. Se lordine del polinomio (l) inferiore al numero di punti di dati
(2n+1) nella finestra, in genere la funzione polinominale non riesce a passare
attraverso tutti i punti. Ecco perch i minimi quadrati danno unapprossimazione
livellata ai punti originali.
Un metodo meno veloce di quello di Savizky e Golay, quello per cui, presi una
serie di dati (A vs ) ci costruiamo una tabella
X1

Y1

X2

Y2

A questo punto ci possiamo calcolare la derivata prima come rapporto tra y e x.


I metodi elettronici ricorrono agli amplificatori operazionali che un tipo di
amplificatore differenziale. Nella fattispecie amplifica la differenza dei due segnali di

158

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

ingresso, ossia, il guadagno differenziale. Se si utilizza questo metodo, bene


scegliere una opportuna velocit per la scansione dello spettro, in quanto la velocit
di acquisizione a scapito della risoluzione.
Un ultimo metodo per trovare lo spettro in derivata quello che prevede la non
conoscenza dello spettro, ma solo un assorbimento ad una 0 fissata. Quello che si
compie una modulazione della lunghezza donda intorno a 0 utilizzando
fenditure, specchi, reticoli o prismi, dischi In altre parole io conosco solo I(0). Un
singolo dato pu per essere espanso grazie ad una serie numerica (es. serie di
Taylor):

Allinterno dellespressione precedente io posso inserire al posto di il seguente


valore che rappresenta i valori di che vengono mano a mano registrati attraverso la
modulazione di cui sopra:

dove

la frequenza di modulazione.

Come detto si sostituisce la precedente espressione di allinterno della serie di


Taylor e otterr due macrotermini: uno non dipendente da
dipendente da

. I termini dipendenti da

e un secondo

contengono in s le informazioni legate

alla derivata prima ( ), seconda (2 ) ecc Con un opportuno rivelatore lock-in,


sono in grado di andare a leggere il segnale ottenuto con una frequenza di
oscillazione intorno a 0

e otterr uno spettro in derivata prima, oppure potr

andare a leggere il segnale relativo alla frequenza 2

e otterr lo spettro in derivata

seconda e cos via

159

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.2.4 Tecniche multicanale

Nella sezione 10.2.1 abbiamo parlato degli spettrofotometri a singolo e a doppio


raggio, mentre avevamo soltanto accennato a quelli multicanale. Questi possono
essere utilizzati unicamente nella spettrofotometria UV-VIS e sono caratterizzati da
un array di fotodiodi in grado di rilevare contemporaneamente un ampio range di
lunghezze donda. La risoluzione non molto elevata e dellordine di 1 nm, per
in grado di effettuare un intero spettro in meno di 1 s.
E utilizzato nei moderni spettrofotometri. Si basa sullutilizzo di semiconduttori
(come il Silicio ed il Germanio).

Figura 96 - Esempi di semiconduttori

Se in un cristallo di silicio si introduce una piccola percentuale di un elemento che


possiede un elettrone in pi rispetto al silicio (Sb, As, ecc.), si ottiene un materiale
con elettroni liberi nella struttura cristallina, denominato Semiconduttore di tipo n
(Si-n).
Introducendo un elemento con un elettrone in meno (B, In, Ga), si ottiene un cristallo
con delle cariche positive nella struttura ( sempre in piccola percentuale), chiamato
semiconduttore di tipo p (Si-p).
Il diodo a semiconduttore costituito dalla giunzione di un semiconduttore di tipo p
(Si-p) ed uno di tipo n (Si-n). Si utilizza in stato di polarizzazione inversa, cio il
polo (-) della tensione si applica al terminale Si-p. In queste condizioni, nel diodo
non passa corrente.

160

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Figura 97 - Funzionamento di un DAD

Quando una radiazione colpisce la giunzione di un diodo, si generano delle cariche


(+) e cariche (-), che sono convogliate nel circuito dalla tensione applicata. Si genera
una intensit di corrente proporzionale allIntensit della radiazione incidente.
Un insieme di fotodiodi (circa 500) costituisce un rivelatore a serie di fotodiodi;ogni
singolo fotodiodo pu misurare lintensit in un intervallo spettrale di 1-2 nm.

Figura 98 - Un array di fotodiodi

Di seguito riportiamo un esempio di spettrofotometro multicanale:

Figura 99 - Esempio di spettrofotometro multicanale

161

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Questo genere di spettrofotometro non ha parti mobili, in quanto la luce viene


separata nelle sue componenti dal reticolo e tutte le lunghezze donda vengono poi
rilevate dal rivelatore ad array costituito da tanti diodi messi in serie. La banda
passante dipende quindi dal numero di rivelatori componenti larray (fotodiodi). Per
esempio se il = 512 nm e disponiamo di 512 fotodiodi (il numero di fotodiodi
sempre in base 2: 512, 1024, ) , la banda passante sar di 1 nm.
Il vantaggio in questo caso la velocit di rilevazione (tutte le sono rilevate
istantaneamente, non quindi necessaria una scansione), mentre lo svantaggio
principale che il campione sempre sottoposto alla luce e quindi, nel caso in cui sia
fotosensibile, pu degradarsi.

10.2.5 Analisi qualitativa nella spettroscopia


UV/VIS

Gli spettri nella regione del visibile e dellultravioletto presentano generalmente un


numero limitato di bande di assorbimento larghe. Paragonata ad altre tecniche, quali
la spettroscopia a infrarossi - nei quali la produzione di bande strette copiosa -, la
spettroscopia UV-visibile fornisce solo una quantit limitata di informazioni
qualitative. Nei composti organici, gran parte dellassorbimento dovuto alla
presenza di legami (vale a dire insaturi). Un cromoforo un raggruppamento
molecolare che in genere contiene un legame : quando viene inserito in un
idrocarburo saturo (che non presenta uno spettro di assorbimento UV-visibile),
produce un composto che assorbe tra i 185 e i 1000 nm. La Tabella seguente elenca
alcuni cromofori e le lunghezze donda del loro massimo di assorbimento.
La presenza di una banda di assorbimento a una particolare lunghezza donda spesso
un buon indizio rivelatore dellesistenza di un cromoforo. Si noti tuttavia che la
posizione del massimo di assorbimento non fissa ma dipende in parte dallo stato
molecolare del cromoforo e dal solvente in cui il campione disciolto. Anche altri
parametri, quali il pH e la temperatura, possono influire sia sullintensit, sia sulla
lunghezza donda del massimo di assorbimento.

162

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Tabella 4 - Selezione di cromofori e relativi massimi di assorbimento

Coniugando il doppio legame con altri doppi legami si aumenta sia lintensit che la
lunghezza donda della banda di assorbimento. Nel caso di alcuni sistemi molecolari,
come gli idrocarburi o i carotenoidi coniugati, sono state condotte ricerche
sistematiche sul rapporto tra intensit e lunghezza donda. Anche gli ioni di
transizione dei metalli hanno livelli energetici elettronici che determinano
lassorbimento a 400700 nm nella regione visibile.
Anche se gli spettri UV-visibili non consentono lidentificazione assoluta di un
composto sconosciuto, spesso vengono usati per confermare lidentit di una
sostanza attraverso il confronto dello spettro misurato con uno spettro di riferimento.
Laddove gli spettri sono molto simili, possibile ricorrere agli spettri derivati
La maggior complessit degli spettri derivati si rivela utile nellanalisi qualitativa, sia
per caratterizzare le sostanze, sia a scopo di identificazione. Per esempio, lo spettro
di assorbimento del testosterone, un ormone steroideo, mostra ununica banda larga,
senza tratti caratteristici, centrata a circa 330 nm, mentre la derivata seconda presenta
sei picchi distinti.
Il potenziamento della risoluzione pu rivelarsi utile anche nellidentificazione di un
composto sconosciuto. Quando nella modalit di assorbanza si addizionano due
bande gaussiane con larghezza di banda spettrale naturale di 40 nm separate da 30

163

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

nm, si ottiene ununica banda con massimo equidistante dai risultati delle bande dei
due componenti. I due componenti non sono risolti. Nella derivata quarta, le due
bande sono invece chiaramente visibili, con i massimi centrati vicino alla max delle
bande dei componenti.

10.2.6 Analisi quantitativa nella spettroscopia


UV/VIS

La spettroscopia di assorbimento basata sulla radiazione ultravioletta e visibile uno


degli strumenti disponibili pi utili per un chimico per lanalisi quantitativa. Le
caratteristiche importanti dei metodi spettrofotometrici sono:
1. Ampia applicabilit. Numeri enormi di specie inorganiche, organiche e
biochimiche assorbono radiazione visibile o ultravioletta e sono cos
disponibili per la determinazione quantitativa diretta. Anche molte specie non
assorbenti possono essere determinate dopo conversione chimica a derivati
assorbenti (es. aldeidi derivatizzabili con dinitro-fenil-idrazina). E stato
stimato che oltre il 90% delle analisi realizzate nei laboratori chimici sono
basate sulla spettroscopia di assorbimento UV/VIS.
2. Alta sensibilit. I limiti di rivelabilit tipici per la spettroscopia UV/VIS
variano tra 10-4 e 10-7.
3. Selettivit da moderata ad alta. Spesso, possibile trovare una lunghezza
donda alla quale soltanto lanalita assorbe e ci rende le separazioni
preliminari non necessarie.
4. Buona accuratezza. Gli errori relativi in concentrazione incontrati con una
procedura tipica spettrofotometrica o fotometrica usando la radiazione
ultravioletta e visibile giacciono nellintervallo dall1% al 5%. Tali errori
possono spesso essere diminuiti fino a pochi decimi di percentuale con
speciali precauzioni
5. Facilit e convenienza. Le misure spettrofotometriche e fotometriche sono
facilmente e rapidamente eseguite con strumenti moderni.
164

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Un primo passo in qualunque metodo fotometrico o spettrofotometrico lo sviluppo


delle condizioni che producono una relazione riproducibile fra assorbanza e
concentrazione dellanalita:
1. Selezione della lunghezza donda. Per ottenere la sensibilit massima, le
misure di assorbanza spettrofotometriche sono ordinariamente eseguite ad
una lunghezza donda corrispondente ad un picco di assorbimento, perch la
sensibilit (cambiamento dellassorbanza per unit di concentrazione)
maggiore in questo punto.
2. Variabili che influenzano lassorbanza. Variabili comuni che influenzano lo
spettro di assorbimento di una sostanza includono il tipo di solvente, il pH
della soluzione, la temperatura, lalta concentrazione di elettrolita e la
presenza di sostanze interferenti.
3. Determinazione della relazione fra assorbanza e concentrazione. Gli standard
di calibrazione per unanalisi spettrofotometrica o fotometrica dovrebbero
approssimare quanto pi possibile la composizione complessiva del campione
reale, e dovrebbero coprire un intervallo ragionevole di concentrazioni di
analita.
4. Analisi delle miscele. Lassorbanza totale di una soluzione ad una qualsiasi
lunghezza donda eguale alla somma delle assorbanze dei componenti
individuale nella soluzione. Questa relazione rende possibile, in principio, la
determinazione della concentrazione dei componenti individuali di una
miscela anche se c totale sovrapposizione nei loro spettri. Per esempio, la
figura seguente mostra lo spettro di una soluzione contenente una miscela
della specie M e della specie N, insieme agli spettri di assorbimento
individuali. Notiamo che non esiste alcuna lunghezza donda alla quale
lassorbanza dovuta ad una soltanto di queste componenti. Per analizzare la
miscela, le assorbanze specifiche molari per M ed N sono prima determinate
alle lunghezze donda 1 e 2 con concentrazioni sufficienti delle due
soluzioni standard per essere sicuri che la legge di Beer sia osservata in un
intervallo di assorbanze che comprende lassorbanza del campione. Si noti
che le lunghezze donda selezionate sono quelle alle quali le assorbanze

165

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

specifiche molari dei due componenti differiscono significativamente. Di


conseguenza, a 1 lassorbanza specifica molare del componente M di gran
lunga maggiore rispetto a quella del componente N. Lopposto vale per 2.
Per completare lanalisi, si determina lassorbanza della miscela a queste due
lunghezze donda. Dalla conoscenza delle assorbanze specifiche molari e dal
cammino ottico si ottengono le seguenti equazioni:

dove il pedice 1 indica le misure a 1 e il pedice 2 indica quelle a 2. Con i


valori di e b noti, le precedenti equazioni costituiscono un sistema di due
equazioni in due incognite che possono essere facilmente risolte.

Figura 100- Spettro di assorbimento di una miscela a due componenti (M+N) con gli spettri dei singoli
componenti

Concludiamo questa parte legata alla spettroscopia UV/VIS dicendo che sono
possibili anche quantificazioni di analiti indirette attraverso, per esempio, delle
derivatizzazioni che permettono un miglior assorbimento UV/VIS da parte di una
molecola che assorbe poco.
166

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.2.7 Applicazioni UV-VIS in campo ambientale

Ammoniaca NH3. Con il reattivo di Nessler lammoniaca pu essere


derivatizzata.

Oppure

NH3

pu

essere

trattata

con

fenolo+nitro

prussiato+ipoclorito

Azoto organico. Le molecole organiche contenenti azoto possono essere


trattato con il metodo Kjeldahl che porta alla formazione di NH3.

Cloro. Viene ossidato con composti organici

Cianuro. Si tratta con cloramina T. Non si fa per cromatografia ionica in


quanto hanno una pKa (HCN) di circa 10 e in generale gli acidi con pKa > 6
non vengono trattati in questo modo.

Nitriti. Escono come picco di spalla dei cloruri. Vengono derivatizzati con il
reattivo di Griess

Nitrati. Vengono rilevati per via colorimetrica.

Silice: viene fatta reagire con molibdeno.

Fosfati. Vengono ossidati per la determinazione dei fosfati organici.

Metalli:

Vengono

derivatizzati

per

complessazione.

Possibilit

di

speciazione.

10.2.8 Spettrometria ad alta sensibilit

Per aumentare la sensibilit in un metodo spettrofotometrico possibile aumentare la


lunghezza della cella, quindi il cammino ottico (legge di Lambert Beer). Questo fatto
risulta particolarmente importante quando abbiamo a che fare con i gas. Vedremo
infatti che nellinfrarosso utilizzeremo delle celle a cammino multiplo, possibili
grazie alla presenza di opportuni specchi.

167

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.3 Spettroscopia IR
In questo paragrafo ci occupiamo della spettroscopia IR, la quale possiede energia
sufficiente per perturbare i livelli vibrazionali e quelli rotazionali delle molecole
gassose. Gli stati elettronici rimangono invece imperturbati.
Per i livelli vibrazionali, risolvendo lequazione di Schrodinger, si ottiene che
lenergia associata ad essi data da:
v=0,1,2 (numero quantico vibrazionale)
Per i livelli rotazionali, lenergia, sempre risolvendo lequazione di Schrodinger,
data da:
J = 0,1,2. (numero quantico rotazionale)
Qualora si sia in fase gassosa, come abbiamo visto, la spettroscopia IR coinvolge
anche gli stati rotazionali cos che sar necessario parlare di energia rotovibrazionale
data da:

Si tenga presente che la separazione tra i livelli energetici vibrazionali molto


maggiore rispetto a quella che c tra i livelli rotazionali (1000 cm -1 contro 3 cm-1).

168

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Figura 101 - Livelli energetici vibrazionali e rotazionali

Vediamo ora come distribuita la popolazione delle molecole tra i vari stati
rotazionali e vibrazionali. Per farlo usufruiamo dellequazione di Boltzmann:

Figura 102 - La curva rossa rappresenta la distribuzione degli stati rotazionali. La linea nera quelli
vibrazionali.

169

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Dal grafico (fa schifo, lo ammetto) si evince come a T=300 K in condizioni standard
gli stati rotazionali fino a J=7-8 sono molto popolati. Lo stesso discorso per non si
pu applicare agli stati vibrazionali. Pertanto si pu affermare che lunico stato
effettivamente popolato per quanto riguarda i livelli vibrazionali quello
fondamentale. Quelli rotazionali invece sono popolati in maniera pi omogenea.
Anche per la spettroscopia IR bene definire le regole di selezione:

Transizioni vibrazionali: risolvendo lespressione legata al momento di


transizione notiamo che essa diversa da zero (quindi fa s che avvenga una
transizione) quando sono verificate contemporaneamente le seguenti
condizioni:
a) Al cambiare della distanza tra i nuclei cambia anche il momento di dipolo
elettrico. Alla luce di ci le molecole biatomiche omonucleari (N2,
O2,) non assorbono, mentre quelle lineari come la CO2 hanno dei moti
IR attivi
b) v = 1

Transizioni rotazionali: risolvendo lespressione legata al momento di


transizione notiamo che essa diversa da zero quando:
a) le molecole presentano un momento di dipolo elettrico permanente
b) J = 1

10.3.1 Strumenti per spettroscopia infrarossa

Tre tipi di strumenti nellinfrarosso sono presenti nei laboratori moderni: spettrometri
dispersivi, spettrometri in trasformata di Fourier (FTIR), e fotometri a filtro. I primi
due sono utilizzati per ottenere spettri completi per lidentificazione qualitativa,
mentre i fotometri a filtro sono progettati per lavoro quantitativo. Gli strumenti in
trasformata di Fourier e a filtro sono non dispersivi, nel senso che non impiegano un
reticolo o un prisma per disperdere la radiazione nelle sue lunghezze donda.

170

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.3.1.1 Strumenti dispersivi

Con una differenza, gli strumenti dispersivi nellinfrarosso sono simili nello schema
generale agli spettrofotometri a doppio raggio (nel tempo) mostrati qualche pagina
indietro. Le differenze consistono nella posizione del portacampione rispetto al
monocromatore. Nella maggior parte degli strumenti nellUV/VIS, le cellette sono
posizionate fra il monocromatore ed il rivelatore per evitare la decomposizione
fotochimica, che pu avvenire se i campioni sono esposti alla piena potenza della
sorgente. La radiazione infrarossa, al contrario, non sufficientemente energetica da
provocare decomposizione, di conseguenza il compartimento delle cellette pu
essere posizionato fra la sorgente e il monocromatore. Questa disposizione
vantaggiosa perch qualunque radiazione diffusa o emessa generata nel
compartimento del campione in gran parte rimossa dal monocromatore.
Le sorgenti infrarosse sono solidi riscaldati (quindi non pi le lampade al deuterio
utilizzate per la radiazione UV), i reticoli nellIR sono pi grossolani di quelli
richiesti per la radiazione UV/VIS, e i rivelatori nellIR rispondono al calore pi che
ai fotoni. Inoltre, le componenti ottiche degli strumenti nellinfrarosso sono costruite
con Sali raffinati, come cloruro di sodio o bromuro di potassio.

10.3.1.2 Spettrometri in trasformata di Fourier

Gli spettrometri nellIR in trasformata di Fourier (FTIR) offrono i vantaggi di una


sensibilit inusualmente alta, di elevata risoluzione e velocit di acquisizione dei dati
(i dati di un intero spettro possono essere ottenuti in un secondo o meno). Allinizio
gli strumenti FTIR erano ingombranti, complessi e con dispositivi costosi controllati
da computer da laboratorio altrettanto costosi. Non appena la strumentazione
coinvolta ed il prezzo dei computer diminu drammaticamente, mentre migliorarono
di alcuni ordini di grandezza la potenza, la velocit e la facilit duso, gli
spettrofotometri FTIR diventarono comuni in laboratorio. Ad oggi questo genere di
strumento il pi presente.

171

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Gli strumenti in trasformata di Fourier non contengono elementi dispersivi e tutte le


lunghezze donda sono rivelate e misurate contemporaneamente usando un
interferometro di Michelson (10.3.1.2.1 Linterferometro di Michelson). Per
separare le lunghezze donda, necessario modulare il segnale della sorgente che
attraversa l campione, in modo che esso possa essere registrato come
interferogramma. Un interferogramma una registrazione del segnale prodotto da un
interferometro di Michelson. Il segnale elaborato mediante un procedimento
matematico noto come trasformata di Fourier per produrre uno spettro IR.
Linterferogramma successivamente decodificato con una trasformata di Fourier,
unopportuna operazione matematica eseguita dal computer che attualmente parte
integrante di tutti gli spettrometri. Sebbene la teoria matematica particolareggiata
delle misure in trasformata di Fourier esuli dagli obiettivi, ci ritorneremo pi o meno
qualitativamente quando parleremo di Interferometro di Michelson pi nel dettaglio.
Gli strumenti didattici sono relativamente economici (circa 10.000uro), hanno una
risoluzione di 4 cm-1 e raggiungono un rapporto segnale-rumore di 5000 per una
misura di un minuto. Quelli per la ricerca hanno invece un costo almeno 6 volte
maggiore, una risoluzione di 0,125 cm-1 o migliore e producono un rapporto segnalerumore di 33000 per un periodo di misura di 1 minuto.
10.3.1.2.1 Linterferometro di Michelson e larchitettura di uno
FTIR

Figura 103 - Schema di funzionamento di uno spettrofotometro FTIR

172

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Uno spettrofotometro a trasformata di Fourier FTIR consiste in una sorgente di luce


collimata, uno specchio fisso (SF), uno specchio mobile (SM), un partitore di fascio
(SS) e un rivelatore. La sorgente di luce pu essere continua come nella spettroscopia
FTIR o monocromatica, quale un laser (lo vedremo in seguito) o una lampada ad
arco di sodio. Gli specchi sono costituiti da vetro liscio, ultra piatto, con uno strato
riflettente depositato in fase vapore sulla loro superficie. Lo specchio mobile di
solito montato su un supporto lineare molto preciso che gli consente di muoversi
lungo la direzione del fascio di luce rimanendo perpendicolare ad esso, come
mostrato nellimmagine.
Il punto chiave del funzionamento dellinterferometro il partitore di fascio, che di
solito uno specchio parzialmente argentato simile agli specchi ad una sola via che
spesso si osservano nei negozi al dettaglio e nelle aule per interrogatori di polizia. Il
partitore di fascio fa s che una frazione della luce passi attraverso di esso mentre
unaltra venga riflessa. Il dispositivo lavora in entrambe le direzione, cosicch la
luce, colpendo entrambi i lati del partitore di fascio, viene parzialmente riflessa e
parzialmente trasmessa.
Per semplicit useremo come sorgente di luce la riga blu del laser a ioni-argon. Un
fascio A proveniente dalla sorgente colpisce il partitore di fascio, che inclinato di
45 rispetto al fascio in arrivo. Il nostro partitore di fascio presenta il rivestimento sul
lato sinistro, cos il fascio A penetra nel vetro e viene parzialmente riflesso dal lato
interno del rivestimento. Esso riemerge dal partitore di fascio come raggio A e si
dirige verso lo specchio fisso, dove viene riflesso per ritornare verso il divisore di
fascio. A questo punto, parte del raggio viene quindi trasmessa attraverso il partitore
di fascio al rivelatore. Sebbene il fascio perda un po di intensit a seguito di
ciascuna interazione con lo specchio fisso e il partitore di fascio, leffetto
complessivo che una frazione (fascio A) del fascio incidente A alla fine raggiunge
il rivelatore.
Nella prima interazione con il partitore di fascio, la frazione del fascio A che
trasmessa emerge alla destra dello specchio mobile come fascio B. Quindi esso viene

173

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

riflesso e ritorna sul lato sinistro del partitore di fascio, dove viene riflesso verso il
rivelatore.
Lobiettivo principale dellottica dellinterferometro consiste nel dividere il fascio
incidente in due fasci che si muovono nello spazio su percorsi separati e che si
ricombinano sul rivelatore. E in questa regione che i due fasci, o i due fronti donda,
interagiscono per formare un profilo di interferenza dando origine a interferenze
costruttive e distruttive.
Essendoci uno specchio mobile, i punti di interferenza costruttiva saranno spostati in
quanto cambia la differenza di cammino ottico. Il profilo che ne risulta di tipo
sinusoidale e rappresenta la differenza di intensit che raggiunge il rivelatore in
funzione del tempo. Per passare dal dominio dei tempi al dominio delle frequenze,
applichiamo la trasformata di Fourier (figura 106).

Figura 104

174

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Se anzich avere una sorgente rappresentata da un solo laser, ne abbiamo una con
due laser, il segnale che apparir in uscita dallinterferometro esibir un profilo un
po pi complesso rispetto a quello della figura precedente. Applicando la
trasformata di Fourier riusciamo ad ottenere, nel dominio delle frequenze, i valori di
frequenza corrispondenti alle lunghezze donda delle nostre sorgenti.

Figura 105

Fino ad ora ci siamo occupati di spiegare come linterferometro di Michelson pu


produrre informazioni sullintensit per una sorgente di luce in funzione della
lunghezza donda. Lo spettro di un campione pu essere ottenuto acquisendo prima
di tutto un interferogramma di riferimento della sorgente senza la presenza del
campione sul cammino ottico. Quindi il campione viene posto nella posizione e di
nuovo facciamo s che lo specchio esegua la sua scansione acquisendo cos un
secondo interferogramma. Nella spettrometria FTIR; il campione assorbe la
radiazione infrarossa che attenua il fascio nellinterferometro. Quindi, viene valutata
la differenza tra il secondo interferogramma (quello del campione) e quello di
riferimento.

Poich

linterferogramma

della

differenza

dipende

solo

175

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

dallassorbimento della radiazione dovuta al campione, la FFT viene eseguita sui dati
risultati producendo lo spettro IR del campione.

Figura 106 - In alto l'interferogramma. In basso lo spettro IR ottenuto applicando la trasformata di


Fourier FFT

Per concludere, questo genere di spettroscopia ha due principali vantaggi sulla


tecnica tradizionale:
1. Il vantaggio di Fellgett, che consiste nella possibilit di ottenere informazioni
sull'intero spettro con una sola misurazione come descritto poc'anzi. Questo
migliora anche il rapporto segnale/rumore e richiede un minor tempo per
raggiungere la stessa risoluzione.
2. Il vantaggio di Jacquinot, che consiste in un miglior utilizzo della potenza
della sorgente di luce: non essendo presenti fenditure di entrata ed uscita
176

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

infatti aumenta la quantit di luce che passa attraverso il campione,


migliorando ulteriormente la misurazione.

Lutilizzo dellinterferometro di Michelson necessario per modulare le frequenza


della radiazione provieniente dalla sorgente ad una frequenza maggiormente
misurabile senza per modificare la sua dipendenza dal tempo.

10.3.1.3 Applicazioni qualitative della spettrofotometria IR

Uno spettro di assorbimento nellIR (figura 108), anche uno di un composto


relativamente semplice, spesso contiene unenorme quantit di picchi netti e di
minimi. Le bande di assorbimento utili per lidentificazione dei gruppi funzionali
sono localizzate nella regione di lunghezze donda pi corte dellinfrarosso (da circa
2,5 a 8,5 m), in cui le posizioni dei massimi sono solo leggermente influenzate
dallo scheletro di carbonio a cui i gruppi sono attaccati. Lidentificazione dei gruppi
funzionali (i principali sono riportati in tabella), raramente sufficiente a
determinare una caratterizzazione sicura del composto.
Gruppo funzionale

Numero donda (cm-1)

OH

Alifatico ed aromatico

3600-3000

NH2

Anche secondario e terziario

3600-3100

C-H

Aromatico

3150-3000

C-H

Alifatico

3000-2850

CN

Nitrile

2400-2200

CC

Alchino

2260-2100

COOR

Estere

1750-1700

COOH

Acido carbossilico

1740-1670

C=O

Aldeidi e chetoni

1740-1660

CONH2

Ammidi

1720-1640

C=C

Alchene

1670-1610

177

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Ar-O-R

Aromatico

1300-1180

R-O-R

Alifatico

1160-1060

10.3.1.3 Applicazioni quantitative della spettrofotometria IR

I metodi quantitativi della spettroscopia infrarossa differiscono in qualche misura da


quelli analoghi con la radiazione UV/VIS a causa della pi grande complessit degli
spettri, della larghezza esigua dei picchi di assorbimento, e delle prestazioni degli
strumenti disponibili per le misure in questa regione spettrale.
La spettrofotometria infrarossa ha le potenzialit di determinare un numero
insolitamente elevato di sostanze perch quasi tutte le specie molecolari assorbono
nella regione infrarossa. Inoltre, lunicit di uno spettro infrarosso fornisce un grado
di specificit eguagliato o superato da relativamente pochi altri metodi analitici.
Questa specificit ha unapplicazione particolare nellanalisi di miscele di composti
organici con strutture simili.
La recente proliferazione delle direttive governative sui contaminanti atmosferici ha
richiesto lo sviluppo di metodi sensibili, rapidi ed altamente specifici per una variet
di composti chimici. Le procedure di assorbimento nellinfrarosso sembrano
soddisfare questa necessit meglio di ogni altro singolo metodo analitico.
Utilizzando un semplice fotometro (caratterizzati da filtri ad interferenza ognuno
progettato per un inquinante specifico) possibile andare a determinare le
concentrazioni di inquinanti nellaria come CO, nitrobenzene, cloruro di vinile,
cianuro di idrogeno e la piridina.

10.3.1.4 Il problema dellaliasing


Prima di poter essere elaborati da un personal computer i segnali di misura debbono
essere convertiti in forma numerica. Lo strumento che effettua questa operazione
lunit di conversione o convertitore Analogico digitale (ADC).

178

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Si vuole porre adesso lattenzione ai problemi che possono nascere quando si


converte una informazione di misura analogica in forma numerica.
La struttura base di un sistema di misura basato sullelaborazione numerica dei
segnali mostrata in figura seguente:

Il segnale s(t) (vedi figura seguente) un segnale continuo nel tempo e nelle
ampiezze.

Cio qualsiasi sia lintervallo di osservazione tale segnale sempre rappresentato da


un numero infinito di punti. Quando si effettua un campionamento quello che si
cerca di fare e di rappresentare lo stesso segnale con un numero finito di punti. In
maniera intuitiva guardando la figura seguente si pu dire di si:

Ma in maniera altrettanto intuitiva osservando limmagine seguente si pu affermare


di no.

179

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Il problema fondamentale dellelaborazione numerica di segnali stabilire se e come


una sequenza, ottenuta dal campionamento di un segnale tempo continuo, contiene le
stesse informazioni del segnale di partenza. Bisogna, cio, verificare se il contenuto
informativo associato al segnale nel dominio del tempo continuo si mantiene
inalterato attraverso loperazione di campionamento. Bisogna quindi verificare se
possibile estrarre dal segnale ottenuto nel dominio del tempo discreto le stesse
informazioni associate al segnale nel dominio del tempo continuo
La frequenza di
campionamento
determina ogni
quanto ha luogo
una conversione
analogicodigitale (A/D).
Unelevata
frequenza di
campionamento acquisisce pi punti in un dato intervallo di tempo e pu fornire una
rappresentazione migliore del segnale originale rispetto ad una bassa frequenza di
campionamento. Campionare troppo lentamente pu causare una rappresentazione
incompleta del segnale analogico. La figura seguente mostra un segnale campionato
adeguatamente e gli effetti di un sottocampionamento. Leffetto di un
sottocampionamento che il segnale appare come se avesse una frequenza differente
da quella effettiva. Tale fenomeno prende il nome di aliasing.

180

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Secondo il teorema di Nyquist, necessario campionare ad una frequenza pi


grande di due volte la massima frequenza componente del segnale che state
acquisendo per evitare laliasing. Per una data frequenza di campionamento, la
massima frequenza che pu essere rappresentata accuratamente senza aliasing nota
come frequenza di Nyquist. La frequenza di Nyquist la met della frequenza di
campionamento. I segnali con componenti in frequenza al di sopra della frequenza di
Nyquist appariranno replicate tra la componente in continua e la frequenza di
Nyquist. La frequenza dellalias (fantasma) il valore assoluto della differenza tra la
frequenza del segnale dingresso e il multiplo intero pi vicino alla frequenza di
campionamento.
Per esempio, supponiamo che fs, la frequenza di campionamento, sia di 100 Hz.
Supponiamo anche che il segnale dingresso contenga le seguenti frequenze.25 Hz,
70 Hz, 160 Hz e 510 Hz. Queste frequenze sono mostrate nella figura successiva:

Come mostrato nella figura seguente, le frequenze al di sotto della frequenza di


Nyquist (fs/2= 50 Hz) sono campionate correttamente. Le frequenze al di sopra della
frequenza di Nyquist sono affette da aliasing. Per esempio (Fig.7), F1 (25 Hz) appare
alla frequenza corretta, ma F2 (70 Hz), F3 (160 Hz) e F4 (510 Hz) hanno le repliche

181

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

rispettivamente a 30 Hz, 40 Hz e 10 Hz.

Qundi, il teorema di Nyquist fornisce un punto di partenza per la scelta di


unadeguata frequenza di campionamento pi grande di due volte la componente di
frequenza pi alta presente nel segnale.
Sfortunatamente, questa frequenza spesso inadeguata ai fini pratici. I segnali reali
spesso contengono componenti in frequenza che sono al di sopra della frequenza di
Nyquist. Queste frequenze vengono erroneamente replicate e aggiunte alle
componenti del segnale campionate accuratamente, producendo dati campionati
distorti. Quindi, in pratica, di solito il campionamento viene fatto ad una frequenza
diverse volte la massima frequenza da 5 a 10 volte tipico nel campo industriale.
Una conseguenza dellaliasing che, a causa di frequenza richieste troppo elevate,
non possibile effettuare spettri in trasformata di Fourier in UV, a patto di avere
strumentazioni estremamente performanti.
Per calcolare la frequenza delle repliche, si pu utilizzare lequazione seguente:
Frequenza della replica = |(multiplo intero pi vicino alla frequenza di
campionamento frequenza dingresso)|
Per esempio:
replica F2 = | 100 70 | = 30 Hz
replica F3 = | 2*100 160 | = 40 Hz
replica F4 = | 5*100 510 | = 10 Hz

182

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.3.2 Spettroscopia fotoacustica (PAS)


Negli ultimi tempi c stato un grosso interesse nei confronti della Spettroscopia
Fotoacustica (Photoacoustic Spectroscopy o PAS), perch questa garantisce una
maggiore sensibilit rispetto alle tecniche spettroscopiche convenzionali. Tutti i
metodi spettroscopici danno delle informazioni qualitative e quantitative per mezzo
della misura della quantit di luce assorbita da una sostanza; anche il metodo PAS
misura questo fenomeno, ma in maniera pi sensibile.
Al giorno doggi vi un grande bisogno di rivelatori di gas ad alta sensibilit. Molti
enti di ricerca ed industrie spesso utilizzano gas altamente tossici,pericolosi anche a
concentrazioni minime. Anche durante la nostra normale attivit quotidiana vengono
generati svariati gas inquinanti; alcuni sono dannosi alla salute anche a bassa
concentrazione se vi ci si espone per lunghi periodi. Grazie alla sua sensibilit
superiore rispetto alle tecniche paragonabili,il metodo PAS particolarmente adatto
quando viene coinvolta la sicurezza.

I rivelatori di gas basati sul PAS trovano molte applicazioni sia negli ambienti interni
che esterni. Esempi tipici sono: lidentificazione ed il monitoraggio dei gas tossici ed
inquinanti presenti nellatmosfera; il monitoraggio dei composti organici in luoghi
come gli impianti di produzione, i laboratori e gli ospedali; il controllo dei processi
produttivi come il monitoraggio della fermentazione o della produzione dei gas puri.
Quando si parla di Spettroscopia Fotoacustica laffermazione pi comune di molte
persone Che cose? Non ne ho mai sentito parlare.
Leffetto fotoacustico consiste nellemissione di un segnale sonoro da parte di un
campione di gas posto in uno spazio chiuso a causa dellassorbimento delle
radiazioni provenienti da una sorgente intermittente di luce alla quale esposto.
Questo effetto venne scoperto accidentalmente dallo scienziato Alexander Bell,
durante le sue ricerche sul fotofono. Alexander Bell descrive i suoi primi
esperimenti, condotti mentre era in Francia, in una lettera ad un suo collega
americano.

183

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Molti altri scienziati dellepoca, come Tyndall e Rontgen, erano estremamente


interessati a questo fenomeno. Sfortunatamente gli unici rivelatori acustici a loro
disposizione a quel tempo erano le orecchie e perci risult piuttosto difficile
quantificare i loro risultati. A causa di questa limitazione linteresse nel metodo PAS
venne meno. Nonostante linvenzione del microfono a condensatore nel 1930, il
metodo PAS non ebbe molto successo, almeno fino al 1960 quando questa tecnica
comincio a suscitare un pi vivo interesse. Da quel momento in poi la fotoacustica
(detta anche optoacustica), stata applicata in molti campi; grazie alle numerose
esperienze, si e potuto anche approfondirne sia laspetto teorico che pratico.

Il fenomeno conosciuto come effetto


fotoacustico corrisponde allemissione di
un suono prodotto da un campione di gas
racchiuso in uno spazio, il quale assorbe
radiazioni provenienti da una sorgente
intermittente di luce.
Quando un gas viene irradiato con della
luce, assorbe una parte dellenergia
luminosa incidente, in proporzione alla
sua concentrazione. Lenergia luminosa
assorbita, si trasforma immediatamente
in calore e questo provoca un aumento
della pressione. Quando la luce intermittente viene modulata ad una certa frequenza,
laumento della pressione periodico alla frequenza di modulazione. Le onde di
pressione (dette onde sonore), sono facilmente misurabili con un microfono. Queste
possono essere sentite se la loro frequenza e compresa fra i 20 Hz e i 20 kHz.
Lintensit del suono emesso dipende da vari fattori; la natura e la concentrazione
della sostanza e lintensit della luce incidente. La selettivit, che pu essere ottenuta
in spettroscopia, e dovuta al fatto che le varie sostanze assorbono la luce a specifiche
lunghezze donda.

184

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

I componenti essenziali di un sistema fotoacustico sono:


1) una camera per contenere il campione di gas
2) una sorgente luminosa
3) alcuni mezzi per poter modulare la luce (di solito un chopper)
4) un rivelatore per misurare il suono (di solito un microfono)
5) alcuni metodi per poter elaborare il segnale. Il livello di precisione
dellanalisi del segnale dipende interamente dalle necessita di
misura.
Gli strumenti fotoacustici progettati per i campionamenti automatizzati, incorporano
dei componenti supplementari come una pompa, dei filtri dellaria, ecc. Un sistema
fotoacustico di misura completo molto compatto e pu essere facilmente montato
in uno strumento portatile.
La sorgente di luce pi adatta per la rivelazione e lanalisi di un gas quella che
emette radiazioni nella regione dello spettro elettromagnetico corrispondente agli
infrarossi, in modo particolare tra i 650 e i 4000 cm-1.

La sorgente di luce ad infrarossi pi comune e la luce solare ed Alexander Bell fu la


prima persona ad utilizzarla nei suoi esperimenti in fotoacustica. Sebbene la luce
solare sia indubbiamente la sorgente meno costosa, questa non , come lui stesso
commenta, la pi affidabile. Una eccellente e pi sicura alternativa alla luce solare
una sorgente ad incandescenza. Il tipo pi semplice composto da un filamento che
viene riscaldato ad alta temperatura, offrendo il vantaggio di essere stabile,
economico e a lunga durata; luscita spettrale continua ed il 70-80% di questa
compresa nella regione degli infrarossi.

185

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

In spettroscopia si richiedono delle radiazioni con una larghezza di banda stretta, ed


per questa ragione che viene utilizzata una lampada ad incandescenza insieme ad un
sistema ottico che seleziona la banda con la lunghezza donda desiderata. I filtri sono
usati per avere unirradiazione a lunghezza donda fissa. Per una sintonizzazione
continua possono essere usati dei reticoli di diffrazione, dei prismi o dei sistemi per
interferometria.
La metodica PAS presenta ulteriori vantaggi: innanzi tutto utilizza un trasduttore
molto stabile (il microfono) che pu rimanere anche parecchi mesi senza essere
calibrato (mentre la spettroscopia a trasmissione richiede una calibrazione giornaliera o settimanale). La risposta lineare del microfono permette, inoltre, la misura
della concentrazione dei gas in un ampio range dinamico (tipicamente 4 o 5 ordini di
grandezza) senza che vi sia il bisogno di cambiare limpostazione del range di misura
o di ricalibrare. La metodica PAS necessita di un piccolo volume di gas (~3 cm3)
nella camera di misura (contro i ~3000-4000 cm3 richiesti dalla spettroscopia a
trasmissione); questo riduce il tempo fra le misurazioni (e quindi anche il tempo di
risposta e minore).

Il PAS non viene utilizzato soltanto per la determinazione quantitativa di gas, come
visto fino qui, ma anche per lottenimento di spettri di assorbimento da parte di solidi
e liquidi torbidi accoppiandolo con uno spettrofotometro FTIR.
Negli studi foto acustici, il campione viene sistemato allinterno di una piccola coppa
posizionata allinterno dellaccessorio foto acustico. La cella dello spettrometro foto
acustico viene riempita con un gas ad elevata conducibilit termica, quale elio o
azoto, e posizionata nello scomparto del campione dello strumento a trasformata di
Fourier. Lo specchio invia sul campione il fascio modulato proveniente dallo
strumento FTIR. Il successivo assorbimento della radiazione da parte del campione
pu portare ad un rilassamento non radiativo degli stati vibrazionali eccitati delle
molecole del campione. Tale processo pu trasferire calore alla superficie del
campione, dando origine ad unonda acustica modulata nel gas della cella che viene
rilevata da un microfono ad elevatissima sensibilit.

186

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

La spettroscopia PAS una tecnica ad elevata sensibilit (fino a 10 -7 M) insieme alle


lenti termiche fino a 10-8 M) che sfruttano la variazione di indice di rifrazione di una
soluzione colpita da radiazione laser. Tale variazione pu essere correlata con la
concentrazione di analita presente.

10.3.3 Open Path FTIR

Uno strumento OP-FTIR estremamente sofisticato e permette di effettuare


misurazioni continue e in tempo reale di una vasta gamma di composti volatili
organici ed inorganici.
OP-FTIR basata sugli spettrometri infrarossi usati nei laboratori chimici fin dagli
anni 60. Tuttavia, la tecnologia FTIR applicata a misure sul campo relativamente
nuova e risale ai primi anni 90.
In uno strumento Open-Path, la luce infrarossa e il detector sono contenuti nella
stessa strumentazione. Questo permette al raggio infrarosso di essere diretto su
distanze e direzioni variabili (generalmente molto grandi con un netto guadagno in

187

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

termini di sensibilit) verso uno specchio riflettente che permette il ritorno del raggio
allo strumento, che come abbiamo visto, contiene anche il detector.
Gli OP-FTIR possono misurare unenorme quantit di composti volatili ad eccezione
delle molecole omoatomiche. Per il resto tutti gli altri composti volatili, inclusi gli
organometallici, possono essere rivelate se si presentano in fase gas,cos come HCl,
HF, i VOCs ecc
Bisogna tuttavia tenere in mente che le misure in atmosfera non sono molto facili in
virt del fatto che vi sono specie come CO2 e H2O che possono assorbire. Per ovviare
a questo problema si devono trovare delle finestre in cui solo il nostro analita
assorbe.
Entriamo un po pi nei dettagli e vediamo quali sono le molecole che possono
essere principalmente analizzate, proprio in atmosfera, dalle tecniche OP-FTIR. I
principali inquinanti gassosi sono NO, C2H4, SO2, CO, O3 e i laser pi usati a questo
scopo sono quelli basati su Sali di Pb semiconduttori i quali emettono radiazione
coerente nella regione IR (tra i 3 e i 27 m). In realt questi dispositivi sono pi
adatti a strutture di laboratorio, mentre sono di recente concezione alcuni laser che
presentano delle frequenze modulabili (cambiando temperatura e corrente, figura
109) rendendo cos applicabile questa tecnica a largo campo.

Figura 107 - Architettura di un sistema ottico a lungo raggio

Abbiamo finora parlato di sistemi long-path orizzontali, ma anche possibile


utilizzare questa tecnica verticalmente in modo passivo (a) usando il sole come
188

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

sorgente luminosa e un laser tunabile come detector, oppure attivo (b) utilizzando un
satellite come reflecto (figura 110).
Questi sistemi sono utilizzati per effettuare misure in atmosfera. Se utilizziamo il
metodo passivo, valutiamo lintensit della luce solare al suolo. Se pi bassa del
previsto vuol dire che ci sono dei composti che la assorbono (come per esempio O3).

Figura 108 - Si osservi come sia possibile "tunare" le frequenze del laser (e quindi anche le lunghezze
d'onda) in funzione della temperatura e quali siano i gas che assorbono principalmente in quelle frequenze.

Figura 109 - Sistemi long-path passivi (A) e attivi (B)

189

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

I risultati saranno mediati su tutto lo spazio, pertanto non posso sapere se la


concentrazione dellanalita uguale ovunque o se esso maggiormente concentrato
in alcune zone rispetto ad alte. In altre parole non posso fare un profilo di
concentrazione anche se, dal momento che la larghezza della banda dipende dalla
pressione, possiamo ottenere qualche informazione, non molto precisa, su dove
principalmente localizzato lanalita.
I costi per questo genere di strumentazione non sono bassi e possono raggiungere i
100.000 uro. In pi non possono essere utilizzati nel caso di nebbia, mentre in caso
di pioggia presenteranno un rumore non trascurabile.
LOP-FTIR utilizza come sorgente un laser. Sono diversi gli impieghi di laser per
analisi spettroscopiche, una tra tutte quella relativa allo studio del radicale libero
monossido di cloro, ClO, che considerato un importante componente della
stratosfera. Vi molta controversia sulla concentrazione di ClO nellatmosfera e del
suo ruolo sul ridurre lozono stratosferico. Per poter studiare la distribuzione di
questo composto necessario determinarne le caratteristiche e poich esso molto
reattivo, non pu essere preparato ad alte concentrazioni e le tecniche
spettroscopiche convenzionali non possono misurarne quantitativamente propriet
spettrali. Usando un laser variabile PbSnTe, la banda fondamentale stata osservata
a 850 cm-1. Lalta risoluzione necessaria per risolvere le linee spettrali molto strette
alle basse pressioni per cui ClO relativamente stabile. Operativamente si altres
aggiunta NH3 per calibrare le frequenze ed stato usato un metodo in derivata.
Studiando un numero di linee in questo modo possibile determinare alcuni
parametri fondamentali della molecola, e quindi acquisire informazioni sulle
frequenze e sezioni durto per utilizzarle per una determinazione a distanza.

190

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.4 Spettroscopia Raman

La spettroscopia Raman, dal nome del fisico premio Nobel (1930) C.V. Raman, si
fonda sullomonimo effetto Raman e cio: quando una sostanza trasparente viene
irradiata con un raggio di luce ad una lunghezza donda alla quale non vi
assorbimento, una piccola parte dellenergia della radiazione viene diffusa
(scattering). Se la radiazione monocromatica di frequenza 0, o comunque la banda
passante ha un intervallo di frequenze molto piccolo, la maggior parte della luce
diffusa ha la stessa frequenza di quella incidente (scattering di Rayleigh). Si osserva,
inoltre, la diffusione di radiazioni aventi alcune frequenze discrete al di sopra e al di
sotto di quella della luce incidente (diffusione Raman).

Figura 110 - Nell'IR osserviamo un semplice assorbimento, mentre nel Raman si osserva una diffusione
della luce. In particolare possiamo dire che: il raggio centrale (diffusione Rayleight) viene diffuso in avanti
senza mutare di frequenza (urto elastico), mentre altri fotoni incidenti (1 su 10 7) urtano contro le molecole
e cedono una certa quantit di energia ed emergono con energia diminuita (radiazione di Stokes), oppure
possono strappare energia alle molecola ed emergere come radiazione anti-Stokes. Entrambi gli urti sono
anelastici

Possiamo spiegare con maggiore dettaglio, quanto scritto nella didascalia. In


particolare, un fotone di energia E0 = h0 subisce una collisione con una molecola. Se
lurto perfettamente elastico, il fotone verr deviato ma la sua frequenza rimarr
inalterata (Rayleigh). Se una frazione di energia della radiazione incidente viene
scambiata durante lurto (che sar quindi anelastico), la molecola utilizza parte
dellenergia (E) acquistata dal fotone per compiere una transizione vibrazionale e/o
191

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

rotazionale. In particolare se la molecola guadagna lenergia E, il fotone diffuso


avr una frequenza = 0- E/h (radiazione di Stokes), se la molecola perde
lenergia E, il fotone diffuso avr una frequenza = 0+ E/h (radiazione antiStokes).
La figura seguente chiarisce quanto espresso:

Figura 111 Nella radiazione di Stokes, il fotone ha perso energia, cedendola alla molecola, ed emerge cos
ad una frequenza inferiore a quella incidente. Al contrario, nella radiazione anti-Stokes il fotone ha
acquistato energia dalla molecola ed emerge con una frequenza maggiore di quella incidente.

Leffetto Raman, il processo non quantizzato. Lenergia della molecola pu


assumere uno qualunque degli infiniti valori o stati tra lo stato fondamentale ed il
primo stato elettronico eccitato: questi stati vengono appunto chiamati stati virtuali.
Possiamo ulteriormente spiegare ci che succede in questo modo: sia nelle
interazione elastiche che generano la diffusione di Rayleigh, sia in quelle anelastiche,
le molecole colpite da un fotone incidente passano da uno stato iniziale ad uno stato
energetico virtuale, non quantizzato (ma sempre relativo allo stato elettronico
fondamentale), da cui decadono emettendo fotoni. Linterazione anelastica ha due
possibilit:

192

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

la molecola decade ad uno stato vibrazionale eccitato emettendo un fotone ad


energia minore di quello incidente (Stokes)

la molecola gi presente in uno stato vibrazionale eccitato decade dallo stato


virtuale allo stato fondamentale emettendo un fotone ad energia maggiore di
quello incidente (anti-Stokes).

Quello che emerge da uno spettro Raman quindi la radiazione di Rayleigh


nettamente la pi intensa dello spettro avente la stessa lunghezza donda della
radiazione incidente, i segnale corrispondenti alle interazioni anelastiche in cui sono
emessi fotoni ad energia minore di quelli incidenti (linee Stokes) e i segnali
corrispondenti alle interazioni anelastiche in cui sono emessi fotoni ad energia
maggiore di quelli incidenti (linee anti-Stokes). Dal momento che, in accordo con la
distribuzione di Boltzmann, a temperatura ambiente il livello vibrazionale
fondamentale il pi popolato, le linee di Stokes sono pi intense delle anti-Stokes.
Inoltre, le linee Stokes e quelle anti-Stokes sono simmetriche rispetto alla linea
Rayleigh.
Ricorda inoltre che gli spettri Raman non dipendono dalla tipologia di sorgente
utilizzata: essi sono tutti uguali. La sorgente va scelta per minimizzare leventuale
assorbimento di radiazione da parte del solvente o per limitare effetti interferenti
quali la fluorescenza. Per esempio non useremo un laser Nd:YAG per effettuare uno
spettro Raman di un campione immerso in acqua, in quanto alla lunghezza donda di
emissione del laser abbiamo assorbimento da parte dellacqua.
Per schematizzare:

Figura 112 - La radiazione che noi andiamo a studiare nella spettroscopia Raman quella diffusa
anelasticamente. La radiazione di Rayleigh viene eliminata con opportuni filtri

193

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Uno spettro Raman ottenuto mettendo in ascissa il Raman Shift, cio la differenza
tra le frequenze dei fotoni incidente e diffuso, espressa come numero donda (cm-1):

Figura 113 - Spettro Raman del CCl4 (0 = 488 nm)

Lintensit delle bande Stokes e anti-Stokes, come gi apprezzabile dalla figura


precedente, maggiore per le bande Stokes rispetto a quelle Anti-Stokes, ma
entrambe sono di intensit inferiore rispetto a quella di Rayleigh:

Figura 114 - Confronto tra le intensit

194

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.4.1 Effetto Raman: derivazione classica

Quando si applica un campo elettrico a una molecola, gli elettroni e i nuclei, in


accordo con la legge di Coulomb, si muovono in direzioni opposte. Il campo elettrico
applicato induce dunque un momento di dipolo indotto nella molecola che, andr a
sommarsi a quello permanente eventualmente presente. Se il campo elettrico
applicato (E) non troppo forte, il momento di dipolo indotto (indotto) linearmente
proporzionale al campo stesso ed dato da:
indotto E

dove la costante di proporzionalit detta polarizzabilit ed un indice della


deformabilit di un legame allinterno di un campo elettrico.
Possiamo gi da subito enunciare una regola generale e cio che una rotazione o
vibrazione di una molecola Raman attiva se causa una variazione di una
componente della polarizzabilit molecolare. Se rappresentiamo la polarizzabilit
come un elissoide, una variazione di una componente della polarizzabilit, significa
una variazione di forma, dimensione o orientazione di questo elissoide.
Se il campo elettrico applicato oscillante (come nel caso di quello portato da una
radiazione elettromagnetica) allora anche il momento di dipolo indotto oscilla con la
stessa frequenza del campo: indotto E 0 cos(t ) e genera una radiazione
elettromagnetica con la stessa frequenza del campo applicato (effetto Rayleigh).
Se qualche moto interno della molecola (rotazione o vibrazione) modula il momento
di dipolo indotto oscillante, allora possono comparire delle frequenze aggiuntive.
Classicamente ci significa che la polarizzabilit costituita da un termine statico
eq (polarizzabilit della molecola nella posizione di equilibrio) e da un termine
oscillante in modo sinusoidale di ampiezza :

195

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

eq cos( t )
Sostituendo la precedente equazione nellespressione del momento di dipolo indotto
oscillante indotto E 0 cos(t ) e utilizzando le formule di prostaferesi:

indotto eq E 0 cos(t )

E 0
E 0
cos[( )t ]
cos[( )t ]
2
2

L'espressione del momento di dipolo elettrico presenta cos esplicitamente i tre


addendi che danno conto rispettivamente:
- della diffusione elastica (Rayleigh)

eq E 0 cos(t )

- della diffusione anelastica (Raman) di tipo Stokes

E 0
cos[( )t ]
2

- della diffusione anelastica (Raman) di tipo anti-Stokes

E 0
cos[( )t ]
2

Lespressione del momento di


dipolo in questa forma racchiude
anche la condizione perch si
osservi leffetto Raman: per
avere radiazione con frequenza diversa da quella della luce
incidente la polarizzabilit deve cambiare durante il moto
della molecola ( ).
Poich la probabilit di creare un dipolo indotto non uguale in tutte le direzioni (per
esempio, in una molecola biatomica pi facile spostare gli elettroni lungo l'asse
internucleare) allora la polarizzabilit non un semplice valore scalare (se non in
casi di grande simmetria della molecola) n un vettore e la relazione che intercorre
tra le componenti del dipolo indotto e quelle del campo elettrico la seguente:
x ,indotto xx E x xy E y xz E z
y,indotto yx E x yy E y yz E z
z,indotto zx Ez zy E y zz Ez

196

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

x ,indotto xx


y ,indotto yx
z ,indotto zx

o, in forma matriciale:

xy xz E x

yy yz E y
zy zz E z

dove la matrice detta "tensore di polarizzabilit". La matrice una matrice


simmetrica ( xy yx ) ed quindi diagonalizzabile, ovvero sempre possibile
determinare un sistema di assi (X, Y, Z) tali che il tensore di polarizzabilit sia una
matrice diagonale:
X
0
0

Y
0

0
0
Z

10.4.2 Le regole di selezione


Se il momento di dipolo indotto :

indotto eq cos( t )E 0 cos(t )


allora il momento di transizione :

ij i* (r ) indotto j (r )dr
r

ij i* (r ) eq cos( t )E 0 cos(t ) j (r )dr


r

ij eq E 0 cos(t ) i* (r ) j (r )dr E 0 cos(t ) cos( t ) i* (r ) j (r )dr


r

ij 0 E 0 cos(t ) cos( t ) i* (r ) j (r )dr


r

Affinch sia permessa una transizione Raman dunque deve essere diverso da zero
l'integrale:

*
i

(r ) j (r )dr

197

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Nel caso dei moti rotazionali la variazione massima della polarizzabilit


durante la rotazione. Per molecole lineari // . Poich nella
transizione sono coinvolti due quanti di energia allora la regola di selezione per
molecole lineari J=0, 2.
L'aspetto dello spettro rotazionale Raman di un rotatore lineare il seguente:

Nel caso dei moti vibrazionali4

d
dqk

qk , dove
eq

d
dqk

la derivata della
eq

polarizzabilit valutata lungo la direzione q k del moto vibrazionale eccitato durante la


transizione. Il momento di dipolo di transizione diventa in tal caso:

ij E 0 cos(t ) cos(vib t )

d
dq k

i* (q k )q k j (q k )dq k
qk

eq

La transizione sar permessa dunque:


- se diverso da 0 il temine

d
dqk

, ovvero se la polarizzabilit varia durante


eq

il moto vibrazionale
4

NOTA BENE: in queste notazioni usiamo q al posto di r. Il motivo che il testo dal quale ho
copiato queste formule si usava q e non r.

198

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

- e se diverso da zero l'integrale

*
i

(q k )q k j (q k )dq k , tale integrale

qk

diverso da zero per =1.


Possiamo riassumere:
Un modo vibrazionale attivo nell'IR se si ha una variazione del momento di
dipolo durante la vibrazione e v = 1 e J = 1.
Un modo vibrazionale attivo nel Raman se si ha una variazione della
polarizzabilit durante la vibrazione e v = 1 e J = 2.
In altre parole, se una molecola poco o per niente simmetrica i suoi modi
vibrazionali saranno in genere tutti Raman attivi. Se la molecola possiede degli
elementi di simmetria non in generale semplice capire, senza adeguate
considerazioni, se la polarizzabilit varia o no nel corso della vibrazione.
Se la molecola possiede un centro di simmetria, nessun modo pu risultare
contemporaneamente attivo nel Raman e nellIR (regola di esclusione).
L'aspetto dello spettro vibro-rotazionale Raman di una molecola lineare il seguente:

Figura 115 - Esempio di spettro Raman

E possibile prevedere la posizione delle righe Stokes (prima equazione) e antiStokes rotazionali (seconda equazione):

199

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

(J+2 J) = 2B(2J+3)
(J-2 J) = + 2B(2J+3)
Le righe Stokes compaiono a frequenze inferiori a quella della radiazione incidente
con spostamenti 6B, 10B, 14B, rispetto a per J=0,1,2 Quando la molecola
subisce una transizione con J = +2 la radiazione diffusa labbandona in uno stato
rotazione pi elevato, sicch il numero donda della radiazione incidente, diminuisce.
Quando invece la molecola subisce una transizione con J = -2 il fotone diffuso
emerge con maggiore energia. Le righe anti-Stokes denunciano spostamenti 6B, 10B,
14B (per J=2,3,4,.. J=2 lo stato di energia pi bassa atto a contribuire vigendo la
regola di selezione J = -2) sul lato delle frequenze superiori a quella della
radiazione incidente.
Utilizzando le precedenti equazioni si calcolino le lunghezze donda per N 2 e NH3
per il quale B = 1,99 cm-1 quando la sostanza viene esposta alla radiazione laser
monocromatica da 336,732 nm [vd. esercizio pagina 490 Chimica Fisica Atkins].
Lo spettro che ci si calcola mostra una dispersione dellintero spettro piccolissima,
quindi la luce incidente devessere altamente monocromatica.
Passando agli spettri vibrorotazionali Raman, le righe a frequenza alta rispetto alla
radiazione incidente, cio le righe anti-Stokes, sono quelle per le quali vale v = -1;
le righe a frequenza bassa, le righe Stokes, corrispondono a v = +1. Negli spettri
raccolti in fase gas le righe Stokes e anti-Stokes presentano struttura ramificata
grazie alle transizioni rotazionali che accompagnano leccitazione vibrazionale. Le
regole di selezione sono J =2(come nella spettroscopia Raman rotazionale pura) e
danno origine al ramo O (J = -2), al ramo Q (J = 0) e rampo S (J = +2). A
differenza della spettroscopia nellIR, si ottiene il rampo Q per tutte le molecole
lineari.
Linformazione che forniscono gli spettri Raman vibrazionali si aggiungono a quelle
accessibili tramite la spettroscopia nellinfrarosso, perch possibile studiare anche
le molecole biatomiche omonucleari. E possibile interpretare gli spettri in funzione

200

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

delle costanti di forza, delle energie di dissociazione e della lunghezza dei legami. In
particolare, la radiazione Rayleigh non fornisce alcuna informazione in quanto ha la
stessa energia in ogni campione; le righe anti-Stokes sono generalmente di intensit
troppo bassa per essere rivelate e possono essere sfruttate soltanto per indicare la
temperatura del campione in base al rapporto con lintensit delle righe Stokes; le
righe Sokes sono legate ai gruppi funzionali delle molecole del campione e ai loro
modi di vibrazione, e sono quindi sfruttate a scopo diagnostico per identificare
qualitativamente i composti presenti nel campione. Nella spettroscopia Raman
laspetto quantitativo scarsamente preso in considerazione in quanto la
disomogeneit della superficie analizzata pu inficiare la riproducibilit di una
misura.
Di seguito vediamo alcune tabelle che permettono di fare un confronto tra tecnica
Raman e tecnica IR vedendo per alcune molecole quali sono i modi Raman attivi e
quali no e che differenze sussistono con lIR.

Figura 116 - Modi Raman attivi per molecola biatomica

201

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Figura 117 - Transizioni IR inattive e IR attive per molecole biatomiche. Si noti che, al contrario del
Raman (attivo sia per le molecole biatomiche omonucleari ed eteronucleari), l'IR inattivo per le
omonucleari

Figura 118 - Modi Raman attivi per l'acqua

202

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Figura 119 - Modi Raman per l'anidride carbonica. Si noti che sono attivi solo quelli per cui lo stretching
simmetrico che sono invece inattivi per l'IR (vd. regola di esclusione per cui se una molecola possiede un
centro di simmetria allora le vibrazioni Raman attive sono IR inattive e quelle IR attive sono Raman
inattive

La figura 119 permette di spiegare meglio la regola di selezionare d/dr. In effetti per
il moto vibrazionale IR attivo, noi abbiamo da un lato un accorciamento del legame
(diminuzione della polarizzabilit), dallaltro un allungamento (aumento della
polarizzabilit). Dal momento che si deve valutare la variazione complessiva di
polarizzabilit della molecola, possiamo concludere che essa uguale a zero. Per
questo motivo il modo di stretching antisimmetrico Raman inattivo.
E importante sottolineare che lo spostamento Raman per un dato legame ed un
determinato modo di vibrazione, indipendente dalla lunghezza donda del laser,
quindi gli spettri Ramna sono in teoria identici con qualunque laser vengano prodotti
e sono confrontabili anche se prodotti con strumenti Raman differenti.

203

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.4.3 Raman di risonanza


Una

modificazione

basilare

comporta

delleffetto
limpiego

Raman
di

una

radiazione incidente pressoch coincidente


con la frequenza di transizione elettronica
del campione. In questo caso la tecnica
prende il nome di spettroscopia Raman di
risonanza, e si caratterizza per unintensit
della radiazione diffusa molto maggiore. Per
di pi, visto che adesso contribuiscono alla
diffusione pi intensa solo pochi modi
vibrazionali,

lo

spettro

appare

molto

semplificato. Nella spettroscopia Raman di


risonanza assistiamo ad un aumento di
Figura 120 - Confronto tra Raman di risonanza
(in basso) a 488 nm e Raman normale (in alto) a
407 nm. Si noti la grande "pulizia" dello spettro

intensit dei picchi fino a 6 ordini di


grandezza e questo consente di analizzare
specie presenti fino a 10-6 M (non pi 0,1 M

come nel Raman convenzionale). Questa tecnica richiede laser tunabili (es. a
coloranti, 11.9.8) per potersi avvicinare al massimo di assorbimento per
massimizzare lintensit in uscita.
Per evitare la fotodegradazione del campione, esso viene introdotto in una cuvetta in
continua rotazione cos da far entrare in contatto solo per brevi istanti il campione
con il fascio laser.
La spettroscopia Raman di risonanza si applica a studiare le molecole biologiche che
assorbono fortemente nelle regioni ultravioletta e visibile dello spettro. Tra gli
esempi si annoverano pigmenti quali il -carotene e la clorofilla a, che catturano
lenergia solare nel corso della fotosintesi. Gli spettri Raman di risonanza che ne
risultano mostrano transizioni vibrazionali provenienti da solo poche molecole di
pigmenti legati a grandissime proteine e disciolti in tampone acquoso. Questa
selettivit deriva dal fatto che lacqua (il solvente), i residui amminoacidi e il gruppo
204

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

peptidico non subiscono transizioni alle lunghezze donda laser utilizzate


nellesperimento, e ci ne indebolisce gli spettri Raman convenzionali in confronto
con gli spettri amplificati dei pigmenti. Generalmente si usano celle in vetro o in
plastica

10.4.4 Spettroscopia

Raman

anti-Stokes

coerente (CARS)
E una tecnica Raman multi fotonica. E possibile aumentare lintensit delle
transizioni Raman mediante la cosiddetta spettroscopia Raman anti-Stokes coerente
(CARS). La tecnica poggia sul fatto che, se si fa attraversare un campione da due
raggi laser di frequenza 1 e 2, questi possono mescolarsi generando una radiazione
coerente di pi frequenze diverse, una delle quali sar 21-2.
Supponiamo di far variare 2 fino a quando concordi con una qualsiasi riga Stokes
del campione, per esempio quella di frequenza 1-; lemissione coerente avr la
frequenza 3 = 21-(1-) = 1+ che la frequenza della corrispondente riga antiStokes.
Figura 121

Questa radiazione coerente d luogo a un raggio sottile di


elevata intensit e direzionalizzato.
Un vantaggio della CARS consiste nella possibilit di
studiare le transizioni Raman in presenza di radiazione di
fondo incoerente e concorrente, e ci permette di utilizzarla
per osservare gli spettri Raman delle specie presenti nelle
fiamme. Un esempio lo forre lo spettro CARS vibro
rotazionale del N2 gassoso in una fiamma metano-aria.

205

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.4.5 Spettroscopia Raman inversa (IRS)


Come la CARS, anche la IRS una tecnica spettroscopica multifotonica, cio
ricorrono a due sorgenti. Una prima fissa (1) ed unaltra variabile (2 < 1). Quando
1 2 uguale ad una frequenza Raman, il campione assorbe.

Figura 122 - A sinistra RAMAN tradizionale. A destra RAMAN inverso: si notino gli assorbimenti.

10.4.6 Raman Microprobe


Negli spettrometri Raman dotati di microscopio, larea interessata dallanalisi pu
essere limitata a poche unit fino ad alcune centinaia di m 2 a seconda del laser e
dellobiettivo utilizzati. Gli obiettivi normalmente impiegati sono 10x, 20x, 50x, 80x
e 100x.
A fronte di questa capacit di risoluzione spaziale risulta obbligatorio sapere
esattamente dove si sta effettuando la misura per evitare errori macroscopici; per
questo motivo i microscopi Raman sono dotati di una telecamera coassiale con il
laser, che permette di visualizzare larea in cui si sta puntando. Laccoppiamento
delle tecniche Raman con un microscopio particolarmente usato in diagnostica dei
beni culturali (studio dei pigmenti pittorici) oltre che in campo biomedico
(differenziazione tra tessuto sano e tessuto malato), biochimico (nello studio del ciclo
vitale di una cellula), farmacologico e chimico ambientale. In effetti, visto che

206

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

questultimo

il

campo

di

nostro interesse, permette la


caratterizzazione
inorganiche

adsorbite

particolato
rendendo

particelle
sul

atmosferico
cos

Raman

la

tecnica

Microprobe

affiancabile anche a quelle di


Figura 123 - Schema di un microscopio Raman

microscopia
classiche.

elettronica
Per

le

analisi

ambientali, cio di piccole particelle, occorre ottimizzare il segnale che proviene dal
campione (spesso estremamente leggero, 10 -12 g) e scegliere opportunamente il
materiale di supporto (LiF). Dal punto di vista operativo si centra con il microscopio
la particella e successivamente il segnale Raman massimizzato da un controllo
traslazionale delle posizioni della particella e del raggio. I dati vengono immessi in
un computer.
Altri materiali comunemente usati nella raccolta del particolato atmosferico
(membrane polimeriche) non sono adatte come supporto in quanto producono intense
bande nella zona spettrale di interesse. Le particelle devono quindi essere rimosse da
questi filtri.
Il trasferimento o il deposito sul supporto pu avvenire per dispersione in un solvente
volatile, per spruzza mento di un aerosol o per trasferimento con tecniche di
micromanipolazione.
Questa tecnica permette di distinguere i materiali inorganici (ad esempio la struttura
cristallina e gli atomi che costituiscono il cristallo) e i sali (per esempio riesce a
distinguere diversi tipi di solfati

207

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.4.7 Strumentazione Raman


Negli spettrometri Raman si fa uso di sorgenti laser per due ragioni. Innanzitutto gli
spostamenti di frequenza della radiazione diffusa rispetto a quella incidente sono
piccolissimi, quindi, se li si vuole osservare, occorre sfruttare una radiazione
altamente monocromatica quale assicura il laser. In secondo luogo lintensit della
radiazione scarsa e questo impone di usare raggi incidenti intensi come sono
appunto quelli forniti dai laser. Gli spettri Raman si possono esaminare utilizzando
laser a luce visibile o ultravioletta, nel qual caso si sfrutta un reticolo di diffrazione
per distinguere tra radiazione Stokes, radiazione anti Stokes e radiazione di
Rayleight. Nella maggioranza degli strumenti moderni questultima viene assorbita
da un filtro eliminatore di banda, che assorbe un ristrettissimo campo di lunghezze
donda e lascia raggiungere il rivelatore dalle sole radiazioni Stokes e anti-Stokes.
Nei casi in cui si registra linterferenza ad opera di una forte emissione di
fluorescenza da parte del campione, o quando un inquinante interferisce con la
debole diffusione Raman proveniente dal campione, si ricorre ad una radiazione
incidente nellinfrarosso vicino e si sfruttano comunemente le tecniche a trasformata
di Fourier. Negli spettrometri Raman a trasformata di Fourier la radiazione diffusa
dal campione attraversa un filtro eliminatore e poi linterferometro di Michelson.
Lintensit totale I al rivelatore varia con la differenza di percorso p tra i due raggi
nellinterferometro, e dalla trasformazione di Fourier di I(p) emerge lo spettro della
radiazione diffusa, che mostra massimi ai numeri donda corrispondenti alle righe
Stokes e anti-Stokes. La spettroscopia Raman spesso complementare rispetto a
quella infrarossa, perch, come si vedr, entrano in gioco regole di selezione
differenti.
Esistono anche dei sistemi che permettono il campionamento a distanza i quali
ricorrono alle fibre ottiche le quali garantiscono il trasporto della radiazione
infrarossa per lunghe distanze (> 100 m). Queste fibre portano alleccitazione del
campione (solido o liquido) e la radiazione Raman emessa viene raccolta da unaltra
fibra ottica che la porta al trasduttore.

208

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

10.5 Spettroscopia UPS e XPS


Prima di entrare nel merito della spettroscopia fotoelettronica, facciamo una breve
introduzione. Questo tipo di spettroscopia misura lenergia di ionizzazione delle
molecole/atomi nellatto di espellere gli elettroni dai vari orbitali. Queste
informazioni vengono usate per dedurre lenergia degli orbitali. Lenergia incidente
deve essere uguale alla somma dellenergia di ionizzazione e dellenergia
dellelettrone espulso:

dove il pedice i, indica che, dal momento che la ionizzazione pu coinvolgere


qualsivoglia orbitale, lenergia di ionizzazione sar diversa. Quindi Ii indica lenergia
di ionizzazione relativa allespulsione di un elettrone da un orbitale i. Pertanto,
misurando lenergia cinetica degli elettroni espulsi e conoscendo il valore
dellenergia incidente possibile calcolare Ii.
Riassumendo: colpisco il mio campione con una radiazione h avente una certa
energia. Una parte di questa energia viene utilzzata per allontanare lelettrone dal
campione (ionizzazione) e quella in eccesso viene usata dallelettrone stesso per
muoversi (viene convertita nellenergia cinetica). Misurando questa energia cinetica
e conoscendo lenergia della radiazione incidente risalgo a I.
Linterpretazione degli spettri della spettroscopia fotoelettronica (di cui fanno parte
le tecniche UPS e XPS) avviene mediante il teorema di Koopmann: lenergia di
ionizzazione uguale allenergia dellorbitale da cui lelettrone stato espulso.
Questo teorema di fatto unapprossimazione della realt in quanto non considera la
riorganizzazione degli elettroni in seguito alla ionizzazione. Qualora lespulsione di
un elettrone porti alla formazione di uno ione vibrazionalmente eccitato, lequazione
precedente andrebbe riscritta come:

209

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

dove lultimo termine rappresenta lenergia necessaria per aver messo in vibrazione
lo ione.
A seconda degli orbitali che si vogliono eccitare avremo energie in gioco molto
diverse. Per lo studio degli elettroni di valenza si opera di norma a < 200 nm
(spettroscopia fotoelettronica nellultravioletto, UPS), mentre per gli elettroni di core
necessaria unenergia estremamente elevata e per questo si fa uso di raggi X
(spettroscopia fotoelettronica a raggi X, XPS).
Lenergia dei fotoelettroni viene misurata con lausilio di un deflettore elettrostatico
che causa deviazioni della traiettoria in base alla velocit degli elettroni. Si registra il
flusso elettronico e lo si diagramma in funzione dellenergia cinetica.
Spettroscopie utili per la composizione elementale di un dato materiale.

10.6 Spettroscopia AES e XRF


In seguito ad una vacanza elettronica (causata dallincidenza di una radiazione), vi
possono essere due fenomeni in competizione: lemissione di elettroni Auger oppure
lemissione di Raggi X causati dal rilassamento di un elettrone da un guscio pi
esterno per riempire la vacanza. In particolare, lenergia che emette questo elettrone
pu essere utilizzata in un caso per espellere un secondo elettrone (elettrone Auger)
oppure viene direttamente emessa come Raggio X.
I due fenomeni sono quindi in competizione, ma sono funzione del numero Z.
Allincirca a Z = 30 si ha la stessa percentuale di produzione di elettroni Auger e
Raggi X in seguito ad una vacanza per esempio nel guscio K. A Z > 30, prevale
lemissione di Raggi X.
La spettroscopia Auger una tecnica di superficie in funzione del fatto che gli
elettroni hanno un cammino allinterno del bulk di un materiale molto limitato.
Spettroscopie utili per la composizione elementale di un dato materiale.

10.7 Spettroscopia XAS

210

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

Lassorbimento di raggi X pu eccitare gli elettroni 1s o 2s,2p di un elemento verso


orbitali vuoti localizzati. Il fenomeno era conosciuto da decenni ma diventato di
grande utilit da quando sono disponibili raggi-X ad elevata intensit derivanti da
sorgenti di radiazione a sincrotrone. Con questa tecnica si possono ottenere numerose
informazioni, quali:
-

determinazione dello stato di ossidazione di un metallo

ottenere informazioni strutturali elettroniche

derivazione di dettagli relativi alle geometria di coordinazione del metallo

10.8 Spettroscopia LEED


Questa spettroscopia ricorre a sorgenti elettroniche. La LEED permette di studiare
solidi cristallini con ordine a lungo raggio andandone a determinare la struttura
cristallina superficiale. In effetti si fa ricorso a elettroni con unenergia compresa tra i
20 e i 200 eV, quindi non sufficienti per penetrare nel bulk del campione. Gli
elettroni saranno quindi deviati dalla nuvola elettronica degli atomi/molecole sulla
superficie senza perdita di energia e andranno a impattare su uno schermo
fluorescente dando origine a dei punti luminosi. Analizzando intensit e posizione di
questi punti si risale al reticolo cristallino superficiale.

10.9 Spettroscopia EELS


In spettroscopia EELS un materiale sottoposto ad un fascio di elettroni aventi un
ristretto range di energia cinetica. Una parte di questi elettroni subir scattering
anelastico perdendo parte della sua energia iniziale. La traiettoria di questi elettroni
sar deviata in maniera casuale.
Le energie possono essere disperse in modi estremamente diversi:
-

eccitazioni plasmoniche

ionizzazione dei gusci K e L

211

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopie molecolari

perdita attraverso effetto Cerenkov, cio attraverso lemissione di una


radiazione elettromagnetica da parte di un materiale le cui molecole sono
polarizzate da una particella carica in moto che lo attraversa

Lammontare di tutte queste perdite energetiche pu essere misurato attraverso uno


spettrometro elettronico. La perdita energetica derivante dalla ionizzazione dei gusci
K e L pu essere particolarmente utile per andare a determinare gli elementi
costituenti del materiale in esame.
Per fare un esempio, una perdita di energia di 285 eV corrisponde proprio allenergia
necessaria per rimuovere un elettrone dal guscio K di un atomo di carbionio. Un
picco evidente in corrispondenza di questo valore indica inequivocabilmente la
presenza di carbonio nellarea colpita dal fascio elettronico.

10.10 Spettroscopia HREELS


Gli spettri HREELS si originano dagli stessi principi della EELS e cio si vanno a
valutare specifiche perdite energetiche in seguito alla collisione degli elettroni con la
materia e la loro retrodiffusione anelastica.
La particolarit che il range di perdite energetiche per la HREELS, coinvolgendo
eccitazioni della struttura superficiale, risulta estremamente ristretto. E pertanto
richiesto uno spettrometro ad alta risoluzione. In pi, in HREELS, lenergia degli
elettroni incidenti, affinch si abbia alta risoluzione, deve essere dello stesso ordine
di grandezza delle perdite energetiche (max 10-100 eV). Considerando che elettroni
pari a 100 eV hanno un cammino allinterno della superficie non superiore a 1nm,
risulta chiaro che questa una tecnica superficiale, al contrario della EELS che,
operando ad alte energie pu trovare applicazioni anche in trasmissione.
Nella HREELS possibile non solo misurare le perdite elettroniche, ma anche la
distribuzione angolare di elettroni con una certa perdita energetica e questo permette
di indagare con maggiore dettaglio le caratteristiche della superficie.

212

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

CAPITOLO 11
11 Spettroscopia laser

11.1 Le molecole elettronicamente eccitate possono


rilassarsi dopo un certo numero di processi

Come sappiamo, una molecola biatomica (ma il discorso vale anche per quelle
poliatomiche) si trova sempre allo stato elettronico fondamentale se non viene
eccitata da alcun tipo di radiazione. Gli stati elettronici e vibrazionali eccitati, che
possono essere popolati in seguito ad uninterazione con una radiazione UV/VIS o
IR, possono essere di singoletto o di tripletto. Per comodit si tende a rappresentare
solo il primo stato elettronico eccitato di singoletto (S1) e di tripletto (T1), che si
trova ad energia pi bassa rispetto a S1. La lunghezza del legame nella molecola
R(S0) < R(S1) < R(T1).
Il rilassamento dagli stati elettronici/vibrazionali eccitati pu essere non radiativo
(senza assorbimento e/o emissione di luce) oppure radiativo (con emissione di luce).
Se la molecola eccitata non urta con altre molecole, essa tender a ricadere nello
stato fondamentale emettendo luce. Le collisioni tra una molecola eccitata ed altre
molecole del campione, pu risolversi invece in uno scambio di energia che rimuove
una parte dellenergia vibrazionale in eccesso. Questo processo si chiama
rilassamento vibrazionale.
A causa del rilassamento vibrazionale, una molecola eccitata si rilassa rapidamente
nello stato vibrazionale inferiore di S1. Una volta che la molecola ha raggiunto lo
stato vibrazionale pi basso di S1, pu decadere in uno degli stati vibrazionalmente
eccitati di S0 emettendo un fotone (fenomeno detto di fluorescenza) e che coinvolge
stati elettronici con la stessa molteplicit di spin (transizione permessa dalle regole di
selezione) dando cos origine ad un decadimento radiativo. La molecola nello stato

213

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

S1 pu per anche collidere con altre molecole e cadere in uno degli stati vibrazionali
eccitati di S0 dando per origine ad una transizione non radiativa cio senza
emissione di luce. Questo processo che coinvolge sempre degli stati con la stessa
molteplicit di spin viene chiamato conversione interna. La scala temporale di questi
fenomeni di circa 10-9 s per la transizione radiativa (fluorescenza) da S1 S0, 10-710-12 s per la conversione interna da S1 S0.
Esiste per unaltra tipologia di transizione possibile dal momento che in un tratto le
curve di potenziale dello stato di tripletto T 1 e dello stato di singoletto S1 si
sovrappongono. In questa circostanza possibile il cosiddetto intersystem crossing,
vale a dire il trasferimento isoenergetico da uno stato vibrazionale eccitato relativo a
S1 ad uno vibrazionale eccitato relativo a T 1. In seguito, la molecola nello stato
vibrazionale eccitato relativo a T 1 per rilassamento vibrazionale cade nello stato v=0
di T1. Da qui possono avvenire due cose: o una transizione radiativa dallo stato T 1 ad
un livello vibrazionale eccitato di S0 (fosforescenza) oppure una conversione interna
non radiativa causata dalle collisioni tra molecole. Tutti i fenomeni descritti in questo
paragrafo sono proibiti per spin perch coinvolgono stati elettronici con molteplicit
di spin differente, quindi sono poco probabili. In effetti la scala temporale di questi
fenomeni dellordine dei 10-7-10-5 s per la transizione radiativa (fosforescenza) da
T1S0, 10-8-10-3 s per lintersystem crossing da T1S0.
Da un punto di vista spettrale, lassorbimento di radiazione da parte di una molecola
coinvolge il passaggio degli elettroni dallo stato v=0 dello stato elettronico S 0 a
diversi livelli vibrazionali eccitati (v=1,2,3) di S 1, lemissione per fluorescenza
coinvolge transizioni da v=0 dello stato elettronico eccitato S1 a diversi livelli
vibrazionali eccitati (v=0,1,2,3) di S0 e lemissione per fosforescenza coinvolge
transizioni da v=0 dello stato elettronico eccitato T 1 a diversi livelli vibrazionali
eccitati di S0. Ne consegue che le transizioni di fosforescenza e di fluorescenza
avvengono ad energie minori rispetto a quelle coinvolte nellassorbimento (quindi a
maggiori) e che, dal momento che T 1 ha unenergia minore di S1, le transizioni di
fosforescenza sono quelle che avvengono ad energia minore.

214

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Tutti i fenomeni descritti fin qui possono essere razionalizzati nel diagramma di
Jablonski.

Figura 124 - Diagramma di Jablonski

11.2 Rate equation


Per capire come funziona un laser necessario conoscere la rapidit con la quale gli
atomi e le molecole subiscono transizioni radiative. Per studiare la dinamica del
decadimento radiativo ci concentreremo per semplicit sugli atomi e non sulle
molecole (le conclusioni che si traggono con questa trattazione sono per facilmente
applicabili anche alle molecole).
Supponiamo di avere a disposizione N atomi caratterizzati, per semplicit, da due
soli stati elettronici: E1, a pi bassa energia, ed E2 a pi alta energia. Dalla legge di
Boltzmann sappiamo che in condizioni di T ambientale lunico stato elettronico
occupato lo stato E1. Pertanto il numero di atomi che si trovano nello stato E 1 (N1)
uguale al numero di atomi totali N, quindi: N 1 = N. Se sottoponiamo i nostri atomi
ad una radiazione sufficiente per farli promuovere dallo stato fondamentale E 1 a
quello eccitato E2, avremo che alcuni di questi effettivamente assorbono la
radiazione e si trovano nello stato eccitato: h12 = E2-E1 (Figura 125).
215

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Figura 125 - Illustrazione del processo di assorbimento da parte di un atomo che passa dallo stato
fondamentale E1 allo stato eccitato E2. Si noti che lo stato eccitato E2, in partenza, non popolato in
accordo con la relazione di Boltzmann

Per esposizione alla luce h12 = E2-E1, un campione di atomi subisce


simultaneamente tre processi: assorbimento, emissione spontanea ed emissione
stimolata.
Il processo di assorbimento dato da questa relazione di Einstein in cui si nota
come la decrescita di atomi N1 nello stato E1 nel tempo proporzionale alla quantit
di atomi che si trova nello stato E1 e alla densit di energia radiante alla frequenza 12
(). Il coefficiente di proporzionalit B12 detto coefficiente di Einstein. Lindice
12 si riferisce allordine degli stati coinvolti nella particolare transizione che si sta
discutendo (dallo stato fondamentale 1 allo stato eccitato 2)

Il processo di emissione spontanea quel fenomeno per cui un dato atomo


rilassandosi spontaneamente dallo stato eccitato E 2 allo stato fondamentale E1 emette
un fotone di energia h12. Il tasso di emissione spontanea pu essere descritto
valutando una proporzionalit tra la diminuzione di N2 (numero di atomi nello stato

216

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

E2) e il numero degli atomi N2(t). La costante di proporzionalit un altro


coefficiente di Einstein A21:

Figura 126 - Il processo di emissione spontanea

Oltre allemissione spontanea, Einstein propose che lesposizione di un atomo in uno


stato elettronico eccitato ad una radiazione elettromagnetica h12 = E2-E1 possa
stimolare lemissione di un fotone e in questo modo riportare latomo nello stato
fondamentale. Parliamo quindi emissione stimolata. La variazione di popolazione di
atomi nello stato eccitato proporzionale alla densit di energia radiante alla
frequenza 12 e alla popolazione N2(t). La costante di proporzionalit il terzo
coefficiente di Einstein B21:

Il processo di emissione stimolata amplifica lintensit della luce; un fotone alla


frequenza 12 stimola un atomo ad emetterne un altro, generando cos un secondo
fotone alla frequenza 12. I laser sono dispositivi che sfruttano lamplificazione della
luce attraverso lemissione stimolata che, bene sottolinearlo, prevede lemissione di
due fotoni in fase.
I tre coefficienti di Einstein visti fino a qui (B12, A21 e B21) sono tutti correlati uno
con laltro. In particolare si pu dimostrare che B12 = B21 e A21 = (8h3)/(c3)B21

217

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Figura 127 - Il processo di emissione stimolata

Come abbiamo detto in precedenza, quando un campione esposto alla luce, della
giusta frequenza, gli atomi appartenenti al campione subiscono sia un assorbimento,
sia unemissione spontanea sia unemissione stimolata cos che il tasso di variazione
della popolazione sia dello stato elettronico fondamentale sia dello stato elettronico
eccitato dato dalla somma dei tassi dei tre singoli processi.

11.3 Un sistema a due livelli non pu raggiungere


linversione di popolazione
I laser sono progettati per amplificare luce tramite lemissione stimolata di
radiazione. Affinch ci avvenga necessario che un fotone che attraversa un
campione di atomi abbia una probabilit maggiore di causare lemissione stimolata
che di essere assorbito dagli atomi stessi. Ci impone che il tasso di emissione
stimolata sia maggiore del tasso di assorbimento:

Abbiamo visto in precedenza che B21 = B12, pertanto necessario, affinch sia vera
questa disuguaglianza che N2 > N1 che descrive una situazione denominata di
inversione di popolazione che, in accordo con lequazione di Boltzmann, non
rappresenta una situazione di equilibrio: essa va generata. La domanda a questo
punto : possibile generare uninversione di popolazione in un sistema a due
livelli? Si pu dimostrare a partire dalla somma dei tassi di assorbimento, emissione
spontanea e stimolata che, per un tempo t il rapporto tra N2 e Ntotale sempre
218

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

minore di . Ci significa che il numero di atomi nello stato eccitato in un sistema a


due livelli non pu mai superare il numero di atomi nello stato fondamentale.
Pertanto, in questo tipo di configurazione (2 livelli energetici), non si potr mai avere
uninversione di popolazione.

11.4 Linversione di popolazione


Un requisito dellazione laser lesistenza di uno stato eccitato metastabile, uno stato
eccitato la cui durata sia sufficientemente prolungata da permettergli di partecipare
allemissione stimolata. Un altro requisito lesistenza di una popolazione maggiore
nello stato metastabile che nello stato inferiore nel quale ha termine la transizione,
perch in tali condizioni vi sar unemissione netta di radiazione. Lequilibrio
termico vuole che sia vero il contrario, sicch necessario realizzare linversione di
popolazione, cio far s che nello stato superiore le molecole siano pi numerose.
Un modo di conseguire linversione di popolazione quello illustrato in figura 128.
Si eccita la molecola ad uno stato intermedio E 3, che poi cede una parte dellenergia
con modalit non radiativa e perviene allo stato inferiore E 2; la transizione laser
coincide con il ritorno di A allo stato fondamentale E1. Poich in tutto entrano in
gioco tre livelli, questo assetto conduce al laser a tre livelli. In pratica E 3 sar
costituito da molti stati, tutti atti a convertirsi nel pi alto dei due stati laser, A. La
transizione E3 E1 viene stimolata da un lampo intenso di luce con il processo detto
di pompaggio, un effetto spesso realizzato facendo passare la scarica elettrica
attraverso lo xenon oppure ricorrendo a un altro laser. La conversione da E3 ad E2
dovrebbe essere veloce, le transizioni laser da E 2 a E1 relativamente lente.
Lemissione stimolata tra i livelli E 2 ed E1 possibile in presenza di una radiazione
pari al E tra gli stessi e questa presente visto che tra questi due livelli anche
possibile unemissione spontanea.
Il procedimento a tre livelli presenta lo svantaggio di rendere difficile linversione
della popolazione, dato lenorme numero di molecole che il pompaggio deve
trasferire dallo stato fondamentale a quello eccitato. Il compito riesce semplificato
dalla disposizione adottata nel laser a quattro livelli, quando la transizione laser

219

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Figura 128 Schema di uninversione di popolazione su tre livelli.

termina in uno stato diverso da quello fondamentale (E 2 nella figura 129). Essendo
inizialmente E2 non popolato, qualsiasi popolazione in E3 corrisponde ad
uninversione di popolazione e, se E3 sufficientemente metastabile, possiamo
prevedere un effetto laser. Per di pi tale inversione di popolazione si pu mantenere
se la transizione E2 E1 veloce perch transizioni siffatte impoveriscono qualsiasi
popolazione in E2 mantenendolo relativamente vuoto.

Figura 129 - Schema di funzionamento di un laser a quattro livelli

220

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

11.5 Caratteristiche della radiazione laser


1) Direzionalit: Al contrario delle sorgenti elettromagnetiche tradizionali il
laser permette di emettere la radiazione in un'unica direzione. Pi
precisamente l'angolo solido sotteso da un fascio laser estremamente
piccolo; una buona descrizione della propagazione e collimazione di un
fascio laser data dall'ottica dei fasci gaussiani. Questa caratteristica viene
sfruttata in diversi ambiti, per esempio permette di trattare le superfici in
maniera estremamente accurata . In spettroscopia si ha la possibilit di
aumentare notevolmente il cammino ottico e quindi la sensibilit usando una
sorgente laser che attraversa il campione con una traiettoria a zig-zag grazie a
un sistema di specchi.
2) Monocromaticit: L'allargamento della banda di emissione dato
dalla larghezza naturale e dall'effetto Doppler (che pu essere eliminato o
comunque contenuto parecchio). In spettroscopia si sfrutta questa
caratteristica per ottenere spettri ad alta risoluzione. Sarebbe molto
difficoltoso ottenere gli spettri Raman senza questa caratteristica dei laser.
Lallargamento della banda, come anticipato, pu essere dovuto dalleffetto
Doppler (causato dal moto termico delle molecole) e dalle collisioni
(associato alle variazioni di energia delle molecole conseguenti agli urti con
le altre molecole). Da non dimenticare anche lallargamento naturale legato
allincertezza quantistica sui livelli energetici.

3) Brillanza: Nei laser la quantit di energia emessa per unit di angolo solido
incomparabilmente pi elevata rispetto alle sorgenti tradizionali. In
particolare elevato il numero di fotoni per unit di frequenza. Questa
caratteristica diretta conseguenza delle due precedentemente citate. Grazie a
221

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

questa caratteristica si ha la possibilit di osservare fenomeni particolari,


come per esempio l'assorbimento a molti fotoni. L'elevata intensit ha trovato
anche diverse applicazioni tecnologiche, per esempio nel taglio dei metalli.
4) Coerenza: Mentre nell'emissione spontanea ogni fotone viene emesso in
maniera casuale rispetto agli altri, nell'emissione stimolata ogni fotone ha la
stessa fase del fotone che ha indotto l'emissione. La fase viene quindi
mantenuta nel tempo e nello spazio. Questa caratteristica ha permesso lo
sviluppo della tecnica CARS. E possibile calcolare la lunghezza di coerenza
(quanto spazio percorrono i raggi laser mantenendo coerenza di fase) facendo
un semplice rapporto: L=c/ dove la larghezza di banda di una
determinata sorgente (circa 1800 nm per una lampada al tungsteno, < 1 nm
per un laser)
5) Impulsi ultra-brevi: Con diverse tecniche possibile costruire laser che
emettano pacchetti di onde estremamente stretti nel dominio del tempo,
attualmente si giunti allo sviluppo di impulsi dell'ordine del femtosecondo.
Questi laser hanno trovato impieghi in diversi ambiti di ricerca, hanno per
esempio permesso la nascita di una nuova disciplina, che stata
chiamata femtochimica.

11.6 Cosa c allinterno di un laser?


Un laser costituito generalmente da tre componenti: a) un mezzo amplificatore che
aumenta lintensit della luce alla lunghezza donda desiderata; b) una sorgente di
pompaggio che eccita il mezzo amplificatore e c) degli specchi che dirigono il raggio
di luce avanti e indietro attraverso il mezzo amplificatore.
Il mezzo amplificatore
I mezzi amplificatore si possono presentare allo stato solido, liquido o gassoso. Il
primo mezzo amplificatore utilizzato era di rubino Al2O3 con alcune impurezze di
Cr3+ il vero responsabile dellemissione stimolata in quanto possedente le giuste
propriet per raggiungere un inversione di popolazione. Questa tipologia di laser a
222

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

stato solido ottenuta mediante opportuno drogaggio di alcuni elementi (Cr3+ nel
caso del rubino) in materiali solidi (Al 2O3 nellesempio che stiamo discutendo).
Esistono diversi altri mezzi amplificatori a stato solido molti dei quali a base di Nd 3+
inserito in materiali ospitanti differenti come YAG (Y 3Al5O15) o YLF (Y3LixFy). Si
noti che a seconda del materiale ospite i laser anche con lo stesso elemento inserito
hanno lunghezze donda di emissione diverse. Questi laser a stato solido possono
essere sorgenti continue oppure a impulsi.
Un altro mezzo amplificatore utilizzato quello allo stato gassoso costituito da un
atomo di gas nobile (laser He-Ne di cui ci occuperemo pi avanti), uno ione positivo
(laser a Ar+), un atomo di metallo (He-Cd), una molecola neutra (laser a N2 o CO2).
Questi laser, anchessi ad emissione continua o ad impulsi emettono generalmente
nelle regioni del UV/VIS e IR.
Descriveremo queste tipologie di laser pi dettagliatamente nei prossimi paragrafi.
Sorgente di pompaggio
La sorgente di pompaggio, come gi anticipato, ha il compito di eccitare il mezzo
amplificatore e questo pu essere fatto o per eccitazione elettrica o per eccitazione
luminosa.
Leccitazione luminosa avviene per mezzo di una forte
sorgente luminosa, per esempio una lampada ad
emissione continua o lampada per flash. Nella figura a
fianco si noti che la sorgente di pompaggio, nella
fattispecie una lampada, stata collocata tutta intorno al
Figura 130 - Lampada e mezzo
amplificatore (rubino)

mezzo amplificatore (Rubino drogato con Cr3+).

Leccitazione luminosa non riesce ad essere completamente assorbita dal mezzo


amplificatore, anzi, le rese di emissione stimolata sono estremamente basse oscillanti
tra lo 0,001% e l1% per i laser a gas e quelli a stato solido. Esistono tuttavia alcuni
laser come quelli a CO2 o quelli a semiconduttore che esibiscono alte efficienze di

223

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

conversione che possono arrivare fino al 70%. Il motivo della scarsa efficienza
(soprattutto per le prime tipologie illustrate) legato al fatto che non si ha un
popolamento selettivo dello stato elettronico necessario per linversione di
popolazione con le lampade tradizionali. Questo ha indotto ad utilizzare dei laser
come sorgenti di pompaggio per altri laser.
Come dicevamo, laltra tipologia di sorgente di pompaggio quella elettrica nella
quale si utilizzano delle scariche elettriche per eccitare il mezzo amplificatore ed un
sistema usato soprattutto nei laser a gas. Discuteremo questa tipologia di eccitazione
quando parleremo dei laser He-Ne.
Caratteristiche della cavit laser
La radiazione che viene emessa dagli atomi eccitati viene diretta avanti e indietro
attraverso il mezzo amplificatore usando degli specchi. Uno degli specchi possiede
una riflettivit minore del 100% il che permette alla luce di fuggire dalla cavit.
Questa luce uscente costituisce il raggio laser. Gli altri raggi che risuonano
allinterno del mezzo amplificatore servono sia per causare lemissione stimolata sia
per essere assorbiti da quegli atomi che si trovano sul primo livello energetico
eccitato per fargli nuovamente raggiungere linversione di popolazione eccitandoli
sul secondo livello energetico eccitato.
La cavit risonante definisce anche le lunghezze d'onda generate dal laser, infatti al
suo interno possono risuonare solo le lunghezze d'onda (e quindi i fotoni) che in un
viaggio di andata e ritorno nella cavit si ritrovano nel punto iniziale con la stessa
fase:

dove N un numero intero e L la lunghezza della cavit risonante.


In una cavit risuonano quindi molte frequenze ovvero quelle per cui:

224

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

dove c la velocit della luce nel mezzo e dove si sostituito con =c/.
Prendiamo in considerazione per esempio un laser He-Ne, la radiazione emessa
rossa, ovvero con lunghezza d'onda di 633 nm. La cavit di tale laser ha tipicamente
la dimensione di 15-50 cm. Se si prende per esempio una lunghezza L=31.65 cm si
osserva che possono risuonare ad esempio le seguenti lunghezze d'onda:

Lunghezza donda (nm)

999998

633,0013

999999

633,0006

1000000

633,0000

1000001

632,9994

Allora se la banda di amplificazione del materiale attivo sufficientemente larga (e


lo sempre) possono generarsi pi lunghezze donda del laser. Se il laser lavora in
questa modalit si dice che sta operando in regime multimodale.

225

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Figura 131 - In alto abbiamo la banda in cui il mezzo chiamato attivo effettivamente attivo che, insieme
alle frequenze di risonanza della cavit (alcune ricavate nella tabella) d l'output del laser. I picchi del
grafico pi in basso sono detti modi risonanti.

E anche possibile selezionare uno specifico modo


risonante per esempio introducendo appositi filtri (filtri
polaroid,

etalon)

Per

esempio

possono

essere

selezionate solo quelle lunghezze donda che presentano


un profilo di intensit trasverso nullo e che sono
razionalizzate sotto la sigla TEM00. Tipicamente nei laser
commerciali viene riportata la percentuale dellintensit
duscita che risulta associata al modo TEM00.

226

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

11.7 Laser continui o a impulsi


I laser possono essere classificati come continui o pulsati, in funzione del fatto che la
radiazione venga emessa continuamente o sotto forma di impulsi.

11.8.1 Laser continui (CW)


Il laser in grado di generare radiazione fino a quando viene mantenuta linversione
di popolazione. Ove si dissipi il calore, il laser pu funzionare in continuit, perch
in tal caso il pompaggio riesce a ripristinare la popolazione del livello superiore.

11.7.2 Laser pulsati


Quando il surriscaldamento non evitabile, si pu far funzionare il laser soltanto ad
impulsi, della durata magari di un microsecondo o di un millisecondo, sicch il
mezzo abbia la possibilit di raffreddarsi o lo stato inferiore di eliminare la propria
popolazione. Se, invece, conviene proprio sfruttare impulsi di radiazione anzich una
radiazione continua, e concentrare una grande quantit di potenza in un impulso
breve, si pu ricorrere a diversi modi operazioni quali il Q-Switching ed il ModeLocking.

11.8.2.1 Q-switching
La tecnica del Q-switching, il cui nome derivata dal fattore-Q che identifica la
qualit di una cavit risonante, consiste nel peggiorare inizialmente le qualit della
cavit risonante e favorire linversione di popolazione. Queste condizioni poi
vengono subitamente migliorate favorendo cos limpulso laser. Sono diverse le
tecniche che possono essere utilizzate per questo tipo di tecnica a impulsi, una di
queste quella che prevede limpiego di un assorbitore saturabile, tipicamente una
soluzione di colorante che perde la capacit di assorbire una volta che lintensa
radiazione ne abbia eccitato un gran numero di molecole. A questo punto il colorante
diviene bruscamente trasparente e la cavit risonante.
Un altro metodo per il Q-switching quello dello specchio rotante. Uno dei due
specchi che costituiscono il risonatore laser viene fatto ruotare attorno ad un asse
227

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

perpendicolare ad una velocit molto elevata. Ovviamente lazione laser potr partire
solo quando lo specchio rotante si trova parallelo allaltro specchio del risuonatore.
Lenergia di pompa viene quindi accumulata durante tutto il periodo in cui lo
specchio rotante risulta non parallelo allaltro specchio fisso e viene quindi rilasciata
sotto forma di un potente impulso di luce nel breve periodo nel quale i due specchi
sono paralleli.
Citiamo anche il metodo che prevede lutilizzo della Cella di Pockels. Questa di
potassio-diidrogenofosfato e, se ad essa viene applicato un potenziale, in grado di
ruotare il piano di propagazione della luce (da polarizzata su un piano, come quella
laser, ad una polarizzata circolarmente) impendendo che la radiazione emessa riesca
a stimolare lemissione di radiazione da parte di altre molecole. La cavit risonante
inattiva. Quando richiesto si rimuove il potenziale ripristinando cos la cavit
risonante.
Il Q-switching permette impulsi della durata di circa 5 ms.

11.8.1.2 Mode locking


Abbiamo anche visto che un laser irradia ad un certo numero di frequenze differenti,
a seconda delle specifiche caratteristiche di risonanza della cavit. I modi risonanti
differiscono di frequenza secondo multipli di c/2L. Di norma questi modi presentano
luno rispetto allaltro fase arbitraria, ma possibile bloccare le fasi insieme. Si pu
infatti dimostrare che ogni t=2L/c tutti i modi sono in fasi, in questa circostanza si
verifica linterferenza, che fornisce una serie di picchi acuti, mentre lenergia del
laser si ottiene in impulsi intensi dellordine del picosecondo. Lacutezza dei picchi
dipende dal campo dei modi che si sovrappongono e, quanto pi il campo vasto,
tanto pi ristretti sono gli impulsi. In un laser di cavit lungo 30 cm i picchi riescono
separati da 2 ns. Se concorrono 1000 modi, la larghezza degli impulsi 4 ps. Quindi:
limpulso dura dei picosecondi e tra un impulso e laltro passano dei nanosecondi.

228

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Figura 132 Tutte le onde hanno la stessa fase al tempo t=0 e ogni t=2L/c

11.8.1.3 Cavity dumping


Il Q-switching non funziona quando la vita media dello stato eccitato troppo breve.
In questi casi si usa la tecnica del cavity dumping per generare impulsi. Al di l di
questi casi, il cavity dumping usato in generale per ridurre la durata dellimpulso e
aumentare la frequenza di ripetizione. Nel Q-switching lenergia immagazzinata
nel mezzo attivo, mentre nel cavity dumping lenergia immagazzinata nella cavit.
In un certo senso, il cavity dumping linverso del Q-switching. Attraverso alcune
architetture si accumula la radiazione allinterno della cavit la quale viene poi
espulsa ad impulsi regolari.

11.7

Classificazione dei laser


11.9.1 Laser He-Ne

Un laser He-Ne costituito da unampolla di vetro contenente la miscela di gas che


fa le veci dellamplificatore (1.0 torr di He, 0.1 torr di Ne). Ai due lati dellampolla
vi sono altrettanti specchi uno riflettente al 100% alla frequenza richiesta per il
funzionamento del laser e laltro parzialmente riflettente per favorire luscita del
raggio laser. Lampolla collegata ad un alimentatore elettrico di corrente continua i
cui elettroni entrando in contatto con i gas ne determinano leccitazione in modo
229

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

continuo. Le collisioni tra elettroni e atomi rappresentano quindi la sorgente di


pompaggio per questo laser. Vediamo ora pi in dettaglio il motivo per cui questo
processo produce luce laser.
Dal momento che la quantit di He almeno di un ordine di grandezza superiore a
quella di Ne, gli elettroni avranno maggiore probabilit di collidere con i primi
rispetto ai secondi generando cos una molteplicit di stati eccitati. Quelli che
presentano la vita pi lunga (10-4-10-6 s)sono 2s 3S1 e 2s 1S0 cio uno degli elettroni
dellatomo di He viene eccitato nello stato 2s. Gli stati eccitati dellHe hanno
unenergia molto simile agli stati 2p55s e 2p54s del Ne nello stato fondamentale.
Pertanto, vista la vita relativamente lunga degli stati di He* sono possibili questi
trasferimenti non radiativi:
He*(2s3S1) + Ne(g) He(g) + Ne*(2p54s)
He*(2s1S0) + Ne(g) He (g) + Ne*(2p55s)
Gli stati 5s e 4s del Ne hanno una vita pi lunga rispetto a quelli di energia
leggermente inferiori 4p e 3p pertanto si pu instaurare uninversione di popolazione
tra gli stati s e p. Ne consegue che avremo una possibile emissione stimolata tra
questi stati nel Ne che sono associate alle transizioni dagli stati 3P2, 3P1, 3P0 e 1P1
associati alle configurazioni 2p5ns agli stati 3D3, 3D2, 3D1, 1D2, 3P2, 3P1, 3P0, 1P1, 3S1 e
1

S0 associati alle configurazioni 2p5np. Per esempio, la lunghezza donda di uscita a

1152.3 nm corrisponde alla transizione 4s 1P1 3p 3P2 del neon. Il laser He-Ne pi
largamente utilizzato produce una radiazione luminosa a 632.8 nm amplificando
lemissione che proviene dalla transizione 5s 1P1 3p 3P2.
Questi laser operano generalmente in modo continuo.

230

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Figura 133 - Una scarica elettrica produce atomi di He negli stati eccitati 2 3S e 21S. Le energie di tali stati
sono simili agli insieme di quattro stati 3P2, 3P1, 3P0 e 1P1 corrispondenti aalle configurazioni 2p54s1 e 2p55s1
del Ne, pertanto il trasferimento di energia non radiativo dallHe al Ne avviene prontamente per collisione.
Le vite medie degli stati eccitati del Ne prodotti da queste collisioni sono tali da rendere raggiungibile
linversione di popolazione. tra gli stati s e gli stati a pi bassa energia p (2p54p1 e 2p53p1)

I simboli di termine
3

P2, 3P1, 3P0, 1P1, 3D3, 3D2, 3D1, 1D2, 3P2, 3P1, 3P0, 1P1, 3S1 e 1S0 altro non sono che i simboli di

termine, antica eredita di un corso di Chimica Fisica di cui probabilmente non ci si ricorda
pi. Non necessario per gli scopi che ci prefiggiamo in queste dispense ricordarsi come si
calcolano (tra laltro non affatto semplice), ma bene ricordare a che cosa si riferiscono. I
simboli di termine forniscono una descrizione dettagliata della configurazione elettronica.
Per esempio la configurazione elettronica dello stato fondamentale di un atomo di carbonio
1s22s22p2. I due elettroni 2p potrebbero trovarsi in uno qualsiasi dei tre orbitali 2p (2p x,
2py e 2pz) ed avere un qualsiasi spin che sia in accordo col principio di esclusione di Pauli.
Per discernere le possibili combinazioni possibili possibile calcolarsi i simboli di termine
che si calcolano solo sui gusci non chiusi (quindi si ignorano 1s22s2) e saranno 1S0, 1D2, 3P0,
3

P1, 3P2 . Attraverso le regole di Hund poi possibile stabilire quali tra questi il pi stabile

che sar 3P0. Per approfondire: Chimica Fisica McQuarrie, Simon capitolo 8.

231

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

11.9.2 Laser a ioni


Un emissione laser pu avvenire in
presenza di ioni di gas nobili quali
Ne+, Ar+, Kr+ e Xe+, ma quelle che
coinvolgono gli ioni Ar+ e Kr+ sono le
emissioni pi utilizzate. Ci occupiamo
brevemente dei laser a ioni Ar+
costituiti da argon mantenuto a circa 1
Figura 134 - Le transizioni interessate dal laser ad Ar

torr, attraverso il quale si fa passare


una scarica elettrica. Questa causa la

formazione di ioni A+ e Ar2+ in stati eccitati i quali subiscono la transizione laser ad


uno stato inferiore. Tali ioni ritornano successivamente al proprio stato fondamentale
emettendo una radiazione ultravioletta a 72 nm e vengono poi neutralizzati da una
serie di elettrodi posti nella cavit laser. Uno dei problemi che si pongono ai
costruttori quello di reperire materiali atti a sopportare questa dannosa radiazione
residua. Nella transizione laser si presentano numerose righe perch gli ioni eccitati
possono subire la transizione a parecchi stati inferiori, ma due emissioni forti di Ar+
si registrato a 488 nm (blu) e a 514 nm (verde); altre transizioni si verificano altrove,
nel visibile, nellinfrarosso e nellultravioletto. Il laser a ioni di kripton funziona in
maniera analoga, meno efficiente, ma fornisce un campo di lunghezze donda pi
ampio, con la pi intensa a 647 nm (rosso); pu generare comunque anche righe nel
giallo, nel verde e nel violetto. Entrambi questi laser trovano ampio impiego negli
spettacoli di luce laser e nelle sorgenti di radiazione ad alta potenza per le attivit di
laboratorio. Si tratta di laser a quattro livelli.

11.9.3 Laser a vapori metallici


In questo tipo di laser il mezzo attivo costituito da atomi metallici neutri, sotto
forma di vapore, eccitati da una scarica elettrica. Un esempio di laser a vapori
metallici pu essere quello al Cd in cui dellHe eccitato collide con il Cd
ionizzandolo secondo la ionizzazione di Penning e realizzando cos uninversione di
popolazione. Il Cd+ il mezzo attivo che lasera:
232

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

He* + Cd He + Cd+ + e-

11.9.4 Laser molecolari


Tra

laser

molecolari

ci

soffermiamo su un particolare
laser a gas, quello a biossido di
carbonio che funziona sulla
base

di

un

principio

leggermente diverso da quelli


visti per i laser a ioni, in quanto
la sua radiazione (tra gli 9,2 m
e 10,8 m, con lemissione pi
forte a 10,6 m nellinfrarosso)
Figura 135 - I modi vibrazionali della CO2

origina

da

transizioni

vibrazionali. La maggior parte


del gas operante costituito da azoto, che si eccita vibrazionalmente per effetto di
urti elettronici e ionici nella scarica elettrica. I livelli vibrazionali coincidono
casualmente con la scala dei livelli energetici dello stiramento asimmetrico (3) di
CO2, che durante lurto assumono lenergia. Lazione laser si svolge tra il primo stato
eccitato di 3 e il primo stato eccitato dello stiramento simmetrico o del piegamento
rimasto spopolato durante lurto. Nel gas si introduce una certa quantit di He che
serve ad allontanare energia da questo stato e a mantenere linversione della
popolazione.

233

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Figura 136 La molecola di azoto viene eccitata. Vista la sovrapposizione energetica tra lo stato di
vibrazione antisimmetrica e lo stato elettronico eccitato di 2 avviene un trasferimento elettronico non
radiativo. A questo punto si verifica uninversione di popolazione tra il primo stato eccitato di vibrazione
antisimmetrica e i primi stati eccitati di piegamento ( 2) e vibrazione simmetrica ( 1) .

11.9.5 Laser chimici e a ecciplessi


Anche le reazioni chimiche possono servire per generare stati molecolari a
popolazione invertita, lontana dallequilibrio. Ad esempio, dalla fotolisi di UF6
traggono origine UF5 e atomi F che attaccano le molecole H2 della miscela
producendo HF eccitato e H. Poich le molecole di HF neoformate presentano
popolazione vibrazionale di non equilibrio, quando esse si portano a stati inferiori
(non popolati) ne pu derivare lazione laser. Processi siffatti costituiscono esempi
degni di nota di conversione diretta dellenergia chimica in radiazione
elettromagnetica coerente.
Linversione della popolazione indispensabile allazione laser si realizza in maniera
meno ovvia nei laser a ecciplessi, poich in essi lo stato inferiore di fatto non esiste.

234

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Questa singolare situazione si realizza formando un ecciplesso, vale a dire una


combinazione di due atomi o di due molecole atta a sopravvivere solamente in uno
stato eccitato e che, quindi si dissocia non appena sia stata eliminata lenergia di
eccitazione. Ce ne offre un esempio la miscela di xenon, cloro e neon (che agisce da
gas tampone). La scarica elettrica produce nel gas atomi eccitati di Xe, i quali si
legano agli atomi di cloro fornendo lecciplesso XeCl*. Questo sopravvive per circa
10 ns, quanto basta a prendere parte allazione laser a 308 nm (UV). Non appena
XeCl* abbia emesso un fotone, gli atomi si separano, perch la curva dellenergia
potenziale molecolare dello stato fondamentale di tipo dissociativo e questo stato
dellecciplesso non si pu popolare. Un altro esempio lecciplesso KrF*, che
produce radiazione di 249 nm.

Figura 137 - Curve dell'energia potenziale molecolare relative all'ecciplesso KrF*. La specie riesce a
sopravvivere solamente in uno stato eccitato, perch, liberandosi della propria energia accede allo stato
inferiore, che dissociativo. Potendo esistere solo lo stato superiore, quello inferiore non risulta mai
popolato.

11.9.6 Laser a stato solido


I laser a stato solido utilizzano ioni presenti in un cristallo ospite come mezzo attivo.
Il laser a rubino fu il primo ad essere inventato e rimane di discreto impiego.

235

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Il rubino (0,05% Cr3+ in zaffiro, Al2O3, funziona come un laser a tre livelli con
unemissione a 693.4 nm ad impulsi (ms) o continua. La luce visibile in una delle
due bande di pompaggio porta gli ioni Cr3+ in una delle due bande eccitate da cui
decadono in circa 100 ns a due livelli metastabili con tempo di vita medio a
temperatura ambiente di 3 ms. L'emissione permessa da entrambi i livelli, ma la
transizione dal livello E predominante. Il livello fondamentale il livello inferiore
della transizione laser e questo vuol dire che necessaria una pompa ad alta potenza
per portare la met degli atomi pi uno ai livelli pi alti di energia e quindi avere
un'inversione di popolazione. Questo innalza la soglia del laser e comporta una bassa
efficienza.

bande di pompaggio
transizioni non radianti
livelli metastabili
(

2A
E

luce di pompaggio
550 nm

420 nm

transizione laser 694,3 nm


stato fondamentale

Figura 138 - Laser a rubino

Un altro esempio di laser a stato solido quello Nd:YAG che si basa su


uninversione di popolazione che coinvolge quattro livelli energetici. Il Nd inserito
nel cristallo di YAG con una percentuale di circa l1%. I laser Nd:YAG vengono
pompati otticamente con una lampada stroboscopica o con diodi laser. Sono uno dei
tipi di laser pi comuni, e hanno una grande variet di usi.
Questi laser emettono normalmente luce con lunghezza d'onda di 1064 nm,
nell'infrarosso, ma presentano anche transizioni a 940, 1120, 1320 e 1440 nm. I laser
Nd:YAG possono funzionare sia in onda continua che ad impulsi; in quest'ultima
modalit vengono generalmente usati in commutazione Q, cio con un commutatore
ottico inserito nella cavit risonante che rimane chiuso finch il cristallo non ha

236

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

raggiunto la massima inversione di popolazione, momento in cui aprendosi permette


al laser di scaricare un singolo impulso di potenza molto alta.

11.9.7 Laser a semiconduttore


Un laser a semiconduttore opera nel vicino infrarosso e nella regione del visibile.
Con i laser al rubino e Nd:YAG un laser allo stato solido, ma i meccanismi di
produzione della luce laser sono un po differenti.
Nella figura seguente vediamo come sono collocate le bande di valenza e le bande di
conduzione in un conduttore (a), in un isolante (c) ed in un semiconduttore (b).I
semiconduttori presentano un band gap tra la banda di valenza V e la banda di
conduzione C che, non essendo sufficientemente elevato, permette la promozione di
un elettrone dalla banda di valenza a quella di conduzione per semplice
riscaldamento.

Figura 139 - Banda di conduzione (C), banda di valenza (V) per un conduttore (a), semiconduttore (b) e
isolante (c)

E possibile ottenere dei semiconduttori a partire da dei materiali isolanti


introducendo in essi delle impurezze in un processo noto come doping. In
particolare il dopaggio pu avvenire in due modi: introducendo un atomo che ha un
elettrone in pi rispetto al materiale che lo ospita (ottenendo un semiconduttore di
tipo n) riducendo cos il band gap tra banda di valenza e banda di conduzione in
seguito allintroduzione di un livello di impurezza con un elettrone tra la banda di
valenza e quella di conduzione. Il salto tra I e C quindi minore rispetto a quello tra
C e V senza drogaggio (es. Silicio drogato con Fosforo. Il fosforo ha un elettrone in
pi nellorbitale 3p rispetto al silicone). Laltro modo di drogare un isolante per
farlo diventare un semiconduttore quello di introdurre un elemento con un elettrone
in meno rispetto al materiale che lo ospita. Il risultato sar che vi sar una banda di

237

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

impurit I vuota ad energia pi bassa rispetto alla banda C di conduzione. In questo


caso il salto da V a I richiede unenergia minore rispetto a prima. Un esempio
silicio drogato con Alluminio.

Figura 140 - a) drogaggio di tipo n; b) drogaggio di tipo p

Prima di parlare dettagliatamente del laser a semiconduzione vediamo come


possibile creare, in generale, uninversione di popolazione allinterno di un
semiconduttore. Facciamo riferimento alla figura seguente e supponiamo di portare
in qualche modo elettroni dalla banda di valenza a quella di conduzione, cio di
iniettare portatori di carica nelle due bande. Dopo un breve tempo di riassestamento
(10-13 s) gli elettroni nella banda di conduzione si porteranno nella parte pi bassa di
essa, mentre la parte pi alta della banda di valenza risulter vuota di elettroni, cio
piena di buche. Si ottiene cos uninversione di popolazione tra banda di valenza e
banda di conduzione. Poich gli elettroni in C tendono a decadere in V, si potr avere
azione laser se tale materiale posto in un opportuno risuonatore.

Figura 141 - Prima (a) e dopo (b) l'applicazione della polarizzazione diretta. Da notare la perdita di
degenerazione dei livelli di Fermi

Una maniera molto semplice di ottenere linversione di popolazione consiste


nellutilizzare il semiconduttore in esame sotto forma di diodo a giunzione P-N, in
cui i due componenti P ed N siano fortemente drogati. In questo caso il pompaggio

238

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

viene realizzato polarizzando direttamente il diodo, ovvero facendolo attraversare da


unopportuna corrente che circoli dal lato P verso il lato N della giunzione. Quello
che avviene in un diodo di tale specie illustrato nella figura seguente.

Figura 142 - Schema di funzionamento di un laser giunzione P-N. a) giunzione non polarizzata. b)
giunzione polarizzata

Essendo il drogaggio molto forte, il livello di Fermi Fp del semiconduttore P cade


nella banda di valenza ed il livello di Fermi Fn del semiconduttore N cade nella
banda di conduzione. Se il diodo non polarizzato, si dimostra che i due livelli di
Fermi si portano alla stessa altezza (figura a)). Se il diodo polarizzato con una
tensione V, si dimostra che i livelli di Fermi si separano di una quantit F = eV.
Quindi, se il diodo polarizzato direttamente, i livelli energetici risulteranno come in
figura b). Si vede dunque che si ottiene uninversione di popolazione nel cosiddetto
strato di svuotamento della giunzione P-N. Essenzialmente una tensione di
polarizzazione diretta inietta elettroni nella banda di conduzione (dalla zona N) e
sottrae elettroni (ovvero inietta lacune) nella banda di valenza (dalla zona P). Infine,
alcuni di questi elettroni rilassano e tornano nella banda di valenza, liberando una
quantit di energia pari allenergia del salto di banda. Parte dellenergia viene
liberata sotto forma di radiazione elettromagnetica.
Uno schema di principio di un laser a giunzione P-N mostrato in figura seguente,
dove lo strato di svuotamento indicato tratteggiato. Come si vede, le dimensioni

239

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

del diodo sono piccole; lo spessore dello strato di svuotamento di solito molto
piccolo (0.1 m). Per avere azione laser due delle superfici terminali sono lavorate
speculari e rese parallele. Le altre due sono lasciate grezze per evitare oscillazione
lungo direzioni non desiderate. Di solito le due superfici lavorate non vengono
ricoperte di specchi: infatti, siccome lindice di rifrazione di un semiconduttore
molto elevato, si ha gi abbastanza riflessione totale alla superficie di separazione
semiconduttore-aria. La regione attiva costituita da uno strato di spessore di circa 1
um, pi grande dello spessore dello strato di spopolamento. La dimensione trasversa
del fascio risulta a sua volta molto maggiore, circa 40 m, della dimensione della
zona attiva. Londa elettromagnetica laser riesce cio a penetrare notevolmente sua
nella zona p che nella zona N. Tuttavia, poich le dimensioni trasverse del fascio
risultato pur sempre molto piccole, il fascio in uscita possiede una divergenza molto
elevata.

Figura 143 - a) Disegno schematico di un laser a semiconduttore. b) Distribuzione trasversa dell'intensit


della luce

Infine, diciamo che, tuttavia, i laser a semiconduttore non presentano una semplice
giunzione P-N, ma una giunzione multipla N-P-P.

240

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Figura 144 - Giunzione multipla N-P-P dei laser a semiconduttori

11.9.8 Laser a coloranti


I laser pi importanti da un punto di vista analitico sono i laser a coloranti (rodamina,
cumarina).
Una soluzione di colorante emetter a lunghezze donda controllate dal suo spettro di
fluorescenza e coloranti diversi consentono di avere lunghezze donda variabili tra i
20 e i 50 nm. Vi sono molti tipi di dye laser con differenze rilevanti.
Da un punto di vista del pompaggio si differenziano in:
-

N2, eccimeri o Nd:YAG

lampade a flash

CW dye laser pompato da Ar+ o Kr+ laser

Il primo tipo il pi semplice e facile da usare.


Quando il colorante viene eccitato abbiamo una promozione degli elettroni al livello
elettronico eccitato. Lemissione per fluorescenza che ne consegue non sar
monocromatica, ma coinvolger tutti i livelli vibro-rotazionali dello stato
fondamentale e determiner cos unemissione laser ad ampia banda. Per
permettere lemissione monocromatica, la radiazione fluorescente colpisce un
reticolo che invier alla soluzione di colorante una sola delle lunghezze donda cos

241

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

che sia quella a permettere lemissione laser ad una singola e non a diverse.
Ruotando il reticolo possibile emettere radiazione laser a diverse lunghezze donda.
Un colorante utilizzato comunemente la rodammina 6G in metanolo. Essendo il
guadagno altissimo, baster che solo un breve tratto del percorso ottico attraversi il
colorante. Gli stati eccitati del mezzo (il colorante) sono sostenuti da un altro laser o
da una lampada lampo, e la soluzione del colorante si fa fluire attraverso la cavit
laser per evitare la degenerazione termica.
I laser a coloranti possono essere continui o ad impulsi.

11.10 Strumentazione per misure di cinetica veloce


I laser possono essere utilizzati a risoluzione temporale per andare a studiare
levoluzione di quelle reazioni indotte dalla luce. Stiamo parlando delle reazioni
fotochimiche che possono essere di diversi tipi: fotodissociazione (nellesempio
riportato sotto che coinvolge lozono), fotoisomerizzazione e fotodimerizzazione.
O3 (g) + (=300 nm) O2 (g) + O
Per una reazione fotochimica sempre bene definire il rendimento quantico dato
dal rapporto tra il numero di molecole che subiscono la reazione ed il numero di
fotoni incidenti. Per la reazione di fotodissociazione dellozono, 1.
Di seguito analizziamo larchitettura di uno spettrofotometro laser a risoluzione
temporale. La sorgente innanzitutto una sorgente ad impulsi dellordine dei
femtosecondi. La luce in uscita collide con un separatore di fascio (uno specchio
parzialmente riflettente). Da questo punto in avanti il fascio si divide in due e seguir
due cammini distinti regolati da opportuni specchi. Limportante che, alla fine di
questi cammini ottici, entrambi i fasci arrivino a colpire il campione. I raggi laser
possono compiere cammini lunghi uguali (a quel punto arriveranno allo stesso istante
al campione), oppure cammini lunghi diversamente (i raggi arriveranno al campione
con un ritardo). Quello che si studia in una spettroscopia laser risolta nel tempo la
misurazione di alcune propriet del campione in funzione del tempo di ritardo tra i
due impulsi. Il primo impulso colui che determina la reazione fotochimica e viene
242

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

chiamato impulso di pompaggio. Il secondo impulso quello che viene utilizzato a


fini analitici per rilevare le variazioni nel campione dallarrivo dellimpulso di
pompaggio e viene chiamato impulso di ispezione.

Figura 145 - Schema di uno spettrofometro laser a risoluzione temporale. In questa illustrazione manca il
divisore di fascio. Si supponga che sia collocato fuori dall'immagine prima del sistema di specchi. Anche se
alcuni dispotivi possono disporre di due sorgenti differenti (una laser per leccitazione e una policromatica
per la sonda)

La caratterizzazione di specie chimiche a vita molto breve oppure lo studio per


seguire levoluzione temporale di stati eccitati di una molecola pu avvenire per
assorbimento transiente oppure per fluorescenza indotta da laser (LIF).
In un esperimento di assorbimento transiente, un impulso ultracorto molto intenso
di pompa utilizzato per eccitare la molecola dallo stato fondamentale a uno stato di
energia pi alta, che pu rapidamente evolvere sia dissociando la molecola in radicali
o specie ioniche, sia trasferendo l'energia ad altri stati molecolari. A questo punto, un
impulso di sonda viene inviato sul campione con un ritardo calcolato. Il ritardo ottico
si realizza facendo attraversare a uno dei due raggi un cammino variabile,
semplicemente spostando, con l'aiuto di un motore comandato da un calcolatore, due
specchi o un prisma, come mostrato nella figura precedente. La radiazione usata per
l'impulso di sonda pu essere sia luce bianca, cio radiazione che si estende su quasi
tutto lo spettro visibile, sia radiazione centrata a una frequenza diversa da quella del
raggio di pompa, ma tale da essere assorbita dalle nuove specie presenti. L'impulso
di sonda utilizzato per ottenere due spettri di assorbimento del campione, uno in
presenza e uno in assenza del raggio di pompa. La differenza tra i due spettri fornisce

243

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

lo spettro della specie transiente. Utilizzando ritardi variabili si ottiene lo spettro


risolto nel tempo.
Anche la fluorescenza indotta da laser o LIF (Laser induced fluorescence) molto
utilizzata in misure di femtochimica. Il grande vantaggio di questa tecnica il
bassissimo rumore di fondo rispetto alle misure di assorbimento. In questo caso, la
fluorescenza emessa dal campione a seguito dell'assorbimento di un impulso
ultracorto registrata in funzione del tempo. Tutte le misure del tipo pump and probe
(cos chiamata la tecnica che richiede un impulso di eccitazione e uno di sonda)
richiedono l'agganciamento di fase dei due impulsi laser e una corretta eliminazione
di tutti i contributi incoerenti che disturbano la misura.
Unapplicazione ambientale della LIF proviene dal gruppo di ricerca del Prof. Di
Carlo dellUniversit de lAquila applicata allatmosfera. La tecnica LIF consiste
nelleccitare le molecole presenti in atmosfera con un laser e osservarne la
fluorescenza indotta in celle, tenute a bassa pressione. Le sistema LIF sviluppato nel
laboratorio di ricerca vengono utilizzati un laser YAG che emette radiazione a 532
nm con frequenza di 20kHz e

fotomoltiplicatori come detector. Il LIF viene

impiegato per misurare la concentrazione degli ossidi di azoto, importanti per il


controllo dei livelli di ozono. Vengono inoltre osservati: perossinitrati, alchilnitrati
ed acido nitrico che, facendo parte degli NOx, hanno un ruolo determinante nel
bilancio degli ossidi di azoto.

11.11 Spettroscopia laser ad alta risoluzione


La spettroscopia laser prevede lutilizzo di luce monocromatica (anche se alla fine
ogni lunghezza donda sar associata ad una banda passante, molto limitata, circa
3x10-5 cm-1 per i laser che emettono nel visibile, ma pur sempre presente). Questa
caratteristica permette di ottenere degli spettri ad alta risoluzione che sia in grado di
determinare addirittura le piccole variazioni di energia degli stati rotazionali causate
dallinterazione degli spin elettronici con gli spin nucleari, un effetto chiamati
interazione iperfine.

244

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

11.12 Quasi elastic light scattering (DLS)


La spettroscopia di correlazione fotonica, nota anche come diffusione dinamica della
luce e diffusione quasi elastica della luce, applicabile alla misura delle particelle
sospese in un liquido in moto browniano, cio < 6 m. La velocit del moto
inversamente proporzionale alla dimensione della particella e pu essere individuata
analizzando la dipendenza del tempo di fluttuazione dellintensit luminosa diffusa
dalle particelle, quando illuminate da un raggio laser.
Questa tecnica applicata in un analizzatore di distribuzione di dimensione delle
particelle che opera nel campo dimensionale tra 3 nm e 6 m.. Il raggio generato da
un diodo laser 650 nm, collimato dalla lente collimatrice del laser sul foro di uno
specchio ripartitore, filtrato mediante un foro a spillo dun filtro e focalizzato sulle
particelle del campione contenuto nella cella, per mezzo di due lenti condensatrici. Il
loro punto focale posizionato sulla parete interna della cella, concentrandovi il
massimo della luce, allo scopo di sopprimere le diffusioni multiple, che hanno luogo
quando si misurano dispersioni ad alta concentrazione. Il filtro a foro di spillo
rimuove i raggi erranti, assicurando che solo la luce diffusa dal punto focale sia
inviata ai rivelatori. La luce diffusa dallinterazione con le particelle, attraverso le
lenti di raccolta delle radiazioni diffuse, q eulla condensatrice, sono filtrate dal foro
di spillo del filtro e deviate dallo specchio ripartitore verso la lente condensatrice di
raccolta della luce focalizzata sul rivelatore. Il segnale generato corrisponde alle
vibrazioni dovute al moto browniano delle particelle nel campione. La frequenza di
vibrazione di una particella dipende da numerosi fattori, compresa la dimensione. Per
mezzo dellanalisi della componente principale della frequenza, si ricava la
distribuzione dimensiona delle particelle. La cella di misura consiste di una cuvetta
tale da contenenre da 2 a 4 ml di campione, che una quantit sufficiente per
lanalisi; essa pu essere termostatata elettronicamente o con bagnomaria tra 20C e
70C. Il tempo della misura non supera i 2 minuti. Il software di gestione,
dacquisizione e di elaborazione dispone di numerose funzioni compresa la
presentazione 3D di misure comparative dei risultati e la segnalazione delle
variazioni dagglomerazione dovute ai cambi di temperatura.

245

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Le tecniche di diffusione della luce sono utilizzate nei rivelatori a luce diffusa per
HPLC, con geometrie di rilevamento di diverso tipo, per lidentificazione e
determinazione delle caratteristiche dimensionali di micelle e dei pesi molecolari di
macromolecole separate cromatograficamente per SEC.
Il DLS pu essere usato per la determinazione del diametro di particelle di forma
irregolare come per esempio il particolato carbonioso.

Figura 146 - Intensit della diffusione causata da piccole particelle (sinistra) e da grandi particelle (destra)

Figura 147 - A sinistra come varia l'intensit della luce in funzione del tempo. A destra il diagramma che
correla il coefficiente di correlazione al tempo che viene ottenuto via software utilizzando apposite
funzioni. Il coefficiente di questa curva il coefficiente di diffusione che correlato alle dimensioni delle
particelle attraverso la legge di Stokes-Einstein

11.13 LIDAR
LIDAR un acronimo per Light Detection And Ranging. La tecnica utilizza gli
stessi principi del RADAR, usato per la misurazione delle distanza di un oggetto da
un osservatore. Nel RADAR, il tempo impiegato dalle radioonde per viaggiare verso
e dalloggetto, che riflette o retrodiffonde la radiazione, facilmente convertito in

246

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

una misura della distanza. La differenza del LIDAR rispetto al RADAR, risiede
nellutilizzo di una sorgente di radiazione differente: un laser a impulsi (limpulso
ottenuto mediante cavity dumping) con frequenze che giacciono tra linfrarosso, il
visibile e lultravioletto.
Il LIDAR una tecnica estremamente potente per le indagini riguardanti la
composizione dellatmosfera (troposferica e stratosfera). I componenti dellatmosfera
possono essere nella forma di goccioline liquide (le nubi), particelle (aerosol) oppure
gas. I dispositivi LIDAR possono essere terrestri, installati su aeroplani oppure
alloggiati su satelliti e, sono costituiti da una sorgente pulsata e da un detector per la
misura della radiazione riflessa o retro diffusa.
Il LIDAR pu essere utilizzato quindi come telemetro (per valutare le distanze di
nubi, aerosol e componenti gassose dal dispositivo) oppure come strumento per
misure spettroscopiche sui diversi gas presenti in atmosfera. Questi, come vedremo,
includono ozono, anidride carbonica, CFC e tutte quelle molecole di interesse
ambientale.
Una volta che la radiazione laser viene pulsata dal LIDAR, essa raggiunge le
particelle e le molecole nel suo cammino e pu essere scatterata o assorbita in modi
diversi. Una parte della luce scatterata o emessa ritorna al punto di origine, dove un
telescopio ricevente la analizza e produce un segnale proporzionale alla radiazione
ricevuta. Il lasso di tempo tra la trasmissione ed il ricevimento del segnale indica da
quale distanza la luce stata scatterata e lintensit del segnale indica la
concentrazione delle particelle o delle molecole da osservare. In pratica queste letture
di tempi e di intensit richiedono un trattamento pi elaborato per descrivere
compiutamente le condizioni atmosferiche. Quando ci ottenuto, i dati possono
essere utilizzati per stabilire i profili di vari componenti atmosferici.
I LIDAR si suddividono in monostatici (b), bistatici (a) e monostatici con reflector
(c) a seconda della loro configurazione. In particolare i LIDAR monostatici sono
quelli che presentano sorgente laser e rivelatore nella stessa posizione (misureranno
quindi la luce diffusa che torna indietro), quelli bistatici presentano la sorgente a

247

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

monte e il rivelatore a valle. Infine, quelli monostatici con reflectron. In figura 149
sono illustrate queste tre configurazioni.

11.13.1 DIAL
Un sistema LIDAR ci permette di effettuare misure relative a numerose specie
presenti in atmosfera. Tra le altre lO3 e lSO2. La determinazione della
concentrazione di queste molecole (cos come quella di molti altri inquinanti
atmosferici) possibile utilizzando la tecnica DIAL (LIDAR in assorbimento).
Supponiamo di voler valutare la concentrazione di SO2. Si usano 2 raggi laser
coassiali con molto vicine: una quella della specie assorbente, laltra molto
vicina. Essendo molto vicine in termini di lunghezze donda, le onde subiscono gli
stessi effetti di rifrazione, ma quando incontrano il campione una verr
maggiormente assorbita dellaltra, quindi il segnale sar meno intenso.

Figura 148 - I tre tipi di architettura di un LIDAR: bifasici, monofasici e monofasici con reflector

248

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

Facendo il rapporto tra le due intensit ho la trasmittanza locale dalla quale si ottiene
lassorbanza in funzione della distanza (Figura 153). Con questa tecnica sono
limitato a determinare una sola specie alla volta (quella della scelta). Posso vedere
fino a ppb a qualche chilometro di distanza dalla sorgente. Per ottenere due
lunghezze donda cos vicine, utilizzo il battimento delle frequenza da una sola
sorgente. Queste misure si fanno nellUV, nel VIS, nellIR (dove ci sono le finestre
libere di trasmittanza, cio dove latmosfera non assorbe). Una misura con un
LIDAR in assorbimento molto costosa (1-2 milioni di uro).
I laser utilizzati nelle tecniche LIDAR sono a gas (CO2), a eccimeri (ArF, KrF, XeF,
KrCl), a stato solido (rubino, Nd:YAG.) o a coloranti (operanti nel NIR, nel VIS
e nellUV). Le applicazioni sono diverse a seconda della radiazione utilizzata.

Figura 149 Esperimento DIAL atto alla determinazione di SO2 proveniente da un impianto di produzione
elettrica. I due segnali LIDAR hanno una lunghezza donda di 299.5 e 300.2 nm. Vengono riportati nel
grafico sottostante le concentrazioni in ppb. I segnali sono stati raccolti da un fotomoltiplicatore.

Possono essere utilizzati per la determinazione di inquinanti (e non solo) troposferici


e stratosferici (O3, NO, SO2, Cl2 e Hg per lUV, nel VIS NO2, nel NIR H2O e nel
medio IR molte sostanze tra le quali CH4, HCl, NH3, C6H6, O3, CO2.) anche da
terra senza necessit di utilizzare costosi palloni aerostatici.

249

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

11.3.2 LIDAR RAMAN


Come abbiamo avuto modo di anticipare, il LIDAR non funziona solo in
assorbimento, la cui applicazione labbiamo vista con la tecnica DIAL, ma anche con
scattering.
Lo scattering il processo col quale una particella sottrae energia ad un onda che vi
incide e la irradia nellangolo solido totale incentrato sulla particella (centro
diffusore). Condizione necessaria affinch il processo di scattering abbia luogo che
lindice di rifrazione della particella sia diverso dal mezzo in cui immersa; in tal
modo essa rappresenta una discontinuit ottica per londa.
Londa incidente provoca leccitazione degli elettroni della particella originando
dipoli oscillanti che producono onde sferiche. Nel caso di scattering elastico la
frequenza dellonda sferica generata la stessa dellonda incidente.
A seconda delle dimensioni dei centri diffusori rispetto alla lunghezza donda del
fascioincidente possibile distinguere tre differenti processi di scattering :
a. Scattering di Mie: un processo di scattering elastico che ha luogo
quando le dimensioni della particella diffondente sono uguali o
maggiori della lunghezza dellonda incidente . In questo caso la
radiazione diffusa concentrata nella direzione e nel verso di
propagazione iniziale;
b. Scattering di Rayleigh: anchesso un processo di scattering elastico.
In questo caso le particelle diffondenti hanno dimensioni minori della
lunghezza donda incidente. La radiazione diffusa concentrata
ancora nella direzione di propagazione, ma con uguale intensit nei
due versi di propagazione;
c. Scattering Raman: un processo di scattering anelastico; si manifesta
con la comparsa, nello spettro della radiazione diffusa, di bande
spostate, rispetto alla frequenza della radiazione incidente, di una
quantit pari alle frequenze rotovibrazionali della molecola che funge
da centro diffusore. Poich lenergia rotovibrazionale strettamente
250

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

dipendente dal legame chimico presente nella molecola, con lo studio


di questo tipo di scattering si pu risalire alla specie molecolare.
Lo studio dei processi di scattering assume rilievo nellanalisi del particolato
atmosferico perch gli aerosol hanno una notevole propriet di scattering in
atmosfera, maggiore di quella attribuibile alle molecole di un gas (minore, per, di
quella delle formazioni nuvolose). I processi di interazione radiazione-materia fin qui
menzionati dipendono fortemente dalla composizione atmosferica, dunque possono
fornire rilevanti informazioni sulla tipologia e sulla concentrazione degli aerosol
presenti in atmosfera.
Il problema dei segnali Raman che ritornano al rivelatore (vd. dopo i telescopi) che
sono per poco intensi. Dovr pertanto usare un laser molto intenso. La minore
intensit anche da ricercarsi nel fatto che lintensit della luce scatterata decresce
con laumentare della distanza in funzione anche della lunghezza donda utilizzata.

Figura 150 - Decadimento della potenza del segnale in funzione della distanza e della lunghezza d'onda
scelta. Linea continua: 300 nm, linea tratteggiata: 500 nm

Dicevamo in precedenza che era interessante studiare il segnale Raman che


raggiunge il rivelatore. Esso pu andare bene per analizzare i fumi di scarico per
esempio di una ciminiera. Per far diventare lanalisi quantitativa bene fare il bianco
con lN2, la specie pi abbondante e che potrebbe dare pi interferenze, e poi
registrare lo spettro. Il problema del Raman la sua debole intensit che pu per

251

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

essere amplificata utilizzando opportuni fotomoltiplicatori. Altre interferenze


possono provenire dalla luce ambientale causando un aumento del rumore di fondo.
Questo pu essere ovviato per esempio effettuato analisi in notturna.

11.3.3 I rivelatori di un LIDAR


I segnali in arrivo sono captati da telescopi che raccolgono la radiazione retrodiffusa
dal particolato e dalle molecole presenti in atmosfera nella zona di intersezione tra
campo di vista del telescopio e fascio laser. Tale zona rappresenta il volume
atmosferico investigato, da cui si ottiene il segnale Lidar. Il telescopio si compone di
uno specchio primario, sferico, con diametro pari a 30 cm e lunghezza focale pari a
120 cm e di uno specchio secondario, piano, che invia la radiazione verso il sistema
di selezione spettrale. La presenza del secondario provoca una zona dombra
geometrica che impedisce di raccogliere tutta la radiazione retrodiffusa a basse
quote. Per non sottostimare lintensit del segnale ricevuto bisogna correggere il
segnale con un coefficiente moltiplicativo detto fattore di forma geometrico. Daltra
parte, si tenga presente che, comunque, il campo di vista del telescopio pu essere
regolato con lapertura di un diaframma posto alluscita del telescopio e quindi si pu
favorire la raccolta di radiazione proveniente dalle basse quote, ma, in tal modo, si
ottiene un peggioramento del rapporto segnale rumore e la saturazione dei
fotomoltiplicatori. Si cerca quindi di raggiungere un compromesso, al fine di evitare
perdite di radiazione retrodiffusa eccessive a basse quote ed avere, comunque, un
buon rapporto segnale rumore. Il telescopio deve essere senza rugosit che altrimenti
potrebbero dare origine a fenomeni di scattering: pi sono grossi, maggiori sono le
difficolt nel realizzare superfici perfettamente lisce. Una soluzione sembra essere
quella di creare uno specchio di Hg uniforme e senza imperfezioni superficiali.

11.13.2 Altre applicazioni del LIDAR


Il Oltre al DIAL esplorato in precedenza e allo studio della radiazione RAMAN,
sono aperti diversi esperimenti che coinvolgono le tecniche LIDAR. Il primo anche
andiamo a studiare il GALE che lacronimo per Giant Aperture Lidar
Experiment. Nellatmosfera tra gli 80 e i 120 km esiste uno strato di metalli noto
252

Analisi degli inquinanti con laboratorio Spettroscopia laser

come metal layer costituito da sodio, ferro e calcio. Si tratta di residui lasciati da
un costante flusso di meteoriti che entrano in contatto con la nostra atmosfera. Questi
elementi si trovano nel loro stato elementare perch laria cos rarefatta che non
posso n reagire con lossigeno n

possono essere efficacemente ionizzati.

Lesperimento GALE misura il vento, la temperatura utilizzando lo scattering


fluorescente di risonanza dovuto al sodio trasportato in quel sottile strato di
atmosfera dalle meteoriti. Lo scattering fluorescente di risonanza significa che
quando gli atomi di sodio sono illuminati ad una precisa lunghezza donda (589 nm)
si eccitano ed irradiano luce. Il ricevitore LIDAR misura una frazione di questa luce.
Sfruttando leffetto Doppler, che si manifesta con una piccola variazione della
lunghezza donda misurata, possibile determinare la velocit del vento negli strati
alti dellatmosfera.
Ricorda che leffetto Doppler quel fenomeno che consiste nel cambiamento,
rispetto al valore originario, della frequenza percepita da un osservatore raggiunto da
unonda emessa che si trovi in movimento rispetto allosservatore stesso. Se v a la
velocit di allontamento della luce (quindi dellatomo di sodio), si sfrutta:

per determinare va, quindi la velocit del vento negli strati alti dellatmosfera. 0 la
lunghezza donda di partenza.
Un altro esempio di studi sono quelli effettuati dal progetto LITE (Lidar, Technology
Experiment). Il LITE stato progettato per misurare i componenti atmosferici nelle
nubi e gli aerosol dispersi in atmosfera. Le nuvole sono misurate usando scattering
elastico (la luce scatterata ha la stessa frequenza di quella incidente) della luce
causato dagli aerosol.

253

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

CAPITOLO 12
12 Luminescenza

In questo capitolo discuteremo i fenomeni della luminescenza quali:


-

fotoluminescenza (eccitazione per mezzo di un fotone)


o fluorescenza
o fosforescenza

chemiluminescenza (eccitazione per via chimica)

termoluminescenza (eccitazione per via termica)

triboluminescenza (eccitazione per via meccanica)

In particolare ci soffermeremo sulle prime due categorie di fenomeni dando appena


un assaggio degli altri due.

12.1 Fotoluminescenza
La fotoluminescenza quel fenomeno che si origina dalleccitazione di una molecola
per mezzo di un fotone. La molecola eccitata pu diseccitarsi con fenomeni non
radiativi o radiativi, cio con emissione di luce. In questo caso essa pu dare origine
a fluorescenza se la diseccitazione coinvolge gli stati di singoletto eccitato S 1 e di
singoletto fondamentale S0, oppure fosforescenza se coinvolge gli stati di tripletto
eccitato T1 e di singoletto fondamentale S0. Come abbiamo gi avuto modo di
discutere ampiamente nel 11.1, la prima transizione permessa per spin, la seconda
proibita, quindi poco probabile. Questo si traduce in tempi di rilassamento pi brevi
per la fluorescenza e pi lunghi per la fosforescenza.
In uno spettro possiamo distinguere sia il contributo di assorbimento, sia quello di
fluorescenza sia quello di fosforescenza. In effetti lenergia che coinvolge questi
processi decrescente (Eass > Eflu > Efosf) cos che i fenomeni avvengono a lunghezze
donda crescenti come mostrato nel grafico seguente.

250

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

Figura 151 - A (assorbimento), F (fluorescenza), P (fosforescenza)

Se osserviamo soltanto le transizioni di fluorescenza e di assorbimento notiamo che i


massimi sono distanziati di un certo . Questa differenza detta Stokes shift. Esso
dipende da due fattori principali:
-

in seguito allassorbimento del fotone, si ha un rapido rilassamento non


radiativo verso il livello vibrazionale fondamentale dello stato eccitato,

lintorno chimico fisico pu stabilizzare pi efficacemente il livello


elettronico eccitato del fluoroforo di quanto non faccia con il livello
elettronico fondamentale

In generale gli stati eccitati corrispondono a condizioni di alta polarizzazione della


molecola, pertanto tendono ad essere stabilizzati in un solvente polare, con leffetto
di abbassare lievemente lenergia dello stato eccitato e quindi di aumentare lo Stokes
shift rispetto ad un ambiente meno polare. Un esempio il triptofano, un
amminoacido fluorescente che presente in molte proteine. Se la conformazione
proteica tale da proteggere il triptofano dallacqua circostante, si osserver uno
Stokes shift minore rispetto a quando la conformazione proteica tale da esporre
lamminoacido al solvente. Pertanto lanalisi dello spettro di fluorescenza pu fornire
informazioni sulla configurazione proteica. Inoltre lemissione di fluorescenza
generalmente indipendente dalla lunghezza donda di eccitazione, purch la sostanza
sia in grado di assorbire a tale lunghezza donda.
255

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

La caratteristica principale di un fluoroforo la resa quantica di fluorescenza


(quantum yield), definita come il rapporto tra il numero di fotoni emessi ed il numero
di fotoni assorbiti. La resa quantica di fluorescenza pu anche essere espressa in
funzione delle costanti di velocit associate ai diversi fenomeni che possono avvenire
in seguito ad uneccitazione: fluorescenza (kf), conversione intersistema (ki),
conversione esterna (la diseccitazione della molecola nello stato eccitato in seguito a
urti con molecole del solvente o di altri analiti, k ec), conversione interna (il passaggio
dallo stato eccitato a quello fondamentale senza emissione, particolarmente
importante quando i livelli energetici sono sufficientemente vicini da dare una
sovrapposizione dei livelli vibrazionali, kic), predissociazione (kpd) e dissociazione
(kd). Questa dipendenza viene espressa dallequazione:

Il segnale di fluorescenza proporzionale alla resa di fluorescenza e allintensit


assorbita:

Dove F lintensit del segnale, k una costante strumentale e la resa quantica


di fluorescenza.
Operando le dovute sostituzioni si pu ottenere unespressione che ci permette di
correlare F con la concentrazione:

Dove I0 lintensit della radiazione incidente


Il cui grafico il seguente:

256

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

Figura 152 - Si noti come la linearit si perda a concentrazioni via via crescenti di fluoroforo. Una possibile
causa quella dell'autoassorbimento. Si noti anche la dipendenza dalla temperatura. Tutti gli esperimenti
vanno condotti a temperatura costante e questa va opportunamente dichiarata, pena la mancata
riproducibilit degli stessi.

Notiamo come in realt il segnale non sia direttamente proporzionale alla


concentrazione, ma lo solo per valori di concentrazione tendenti a zero. Insomma,
lintensit della fluorescenza dipende, come per lassorbanza, dalla legge di LamberBeer, definita come il prodotto fra il coefficiente di estinzione molare, il cammino
ottico e la concentrazione molare. Compaiono inoltre altri termini quali la resa
quantica, lintensit della sorgente usata per leccitazione, e lefficienza strumentale
del rilevatore. In soluzioni (o sospensioni) diluite, lintensit della fluorescenza
linearmente proporzionale a questi parametri. Quando lassorbanza eccede 0.05 (per
un cammino ottico di 1 cm), la relazione diventa non lineare, e le misure possono
essere falsate da fenomeni quali lautoassorbimento.
Dalla relazione precedente si evince che, aumentando lintensit della radiazione
incidente, aumenti anche la fluorescenza. In realt, in condizioni di illuminazione
intensa, la distruzione irreversibile del fluoroforo (photobleaching) diventa il fattore
limitante alla rilevazione fluorimetrica. Alcuni meccanismi del photobleaching
includono reazioni tra molecole fluorofore adiacenti, rendendo il processo
considerevolmente pi complicato in campioni biologici reali che in soluzioni diluite
del fluoroforo libero. In tutti i casi, il photobleaching ha origine dallo stato di
tripletto eccitato, che creato dallo stato di singoletto eccitato attraverso un
meccanismo chiamato intersystem crossing. Il rimedio migliore al photobleaching

257

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

massimizzare la sensibilit del rivelatore, permettendo di ridurre lintensit della


radiazione.
I fluorofori assorbono preferenzialmente radiazione polarizzata parallelamente al
momento di dipolo, il quale dipende dai livelli elettronici coinvolti nella transizione.
Se i fluorofori sono in soluzione, la loro orientazione nello spazio sar casuale. Nel
caso di eccitazione con radiazione linearmente polarizzata, solo i fluorofori orientati
con il momento di dipolo parallelo ad essa potranno assorbire fotoni e,
successivamente, emettere. La foto selezione produce una popolazione nello stato
eccitato parzialmente orientata. Se il materiale in analisi rigido, anche la
fluorescenza sar parzialmente polarizzata. Se, al contrario, le molecole possono
muoversi,

la

luce

in fluorescenza

avr

diverse

direzioni

di

emissione

(depolarizzazione della fluorescenza). Misure che valutino quindi lanisotropia di


fluorescenza permettono di ottenere indicazioni sulla mobilit delle molecole.
La fluorescenza presenta numerosi vantaggi: non tutte le molecole che assorbono
emettono e si ottengono segnali significativi anche a bassissime concentrazioni.
Notevole, a tal proposito, il risultato che stato raggiunto dal Dipartimento di
Chimica e di Biochimica dellUniversit della California nel 1990 che riuscito a
determinare una molecola (!!) di pentacene dispersa in un cristallo di p-terfenile.
Questo la dice lunga sulla grande sensibilit di questa tecnica. Da un punto di vista
molecolare, gli elettroni coinvolti nelle transizioni di fluorescenza sono generalmente
elettroni e la fluorescenza si osserva generalmente nei composti che presentano
transizioni *.

12.1.1 Il Quenching
Il processo di fluorescenza di per s ciclico. Se il fluoroforo non distrutto nello
stato eccitato (photobleaching o il quenching ad opera di altre molecole che de
popolano lo stato eccitato), lo stesso fluoroforo pu essere ripetutamente eccitato e
rivelato. Il fatto che un singolo fluoroforo possa generare molte migliaia di fotoni
rilevabili fondamentale per lalta sensibilit delle tecniche di rilevazione a
fluorescenza. Per massimizzare la sensibilit quindi fondamentale evitare la

258

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

presenza di quencher o, come detto in precedenza, evitare di utilizzare una


radiazione incidente troppo intensa. Tra i quencher pi comuni vi lO2 che pu
reagire con le specie eccitate depopolando cos S 1. Un altro quencher rilevante la
temperatura: pi la temperatura cresce, pi la fluorescenza diminuisce come tra
laltro visibile nella figura 153.
Se la temperatura per un parametro facilmente controllabile, occorre fare
maggiore attenzione alla riduzione consistente dellO 2. Ci che viene fatto un
degassamento dei solventi. In particolare lossigeno molecolare un quencher
collisionale insieme ad altri molto comuni come le ammine, gli alogeni,
lacrilammide, lo Xe, lH2O2 e gli ossidi di azoto.
I meccanismi di quenching in seguito alle collisioni variano a seconda della coppia
queancher-fluoroforo. Ad esempio le ammine alifatiche o aromatiche sono quencher
collisionali selettivi per fluorofori aromatici tramite un meccanismo di trasferimento
di carica durante la collisione. Gli alogeni e in particolare lo iodio sono quencher
collisionali molto efficienti che promuovono lintersystem crossing verso uno stato
di tripletto del fluoroforo per accoppiamento di spin-orbita del fluoroforo con
lalogeno. In pi, possiamo dire che i meccanismi di quenching si dicono dinamici se
dipendono dalla velocit di diffusione del quencher verso il fluoroforo, mentre si
dicono statici se sono indipendenti dai processi diffusivi. Il quenching collisionale
un tipico esempio di processo dinamico, in quanto il quencher deve diffondere verso
il fluoroforo affinch avvenga lurto, mentre il trasferimento di energia o di carica
dovuto alla formazione di complessi il tipico processo statico.
Il quenching collisionale descritto dallequazione di Stern-Volmer:

dove F0 e F sono lintensit di fluorescenza in assenza ed in presenza del quencher,


kq la costante di quenching bimolecolare, 0 il tempo di vita del fluoroforo in
assenza del quencher, [Cq] la concentrazione del quencher e KD = kq 0 la costante
di quenching di Stern-Volmer. Secondo questa equazione, il rapporto F0/F dipende

259

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

linearmente dalla concentrazione di quencher [Cq] con pendenza pari alla costante di
quenching KD.
Nelle condizioni in cui il quenching molto elevato, si osservano delle deviazioni
dalla linearit per cui il F0/F cresce pi rapidamente allaumentare della
concentrazione del quencher. Tale fenomeno dovuto al fatto che, al di sopra di una
certa concentrazione limite, una parte dei quencher si trova talmente vicino ai fluoro
fori da avere il 100% di probabilit di quenching.

Figura 153 - Notare la deviazione dalla linearit (descritta dalla legge di Stern-Volmer) in presenza di
massicce quantit di quencher. In questo caso il quencher l'acrilammide

Lultimo quenching che analizziamo quello causato dal pH che coinvolge


specialmente quei composti aromatici con un legante acido o basico. La fluorescenza
in questo caso sar pi o meno evidente quanto pi stabile sar la molecola nello
stato eccitato e questo si pu evincere dal numero di stati di risonanza. Per esempio
lanilina (Ar-NH2) ha ben tre strutture limite di risonanza e avr quindi uno stato
eccitato pi stabile rispetto allo ione anilinio (Ar-NH3+) che ne ha solo una. Ne
consegue che lintensit della radiazione di fluorescenza per lanilina sar maggiore..
Ricapitolando i quencher possono essere:
-

temperatura (quenching per urti tra le molecole. Maggiore la temperatura


maggiore saranno gli urti)

quenching collisionale causato da molecole quali lO 2 (presente in


concentrazioni maggiori 10-3 M)

concentrazione (auto assorbimento)

260

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

pH

impurezze (che possono dare assorbimento competitivo e quindi riducono la


resa di fluorescenza)

12.1.2 Strumentazione per la valutazione


della fluorescenza
Un fluorimetro composto dalle seguenti componenti principali:
-

una sorgente di luce per leccitazione del campione. Tipicamente una


lampada ad arco allo Xe che emette in tutto lintervallo UV-VIS

un monocromatore ed una fenditura per selezionare solo lintervallo di


lunghezza donda di eccitazione desiderato. Anche dei filtri polarizzatori
possono essere inseriti per misure di anisotropia di fluorescenza. Solitamente
il gruppo monocromatore riesce a coprire solo lintervallo spettrale dellUVVIS.

Lalloggiamento porta campioni, solitamente adatto a celle da fluorescenza a


sezione quadrata con 1 cm di cammino ottico per campioni liquidi oppure a
celle cilindriche come tubi capillari per campioni in polvere. In genere il
porta campioni pu essere collegato ad un circuito di raffreddamento per
misure a bassa temperatura (per evitare il quenching causato da essa).

La rilevazione della radiazione emessa avviene ad un angolo di 90 con un


secondo gruppo monocromatore posto dietro una seconda fenditura

Il rivelatore solitamente consiste in un fototubo o, in alcuni casi, in un


fotodiodo.

Tutto contenuto in un unico blocco che costituisce lo strumento.

261

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

Figura 154 - Schema di uno spettrofluorimetro

Solitamente le misure in fluorescenza sono riportate su una scala di intensit versus


lunghezza donda (in nm). La scala di intensit in unit arbitrarie e non assolute.
Per effettuare misure quantitative della radiazione emessa, ovvero per misurare la
resa quantitca di fluorescenza, si deve confrontare lo spettro di emissione del
campione con quello di uno standard fluorescente di cui si conosca la concentrazione
e la resa quantica di emissione. Dato che la risposta del rivelatore non lineare in
tutto lintervallo di lunghezze donda si devono usare standard che emettano nello
stesso intervallo spettrale del campione da analizzare. Conoscere anche la curva di
risposta del fluorimetro utile in generale ed indispensabile per misure di fluorofori
che emettono a basse energie, dove il rilevatore del fluorimetro poco sensibile. A
causa della diversa curva di risposta in fluorimetri diversi, la stessa soluzione pu
dare spettri apparentemente diversi, se non vengono corretti in base alle curve di
risposta degli strumenti.
Come abbiamo visto nel paragrafo dedicato al quenching, le operazioni di
fluorescenza sono tuttaltro che semplici da effettuare. In primis bisogna fare
attenzione alla concentrazione di fluoroforo (alte concentrazioni danno auto
assorbimento) e alla presenza di eventuali impurezze che possono originare segnali
di fluorescenza specialmente quando leccitazione avviene a basse lunghezze donda,
dove pi facile che le sostanze assorbano ed emettano fotoni. Avere una soluzione

262

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

che contenga esattamente la stessa matrice a meno del solo fluoroforo consente di
evidenziare la presenza di impurezze fluorescenti.
Nel caso di campioni con bassi segnali di fluorescenza, possibile che lo spettro di
emissione sia disturbato dalla presenza di scattering Rayleigh o Raman. Ci avviene
in particolare quando il campione contiene particelle di dimensioni nanometriche o
micrometriche. La presenza di tali componenti pu essere evidenziata spostando la
lunghezza donda di eccitazione, in quanto il contributo di fluorescenza
indipendente dalla lunghezza donda di eccitazione, mentre i contributi di scattering
si spostano con essa.

12.2.1 Applicazioni analitiche


Le tecniche fluorimetriche possono essere utilizzate per determinare sia sostanze
organiche sia inorganiche.
Iniziamo la nostra panoramica dai cationi inorganici. Essi possono essere analizzati
direttamente o indirettamente a seconda che siano intrinsecamente fluorescenti
oppure no. In realt sono pochi gli ioni metallici fluorescenti (VO 22+ e Ce3+), ma
molti possono dare complessi fluorescenti.
Utilizzando tecniche di fluorescenza altres possibile andare a determinare anche
dei metalli utilizzando appositi agenti derivatizzanti. Ad esempio il benzoino per
complessare Zn2+ .
Anche gli anioni possono essere determinati per fluorescenza venendo complessato
con un catione fluorescente, oppure con reazioni enzimatiche pu produrre NADPH
che fluorescente in rapporto 1:1. E possibile valutare per fluorescenza anche NO3-,
NO2- e ClO4-. Unaltra applicazione molto importante della fluorescenza quella che
richiede lutilizzo di fibre ottiche. Le sonde a fibre ottiche sono state utilizzare per
dimostrare come parecchie analisi di fluorescenza possano essere eseguite in
posizioni diverse e ben distanti sia dalla sorgente che dal rivelatore. La radiazione
emessa da una sorgente laser percorre una fibra ottica e causa la fluorescenza nelle
soluzioni del campione; la radiazione fluorescente torna quindi indietro per la

263

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

misurazione attraverso la stessa fibra (o su una fibra diversa) fino al rilevatore.


Lutilizzo di questo dispositivo stato esteso agli analiti non fluorescenti, fissando
un materiale indicatore fluorescente allestremit della fibra. Queste fibre ottiche
possono essere inserite in matrici ambientali come lacqua o il terreno

12.2.1.1 Fluorescenza risolta nel tempo


In un sistema fisico nel quale sono presenti molte molecole fluorescenti, un fascio di
eccitazione di fluorescenza (laser ad impulsi con impulsi di eccitazione molto pi
brevi dei tempi di fluorescenza) promuove un certo numero di elettroni sullo stato
eccitato S1. Considerando per semplicit una sorgente laser di eccitazione molto
stretta, la variazione nel tempo del numero di molecole nello stato eccitato pu essere
modellizzata con una cinetica del primordine:

dove N il numero di fluorofori nello stato eccitato, k F0 il tasso intrinseco di


fluorescenza, e KNG pari alla somma dei tassi di diseccitazione non di fluorescenza.
Se definiamo:

come il tempo di vita di fluorescenza osservato e risolvendo lequazione della


cinetica precedente, otteniamo:

Pertanto la dinamica di diseccitazione del livello S 1 descritta matematicamente da


unesponenziale decrescente.
Poich non tutti gli elettroni che tornano allo stato fondamentale contribuiscono alla
fluorescenza, occorre tener conto solo di quelli che emettono fotoni nel calcolare
lintensit di fluorescenza emessa. Lintensit di fluorescenza ottenuta dalla

264

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

diseccitazione delle molecole che tornano allo stato fondamentale moltiplicate per
lefficienza quantica di fluorescenza:

Sostituendo questequazione in quella relativa a N(t), otteniamo:

Dove il tempo di vita di fluorescenza, e dipende anche da decadimenti non


radiativi e quenching. Si nota che lampiezza di fluorescenza F(0) dipende dal
numero iniziale di molecole eccitate. E questo proporzionale al numero di
fluorofori presenti in soluzione che quindi possono assorbire i fotoni incidenti.
Infatti, maggiore il numero di fluorofori presenti in soluzione, maggiore sar il
numero di elettroni che sono eccitati sul livello S1.
Lintensit di emissione di fluorescenza generalmente descritta in funzione del
tempo secondo un modello esponenziale o di somma di esponenziali decrescenti. Il
modello esponenziale possiede una o pi costanti di decadimento che corrispondono
al tempo, o tempi, di vita di fluorescenza. Infatti il decadimento di fluorescenza pu
presentare pi di un tempo di vita, in particolare quando: siano presenti differenti
tipologie di molecole fluorescenti; i fluorofori si trovino in ambienti o formino
legami differenti.
Nel caso, per esempio, di andamento biesponenziale di fluorescenza, si avrebbe
lequazione della intensit:

dove 1 e 2 sono i tempi di vita della dinamica di fluorescenza e A1 e A2 le ampiezze


di fluorescenza dei due analiti considerati.
Come si

nota da questultima equazione, lintensit suddivisa nel valore di

ampiezza e di tempo di vita di fluorescenza.

265

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

Figura 155 - Spettro di una fluorescenza risolta nel tempo per una singola specie

Attraverso questa fluorescenza oltre che discernere i diversi tipi di analiti presenti
attraverso unopportuna interpolazione dei dati anche possibile quantificare il
tempo di vita e la popolazione relativa degli stessi.

Figura 156 - Determinazione di peptidi differenti attraverso la fluorescenza risolta nel tempo

12.2.1.2

LIDAR in fluorescenza

Unapplicazione della fluorescenza risolta nel tempo quella LIDAR che prevede
linstallazione di un laser su un aereo che sorvola per esempio unarea marina.

266

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

Sorvolandola esso pu raccogliere i segnali di fluorescenza provenienti per esempio


dal fitoplancton (come nel caso del progetto della NASA, AOL) o, nel caso di un
inquinamento, da parte degli inquinanti stessi. Un esempio di questo tipo di tecnica
potrebbe essere quello del monitoraggio di una macchia di petrolio in mare. I tempi
di andata e di ritorno sono dovuti dalla distanza dellaereo dal mare e dal tempo di
vita dei fluorofori. Facendo la differenza tra i due tempi (nota la quota di volo), posso
valutare solo il contributo proveniente dalla fluorescenza. I fluorofori con il minor
tempo di vita sono quelli degli idrocarburi.

12.2.1.3

Fluorescenza in HPLC

E possibile applicare la fluorescenza come rilevatore posto a valle della colonna


cromatografica per la determinazione di campioni gi di per s fluorescenti oppure
per quei campioni che possono essere derivatizzati. Per esempio possono essere
analizzati pesticidi, IPA, gas nervini (sarin, tabun), proteine, diversi medicinali
(adrenalina, morfina, penicillina, acido lisergico (LSD).... La fluorescenza una
tecnica molto pi sensibile rispetto allassorbimento e ci permette di far scendere il
limite di rilevabilit ai ppb. Essa viene largamente impiegata per la determinazione di
prodotti alimentari, farmaceutici, campioni clinici, naturali e anche inquinanti
ambientali.
E possibile effettuare anche analisi di fluorescenza risolte nel tempo (on the fly,
durante leluizione) che permettono, attraverso una trasformata di Fourier che ci
permette di passare dal dominio dei tempi a quello delle frequenze, di risolvere
completamente picchi non ben risolti.
Come abbiamo detto, il rivelatore a fluorescenza in HPLC risulta particolarmente
utile per la determinazione di pesticidi o IPA direttamente oppure, per certe molecole
organiche, opportunamente derivatizzati. I derivatizzanti pi comuni sono il
darsilcloruro (nei confronti di fenoli), lNBD e fluoresceina (nei confronti di
ammine). Un altro derivatizzante pu essere la Pd-calceina per alcuni pesticidi i quali
reagiscono con il Pd rilasciando la calceina che di per s fluorescente.

267

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

12.3 Chemiluminescenza
I metodi chemiluminescenti sono in rapida ascesa, sebbene si siano sviluppati
soltanto di recente e consistono nello sfruttare una reazione chimica per generare una
specie nello stato eccitato. Questa, per diseccitarsi, liberer dei fotoni di energia h
che potranno essere facilmente rivelati.
Alcuni esempi di chemiluminescenza particolarmente suggestivi sono quelli delle
lucciole, di alcuni organismi marini (in tal caso si parla di bioluminescenza i cui
meccanismi non sono ancora del tutto noti).
Tornando alla chimica analitica, la chemiluminescenza pu essere schematizzata
cos:
A + B C* + D
C* C + h
C* la specie eccitata che decade a C liberando energia. Naturalmente lo schema
precedente estremamente semplificato in virt del fatto che la maggioranza delle
reazioni chemiluminescenti decisamente pi complessa.
Lintensit di luce Icl funzione dellefficienza quantica di chemiluminescenza ( cl,
cio il numero di fotoni emessi per molecola che ha reagito) che uguale al prodotto
dellefficienza quantica di eccitazione ex, stati eccitati per molecola reagita, e
lefficienza quantica di emissione em, numero di fotoni per stato eccitato. Valori
tipici di cl sono da 0,01 a 0,2:

Sapendo che:

e che:

268

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

Si ottiene:

Se R in eccesso:

dove:

Integrando Icl nel tempo si ottiene con le opportune sostituzioni che:

Ne consegue che, da uno spettro di chemiluminescenza, larea sottesa tra due tempi t 1
e t2 proporzionale alla concentrazione di [A] inizialmente presente.
Gli spettri di chemiluminescenza sono risolti nel tempo (Intensit vs tempo) e
registrano un incremento di intensit fino ad un massimo e poi un decremento pi o
meno esponenziale. Per le indagini quantitative oltre che correlare, come abbiamo
visto sopra, larea sottesa alla curva, anche possibile valutare laltezza del picco
qualora si verifichi una proporzionalit diretta tra altezza del picco e concentrazione.

Figura 157 - Spettro di chemiluminescenza

269

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

La chemiluminescenza pu anche essere promossa da reazioni di ossidoriduzione che


consistono nella formazione di specie A+ e A- alternando il potenziale in una
soluzione in cui presente solo A. I cationi e gli anioni possono quindi reagire tra di
loro dando origine alla specie A nello stato eccitato (A*):
A A+ + eA + e- AA+ + A- A + 1A*
A+ + A- A + 3A*
3

A* + 3A* A + 1A*
1

A* A + h

3A* A + h
La via appena descritta quella relativa allannichilimento, mentre anche
possibile una via che prevede lutilizzo di un coreagente (TPA o ossalato, C2O42-)
che riduce la specie di interesse ossidandosi. In forma ossidata si trasforma in un
potente riducente che, reagendo con la specie in soluzione, determina la formazione
dello stato eccitato che successivamente emetter:
[Ru(bpy)3]2+ - e- [Ru(bpy)3]3+
[Ru(bpy)3]3+ + C2O42- [Ru(bpy)3]2+ + C2O4.C2O4.- CO2-. + CO2
[Ru(bpy)3]3+ + CO2-. [Ru(bpy)3]2+* + CO2
[Ru(bpy)3]2+* [Ru(bpy)3]2+ + h

270

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

12.3.1

Applicazioni

analitiche

della

chemiluminescenza
I metodi chemiluminescenti sono estremamente sensibili perch in assenza di rumore
possibile determinare intensit luminose molto basse. I limiti di rivelabilit sono
quindi legati non tanto agli strumenti, quanto ad eventuali impurit presenti nei
reagenti e possono arrivare fino ai ppb.
I metodi chemiluminescenti possono essere applicati con successo ai gas come
lOzono, gli ossidi di azoto ed i composti solforati. Il metodo di pi ampia diffusione
senza dubbio quello per la determinazione del monossido di azoto secondo le
seguenti reazioni:
NO + O3 NO2* + O2
NO2* NO2 + h ( = 600-2800 nm)
Lozono, prodotto da un generatore elettrico, ed il campione di aria sono inviati in
continuo ad un reattore, nel quale la radiazione luminescente controllata mediate un
tubo fotomoltiplicatore. Per il monossido di azoto si ottiene una risposta lineare per
concentrazioni da 1 ppb a 10.000 ppm. Questa diventata la metodologia standard
per la determinazione di questo gas dal livello del mare fino a 20 km di altezza.
E possibile determinare anche NO2 per decomposizione termica del gas a 700C in
un tubo di acciaio:
NO2 NO + O
Un altro importante metodo di chemiluminescenza utilizzato per il controllo
dellozono atmosferico. La determinazione basata sulla luminescenza prodotta
quando lanalita reagisce con il colorante rodamina B, adsorbito su una superficie di
gel di silice attivato; la sensibilit migliore di 1 ppb di ozono e la risposta lineare
fino a 400 ppb. Lozono pu essere determinato per via chemiluminescente anche
quando questo reagisce con letilene.

271

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

Un altro importante metodo di chemiluminescenza in fase gassosa usato per la


determinazione dei composti dello zolfo nellatmosfera quale il solfuro di idrogeno,
il biossido di zolfo e i mercaptani. In questo metodo, il campione viene bruciato in
una fiamma di idrogeno per dare un dimero dello zolfo che poi si decompone
emettendo luce. Nel caso del biossido di zolfo le reazioni sono:
H2 + 2SO2 S2* + 4H2O
S2* S2 + h (=384-394 nm)
Analogamente, la combustione dei composti del fosforo in una fiamma di idrogeno
d emissione dovuta a HPO* a 526 nm.
Un agente molto utilizzato per lanalisi di specie inorganiche in fase liquida il
luminolo che, reagisce con O2, H2O2, ione ipoclorito, ione permanganato dando
origine ad un prodotto chemiluminescente relativo allanione del luminolo (quindi
richiesto un ambiente basico) con un massimo a 425 nm (colore blu). Spesso queste
reazioni necessitano di un catalizzatore per avvenire in tempi brevi. In tali casi
lintensit di chemiluminescenza direttamente proporzionale alla concentrazione
dellossidante e del catalizzatore. Pertanto, la reazione costituisce un metodo
sensibile per la determinazione di una di queste specie. Per esempio, utilizzando
come ossidante il perossido di idrogeno, si possono determinare il catalizzatore Co2+
, Cr3+ e Cu2+ fino a concentrazioni rispettivamente di 0,01, 0,4 e 1 nmol/l.
Lultima applicazione della chemiluminescenza che raccontiamo quella per la
determinazione dellATP. Determinando lATP siamo infatti in grado di ottenere una
relazione con il carbonio organico presente e quindi siamo in grado di valutare la
biomassa.

La correlazione tra ATP e carbonio organico espressa nel grafico

sottostante:
Il meccanismo che si sfrutta lo stesso utilizzato dalle lucciole per produrre luce e
richiede luciferina (LH2), luciferasi (enzima, E) e Mg2+:
LH2 + ATP + Mg2+ + E ELH2AMP + MgPP

272

Analisi degli inquinanti con laboratorio Luminescenza

ELH2AMP + O2 [osso luciferina]* + AMP + CO2 + H2O


[osso luciferina]* osso luciferina + h

Figura 158 - Relazione tra ATP e carbonio organico

273

Analisi degli inquinanti con laboratorio Metodi per determinazione di inquinanti

CAPITOLO 13
13 Metodi standard per la determinazione di
inquinanti

13.1 Campionamento dellaria


Per campionare laria si utilizzano i denuder, vale a dire delle cartucce costituite da
tubi concentrici ricoperti da materiali differenti a seconda del materiale che deve
essere campionato. Esse sono collegate a delle pompe aspiranti e permettono il
campionamento di enormi volumi daria (decine di litri).
13.2

Determinazione di composti con carbonio

La CO2 pu essere misurata per assorbimento IR con celle a cammino multiplo (fino
a 20 m di cammino ottico), in amperometria (facendola reagire con I 2O5) o in GC
utilizzando un rivelatore FID previa riduzione della CO 2 a CH4. Il FID il rivelatore
a ionizzazione di fiamma pi diffuso in GC. Leffluente dalla colonna viene
indirizzato in una piccola fiamma di idrogeno ed aria. La maggior parte dei composti
organici produce ioni ed elettroni quando viene pirolizzata alla temperatura di una
fiamma di idrogeno e aria. La rivelazione implica il monitoraggio della corrente
prodotta raccogliendo questi trasportatori di carica.
Applicando poche centinaia di Volt tra la punta del bruciatore ed un elettrodo
collettore situato sopra la fiamma, si provoca il movimento degli ioni e degli elettroni
verso il collettore. Si misura la corrente risultante che sar proporzionale alla
concentrazione di gas. Questo genere di rivelatore pu essere utile per analizzare altri
composti organici, facendo per attenzione al fatto che composti contenenti gruppi
carbonilici, alcolici, alogeni e amminici producono in fiamma meno ioni. Il
rivelatore, per com fatto, insensibile allH2O, alla CO2 (per questo prima deve

275

Analisi degli inquinanti con laboratorio Metodi per determinazione di inquinanti

essere ridotta), allSO2, al CO, agli NOx e ai gas nobili. Lo svantaggio di questa
tecnica la completa distruzione del campione
La CO2 (e il CO) possono anche essere rivelati
attraverso tecniche di IR non dispersivo (NDIR)
nelle quali la radiazione IR policromatica viene
fatta passare attraverso due celle: quella di
riferimento (riempita di gas che non assorbe
nellIR, tipicamente N2) e quella del campione
in cui fatto fluire il gas da analizzare. Il
rivelatore costituito da due compartimenti
separati da un diagramma deformabile riempiti
dal gas che si intende rivelare (quindi o CO o
CO2). La radiazione IR che attraversa la cella di
Figura 159 - NDIR

riferimento non viene assorbita, arriver nel


compartimento in cui c il gas analita che

assorbir la radiazione causando un riscaldamento. Al contrario, in corrispondenza


della cella in cui c il campione, la radiazione IR che arriva nel compartimento in
cui c il gas analita non causer alcun riscaldamento (la radiazione gi stata
assorbita).

I due compartimenti si riscalderanno quindi in modo diverso, il

diaframma si muover e lentit della deformazione potr essere correlata con la


concentrazione di gas da analizzare.
Per la misurazione di gas quali gli idrocarburi non metanici possibili utilizzare GC
portatili costituite da due bombole di O2 e H2 (i gas carrier) e da una micro colonna
con capacit di flusso pari a 0,5 ml/min. Questa colonna trattiene molto bene gli
idrocarburi non metanici in testa cos che quando si inverte la direzione del flusso
questi saranno i primi ad uscire. Lintegrazione del picco cromatografico d idea
sulla concentrazione di questi idrocarburi. Permette misure di concentrazioni fino a
20-30 ppb.
Altri idrocarburi vengono invece analizzati per Gas Cromatografia. Per le aldeidi si
pu utilizzare lHPLC previa opportuna derivatizzazione.

275

Analisi degli inquinanti con laboratorio Metodi per determinazione di inquinanti

13.3 Determinazione di composti con zolfo


I composti dello zolfo possono essere rivelati per coulometria, fluorescenza pulsata,
spettroscopie UV diretta, NDIR o in derivata seconda, oppure attraverso GC con
rivelatore FPD (fotometrico a fiamma). Con questo rivelatore leluente viene fatto
passare attraverso una fiamma H2+aria a basse temperature e lo zolfo contenuto nelle
molecole viene convertito in S2* che emetter. Esiste un metodo chemiluminescente
che fa reagire i gas prodotti dalla reazione dello zolfo con H2 e aria con ozono dando
un composto luminescente.
In coulometria si imposta una corrente tra due elettrodi. In una cella viene inviato
SO2 che reagisce con Br. Un indicatore mostra che la reazione arrivata a
completezza, a questo punto si calcola il tempo trascorso e attraverso la relazione
Q=it si calcolano i Coulomb che saranno proporzionali alla concentrazione di SO2.
Lanalisi di SO2 pu avvenire anche per fluorescenza pulsata. La tecnica funziona
perch lo stato eccitato di SO2 ha vita molto breve per cui lo spegnimento per urto
con altre specie trascurabile. Il campione viene fatto passare attraverso un kicker
(soppressore) per gli idrocarburi: le molecole di SO2 non subiscono alcuna reazione.
Nella camera di fluorescenza la radiazione UV pulsata eccita le molecole di SO2,
quando queste decadono si registra lemissione luminosa proporzionale alla
concentrazione del gas.

13.4 Determinazione di composti con lazoto


Gli ossidi di azoto vengono generalmente individuati, come gi visto in precedenza,
per chemiluminescenza che si verifica quando NO viene ossidato da O 3. Lossido di
azoto NO per reazione con O3 produce NO2 in uno stato elettronico eccitato.
Lemissione di chemiluminescenza ha un massimo a 1200 nm ed proporzionale alla
concentrazione di NO (in presenza di un eccesso di O3):
NO + O3 NO2* + O2
NO2* NO2 + h

276

Analisi degli inquinanti con laboratorio Metodi per determinazione di inquinanti

Poich la reazione coinvolge solo lNO, se si desidera quantificare la somma delle


concentrazioni di NO e NO2 necessario ridurre preliminarmente lNO2 a NO. La
camera di riduzione dellNO2 prima della cella di reazione: un tubo di rame,
molibdeno o acciaio inox riscaldato a 750C; il metallo catalizza la reazione:
2 NO2 2NO + O2
La camera di riduzione escludibile nel caso si desiderasse la quantificazione del
solo NO. Il flusso di aria arriva quindi nella cella di reazione, ove viene miscelata ad
una corrente di O2 contenente O3 (0,5%). LO3 viene generato irradiando con luce
UV (lampada di Hg) la corrente di O2.
Dal momento che laria spegne la chemiluminescenza, la pressione mantenuta tra
gli 1 e i 5 mmHg.
E possibile individuare gli ossidi di azoto anche con spettrofotometri utilizzando i
metodi in derivata (seconda), o con il NDIR.
Altri composti con lazoto sono N2O (cromatografia), HNO2 e HNO3 (direttamente
in aria attraverso FTIR), NO3- e NO2- campionati attraverso una cartuccia basica e
analisi attraverso cromatografia ionica vedo i nitrati. I nitriti possono essere
identificati utilizzando un reattivo di Griess).
Lammoniaca viene determinata per via colorimetrica con reattivo di Nessler
I reattivi di Griess e Nessler
La reazione di Griess permette facendo reagire un campione con il reattivo di Griess di
rilevare la presenza di nitriti e misurarne la concentrazione per via fotometrica. Il reattivo
di Griess formato da una miscela di acido Solfanilico e N-(1-naftil)- etilendiammina, in
soluzione acida. Il nitrito reagisce con il reattivo formando un composto di colorazione
rossa misurabile da un fotometro. Il picco massimo di assorbimento di 520 nm.

Il reattivo di Nessler o soluzione di Nessler (scritto anche come Neler ) un reattivo


che permette il riconoscimento qualitativo e quantitativo dell'ammoniaca pi precisamente

277

Analisi degli inquinanti con laboratorio Metodi per determinazione di inquinanti

se presente come ione ammonio in soluzione acquosa. La reazione stata messa a punto da
J. Nessler nel 1856.
costituito da una soluzione alcalina di tetraioduromercurato di potassio, che in
presenza di ammoniaca d la seguente reazione

2 K2[HgI4] + NH3 + 3 KOH --> [Hg2ONH2]I + 7 KI + 2 H2O


sviluppando

un'intensa

colorazione

giallo-arancio,

dovuta

allo

ioduro

di

ossoamidodimercurio, che, col tempo, se la concentrazione sufficientemente alta, floccula


e precipita.
una reazione molto sensibile, che permette di rivelare presenza di ammoniaca anche
a concentrazioni dell'ordine di 0,1 mg/l (0,1 ppm). Sono state rilevate interferenze qualora
in soluzione vi sia del piruvato che, interferendo nella reazione, falsa il risultato anche
dimezzandone l'effetto colorimetrico.

Unultima importante classe di composti sono i PAN, nitrati perossiacilici, che


possono essere rivelati con lECD, rivelatore a cattura elettronica. Esso costituito
da una cameretta rivestita di 63Ni che emette particelle . Le particelle urtano con
una molecola di azoto del gas di trasporto eccitandola e causando lespulsione di un
elettrone dalla sfera pi esterna:
N2 + particella N2+ + elettroni lenti.
A questo punto se transitano analiti con elevata affinit elettronica, questi elettroni
liberati vengono catturati (es, oltre ai PAN, anche alogeni). Una diminuzione di
elettroni determina una diminuzione di corrente che pu essere correlata con la
concentrazione dellanalita che si sta cercando.

13.5 Determinazione dellozono


Lozono ha elevate assorbanze nellUV, e ci anche ovvio dal momento che grazie
alla sua azione assorbente soprattutto nellUV-B (254 nm) ci protegge da questa
radiazione molto energetica permettendo difatto alla vita di svilupparsi al di fuori
278

Analisi degli inquinanti con laboratorio Metodi per determinazione di inquinanti

dellacqua.

Esso pu essere determinato facendo passare un campione daria

aspirato da una pompa e filtrato da un filtro in teflon per eliminare il particolato in


una cella di assorbimento in quarzo dove viene calcolata lassorbanza a 254 nm. Ci
possono essere notevoli interferenze, poich nellatmosfera vi sono molte sostanze
che assorbono nellUV, per questo si opera una misura differenziale. In cosa
consiste? Dopo aver misurato lassorbanza del campione di aria tal quale si esegue
una seconda misura facendo passare il campione di aria su di uno scrubber per
lO3. Questo un catalizzatore a base di molibdeno che provoca la decomposizione
dellO3 in O2 cos da vedere esclusivamente il contributo di assorbimento di eventuali
interferenti.. A questo punto, si esegue la misura e una differenza tra i due spettri si
ottiene quello relativo al solo O3.
Lozono pu essere determinato anche per chemiluminescenza reagendo con C 2H4. Il
prodotto, formaldeide formatasi in seguito alla decomposizione dellozonuro, si trova
nello stato eccitato ed emetter a 420 nm. Unaltra reazione di chemiluminescenza
per la determinazione dellozono quella che prevede la reazione con lacido gallico.
Si formeranno dei prodotti eccitati che urteranno contro la rodamina B (presente nel
sistema di analisi) che, una volta eccitata, emetter a 560 nm.

13.6 Composti alogenati


Gli aloidrocarburi (CH3Cl, CH3Br) vengono analizzati in GC con rivelatore ECD.
Questo rivelatore pu essere usato per determinare tutti i composti alogeno-organici
eccetto i fluoro organici in quanto il F non cattura sufficientemente bene gli elettroni.
Acidi come HCl e HF vengono determinati per via amperometrica (una voltammetria
in cui la concentrazione di analita viene misurata ad un potenziale fisso) o
coulombometrica

13.7 Composti metallici


In fase gassosa possono trovarsi sotto forma di idruri (GC), oppure se sono alchilati
posso effettuare una GC con rivelatore FID.

279

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

APPENDICE A
ALTRE ANALISI AMBIENTALI
Analisi sulle acque
- Campionamento
Parliamo del campionamento da matrici acquose. La strategia principale da seguire ,
come sempre quella di effettuare un profilo di concentrazione lungo la profondit. In
particolar modo occorre vedere come varia la concentrazione di un inquinante in
funzione della profondit, altrimenti la misurazione sarebbe di scarso interesse. Se
non faccio un profilo, non so a quale profondit linquinante si accumulato o
maggiormente presente.
I campionamenti per lacqua li posso fare da un tubo con un bypass per raccogliere a
parte lacqua che deve essere analizzate. Posso effettuare campionamenti da un
fiume: in questa circostanza il campione viene prelevato con un tubo collegato ad
una pompa peristaltica che far risalire lacqua del fiume in un vial di raccolta dove
potr effettuare lanalisi. Come detto in precedenza fondamentale conoscere il
profilo di concentrazione, pertanto user tanti tubi collegati a una pompa peristaltica.
Ognuno di essi sar collocato ad una certa profondit e invier lacqua da analizzare
in vial differenti.
I campionamenti in mare necessitano inevitabilmente di strumentazioni differenti che
vengono collocate in situ grazie a delle navi oceanografiche. Le apparecchiature che
si utilizzano principalmente sono le rosette oppure le seastar. Queste permettono di
effettuare sia profili di concentrazione che, nel caso delle seastar, preconcentrazioni
dei campioni grazie alla presenza di una cinquantina di filtri adsorbenti. La presenza
di questi filtri estremamente importante in quanto permette di avere le specie di
interesse gi preconcentrate senza che sia necessario lavorare sugli ingenti volumi
dacqua estratti dal mare (con conseguenti difficolt logistiche e di costo).

276

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Concludiamo dicendo che alcune analisi su alcuni campioni acquosi prelevati,


specialmente, dal mare (ma non solo), sono effettuati in loco (sotto lacqua): O2
disciolto, pH Questo perch quando si va a estrarre il campione dal mare, si muta
la pressione e questo porta ad un degassamento del campione stesso il che comporta
lalterazione di alcuni parametri.
Per quanto riguarda il campionamento dellaria, parliamo di ricerca del particolato
atmosferico. La distribuzione degli inquinanti legati al particolato (IPA, COV, .),
dipende sia dalla dimensione del particolato stesso (grossolano o fine), sia dalle
condizioni atmosferiche. In effetti, in condizioni di bel tempo, la distribuzione delle
particelle in base al diametro piuttosto regolare (doppia campana, vedi figura
sottostante), al contrario la pioggia tende ad abbattere le particelle grossolane e
questo comporta la sola presenza delle particelle con un diametro pi piccolo.

Figura 160 - La distribuzione del particolato dipende dalle condizioni meteorologiche

Analisi di metalli da campioni acquosi


In generale quando si va ad analizzare la presenza di metalli da campioni acquosi si
provvede sempre, previa filtrazione del campione stesso, ad una acidificazione.
281

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Questo viene fatto affinch non vi sia una crescita batterica e per evitare che
precipitino i metalli come idrossidi. Dopodich si gela il campione (-20C), quindi lo
si irradia con radiazione UV per poi effettuare infine lanalisi.
Il solido rimasto eventualmente sul filtro si scioglie nuovamente acidificando oppure
utilizzando uno dei numerosi protocolli esistente per tali scopi. Questo serve per
cercare di discriminare ulteriori metalli che sono precipitati come idrossidi oppure da
quelli che sono solubili in acqua.
Per lanalisi dei metalli occorre sempre preconcentrare il campione, il che significa
cambiare il rapporto tra inquinanti (micro) e la matrice (macro). In altre parole si pu
agire in due modi: aumentare

il micro mantenendo costante il macro, oppure

diminuire il macro mantenendo costante il micro.


Per i metalli le tecniche principali sono:

precipitazione: come idrossidi (a pH basico) o come composti neutri estraibili


successivamente in solventi organici

flottazione: si fa gorgogliare un gas allinterno della soluzione contenente i


metalli e si vanno a raccogliere gli analiti inorganici alla superficie delle bolle
che si formano. In altre parole si raccoglie la schiuma che si abbatte
successivamente con il calore o con laggiunta di Sali

estrazione: la si effettua per chelati neutri o coppie ioniche. Lestrazione


liquido-liquido pu portare a diversi problemi per via del fatto che la
formazione di emulsioni piuttosto frequente. Per evitarle si pu utilizzare il
naftalene. In che modo? Scaldo, effettuo la separazione a caldo, quindi
raffreddo. Il naftalene precipita e raccolgo il solido di naftalene che al suo
interno

contiene

il

materiale

organico

(chelante

metallo)

che

successivamente con altre tecniche, riuscir a liberare

adsorbimento: si utilizza una resina con EDTA (o con un agente chelante) che
complessi con i metalli

scambio ionico: si raccolgono direttamente (resina a scambio cationico) o


indirettamente (resina a scambio anionico)

282

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

volatilizzazione: idruri, bromuri ecc possono diventare volatili, pertanto li


si raccoglie in fase vapore e si fa lanalisi. Possibilit di accoppiare questa
tecnica con una gas-cromatografia. Le volatilit dipendono dalla massa delle
specie da separare.

Posso usare tecniche che mi dicono la quantit totale di metalli presenti, ma a noi
interessa la speciazione dei metalli, cio, ad esempio quanto c di CrIII (non tossico)
piuttosto che di CrVI (tossico). Anche a tal proposito esistono diversi protocolli che
si studieranno in maggiore dettaglio in altri corsi del piano di studi.
Per lanalisi degli anioni si utilizza una cromatografia ionica (eccetto per F -) con
flow-injection (FIA).
La FIA un metodo automatico in cui il campione iniettato in un flusso continuo di
soluzione che permette il mescolamento del campione con un altro flusso contenente
un reagente per un determinato periodo di tempo (dipende dalla lunghezza del tubo e
dalla velocit di diffusione). Lanalita reagisce e arriva infine ad un detector
(colorimetro, fluorimetro, elettrodo iono-selettivo, biosensore).

Analisi sulle acque


Sulle acque si effettuano analisi su:

conducibilit

solidi disciolti

pH

ossigeno disciolto

domanda biologica di ossigeno (BOD)

domanda chimica di ossigeno (COD)

quantit totale di carbonio organico (TOC)

richiesta totale di ossigeno (TOD)

I solidi disciolti

283

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Indica la quantit di solidi che vi sono disciolti in un campione. In particolare, si


preleva 1 l di acqua, la si fa evaporare e si pesa il solido rimanente. Si pu parlare
anche di salinit e per questo classificare le acque in base al loro diverso contenuti di
Sali disciolti:
-

acque dolci (< 1g/l)

acque salmastre (1-20 g/l)

acque salate (circa 30 g/l)

acque molto salate, salamoie (> 35 g/l)

Si effettuano misure di conducibilit o conduttanza specifica tenendo presente che


pi alta la concentrazione di Sali, quindi di ioni, pi sar alta la conducibilit,
definita come la capacit di una sostanza di condurre corrente elettrica. Corrisponde
allinverso della resistenza, lunit di misur il Siemens/cm. Nel caso di misure di
soluzioni acquose, il valore della conducibilit dipende in modo direttamente
proporzionale dalla concentrazione di solidi disciolti.
Si pu anche valutare, attraverso opportune titolazioni complessometriche, la durezza
dellacqua. Per legge la durezza non deve superare valori compresi tra i 20F e i
30F. Possiamo individuare due tipi di durezze, quali la durezza calcica e la durezza
magnesiaca. La durezza dellacqua si associa alla presenza di CaCO3.

pH
Il pH dellacqua un parametro fondamentale per la vita negli ambienti acquatici:
alcune specie di pesci sono in grado di sopravvivere soltanto a pH neutri o
lievemente acidi o basici (nel range 6,8-7,2), mentre a pH pi acidi il tasso di
sopravvivenza degli organismi pi complessi cala drasticamente.

Domanda chimica di ossigeno (COD)


Per domanda chimica di ossigeno si intende la quantit di ossigeno necessaria per la
completa ossidazione per via chimica dei composti organici presenti in un campione
dacqua seconda la reazione:

284

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

sostanza organica + ossidante (K2Cr2O7 + cat. Ag(I)) CO2 + H2O


Leccesso di dicromato viene successivamente titolato con una soluzione a
concentrazione nota di solfato di ammonio e ferro (II).
Il valore di COD indica quanto ossidante ho dovuto mettere per ossidare il composto
organico. La quantit dipende ovviamente dallo stato di ossidazione del carbonio.

Carbonio organico totale (TOC)


Lanalisi TOC una misura della quantit di carbonio legato in un composto
organico ed spesso utilizzato come indicatore non-specifico della qualit delle
acque. In acqua vi possono essere diverse tipologie di carboni, provenienti cio da
specie inorganiche (carbonati, ) oppure da specie organiche disciolte o sospese,
nella maggior parte dei casi si tratta di acidi umici e acidi fulvici. Effettuiamo quindi
una classificazione:

Total Carbon (TC)

Carbonio inorganico

Carbonio organico

(IC)

(TOC)

Disciolto (DOC)

Particolato
(POC)

Volatile (VOC)

Non volatile (DOC)

285

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Per questa ragione, per operare una corretta misura di TOC, occorre tener conto del
carbonio inorganico presente nel campione, in che modo? Si pu ad esempio
sottrarre il valore di carbonio inorganico al valore ottenuto nellanalisi (TC),
ottenendo il TOC. Oppure si pu rimuovere il carbonio inorganico prima dellanalisi
di solito aggiungendo HCl e strippaggio (rimozione di un gas dalla fase liquida a
quella gassosa) di CO2. Problemi legati alla perdita dei composti organici volatili
(VOCs)
La misurazione del TOC pu essere effettuata seguendo due vie: la via secca, dove si
mette il campione in una fornace con un catalizzatore e analizzo la quantit di CO2
prodotta, oppure per via umida.
In unaliquota viene inserito acido fosforico per la determinazione del carbonio
inorganico (vd. via secca), nellaltra aliquota viene invece addizionato il persolfato.

Figura 161 - Il persolfato

Si tratta il campione con il persolfato con luce ultravioletta e si assiste alla rottura
omolitica del legame O-O del persolfato dando origine a dei radicali particolarmente
reattivi che, avendo un potenziale di ossidazione pari a 2,2 eV riescono a ossidare,
strappando elettroni, quasi tutte le specie organiche. Quasi. Infatti, il persolfato non
ossida tutta la materia organica in quanto in alcuni casi il carbonio si presenta gi nel
suo massimo stato di ossidazione (+4) come nel CCl 4. Questo non potr quindi essere
ossidato a CO2. La differenza di questo metodo con quello della via secca di circa
un 10-15%.
Ma la reazione che avviene davvero unossidazione? Studi scientifici hanno
dimostrato che utilizzando N2 al posto di aria o di O2 come gas allinterno della
camera riscaldata, avviene la medesima cosa: la sostanza organica viene ugualmente
ossidata a CO2.

286

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

In effetti si pu calcolare che se si iniettano nella cella di riscaldamento 5,510-3 mol


di H2O liquida a 300K, si ottiene che a 1100 K, sapendo che 1 mol di un gaso
occupa un volume di circa 23 l, si hanno circa 4,510-2 l di vapore acqueo che satura
completamente la capacit della cella. Questo significa che non c lossigeno e che
la reazione in realt una reazione idrolitica:
CCl4 + 2H2O CO2 + 4HCl
LO2 arriva in un secondo momento ed evita che il catalizzatore posto nella cella
(CuO, Pt, ) si avveleni. Esso ha quindi unazione pulente.
Il TOC si calibra iniettando uno standard primario per pesata come lo ftalato di
potassio in una soluzione a concentrazione nota di carbonio organico totale (es. 1.000
mg/l).
Infine arriviamo al rivelatore: esso un rivelatore IR/NDIR. Questo analizzatore
funziona con una lampada infrarossa, un chopper e due rivelatori riempiti del gas di
cui si vuole effettuare la misurazione, nel caso specifico CO 2. In pi vi collocato un
filtro in modo tale che si selezionino soltanto le lunghezze donda alle quali la specie
che si sta ricercando (CO2) assorba, cos che il contributo di eventuali interferenti sia
eliminato.
In uno dei due rivelatori arriver il bianco, nellaltro invece arriver la CO 2 dal
campione. Quando non passa CO2 dal campione, tutta la radiazione IR raggiunge la
CO2 presente nel rivelatore che si scalda in egual misura senza che vi sia nessuna
differenza di pressione tra i due comparti. Quando invece passa la CO 2 proveniente
dal campione, essa assorbir parte della radiazione infrarossa, proporzionalmente a
quanto gas c, con il risultato che la radiazione che raggiunger la CO2 presente nel
rilevatore associato al campione sar inferiore a quella che raggiunge il rivelatore
associato al bianco. Quindi la CO2 nel rilevatore associato al campione si scalder di
meno, con il risultato che laltra CO2 si espande e si osserver quindi una differenza
di pressione che si correler con il quantitativo di anidride carbonica presente.

287

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Concludendo, il TOC un metodo piuttosto efficiente, ma abbiamo visto che vi


possono essere delle specie refrattarie alla reazione idrolitica di cui sopra, pertanto la
domanda : esiste un metodo pi completo? S ed la spettroscopia di emissione
atomica (ICP) i cui problemi di calibrazione possono essere ovviati utilizzando la
metodologia delle diluizioni isotopiche.

BOD e COD
Il rapporto tra i due valori ci indica la quantit di inquinanti biodegradabili presenti
nel refluo (o nel sistema acquoso) in esame. Se BOD/COD > 2,5 negli scarichi
prevalgono sostanze biodegradabili.

COD e TOC
La valutazione del rapporto tra TOC e COD (il numero di equivalenti di ossidante
necessari per trasformare un composto organico a CO2), mi permette di avere unidea
dello stato di ossidazione medio del carbonio presente nel campione. Se il valore
alto, significa che ho per lo pi idrocarburi, al contrario se assume dei valori
intermedi, significa che il campione relativamente polare.

Domanda biologica di ossigeno (BOD)


Il BOD indica la quantit di sostanza organica biodegradabile ed uno dei parametri
pi in uso per stimare il carico inquinante delle acque reflue. Esso si misura in
mgO2/l: pertanto dire che unacqua ha un BOD di 500 mgO 2/l significa che per
ossidare biologicamente tutte le sostanze organiche presenti in un litro di questacqua
necessario fornire ai microorganismi 500 milligrammi di ossigeno.
La reazione coinvolta :
materiale organico + O2 CO2 + H2O + solidi microbiologici
seguita da una seconda reazione di nitrificazione:
NH3 + 3/2 O2 HNO2 + H2O

288

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

LHNO2 viene successivamente ossidato a HNO3.


Per valutare il BOD normalmente si utilizza il dato dopo 5 giorni dallinizio della
degradazione batterica. Le misure si effettuano con dei respirometri di Warburg,
Barcroft oppure sui pi recenti respirometri elettrolitici.
Valori di riferimento possono essere che con un BOD < 1 mg/l abbiamo un refluo
non inquinata da sostanze organiche biodegradabili, se BOD > 600 mg/l, il refluo
risulta inquinato da sostanze organiche biodegradabili.
I valori possono essere lievemente alterati qualora vi siano nei reflui delle sostanze
inibenti la crescita batterica (metalli, )

Ossigeno disciolto in acqua


Un altro parametro molto importante da considerare la quantit di ossigeno
disciolto in acqua. Esso funzione della temperatura e, come visibile in figura,
diminuisce al crescere della temperatura. Ecco spiegato il motivo per il quale le zone
pi pescose sono quelle pi fredde: c pi ossigeno respirabile!
La misurazione dellossigeno disciolto pu essere fatta o con il metodo di Winkler o
con lelettrodo di Clark. Il metodo di Winkler consiste nel far reagire lossigeno con
un riducente (Mn2+) e successivamente titolare le specie ossidate. Lanalisi si effettua
facendo reagire il campione con due reattivi e con una titolazione finale.
Operativamente: il reattivo I composto da una soluzione di MnSO 4 e NaOH:
Mn2+ + OH- Mn(OH)2
4Mn(OH)2 + O2 + 2H2O 4 Mn(OH)3
2Mn2+ + 4OH- + O2 2MnO(OH)2
Il reattivo II una soluzione di NaI e H2SO4 che scioglie il precipitato di Mn(IV) e
Mn(III):
2Mn(OH)3 + 6H+ + 2I- 2Mn2+ + I2 + 6H2O

289

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

MnO(OH)2 + 2I- + 4H+ 2Mn2+ + I2 + 3H2O


Infine lo iodio prodotto viene titolato con tiosolfato:
I2 + 2S2O3= 2I- + S4O6=
Dalla stechiometria delle reazioni si nota che ad una mole di ossigeno corrispondono
2 moli di iodio. Questa tecnica ora meno utilizzata in favore di metodiche pi
veloci ed automatizzabili. Un esempio di queste nuove tecniche rappresentato,
come anticipato, dallelettrodo di Clark. Esso in realt un sensore costituito da due
elettrodi: un catodo di platino e un anodo di Ag/AgCl. Il catodo inserito in un
cilindro isolante su cui avvolto lanodo, il tutto contenuto in un altro cilindro che
contiene una soluzione di cloruro di potassio. In fondo il sensore chiuso da una
membrana di un polimero permeabile ai gas. Tra i due elettrodi impostata una
differenza di potenziale compresa tra gli 0,7-0,8 V.
Quando questo sensore immerso nellanalita, lO2 riesce a penetrare nella
membrana e raggiunge il catodo dove viene ridotto (la differenza di potenziale
sufficiente per la sua riduzione). La reazione al catodo :
O2 + 4e- + 4H+ 2H2O
Allanodo:
4Ag + 4Cl- 4AgCl + 4eLa misura della corrente prodotta da questa reazione redox direttamente
proporzionale alla pressione parziale di ossigeno che diffonde attraverso la
membrana.
Questo sensore preventivamente tarato con soluzioni a concentrazione nota di
ossigeno disciolto contenente bisolfito.

Richiesta totale di ossigeno (TOD)

290

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Il TOD d una stima indiretta della quantit di sostanze organiche presenti in un


campione di acqua. In particolare il TOD determina la quantit totale di ossigeno
necessaria per la completa ossidazione, mediante combustione, dei composti
organici. I valori ottenuti vengono espressi in milligrammi di ossigeno per litro.

Quantit totale di alogeni organici (AOX)


Pu essere utile calcolare la quantit di alogeni totali presenti in un campione
acquoso (nellordine delle ppb) in quanto potrebbero darci valide informazioni
riguardo la presenza di eventuali solventi alogenati nelle acque.
Essi vengono trasformati in HX e successivamente titolati attraverso una titolazione
coulombometrica.

Campionamento Gas e vapori


In questa sezione vediamo di analizzare come possono essere campionati i gas e i
vapori. Per vapori intendiamo principalmente i VOCs, composti organici volatili.
La volatilit di queste molecole dipende dal loro peso molecolare, ma quelli pi
pesanti possono essere ugualmente ritrovati adsorbiti sul particolato. Un esempio
rappresentato dal pirene, dal benzo[a]pirene e dal coronene. La ripartizione di questi
composti tra fase adsorbita e fase vapore dipende dalla temperatura, pertanto destate
avremo pi pirene, benzo[a]pirene e coronene in fase vapore.

Pirene Benzo[a]pirene

291

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Andiamo con ordine. Parliamo ora di come si effettuato i campioni di aria.


Laria pu essere campionata utilizzando diversi strumenti: un bulbo, costituito da
due rubinetti i quali vengono lasciati dapprima aperti per avvinare la vetreria e poi li
si chiude entrambi. Si porta questa apparecchiatura in laboratorio e, attraverso un
setto si effettuano dei prelievi per le analisi.
Si possono anche usare delle cartucce adsorbenti che presentano al loro interno del
materiale specifico per alcuni composti. Unaltra strumentazione limpinger che
permette la determinazione delle polveri presenti in atmosfera. Nello specifico: su
una superficie piana e umida viene indirizzato, mediante una corrente, un volume
daria noto; la polvere in sospensione nel volume daria colpisce la superficie, vi
aderisce e successivamente viene pesata e analizzata. In ultimo citiamo i PUF disk,
filtri di poliuretano particolarmente affini agli IPA. Esistono in realt diverse altre
cartucce (solvent desorption tubes, thermal desorption tubes) affini per i VOCs le
quali presentano delle fasi stazionarie variabili a seconda della classe di molecole che
si vuole analizzare. Ad esempio se sono interessato alle aldeidi utilizzer una specie
che reagisca con esse e successivamente eluir (e cercher) il prodotto di reazione. In
questo caso il campionamento risulta estremamente selettivo (al contrario dei
canister che, come vedremo, campionano tutto). Per un campionamento meno
selettivo si utilizzano trappole costituite da diversi materiali in modo tale da avere un
maggiore range di adsorbimento. Qualche esempio costituito dal tenax (polietere),
perfetto per i VOCs, mentre il carbone attivo perfetto per gli idrocarburi apolari.
Vediamo ora con ordine alcuni esempi di campionamento, per esempio per quanto
riguarda la SO2. Attualmente esistono dei dispositivi portatili in grado di determinare
la concentrazione di tale gas, ma in passato si usavano strumentazioni pi complesse.
In particolare ve nera una che consisteva in un captatore a forma di imbuto
rovesciato (per evitare la contaminazione dalla pioggia, dai guani di piccione, )
collegato ad una pompa in aspirazione. Laria campionata veniva condotta prima
attraverso un filtro, e successivamente convogliata in una soluzione di H 2O2
basificata con un ammina alifatica. Non si usa KOH in quanto igroscopico.

292

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

SO2 + ammina Acido solforoso + H2O2 SO42Gli anioni ottenuti possono essere quantificati attraverso una titolazione. E
importante introdurre in questo sistema un misuratore del flusso di aria aspirata, cos
da poter quantificare la concentrazione di SO2 in funzione della massa daria
campionata.
Analizziamo ora i bags, che sono dei veri e propri sacchi dotati di una pompa a
pressione e sono quindi adatti a gas permanenti. I VOCs si adsorbirebbero alla
pompa rovinandola. I bags collegati ad una pompa a pressione assorbono laria.
Possono essere utilizzati anche in assenza di pompa introducendo il bags (sottovuoto)
in un recipiente chiuso in cui si fa il vuoto. A questo punto il bag si espande
aspirando il gas.
Pi interessanti sono i canister, contenitori di acciaio passivati con SiO2. La
passivazione fondamentale in quanto se si campionassero solventi clorurati,
lacciaio agirebbe da catalizzatore declorurizzandoli. In questo contenitori non deve
mai entrare del particolato, in quanto si contaminerebbe il canister. Per favorire una
omogeneit nel campionamento, i canister, che sono inizialmente sotto vuoto, sono
dotati di una valvola che permette il loro riempimento graduale e lento secondo una
curva di questo tipo:

A seconda della velocit di riempimento la curva pu essere pi o meno ripida.

293

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

A questo punto subentra per un problema: il campionamento , inevitabilmente, pi


rapido negli istanti iniziali e diventa via via sempre pi lento. Per questo motivo il
campionamento si effettua solo nel tratto in cui la curva lineare fino a circa il 70%
della pressione atmosferica.
Una volta aspirata laria, la si pu estrarre con dei sistemi di campionatore da
canister. Si allaccia il canister ad una pompa, si aspira il campione allinterno di una
trappola dove si adsorbono i VOCs, successivamente si riscalda la trappola, i VOCs
si desorbono e vengono convogliati in GC-MS. Spesso per si utilizzano due
trappole in quanto possibile che nella prima si intrappolino H2O e CO2. Lingresso
di H2O in una strumentazione GC-MS pu comportare danni alla colonna, ma
soprattutto, interferenze significative nella ionizzazione delle specie e questo
renderebbe lanalisi assolutamente priva di significato. Lintroduzione di una
seconda trappa specifica verso i VOCs eliminerebbe questo problema.
La trappola costituita da un tubo di 1-2 mL, paragonabile alla velocit del flusso di
iniezione in GC. Per questo si rischia di perdere in risoluzione: ci potrebbero essere
pi specie nellarea sottesa ad un solo picco. Si pu risolvere questo problema
utilizzando flussi pi alti (optando per colonne widebore), oppure, se si vogliono
mantenere colonne capillari, necessario introdurre uno stadio di criofocalizzazione
dopo la seconda trappola. I VOCs in questo punto condenseranno tutti insieme e, in
seguito ad un riscaldamento, essi entreranno in colonna nello stesso instante.
Le trappole sono riempite di palline di vetro per aumentarla superficie adsorbente e il
desorbimento avviene grazie ad un riscaldamento della trappola stessa. Il gas carrier
spinge le molecole verso la criofocalizzazione (o direttamente in colonna). La
quantit di specie spinte verso la criofocalizzazione (o direttamente in colonna)
funzione del tempo e segue questo andamento:

294

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Per questa ragione per avere un trasporto di tutte le specie adsorbite occorrerebbe
aspettare tempi infiniti. Per ovviare a questo inconveniente si interrompe il
trasferimento dopo un certo tempo t, uguale sia per gli standard che per le specie
incognite.

Calibrazione miscele gassose


Ci sono due sistemi basilari usati per preparare miscele gassose standard in
laboratorio. Il metodo statico prevede laggiunta di quantit note di gas puro in un
contenitore di stoccaggio, mentre il metodo dinamico, gas puri ad una nota velocit
di flusso vengono mescolati in un opportuno sistema. Vi sono almeno due vantaggi
che permettono di favorire il sistema dinamico a quello statico: mancanza di
contaminazioni (possibili nel contenitore di stoccaggio) e in pi una maggiore
flessibilit nel cambiamento dei componenti o delle concentrazioni.

Metodi statici
I metodi statici prevedono lutilizzo di bulbi, contenitori nei quali vengono inserite
quantit note di analita e gas inerte. Non possono essere preparate miscele a
concentrazioni troppo basse e si hanno problemi di adsorbimento sulle pareti, dato
che la plastica dei rubinetti permette una leggera diffusione dei gas. Per questo
motivo le misure devono essere effettuate a tempi non troppo dilatati dalla
preparazione degli standard

295

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Metodi dinamici
- Diluizione di flussi
I flussi di analita e gas inerte, accuratamente misurati, possono essere uniti per
formare il flusso di miscela desiderata. Si incontrano problemi dovuti alla notevole
differenza di pressione tra i due flussi: il gas inerte (a P maggiore) tender ad
invadere parzialmente il condotto dal quale arriva lanalita, determinando la
formazione di una miscela pi diluita del previsto.

- Gorgogliatori in serie
Ponendo in serie vari gorgogliatori termostatati si avr, allequilibrio, un gas uscente
nel quale la pressione dellanalita corrisponde alla sua pressione di vapore.
Cambiando la temperatura e la pressione del sistema possibile variare la
concentrazione dellanalita nella miscela (cambia la pressione di vapore).

- Tubi di diffusione
Ad un tubo nel quale fluisce un flusso di gas inerte, possono essere attaccati molti
tubi di dimensioni e diametro variabili contenenti lanalita in forma liquida pura. La
concentrazione di analita che raggiunger il flusso di gas inerte dipende dalla
lunghezza del tubo di diffusione, dal diametro dello stesso e dalla costante di
diffusivit dellanalita in esame.

296

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

- Tubi di permeazione
Il campione viene posto in una camera. Sopra il campione viene
collocato un materiale polimerico (teflon). Un gas penetra da sotto il
campione e favorisce la sua evaporazione e la sua migrazione allinterno
del teflon. La concentrazione finale sar funzione del coefficiente di
permeazione allinterno del teflon e della velocit del gas carrier.

Estrazione di VOCs da campioni acquosi


Per estrarre i VOCs da campioni acquosi (aerosol, pioggia, ) si usa la tecnica del
purge & trap. Si rimanda alla dispensa di Analisi degli inquinanti per maggiori
dettagli su questa metodologia, qui ci limitiamo a illustrarla molto brevemente.
In altre parole si fa gorgogliare dentro ad un campione di acqua un gas che faccia
risalire i VOCs, i quali essendo volatili sono affini al gas stesso, e li strippi dallla
soluzione acquosa. I composti organici volatili, insieme al gas, andranno in
unopportuna trappola (tenax) dove vengono adsorbiti. Successivamente si scalda la
trappola, avviene il desorbimento e gli analiti vengono inviati ad un gas297

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

cromatografo per unanalisi GC-MS. Anche in questo caso possono subentrare dei
problemi legati alla scarsa risoluzione che avevamo gi analizzato per i canister. Essi
possono essere risolti aggiungendo uno step di criofocalizzazione oppure
introducendo delle colonne widebore.

Particolato
Il particolato si misura in peso di campione in funzione dei metri cubi di aria. In
particolare lunit di misura utilizzata il g/m3. Vengono utilizzati dei flussimetri
per quantificare il flusso daria (TCD). Lo studio del particolato importante sia dal
punto di vista granulometrico, ma anche per quanto riguarda lo studio dei
componenti

organici

e inorganici

ivi

adsorbiti. Infatti

alcuni

inquinanti

preferiscono alcuni tipi di particolato, nel senso che un certo tipo di sorgente
genera un particolare tipo di particolato sul quale sono adsorbiti degli inquinanti
caratteristici di questa sorgente.
Esistono diversi tipi di tecniche per lanalisi del particolato:

filtri

sedimentatori

impattatori

precipitatori

Iniziamo lo studio dai filtri. Un filtro ideale, con dei pori di diametro, ad esempio, di
10 m, dovrebbe filtrare tutto ci che ha una dimensione superiore a 10 m,
lasciando passare tutte le particelle con un diametro inferiore.
In realt, i filtri si comportano diversamente avendo una maggiore efficienza di
collezione anche per particelle con diametri molto piccoli. In effetti, le particelle pi
piccole sono in realt bloccate dal filtro perch si infilano nelle cavit dello stesso
rimanendo cos intrappolate.
Le particelle grosse possono al
contrario essere rimosse dal filtro

298

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

a causa di fenomeni di turbolenza oppure perch respinte elettrostaticamente dal


filtro stesso. Per spiegare questo ultimo concetto dobbiamo pensare che le molecole
di particolato abbiano una carica negativa, quando si adsorbono al filtro lo caricano
negativamente cos che quando nuove particelle (soprattutto di grandi dimensioni)
stanno per arrivare al filtro, vengono respinte.
Nella figura a fianco vediamo la differenza tra filtro ideale (in rosso) e filtro reale (in
nero). Si noti che lefficienza di collezione per le particelle grandi inferiore al
100% per i motivi appena illustrati.
I filtri possono essere di due tipologie differenti. La prima classe rappresentata da
quelli solubili: dei cristalli (in genere di tetracloronaftene) posti in adatti supporti.
Subiscono una solubilizzazione in solvente. La polvere viene separata per filtrazione
o centrifugazione e sottoposta ad osservazione microscopica e/o analisi chimica.
Sono adatti a particelle aventi un diametro maggiore di 2 m, delle quali permettono
un recupero integrale.
La seconda classe quella rappresentata dai filtri insolubili tra i quali troviamo:

filtri di carta: vengono utilizzati per granulometrie non inferiori a 1-2m,


possono essere utilizzati per la determinazione in peso della quantit di
polvere o per una stima della concentrazione mettendola in relazione, ad
esempio, con la luce trasmessa e/o diffusa dal filtro

filtri micropori o membrane: sono mezzi filtranti di produzione sintetica


che permettono una cattura della polvere in sospensione praticamente totale,
fino al 99% per particelle con diametro di 0,1 m. Disponibili in diverse
porosit (efficienza di captazione, resistenza al flusso daria). I materiali
principalmente usati sono: esteri di cellulosa, fibra di vetro, PVC, AgNO 3 o
teflon. Questi ultimi danno problemi legati alle cariche elettrostatiche.

Ricorda comunque che la scelta del materiale anche funzione del tipo di elemento
che voglio campionare. Per esempio, se sono interessato ai metalli, utilizzer un
filtro organico che possa essere bruciato. Se al contrario sono interessato proprio ai
composti organici, utilizzer un filtro inorganico (fibra di vetro) o quarzo. La

299

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

caratteristica a tutti i filtri quella di essere caratterizzati da una bassa igroscopicit


(che dipende dal materiale). A titolo di esempio la fibra di vetro, il PVC e il Teflon
sono ottimi da questo punto di vista perch non igroscopici. Lo stesso non si pu dire
per gli esteri di cellulosa: igroscopici.
Non possibile raccogliere sul filtro una grande quantit di polvere, poich
laccumulo di particelle tende a chiudere i pori del filtro stesso pregiudicando il
flusso di campionamento. La polvere raccoglibile funzione delle caratteristiche
fisiche del filtro impiegato, quindi utile conoscere prima del campionamento il suo
intervallo di lavoro. E buona norma, infine, non superare come valore massimo di
polvere, il doppio della quantit minima consigliata dal fornitore.
Operativamente, come probabilmente gi trapelato in precedenza, la fase
antecedente a quella del campionamento quella relativa al condizionamento dei
filtri. Essi, per quanto vengano classificati come non igroscopici, tendono
ugualmente ad assorbire anche minime quantit di umidit ed hanno spesso nella loro
struttura residui di lavorazione rappresentati da sostanze volatili. Per questo motivo
si mantengono in camera condizionata (20C e 50% U.R.) per almeno 24h (meglio
48h), poi in stufa a 85C per 12-14h, quindi nello stesso ambiente ove posta la
bilancia per almeno 36h. A questo punto lo si pesa. Dopodich si pu passare alla
fase di campionamento. Una volta terminato i campionato i filtri seguono lo stesso
trattamento, limitando per a 4h la loro permanenza nella stufa.

- Collettori di precipitato (no analisi granulometrica)


Il collettore termoforetico: Si sfrutta la tendenza delle particelle a migrare in
presenza di un gradiente di temperatura (si spostano dove fa pi freddo). Lefficienza
altissima, ma questa tecnica pu essere sfruttata solo in presenza di bassi flussi; le
particelle organiche volatili, inoltre, possono essere perse per via dellelevata
temperatura. Non mostra alcuna distribuzione dimensionale.

300

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

La precipitazione elettrostatica un metodo che utilizza forze elettrostatiche per


rimuovere da un flusso gassoso le particelle solide e le goccioline di liquido che
sono in esso sospesi. Il principio alla base dei precipitatori elettrostatici
relativamente semplice, se un gas viene fatto passare attraverso un elettrodo posto ad
elevato potenziale e un altro posto a terra, esso si ionizza dando luogo alleffetto
corona. Gli ioni prodotti vanno a depositarsi sulle particelle di polvere, tar e acqua
che quindi diventano carichi e a causa del campo elettrico presente tenderanno a
muoversi e a depositarsi sullelettrodo di raccolta posto a terra. Le particelle
aderiscono alla parete dellelettrodo formando uno strato che tenuto insieme da
una combinazione di forze di Van der Waals e di attrazione elettrica; periodicamente
lo strato di particelle deve essere rimosso. Lo schema di

funzionamento di un

precipitatore elettrostatico sintetizzato in Figura:

- Analisi granulometrica del particolato


Possiamo poi essere interessati

allanalisi granulometrica del particolato che

permette una corretta determinazione del rischio a carico dellapparato respiratorio.


Infatti, si sa che le particelle pi grosse sono generalmente di origine crostale, mentre
quelle con un diametro minore di 10 m sono essenzialmente derivanti da processi di
combustione non ideale. Inoltre le particelle pi grosse (dette grossolane o inalabili)
vengono fermate o dal naso o dalle ciglia bronchiali che le espellono. Quelle pi

301

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

piccole (dette fini o respirabili) arrivano fino ai polmoni con il risultato che le
sostanze adsorbite su di esse possono essere rilasciate nel sangue.
Il grafico seguente permette di valutare la penetrazione nellalbero respiratorio degli
inquinanti particolati in funzione del diametro aerodinamico.

Gli strumenti che possono essere utilizzati per la separazione granulometrica possono
essere i cicloni, i conimetri a urto virtuale e gli impattori inerziali.

Iniziamo dai cicloni. Per effetto


della

forza

particolato

centrifuga,
di

il

dimensioni

maggiori esce dal flusso e si


deposita sulle pareti interne del
ciclone; la forza di gravit fa s
che queste particelle scivolino
sul fondo del dispositivo dove
vengono raccolte in unapposita
tramoggia
periodicamente

che
svuotata.

viene
La

302

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

parte inferiore del ciclone di forma conica ed in questa zona il flusso daria inverte
il senso del suo moto per la differenza di pressione esistente fra lapertura di entrata e
quella di uscita, posta sulla sommit del dispositivo. Il flusso daria risale in una
stretta spirale verso lalto ed esce dal tubo di scarico che ha lasse coincidente con
quello del ciclone. Laria in uscita si presenta depolverata dal materiale pi
grossolano (indicativamente di diametro superiore a 1 mm),
ma contiene ancora le particelle di dimensioni minori, che non sono riuscite a
sfuggire alla forza di trascinamento dellaria.

I conimetri a urto virtuale sono degli strumenti che prevedono la suddivisione del
particolato pi pesante da quello pi leggero in funzione della differente mobilit
delle particelle in presenza di una corrente daria laterale. Quelle pi pesanti non
risentiranno della suddetta corrente e quindi continueranno la loro corsa (vd. figura)
verso il filtro di raccolta posto direttamente sotto lentrata del flusso daria. Quelle
pi leggere risentiranno di questa forza laterale ed andranno a depositarsi su un altro
filtro.

303

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Gli impattori inerziali vengono usati per classificare le singole particelle del
particolato aerosospeso in base al loro diametro aerodinamico. In questi dispositivi le
particelle vengono separate dal flusso daria che viene campionata a causa della loro
inerzia. Il flusso daria viene fatto passare attraverso un orifizio in cui le particelle
aerosospese vengono accelerate. Alluscita dellorifizio le linee di flusso dellaria
vengono bruscamente deviate cosicch le particelle maggiori di un cenrto diametro
aerodinamico (diametro di cut-off dellimpattatore) escono dalle linee di flusso e
urtano su una superficie di raccolta dellimpattore, mentre le particelle pi piccole
seguono le linee di flusso. Gli impattori a cascata presentano una serie di tali stadi
che consentono di frazionare il particolato in diversi intervalli di dimenzione. Il
sistema (figura) progettato in maniera tale che le dimensioni degli orifizi diventano
progressivamente pi piccole a partire dal primo stadio fino allultimo. La velocit
dellaerosol risulta pi bassa nel primo stadio in cui vengono separate le particelle
pi grandi, mentre quelle pi piccole passano negli stadi successivi.
Questi impattori sono generalmente muniti di un prese paratore che raccoglie le
particelle di diametro aerodinamico maggiore di 10 m e vengono collegati ad una
pompa a vuoto regolata ad un flusso opportuno. Mediante gli impattori a cascata
possono essere intrappolate particelle di dimensioni comprese tra 10 e 0,4 m.

Per raccogliere particelle di granulometria pi piccola occorre utilizzare impattori


con stadi a bassa pressione ed impattori con micro orifizi. Negli impattori a bassa
pressione una progressiva diminuzione della pressione tra stadio e stadio determina
304

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

un aumento del libero cammino medio delle particelle e la loro selezione in base ai
fenomeni di impatto. In questo modo si riesce a selezionare particelle fino a
dimensioni dellordine della decina di nm.
Una variante dellimpattore inerziale quello a griglia rappresentato nella figura
seguente:

- I campionatori automatici di particolato


Concludiamo parlando di due campionatori automatici: il TEOM e i -attenuatori.

Il TEOM (Tapered Element Oscillating Monitor) uno strumento ad alta precisione


utilizzato per la determinazione delle concentrazioni del materiale particolato
disperso in atmosfera, in modo continuo. E costituito da un tubo oscillante con un
filtro posto sullestremit libera su cui si depositano le polveri. La massa delle
particelle cos raccolta induce cambiamenti nella
conseguono variazioni nella frequenza di oscillazione

massa del sistema a cui


meccanica dellelemento

affusolato su cui appoggiato il filtro; in particolare man mano che le particelle


sono raccolte sul filtro la frequenza diminuisce in modo direttamente proporzionale
alla massa accumulata (Figura 2.4). Un microprocessore converte direttamente la
frequenza di vibrazione in una misura di concentrazioni di

massa attraverso

unoperazione di derivata.

305

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

Lo strumento provoca un riscaldamento dellaria in ingresso (che raggiunge circa la


temperatura

di

50C)

minimizzando

le

interferenze

dellevaporazione

condensazione dellacqua sul filtro e fornendo una misura stabile e riproducibile.


Linnalzamento della temperatura determina per levaporazione delle sostanze
volatili (es. sali dammonio,

specie organiche, etc.), fattore che comporta una

sottostima delle misure di concentrazione del materiale particolato effettuate dal


TEOM, motivo per cui dal 2005 ARPA Lombardia fornisce le misure corrette tramite
un fattore moltiplicativo, determinato dal confronto di dati ottenuti da strumenti
TEOM e gravimetrici.

Concludiamo con i -attenuatori. Il principio dellattenuazione Beta un metodo


automatico di misura del PM10 basato sullaspirazione e filtrazione di aria con lo

306

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice A

scopo di trattenere le polveri su un nastro filtrante collocato su un emettitore di raggi


Beta. Le radiazioni emesse da una sorgente radioattiva, costituita da un isotopo del
Promezio o del Carbonio (147Pm o 14C), passano attraverso il filtro intatto e vengono
misurate da un rivelatore di Geiger-Muller. Un volume noto di aria viene quindi
fatto passare attraverso la sezione stessa del filtro sul quale si accumula la polvere
contenuta
nellaria. Col progressivo trattenimento delle particelle sul materiale filtrante, un
numero sempre minore di particelle Beta riesce a penetrare nella massa accumulata,
oltrepassandola.
Al termine del periodo di campionamento, il filtro viene nuovamente esposto ai raggi
e gli impulsi, in uscita dal rilevatore, vengono elaborati da un microcalcolatore che
calcola il rapporto tra il livello di radiazioni assorbite dal filtro con deposito di
polvere e quelli assorbiti dal filtro intatto. Una opportuna taratura dello strumento,
che considera la correlazione tra lattenuazione delle particelle Beta e il particolato
raccolto, permette allo strumento di fornire in tempo reale il valore di concentrazione
di particelle. Infatti lassorbimento proporzionale alla quantit di polvere sul filtro
e, in funzione del volume di aria filtrata, lanalizzatore rilascia il valore di
concentrazione. Il periodo tipico di campionamento per lattenuazione Beta 1 o 2
ore.
E possibile unire ad un -attenuatore un sistema XRF (fluorescenza a raggi X) per
unanalisi qualitativa delle particelle adsorbite sul particolato stesso.
Per concludere, possiamo dire che lanalisi degli analiti adsorbiti sul particolato pu
avvenire attraverso una SPE/SPME nel caso degli anioni (solubili in acqua),
attraverso unestrazione Soxhlet o con microonde nel caso di composti organici,
oppure per dissoluzione acida nel caso dei metalli, seguita da unanalisi in ICP/MS o
simili.

307

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice B

APPENDICE B
CONVERSIONE UNITA DI MISURA
Lenergia in fisica solita misurarsi in Joule ed data da questa analisi
dimensionale: [E] = [M][L2][T-2]
In chimica non si usano quasi mai i Joule, soprattutto negli spettri bens i cm -1, nm,
kbT ecc
In seguito vediamo alcune semplici conversioni tra cm -1 e nm. Questo possibile
farlo esprimendo in modi differenti lequazione di Planck:

Pu essere scritta come:

dove

rappresenta il numero donda in m-1. Molto spesso i chimici usano

il cm-1 per indicare un numero donda.

Dove espressa in m, mentre in chimica si usano specialmente i nm (10 -9 m).


Vediamo un esempio. A quando equivale una radiazione a = 650 nm in cm-1?
Per prima cosa dobbiamo ottenere lenergia associata a questa lunghezza donda in J.

Dopodich sostituiamo in:

e risolviamo per

305

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice C

APPENDICE C
ALCUNE DOMANDE DA ESAMI PASSATI
Esame 1

fast gc e analoga tecnica in hplc,

equazione di Van Deempter coi parametri a,b,c;

estrazione con soxhlet,

estrazione con ultrasuoni,

estrazione con fluidi supercritici,

estrazione con solvente ad alta pressione,

estrazione con solvente accelerata,

lidar e spettroscopie risolte nel tempo,

cenni di fluorescenza e raman,

estrazione con microonde.

Esame 2

estrazione di idrocarburi e amminoacidi da un meteorite ;

spettro MS idrocarburi;

Raman Lidar

come analizzo gli NOx

Esame 3

modi per estrarre da un campione solido i componenti organici non volatili

estrazione accelerata con solvente

estrazione con fluidi supercritici

disegnare diagramma P-T e spiegare il concetto di supercritico

excursus su misurazioni in fluorescenza in campo ambientale

derivatizzanti tipici per la fluorescenza

un esempio di inquinante ritrovabile con fluorescenza diretta

306

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice C

Esame 4

interfacce GC/LC- MS

tecniche calibrazione e raccolta di campioni gassosi

la criofocalizzazione in GC

tubi di permeazione e tubi di diffusione

Esame 5

interfacce GC-MS

Laser(definire le propriet e metodi per calcolarle), come si determinano gli


NOx

Esame 6

Analizzatori di massa ad alta risoluzione e parlare nello specifico dell' ICRFT

Raman,

Laser Raman

Spettroscopie Raman Multifotoniche

Lidar Raman

Esame 7

La classificazione dei diversi composti organici

i principi sui quali si basa la classificazione e lutilit nella preparazione di


unestrazione

come separo unammina da un ac. carbossilico e da un aromatico

Cos la fast GC

Equazione di Van Demmter

come si calcola la velocit lineare del gas carrier

disegnare la Van Demmter

dove si applica una Fast GC


310

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice C

a quale tecnica si abbina solitamente la Fast GC

Esame 8

Sempre sulla fast GC


o come funziona accoppiamento GC-GC
o descrivere linterfaccia
o come si evita la perdita di risoluzione passando da volumi/temperature
diverse tra i 2 sistemi

Sempre sulle classi


o come si effettua lanalisi degli inorganici
o come posso estrarre un tensioattivo anionico
o con che tecnica posso fare lanalisi di acidi carbossilici (come si
derivatizzano)
o che rivelatore utilizzer se li analizzo in HPLC

Esame 9

Classificare le diamine alifatiche


o come le preconcentro dallaria
o come funziona un canister
o quale funzione ha il modulatore di pressione
o che tipo di colonne si usano solitamente nella tecnica purge and trap
o come funziona il trasferimento da una colonnina capillare a un GC

Spiegare la teoria della fluorescenza


o definire il quenching da concentrazione
o dove si applica la fluorescenza nellanalisi degli inquinanti

Parlare del lidar


o nellanalisi di una macchia di petrolio sulloceano come distinguo gli
IPA da la DOM (del mare)

Appi: quando, dove, come, per cosa

Esame 10
311

Analisi degli inquinanti con laboratorio Appendice C

Definire un inquinante

Soxlet
o -vantaggi. Svantaggi, particolarit del metodo
o -disegnare lo strumento
o -in rif al soxlet gli ultrasuoni si possono dire pi efficienti?
o -solventi tipici del soxlet e degli ultrasuoni

Ase: vantaggi. Svantaggi. statico o dinamico?

Cosa sono i cosidetti composti residui del suolo


o -perch il Soxlet non li estrae e lase si?

Parlare del quadrupolo come funziona e quali tecniche possiamo utilizzare

Perch il raman ha solo 2 segnali


o la polarizzabilit costante per un atomo, per una molecola lo sar?
No e perch?
o spiegare bene il processo raman con le formule e il resto

312