Teste de Ames

A avaliao das substncias em relao mutagenicidade e

genotoxicidade so baseadas em uma combinao de testes que servem para
a deteco dos possveis danos genticos associados a doenas humanas:
mutao gentica (mutaes pontuais, ou seja, excluses/inseres que
afetam os genes); clastogenicidade, ou seja, alteraes cromossmicas
estruturais; aneuploidia (aberraes cromossmicas numricas). Mesmo que
se considere que nenhum nico ensaio detecte todos os possveis danos ao
DNA, o teste de mutagenicidade (conhecido como teste de Ames) deve ser
aplicado a qualquer nova substncia antes da mesma chegar populao
(OECD,
1997).
O teste de Ames desenvolvido pelo Dr. Bruce Ames e colaboradores,
utiliza cepas de Salmonella typhimurium com mutaes em local especfio
responsvel pela biossntese do aminocido histidina, isto , essas bactrias
no sintetizam esse aminocido e logo proliferam somente em meio de cultura
acrescido do mesmo. O cientista percebeu que quando esses mutantes eram
submetidos ao de um agente mutagnico, o gentipo his-() poderia ser
modifiado, revertido (his+). Em contato com o agente mutagnico, algumas
clulas revertiam, passavam a proliferar e a formar colnias. A reverso
indicava que existiam alteraes nos cdons permitindo clula bacteriana
sintetizar o aminocido e multiplicar-se

Teste de microncleo
O estudo de aberraes cromossmicas possibilita a identificao de
quase todas as alteraes na estrutura do caritipo, escapando apenas as bem
pequenas, no visveis ao microscpio. Mas, hoje em dia, por haver tcnicas
para deteco de mutaes cromossmicas mais rpidas e simples, como o
Teste de Microncleos, o estudo de aberraes cromossmicas apenas
utilizado em situaes recomendadas, como dirimir dvidas, definir os tipos de
mutao e validar outras metodologias. Estes testes tm um sistema de

validao internacional e podem ser desenvolvidos tanto in vitro como in vivo,

desde que se conhea adequadamente a biologia do organismo-teste.
O Teste de Microncleos internacionalmente aceito como parte da
bateria de testes recomendada para a avaliao mutagnica e registro de
novos frmacos que entram, anualmente, no mercado mundial.

Teste de Microncleos Uma das metodologias bastante utilizadas para

avaliao de possveis danos mutagnicos causados por frmacos nos
organismos o Teste de Microncleos (MN), inicialmente desenvolvido em
eritrcitos de medula ssea de camundongos. Esse tipo de teste tem sido
recomendado para estudos de biomonitoramento, principalmente por sua
capacidade de detectar agentes clastognicos (quebra de cromossomos), e de
agentes aneugnicos (segregao cromossmica anormal) requerendo, no
entanto, proliferao celular para a observao do biomarcador de efeito
(FENECH, 2000; RIBEIRO et al., 2003). um teste citogentico que pode ser
usado

como

biomarcador

para

avaliao

de

efeitos

aneugnicos

clastognicos em diversos organismos vivos. Este teste vem sendo usado,

desde 1980, para demonstrar danos citogenticos induzidos por radiaes,
contaminantes ambientais, ocupacionais, estilo de vida, deficincias em
nutrientes e outras doenas. importante ressaltar que o teste de MN um
dos testes para avaliao de genotoxicidade menos invasivo e que causa
poucos transtornos aos pacientes, quando comparados com os que necessitam
de biopsia (STICH et al., 1998; PASTOR et al., 2003). O ensaio in vitro
amplamente utilizado como screening de avaliao dos danos citogenticos em
clulas de mamferos.
Sua popularidade , em grande parte, devido ao fato de que ele pode
ser executado com menos conhecimentos tcnicos relativos anlise de
aberraes cromossmicas, alm de ser capaz de detectar aneugenias e
clastogenias. Assim, tem havido forte pesquisa na automao da aferio do
ponto de extremidade de microncleos in vitro, uma meta que poderia
potencialmente reduzir o trabalho e os custos.

O teste de MN em medula ssea de roedores in vivo amplamente

aceito pelas agncias internacionais e instituies governamentais, como parte
de uma bateria de testes recomendados para se estabelecer avaliao e
registro de novos produtos qumicos e farmacuticos que entram anualmente
no mercado mundial (CHOY, 2001). Este teste foi desenvolvido de incio, em
eritrcitos de medula ssea de camundongos, porm tambm realizado em
ratos (TAKAHASHI et al., 2004). Alguns agentes contm substncias que
acarretam a ocorrncia de mutaes. Por isso, h necessidade de estud-los,
fazendo-se testes que detectem o efeito mutagnico como o Teste de
Microncleos. Atualmente, o Teste de Microncleos utilizado como padro de
teste de mutagenicidade OECD Guidelines for the testing of chemicals/
section 4: Health Effects Mammalian Erythrocytes Micronucleos Test: n 474
e recomendado pelo Gene-Tox Program, Environmental Protection Agency
EPA/US.
Os microncleos so pequenos corpsculos nucleares representando o
material gentico que foi perdido pelo ncleo principal como consequncia de
um dano gentico. Aps a separao das cromtides, no processo mittico,
dois ncleos so reconstitudos, um em cada polo. A membrana nuclear
refeita ao redor destes dois conjuntos cromossmicos. Mas se um cromossomo
inteiro ou um fragmento cromossmico acntrico no se integra ao novo ncleo
(por no estar unido ao fuso), este tambm pode constituir um pequeno ncleo
individual (Figura 1) (FENECH et al., 1999; IARMARCOVAI et al., 2007;
HOLLAND et al. , 2008).

Os MNs podem ser gerados de diferentes processos oriundos de

quebras ou perdas de cromossomos (FENECH, 2007). Embora os mecanismos
de reparo celular sejam extremamente eficientes, a sensibilidade da estrutura
cromossmica permite a atuao de agentes clastognicos e aneugnicos
durante a mitose e a meiose. A atuao de agentes clastognicos e
aneugnicos, dentre outras formas, responsvel pela origem das aberraes
cromossmicas estruturais e numricas (CARVALHO et al., 2002).
A hiptese de associao entre a ocorrncia de microncleos e o
desenvolvimento de cncer baseada na alta frequncia desse biomarcador
em pacientes oncolgicos no tratados e na inversa correlao entre sua
frequncia em clulas sanguneas com os micronutrientes da dieta (BONASSI
et al., 2007). A formao de microncleos extensivamente usada em
epidemiologia molecular como um biomarcador de danos nos cromossomos,
instabilidade gentica e, eventualmente, risco de cncer. A ocorrncia dos
microncleos representa

uma

resposta

integrada

de

instabilidade

de

cromossomos, fentipos e alteraes celulares causadas por defeitos

genticos e ou exposio exgena a agentes genotxicos, refletindo inmeras

alteraes cromossmicas importantes para a carcinognese. Existem relatos

de associaes entre polimorfismos genticos e formao de microncleos e
que variantes genticas podem modular os efeitos da exposio ambiental aos
agentes genotxicos, bem como idade, caractersticas de estilo de vida (lcool,
fumo, folatos) e doenas (cardiovasculares, cncer).

Ensaio do Cometa

Recentemente, o teste alcalino eletrofortico de clula-nica ou Ensaio

Cometa, que detecta quebras no DNA, tem sido recomendado para o
biomonitoramento sendo um teste realizado em clulas individuais no
proliferativas (FARBAIRN et al., 1995; TICE, 1988).
Nesse ensaio, a clula colocada em contato com o agente qumico em
teste. Posteriormente, o DNA extrado e submetido a uma corrida em
eletroforese. Se,aps a corrida, o DNA estiver ntegro, ele surge em forma de
um s aglomerado, porm, se a substncia mutagncia, ela deixa o DNA
fragilizado pela mutaes, este se quebra facilmente e so observados
rastros na revelao (TICE, 1988).
O Ensaio do Cometa, que tem sido empregado em biomonitoramento de
populaes, para avaliar genotoxicidade e capacidade de reparo de danos ao
DNA em humanos, animais e populaes de plantas, frmacos, bem como em
aplicaes clnicas. Nessas condies, verifica-se que, dentre os diversos
bioensaios de genotoxicidade e mutagenicidade a frmacos, o Ensaio Cometa,
o Teste de Microncleos, cada um com suas especificidades, vantagens e
desvantagens, vm sendo bastante utilizados, sendo importantes para o
diagnstico de possveis efeitos mutagnicos e genotxicos, reparo celular e na
preveno de riscos a curto ou a longo prazo de exposio. Correlaes entre
esses bioensaios podem contribuir para o entendimento da complexidade
molecular da exposio a frmacos em estudos de gentica toxicolgica.

DNA sem dano

DNA que sofreu mutaes

Referncias
NETO, M.P.L. . Avaliao txica, citotxica, genotxica e mutagnica do composto 3(2-cloro-6-fluorobenzil)-imidazolidina-2,4-diona em clulas. UFPI, Teresina 2011, 130 p.
AIUB, C.A.F. E FELZENSZWALB, I . Os princpios do teste de ames (Salmonella/
microsomo) e sua aplicabilidade. Sociedade Brasieria de Gentica, v.6(2), p. 11-16
(2011).