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INTRODUCCIN
Analizar
el
efecto
antagnico
de
los
probiticos
comerciales
Eritromicina
para
el
control
de
la
bacteria
patgena
bioqumicamente
tipificar
microbiolgicamente
Carnobacterium pisccola.
Probar el efecto antagnico con los probiticos Lactobacillus plantarum y
Lactobacillus casei a concentraciones de 109, 107 y 105 ufc/ml, y a temperaturas
de 8C, 15C y 20C.
Determinar el efecto antagnico con los antibiticos Oxitetraciclina,
Amoxicilina, Eritromicina a concentraciones de 30 mcg, 25 mcg y 15 mcg
respectivamente, y a temperaturas de 8C, 15C y 20C.
1.2.1 Probiticos
estn:
Lactobacillus,
Bifidobacterium,
Streptococcus
Actividad metablica
en
la
dieta
de
forma
constante
para
lograr
la
accin
de
cidos,
perxido
de
Hidrgeno
bacteriocinas
desde
hace
siglos;
constituyen
un
vasto
conjunto
de
10
Reino
Bacteria
Divisin
Firmicutes
Clase
Bacilli
Orden
Lactobacillales
Familia
Lactobacillaceae
Gnero
Lactobacillus
Especie
L. plantarum
en
perxido
de
hidrgeno
que
resulta
txico
para
otros
2007). Otros
12
Reino
Bacteria
Divisin
Firmicutes
Clase
Bacilli
Orden
Lactobacillales
Familia
Lactobacillaceae
Gnero
Lactobacillus
Especie
L. casei
13
Reino
Bacteria
Divisin
Firmicutes
Clase
Bacilli
Orden
Lactobacillales
Familia
Carnobateiaceae
Gnero
Carnobacterium
Especie
C. pisccola
1.2.3 Antibiticos
paredes
celulares
bacterianas.
La
estreptomicina,
tetraciclinas,
1.2.3.1 Oxitetraciclina
16
1.2.3.2 Amoxicilina
1.2.3.3 Eritromicina
se excreta por la bilis. Alcanza bajas concentraciones urinarias pues slo del
2% al 15% se elimina en forma activa en la orina. La vida media plasmtica es
de una y media horas, pero la droga permanece activa en los tejidos, por un
tiempo mayor (Gundin. et al., 1998). Las eritromicinas se ligan a la subunidad
50 S del ribosoma e inhiben la elongacin de la cadena peptdica (Prescott, L.,
et al., 2002).
Chordata
Sub Phylum
Vertebrata
Orden
Salmoniformes
Sub Orden
Salmonoidei
Familia
Salmonidae
Sper clase
Gnastosthomata
Clase
Osteichyes
Sub Clase
Actinopterygii
Gnero
Oncorhynchus
Especie
mykiss
18
1.2.4.1 Origen
1.2.4.2
Descripcin
20
diferencia de la trucha comn que prefiere los fondos que mantiene durante su
estancia en los estanques (Blanco, 1994).
adaptacin
social
la
alta
densidad
poblacional,
con
1.2.4.4 Alimentacin
La racin alimenticia tiene que ser bien balanceada con un nivel del 3840% de protena y una temperatura de 10-18C, en la cual el aprovechamiento
del alimento que se consigue es mejor. Se recomienda tambin la interrupcin
de la alimentacin por un da por semana para mejorar y beneficiar la salud de
la trucha (Briones, 1994).
1.2.5.1 Tipificacin
24
Segn Prescott, L., et al., (2002), hay varias formas de preparar cultivos
puros, pero los ms comunes son:
25
Puede hacerse en tubo y debe realizarse una vez incubados los cultivos
de manera inclinada para poder gotear por la pendiente perxido de hidrgeno
al 3%. La catalasa va a convertir el perxido de hidrgeno en agua y burbujas
de oxgeno, siendo este resultado tomado como positivo; en caso de no
presentarse burbujas es un resultado negativo (Prescott, L., et al., 2002).
27
28
1.3 Hiptesis
2. MATERIALES Y MTODOS
30
2.1 Participantes
2.4 Diseo
31
F de V
GL
Total
80
Tratamientos
(26)
Entre grupos
G3vsG1,G2
G1vsG2
Temperatura
DxT
(8)
Dosis
Temperatura
DxT
Error
(8)
(8)
Antibiticos
Temperatura
DxT
4
54
Tratamientos
Descripcin
Antagonistas
Dosis (ufc/ml)
Temperatura
(C)
T1
T2
Probitico 1
Probitico 1
L. plantarum
L. plantarum
C1= 8
C1= 8
D1= 10
D2= 10
T3
Probitico 1
L. plantarum
D3= 10
C1= 8
T4
Probitico 1
L. plantarum
D1= 105
C2= 15
T5
Probitico 1
L. plantarum
D2= 107
C2= 15
T6
Probitico 1
L. plantarum
D3= 109
C2= 15
T7
Probitico 1
L. plantarum
D1= 105
C3= 20
T8
Probitico 1
L. plantarum
D2= 107
C3= 20
L. plantarum
C3= 20
T9
Probitico 1
D3= 10
T10
Probitico 2
L. casei
D1= 10
C1= 8
T11
Probitico 2
L. casei
D2= 107
C1= 8
T12
Probitico 2
L. casei
D3= 109
C1= 8
T13
Probitico 2
L. casei
D1= 105
C2= 15
T14
Probitico 2
L. casei
D2= 107
C2= 15
T15
Probitico 2
L. casei
D3= 109
C2= 15
L. casei
C3= 20
C3= 20
T16
T17
Probitico 2
Probitico 2
L. casei
D1= 10
D2= 10
T18
Probitico 2
L. casei
D3= 10
C3= 20
T19
Antibitico 1
Oxitetraciclina
D4= 30 mcg
C1= 8
T20
Antibitico 2
Amoxicilina
D5= 25 mcg
C1= 8
T21
Antibitico 3
Eritromicina
D6= 15 mcg
C1= 8
T22
Antibitico 1
Oxitetraciclina
D4= 30 mcg
C2= 15
T23
Antibitico 2
Amoxicilina
D5= 25 mcg
C2= 15
T24
Antibitico 3
Eritromicina
D6= 15 mcg
C2= 15
T25
Antibitico 1
Oxitetraciclina
D4= 30 mcg
C3= 20
T26
Antibitico 2
Amoxicilina
D5= 25mcg
C3= 20
T27
Antibitico 3
Eritromicina
D6= 15 mcg
C3= 20
regresin y correlacin de las dosis con cada una de las variables en estudio.
Tambin se hizo un DMS al 5% entre probiticos y entre antibiticos.
2.5 Procedimientos
sin
alimentacin. Cumplidas las 48 horas se las sumergi en una solucin del 100
ppm de aceite de clavo para poder manipularlas y, una vez que el eje de nado
perdi su funcionalidad, se procedi a retirarlas del agua, pesarlas en una
balanza y empezar la diseccin con un corte desde la regin posterior (a la
altura de la cloaca u ano) hasta la regin anterior (aletas pectorales) con la
ayuda de una tijera de diseccin. Se continu el corte hasta llegar a la regin
opercular, en donde se hizo un corte vertical ascendente y se sigui la lnea
lateral para finalizar en el punto de inicio (Quintero, 2006). De esta manera se
tuvo acceso al intestino, el cual fue retirado y puesto en una caja petri estril
para ser llevado a una cmara de flujo de bioseguridad para pesarlo, abrirlo
con un corte longitudinal y poder retirar el contenido del intestino que tambin
fue pesado.
35
Tabla 2.2 Dosis de los probiticos comerciales para el control del patgeno
Carnobacterium pisccola.
Tabla
L. plantarum x Dosis
L. casei x Dosis
Dosis
(P1D)
(P2D)
(Ufc/ml)
2.3
P1D1
P2D1
105
P1D2
P2D2
107
P1D3
P2D3
109
Antibiticos a
ser
Carnobacterium pisccola.
Temperatura (C)
Dosis (mcg)
A1
30
A2
25
A3
15
Temperatura (C)
C1
C2
15
C3
20
36
3. RESULTADOS
3.1 Diseccin de la Trucha
Figura 3.1 Trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) lista para la diseccin
una vez sedada.
37
No. Trucha
65.0
2.7
1.2
94.5
5.5
1.6
77.5
3.6
1.5
72.1
2.4
55.8
2.9
Colonia
Descripcin
Colonia rizoide, plana, margen
lobulado, blanca, superficie
brillante
Identificacin
Bacillus (alvei)
Bacillus (coagulans)
Aeromona spp.
Proteus spp.
Lactobacillus spp.
39
Figura 3.3 Inoculacin de los pocillos del kit API 50CHL con el medio de
cultivo especfico.
40
Figura 3.4 Reaccin de los azcares del kit API 50 CHL transcurridos 24
horas.
Figura 3.5 Reaccin de los azcares del kit API 50 CHL transcurridos 48
horas.
41
Para empezar con las pruebas de antagonismo se tuvo que activar los
dos probiticos comerciales, L. plantarum y L. casie, en caldo de MRS (Merck)
a 35C y a las 24 horas se obtuvo ya un buen crecimiento de ambas bacterias.
Figura 3.7 Activacin del probitico comercial L. casei en medio lquido y slido
de MRS.
42
43
44
Primero y quinto da
Lactobacillus plantarum
a)
b)
45
a)
b)
a)
b)
46
Lactobacillus casei
a)
b)
a)
b)
a)
b)
Antibiticos
48
a)
b)
a)
b)
49
b)
Figura 3.20 Efecto antagnico de los tratamientos 25, 26 y 27 a) primer da y b)
quinto da.
Tratamientos y Grupos
GL
Variacin
EVALUACIONES DIARIAS
1
Total
80
Tratamientos
26
0,074**
0,094**
0,121**
0,140**
0,155**
entre grupos
0,108*
0,128*
0,288**
0.376**
0.412**
50
Grupos y Tratamientos
0,45
0,4
0,376
0,35
0,3
0,412
Tratamientos
0,288
0,25
Grupos
0,2
0,15
0,128
0,094
0,108
0,074
0,1
0,05
0,121
0,14
0,155
0
Hal.1
Hal.2
Hal.3
Hal.4
Hal.5
Grupos 1 y 2
Tabla 3.4 Anlisis de varianza para dosis, temperatura e interaccin del grupo 1
(L. plantarum) y grupo 2 (L. casei) bajo la accin del patgeno Carnobacterium
pisccola, en 5 das de evaluacin.
Fuentes de
GL
Variacin
EVALUACIONES DIARIAS
1
0.091**
0,145**
0,160**
0,202**
0,223**
Dosis
0.157**
0,231**
0,260**
0,372**
0,462**
Temperatura
0.069**
0,117**
0,127**
0,145**
0,144**
DxT
0.069**
0,117**
0,127**
0,145**
0,144**
0,032**
0,034**
0,041**
0,044**
0,044**
Dosis
0,061**
0,076**
0,108**
0,144**
0,144**
Temperatura
0,023**
0,019**
0,018*
0,011ns
0,011 ns
DxT
0,023**
0,019**
0,018**
0,011 ns
0,011 ns
51
CONCENTRACIONES
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0,462
0,372
0,26
0,231
L. plantarum
0,157
Hal.1
0,108
0,076
0,061
Hal.2
0,144
Hal.3
Hal.4
0,144
L. casei
Hal.5
Temperatura e Interaccin
0,16
0,145
0,14
0,12
0,117
0,144
0,127
0,1
0,08
0,06
L. plantarum
0,069
L. casei
0,04
0,02
0,023
0,019
0,018
0
Hal.1
Hal.2
Hal.3
0,011
Hal.4
0,011
Hal.5
Grupo 3 (Antibiticos)
Tabla 3.5 Anlisis de varianza para dosis, temperatura e interaccin del grupo 3
(Antibioticos) bajo la accin del patgeno Carnobacterium pisccola, en 5 das
de evaluacin.
Fuentes de
GL
EVALUACIONES DIARIAS
Variacin
0.091**
0,145**
0,160**
0,202**
0,223**
Dosis
0.157**
0,231**
0,260**
0,372**
0,462**
Temperatura
0.069**
0,117**
0,127**
0,145**
0,144**
DxT
0.069**
0,117**
0,127**
0,145**
0,144**
GRUPO 3
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0,462
0,372
0,231
0,157
0,117
0,26
Concentracin
0,127
0,145
0,144
Temp e Inter
0,069
Hal.1
Hal.2
Hal.3
Hal.4
Hal.5
53
Promedios generales
Tabla 3.6 Anlisis de varianza de los promedios generales, en 5 das de
evaluacin.
Fuentes de
GL
Variacin
EVALUACIONES DIARIAS
1
Error
54
0,169
0,006
0,007
0,008
0,007
x transformado
54
1,320
1,330
1,360
1,380
1,390
x real
54
0,770
0,810
0,900
0,970
1,000
cv
54
4.245
5.687
6.337
6.274
6.192
GRUPOS
Tabla 3.7 Promedios del crecimiento del halo entre los grupos en estudio.
Fuentes de
GL
Variacin
EVALUACIONES DIARIAS
1
G1(L. plantarum)
0,718 b
0,782 b
0,800 b
0,863 b
0.907 b
G2 (L. casei)
0,626 b
0,641 b
0,670 b
0,696 b
0,696 b
G3 (Antibiticos)
0,963 a
1.015 a
1.226 a
1.341 a
1.389 a
54
GRUPOS
1,6
1,4
1,226
1,2
1
0,8
0,6
0,963
1,015
0,718
0,626
0,782
0,641
0,8
0,67
1,341
1,389
0,863
0,696
0,907
L. plantarum
0,696
L. casei
Antibiticos
0,4
0,2
0
Hal.1
Hal.2
Hal.3
Hal.4
Hal.5
Figura 3.24 Comparacin entre los tres grupos probados contra el patgeno
Carnobacterium pisccola.
Grupo 1 y 2
Tabla 3.8 Promedios del crecimiento del halo del grupo 1 (L. plantarum) y grupo
2 (L. casei).
Fuentes de
GL
Variacin
EVALUACIONES DIARIAS
1
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
1.156 a
1.344 a
1.400 a
1.589 a
1.722 a
C1 (8C)
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
C2 (15C)
0,644 b
0,644 b
0,667 b
0,767 b
0,900 b
C3 (20C)
1.011 a
1.200 a
1.233 a
1.322 a
1.322 a
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0.5 b
0,878 a
0,922 a
1.011 a
1.089 a
1.089 a
0,544 b
0,589 b
0.633 b
0,633 b
0,633 b
DOSIS GRUPO 1
D1 (10 ufc/ml)
D2 (10 ufc/ml)
D3 (10 ufc/ml)
TEMPERAT
DOSIS GRUPO2
D1 (10 ufc/ml)
D2 (10 ufc/ml)
D3 (10 ufc/ml)
TEMPERAT
C1 (8C)
55
C2 (15C)
0, 544 b
0,544 b
0,567 b
0,644 b
0,644 b
C3 (20C)
0,789 a
0,789 a
0,811 a
0,811 a
0,811 a
DOSIS 3
Dimetro halo (cm)
2
1,722
1,589
1,5
1,4
1,344
1,156
0,878
1,089
1,011
0,922
1,089
L.
plantarum
0,5
0
Hal.1
Hal.2
Hal.3
Hal.4
Hal.5
TEMPERATURA 3
Dimetro halo (cm)
1,4
1,2
1
0,8
1,233
1,2
1,011
0,878
0,922
1,011
1,322
1,322
1,089
1,089
L.
plantarum
0,6
0,4
0,2
0
Hal.1
Hal.2
Hal.3
Hal.4
Hal.5
Grupo 3
Tabla 3.9 Promedios del crecimiento del halo del grupo 3 (Antibiticos).
Fuentes de
GL
EVALUACIONES DIARIAS
Variacin
GRUPO3
A1/D4
1.433 b
1.500 b
1.767 b
1,856 b
1,911 b
0.500 b
0.500 b
0,556 b
0,633 b
0,633 b
0,956 a
1.044 a
1.767 a
1,533 a
1,622 a
TEMPERAT
C1 (8C)
0,911 b
0,956 b
1.222 b
1,344 b
1,344 b
C2 (15C)
0,733 b
0,789 b
1.033 b
1,167 b
1.189 b
C3 (20C)
1.244 a
1.300 a
1,422 a
1,511 a
1,633 a
(Oxitetraciclina/ 30
mcg)
antibitico 2 (Amoxicilina 25
ANTIBITICOS
2,5
Dimetro halo
(cm)
1,5
1,433
1,5
0,956
1,044
0,5
0,5
0,5
1,856
1,533
1,767
1,911
1,622
Oxitetracicli
na
0,633
0,556
0,633
0
Hal.1
Hal.2
Hal.3
Hal.4
Hal.5
TEMPERATURAS
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
1,244
1,3
0,911
0,733
0,956
0,789
1,511
1,344
1,167
1,422
1,222
1,033
1,633
1,344
1,189
C1
C2
C3
0,4
0,2
0
Hal.1
Hal.2
Hal.3
Hal.4
Hal.5
5. DISCUSIN
59
2007, esta
entonces
no
hubo
mayor
problema
en
su
crecimiento.
demostrando
que
ambas
variables
actan
de
manera
sensible
contra
Carnobacterium
pisccola
(tabla
3.5).
La
62
6. CONCLUSIONES
1)
2)
bacterianos:
Bacillus
(alvei),
Bacillus
(coagulans),
Aeromona
spp.,
3)
4)
5)
de
inhibicin,
contra
la
bacteria
Carnobacterium
pisccola
6)
63
7)
8)
9)
10)
64
7. RECOMENDACIONES
especies bacterianos, como por ejemplo el primer 16S rRNA, anlisis por
RFLP, PCR o RAPD.
65
8. BIBLIOGRAFA
marzo,
2008,
de
http://www.aquahoy.com/index.php?option=com_content&task=view&id=1043.
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marzo,
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3.
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70
ANEXOS
Anexo A
Anexo A : Tablas con las colonias obtenidas despus del aislamiento de la flora
intestinal de la trucha arco iris (Orcorhynchys mykiss).
Simbologa
Especificacin
Descripcin
Catalasa
T3,-1,C,MRS
Transparente, borde
irregular
B
T3,-1,C,MRS
T4,-3,C+I,TSA
8 Regiones marcadas
transparentes
D
T5,-5,C,TSA
2 Regiones
transparentes
E
T5,-3,C+I,TSA
borde rugoso
F
T4,-5,C+I,TSA
Crecimiento masivo y
una colonia
transparente borde
rugoso
G
T1,-3,C,TSA
Crecimiento masivo
T1,-5,C,TSA
Crecimiento masivo, 1
colonia blanca en el
71
T2,-3,C,TSA
Crecimiento masivo, 22
colonias pequeas en
la base
J
T2,-1,C+I,TSA
Crecimiento masivo
T3,-3,C,TSA
Crecimiento masivo
T3,-5,C,TSA
Crecimiento masivo
T5,-5,C+I,MRS
Crecimiento colonias
grandes, redondas,
Colonias pequeas,
T5,-1,C+I,MRS
No hubo crecimiento
T2,-1,C,MRS
Colonias separadas,
T1,-1,C,MRS
T2,-5,C,MRS
No hubo crecimiento
72
Smbolo
J (-7)B
Descripcin
Catalasa Gramm
Crecimiento
+
masivo, una
partr
un poco seca
y presenta
olor agradable
Lzz
Crecimiento
sin sep. de
colonias
K (-7)
Crecimiento
masivo, olor
agradable
Hzz
Crecimiento
masivo
J (-7)A
Crecimiento
sin sep. de
colonias
73
Figuras
G(-7)A
Crecimiento
sin sep. de
colonias
Ezz
Crecimiento
con
separacin de
colonias
Jzz
Crecimiento
con estriado
sin sep. de
colonias,
hubo
crecimiento
fuera del
estriado
MRS
Nzz A
Mzz
Crecimiento
con
separacin de
colonias
pequeas,
redondas,
borde liso,
blancas, olor
a queso
Crecimiento
sin sep. de
colonias, color
blanco y olor
bien agradable
74
Anexo B
Anexo B: Tablas con los informes de los resultados de la identificacin
bacteriana tras la realizacin de las diferentes pruebas bioqumicas para
determinacin de gnero y especie.
75
76
77
78
79
80
Anexo C
Anexo C: Efecto antagnico en centmetros del primero al quinto da de los 27
tratamientos contra el patgeno Carnobacterium pisccola.
Tratam
1,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
4,00
4,00
4,00
5,00
5,00
5,00
6,00
6,00
6,00
7,00
7,00
7,00
8,00
8,00
8,00
9,00
9,00
9,00
10,00
10,00
10,00
11,00
11,00
11,00
12,00
12,00
12,00
13,00
Repet
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
Pro o Amb
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
Dosis
1,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
1,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
1,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
1,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
1,00
Temp
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
2,00
81
halo 1 halo 2
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,90 0,90
0,90 0,90
1,00 1,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
2,60 4,00
1,50 1,80
2,00 2,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,00 0,00
0,90 0,90
0,00 0,00
0,00 0,90
0,00 0,00
halo 3
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,90
0,90
1,20
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
4,00
1,80
2,30
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,10
0,00
1,10
0,00
halo 4
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,30
1,30
1,30
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
4,50
2,10
2,30
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,10
0,00
1,10
0,00
halo 5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,80
1,80
1,50
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
4,50
2,10
2,30
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,10
0,00
1,10
0,00
13,00
13,00
14,00
14,00
14,00
15,00
15,00
15,00
16,00
16,00
16,00
17,00
17,00
17,00
18,00
18,00
18,00
19,00
19,00
19,00
20,00
20,00
20,00
21,00
21,00
21,00
22,00
22,00
22,00
23,00
23,00
23,00
24,00
24,00
24,00
25,00
25,00
25,00
26,00
26,00
26,00
27,00
27,00
27,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
1,00
2,00
3,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
1,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
4,00
4,00
4,00
5,00
5,00
5,00
6,00
6,00
6,00
4,00
4,00
4,00
5,00
5,00
5,00
6,00
6,00
6,00
4,00
4,00
4,00
5,00
5,00
5,00
6,00
6,00
6,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
3,00
82
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,90
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,50
1,50
1,10
1,30
1,50
1,30
0,00
0,00
0,00
1,10
0,00
1,00
1,10
1,10
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,90
0,00
2,00
2,00
1,60
0,00
0,00
0,00
1,50
1,50
1,10
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,90
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,50
1,50
1,10
1,30
1,50
1,30
0,00
0,00
0,00
1,10
0,90
1,00
1,10
1,10
1,10
0,00
0,00
0,00
0,00
0,90
0,90
2,50
2,00
1,60
0,00
0,00
0,00
1,50
1,50
1,10
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,10
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,50
1,50
1,30
2,10
1,50
2,10
0,70
0,00
0,70
1,50
1,10
1,30
1,50
1,30
1,10
0,70
0,00
0,70
1,30
1,30
0,90
2,50
2,00
1,80
0,70
0,00
0,00
1,80
1,50
1,50
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,10
0,00
1,20
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,50
1,50
1,30
2,10
1,50
2,10
0,70
0,70
0,70
1,50
1,50
1,30
2,10
1,30
1,10
0,70
0,00
0,70
1,50
1,30
1,30
2,50
2,00
2,00
0,70
0,00
0,00
2,10
1,50
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