La fluorometra tiene relacin con la medicin de la fluorescencia que emite una

especie que ha absorbido radiacin incidente. La fluorescencia es emitida en

todas direcciones y es de longitud de onda ms larga y de menor energa que la
de la radiacin absorbida.
La refractrometra involucra la medicin del cambio de direccin de la radiacin
incidente conforme pasa del aire a una solucin o slido. La radiacin incidente no
es absorbida; interacta con la especie en solucin en tal forma que solo cambia
de direccin, no de longitud de onda. Si solo tiene lugar la refraccin, puede
decirse que ninguno de los fotones de la radiacin incidente es absorbido;
nicamente experimentan un cambio de direccin.
La medicin de la dispersin de la luz es la medicin de la dispersin de los
fotones de la radiacin incidente por parte de partculas slidas suspendidas en la
solucin. Parte de la radiacin incidente pasa a travs de la solucin, pero la
mayor parte se dispersa en todas direcciones, sin cambio de longitud de onda.
Fluorescencia de molculas y iones
Cambios energticos que tienen lugar durante la flourescencia
En la primera etapa de la fluorescencia, un fotn de radiacin excita a una
molcula o ion; esto se conoce como fotoexcitacin. La emisin de fotones que
sigue a la fotexcitacin suele recibir el nombre de fotoluminiscencia
luminiscencia. La fluorescencia es un tipo de fotoluminiscencia. En un proceso
fosfoluminiscente, como la fluorescencia, la especie que emite siempre alcanza el
estado excitado por absorcin de un fotn.
La radiacin que causa la excitacin en la fluorescencia suele ser la radiacin
ultravioleta (UV), pero en ocasiones se utiliza radiacin visible. La excitacin causa
la promocin del estado basal del ion o molcula al estado excitado.
En general, la energa de la radiacin fluorescente es mucho ms baja que la de la
radiacin causante de la excitacin. Como la longitud de onda es inversamente
proporcional a la energa, la radiacin fluorescente se localiza a longitudes de
onda ms largas que la radiacin excitante. La emisin fluorescente suele ser
visible al ojo, pero tambin puede tener lugar arriba de los 300 nm en el UV. Al
igual que las sustancias en solucin absorben en un intervalo de longitudes de
onda, los iones o molculas fluorescentes en solucin emiten un intervalo de
longitudes de onda. Un espectro de flourescencia puede obtenerse utilizando un
espectrofluormetro tal como un espectro de absorcin se obtiene empleando un
espectrofotmetro.

Los compuestos que fluorescen son generalmente sustancias orgnicas con uno o
ms grupos funcionales aromticos, heterociclos y estructuras altamente
conjugadas que presentan transiciones. La intensidad de la fluorescencia es
proporcional es proporcional a la radiacin absorbida por las molculas.
Factores que afectan la fluorescencia

Estructura.- La estructura de la molcula, generalmente las especies

fluorescentes tienen grupos funcionales aromticos ( * ---> ). La rigidez
estructural favorece la fluorescencia.
Concentracin.- La concentracin, si la absorbancia de la disolucin es
pequea (A < 0.05) existe una relacin lineal entre la fluorescencia y la
concentracin.
Temperatura.- La fluorescencia disminuye si aumenta la temperatura ya que
aumenta el nmero de choques y se pierde energa sin emisin de
radiacin.
Disolvente.- Los disolventes viscosos favorecen la fluorescencia al disminuir
la probabilidad de colisiones y la prdida de energa por los mismos.
Disolventes polares favorecen la energa de transicin ---> *
aumentando la fluorescencia. La presencia de tomos pesados disminuye
la fluorescencia porque favorece el cruce de sistemas y la formacin de
estados tripletes excitados (fosforescencia).
p H de la disolucin.- La fluorescencia de molculas con grupos funcionales
cidos o bsicos es afectada por el p H.
Oxgeno Disuelto.- Debido a que las propiedades paramagnticas del
oxgeno favorecen el cruce de sistemas (produccin de tripletes) su
presencia disminuye la fluorescencia.

Instrumentacin de Fluorescencia
Los dos tipos de instrumentos de fluorescencia son el fluormetro de filtro y el
espectrofluormetro. La principal diferencia entre ellos es que en el primero se
emplean filtros monocromadores y en el ltimo se utilizan rejillas para el mismo
fin.
Los monocromadores muestran caractersticas pticas de un filtro tpico que
tambin puede emplearse en un fluormetro de filtro.
El diseo bsico de ambos instrumentos es semejante y sus cuatro
componentes esenciales se muestran en la siguiente figura. La fuente es una
de las diversas lmparas de arco de mercurio o bien una lmpara de arco de

xenn; la ultima se emplea en el espectrofluormetro. La radiacin de la fuente

pasa a travs de una rejilla de excitacin o filtro primario, cualquiera de los
cuales solo permite el paso de cierto intervalo de longitud de onda para excitar
a la muestra. Conforme la radiacin es absorbida por una sustancia en la celda
de muestra, emite fluorescencia en todas direcciones.
La fluorescencia emitida perpendicularmente respecto de la radiacin excitante
pasa a travs de una rejilla de fluorescencia o filtro secundario, cualquiera de
los cuales solo transmite cierto intervalo de longitud de onda. La fluorescencia
transmitida se mide mediante un detector y la informacin de salida del
detector se registra o se revela en un medidor.

Mediciones con el fluormetro de filtro

Los fluormetros de filtro se utilizan fundamentalmente en anlisis cuantitativo;
debido a que su manejo es sencillo, son adecuados para trabajo de rutina. La
fuente es una lmpara de mercurio, ya sea una lmpara de 85 watts de presin
media (366, 405, 436 nm) o una lmpara de 4 watts de baja presin. La ltima
puede ser del tipo de bombilla transparente de cuarzo para la emisin de la lnea
de mercurio de 254 nm, o la del tipo recubierto de fsforo blanco para la emisin
de una banda de radiacin de 300 400 nm. En consecuencia, el fluormetro
queda restringido a las longitudes de onda anteriores para la excitacin.

La radiacin de excitacin se selecciona mediante un filtro primario. La anchura de

banda amplia y la mayor transmitencia de este filtro es una de las ventajas de un
fluormetro de filtro sobre un espectrofluormetro.
La fluorescencia es emitida en todas direcciones, pero solo se mide aquella que se
emite perpendicularmente a la radiacin de excitacin. Con esto se reduce al
mnimo la dispersin de la radiacin de excitacin a travs de la abertura y del
filtro secundario en su viaje hacia el detector. Como sta no puede eliminarse, el
filtro secundario se selecciona de manera que transmita a longitudes de onda mas
largas que la radiacin de excitacin. Con esto el filtro secundario absorbe toda la
radiacin de excitacin dispersada.
Mediciones espectrofluoromtricas
Un espectrofluormetro tiene bsicamente el mismo tipo de diseo que un
fluormetro de filtro, solo se mencionaran las diferencias. La fuente es una
lmpara de arco de xenn; sta emite en forma continua desde 200 nm hasta ms
all de 600 nm.
Tanto la radiacin de excitacin como la fluorescencia emitida se seleccionan
mediante rejillas. Por lo general, la anchura de banda de la rejilla es pequea y
constante de 10 nm.