ESPECTROSCOPA LUMINISCENTE:

Existen tres tipos de mtodos pticos relacionados entre s llamados:

fluorescencia y fosforescencia molecular y quimioluminiscencia. En todos ellos,
las molculas de analto se excitan para dar una especie cuyo espectro de
emisin suministra informacin para el anlisis cualitativo y cuantitativo
Los mtodos se conocen colectivamente como procedimientos luminiscentes
moleculares.
La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitacin se consigue
mediante la absorcin de fotones. Como consecuencia, con frecuencia se alude a
los dos fenmenos con el trmino ms general de fotoluminiscencia.
La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las transiciones
electrnicas responsables de la fluorescencia no conllevan un cambio en el espn
del electrn. Como consecuencia, la fluorescencia presenta una vida corta
cesando la luminiscencia casi inmediatamente (10-5S).

Por el contrario, las emisiones de fosforescencia estn acompaadas por un

cambio en el espn del electrn, que hace que la radiacin se mantenga durante
un tiempo fcilmente detectable, despus de haber acabado la irradiacin a
menudo varios segundos despus o ms. En la mayora de los casos, la emisin
fotoluminiscente, tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia, es de
mayor longitud de onda que la radiacin utilizada para su excitacin.
Uno de los aspectos ms atractivos de la luminiscencia es su inherente
sensibilidad, con lmites de deteccin que suelen ser de uno a tres rdenes de
magnitud inferiores a los encontrados en la espectroscopia de absorcin. Los
lmites de deteccin caractersticas son del orden de partes por billn.
Debido a su alta sensibilidad, los mtodos luminiscencia cuantitativos suelen
sufrir serios efectos de interferencia procedentes de la matriz de la muestra.
Por esta razn las medidas luminiscentes se suelen combinar con las
extraordinarias tcnicas de cromatografa y electroforesis.
En general los mtodos luminiscentes se aplican menos que los mtodos de
absorcin en los analitos cuantitativos debido a que el nmero de especies que
absorben radiacin ultravioleta / visible es mucho mayor que el de especies que
presentan fotoluminiscencia tras la absorcin de radiacin en esta regin del
espectro.

Teora de la Fluorescencia y de la Fosforescencia

La fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, lquidos y slidos, tanto
sencillos como complejos.
El tipo ms sencillo de fluorescencia es el que presentan los vapores atmicos
diluidos. Por ejemplo:
Los electrones 3s de los tomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al
estado 3p mediante la absorcin de radiacin de longitudes de onda de 5 896 a
5 890 .
Despus de 10-8 a 10-5 s, los electrones vuelven al estado fundamental emitiendo
radiacin de estas mismas longitudes de onda en todas las direcciones.
Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiacin absorbida es reemitida sin
cambio de frecuencia, se conoce como radiacin de resonancia o fluorescencia
de resonancia.

Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia

Para diferenciar entre los fenmenos de fotoluminiscencia se requiere una
revisin del spn del electrn y de los estados excitados singulete / triplete.
- Espn del electrn:
El principio de exclusin de Pauli establece que en un tomo no puede haber
dos electrones con los cuatro nmeros cunticos iguales. Esta restriccin
requiere que no haya ms de dos electrones en un orbital, y adems, los dos
deben tener los estados de espn opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que
los espines estn apareados. Debido al apareamiento de espines, la mayora
de las molculas no presentan un campo magntico neto y se dice, por tanto,
que son diamagnticas, es decir, no son atradas ni repelidas por campos
magnticos permanentes.
Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desapareados,
tienen un momento magntico y, consecuentemente, son atrados cuando se
encuentran en un campo magntico; por ello, se dice que los radicales libres
son paramagnticos

- Estados excitados singulete/triplete

Un estado electrnico molecular en el cual todos los espines de los electrones
estn apareados se llama singulete y cuando la molcula se expone a un
campo magntico no se produce un desdoblamiento de niveles de energa.
Por otro lado, el estado fundamental para un radical libre, es un estado
doblete, porque el electrn impar puede tomar dos orientaciones en un
campo magntico, lo que comunica ligeras diferencias de energa al sistema.
Cuando uno de los electrones de una molcula es excitado a un nivel de
energa superior, se forma un estado singulete o triplete. En el estado
singulete excitado, el espn del electrn promocionado continua apareado con
el electrn del estado fundamental; sin embargo, en el estado triplete los
espiones de los dos electrones se han desapareado y, por tanto, estn
paralelos. Estos estados pueden representarse como sigue, donde las flechas
representan la direccin del espn.

Velocidades de absorcin y de emisin

La velocidad a la cual se absorbe un fotn de radiacin es enorme, el
proceso requiere del orden de 10-15 a 10-14 s. Por otro lado, la emisin
fluorescente, tiene lugar a una velocidad significativamente ms lenta. El
tiempo de vida del estado excitado se relaciona inversamente con la
absortividad molar del pico de absorcin correspondiente al proceso de
excitacin. Por tanto, para absortividades molares comprendidas entre 103
y 105, los tiempos de vida del estado excitado son de 10-9 a 10-7s. Para
sistemas dbilmente absorbentes, donde la probabilidad del proceso de
transicin es ms pequea, los tiempos de vida pueden ser tan largos como
de 10-6 a 10-5 s. Como se ha sealado, la velocidad promedio de una
transicin triplete a singulete es menor que la correspondiente transicin
singulete a singulete. Por ello, la emisin fosforescente requiere tiempos
comprendidos entre 10-4 y 10s o superiores

Una molcula excitada puede volver a su

estado fundamental mediante una
combinacin de varias etapas mecansticas.
Como muestran las flechas verticales
rectas de la Figura, dos de estas etapas,
fluorescencia y fosforescencia, conllevan la
emisin de un fotn de radiacin. Las otras
etapas de desactivacin, indicadas por
flechas onduladas, son procesos no
radiantes. El camino ms propicio hacia el
estado fundamental es aquel que minimiza
el tiempo de vida del estado excitado. Por
ello, si la desactivacin por fluorescencia es
ms rpida que los procesos no radiantes,
se observa tal emisin.
Por otro lado, si la desactivacin no
radiante tiene una constante de velocidad
ms favorable, la fluorescencia desaparece
o es menos intensa

La fotoluminiscencia est limitada a un nmero relativamente pequeo

de sistemas que incorporan caractersticas estructurales y ambientales
que hacen que la velocidad de los procesos de relajacin desactivacin
no radiantes se ralenticen hasta el punto en el que la reaccin de
emisin puede competir cinticamente con ellos. La informacin
referente a los procesos de emisin es suficientemente completa para
permitir un clculo cuantitativo de estas velocidades. Sin embargo, la
comprensin de los otros caminos de desactivacin es, en el mejor de
los casos, rudimentaria; para estos procesos, slo se pueden realizar
afirmaciones o especulaciones cualitativas sobre las velocidades y los
mecanismos.

Fosforescencia
La desactivacin del estado electrnico excitado tambin puede incluir la
fosforescencia. Despus del cruce entre sistemas a un estado triplete
excitado, la desactivacin posterior puede tener lugar por conversin
interna o externa o por fosforescencia.
Una transicin triplete
singulete es mucho menos probable que una
conversin singulete/singulete; como se ha dicho, el tiempo de vida medio
de un estado triplete excitado respecto a la emisin oscila entre 10-4 y 10 s
o ms. Por tanto, la emisin causada por una transicin de este tipo puede
persistir durante algn tiempo despus que la irradiacin se haya
interrumpido.
Las conversiones externas e internas compiten con tanto xito con la
fosforescencia que este tipo de emisin se observa normalmente slo a
bajas temperaturas, en medios altamente viscosos o por molculas que
estn adsorbidas sobre superficies slidas.

Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescencia

Tanto la estructura molecular como el entorno qumico van a influir en que
una sustancia sea o no luminiscente; estos factores tambin determinan la
intensidad de emisin cuando tiene lugar la fotoluminiscencia.
En este apartado se consideran brevemente los efectos de algunas de estas
variables.

Rendimiento cuntico
El rendimiento cuntico, o la eficacia cuntica, de fluorescencia de
fosforescencia es simplemente la relacin entre el nmero de molculas
que emiten luminiscencia respecto al nmero total de molculas excitadas.
Para molculas altamente fluorescentes como la fluorescena, la eficacia
cuntica, bajo determinadas condiciones, se aproxima a la unidad. Las
especies qumicas que no presentan una fluorescencia apreciable tienen
eficacias que se aproximan a cero.

INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA

FLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORESCENCIA
Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la
fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotmetros o
espectrofotmetros ultravioleta/visible. La siguiente grfica muestra una
configuracin caracterstica de estos componentes en los fluormetros y los
espectrofluormetros. Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan
pticas de doble haz tal como se muestra, para compensar las fluctuaciones en
la potencia de la fuente.

Filtro o Monocromador
de excitacin

Radiacin dispersada
Muestra

Fuente

Filtro o Monocromador
de emisin

Atenuado
rdel haz

Fotomultiplicador
de la muestra

Fotomultiplicador de
referencia

Amplificador
diferencial

Dispositivo de lectura

El haz de la muestra pasa primero a travs de un filtro o un monocromador de

excitacin, que transmite la radiacin que provocar la fluorescencia pero
excluye o limita la radiacin de la longitud de onda de la emisin fluorescente.
La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones pero lo
ms conveniente es observar la que forma un ngulo recto con el haz de
excitacin; a otros ngulos, la dispersin producida en la disolucin y en las
paredes de las cubetas aumenta y se pueden cometer grandes errores en la
medida de la intensidad. La radiacin emitida llega a un fotodetector despus
de haber pasado por un segundo filtro o monocromador que asla la
fluorescencia para su medida.
El haz de referencia pasa a travs de un atenuador que reduce su potencia a
aproximadamente la de la radiacin fluorescente (normalmente la potencia se
reduce en un factor de 100 o ms. Las seales procedentes del
fotomultiplicador de la muestra y del de referencia se dirigen a un amplificador
diferencial cuya salida se visualiza en un medidor o en un registro. Algunos
instrumentos de fluorescencia son de tipo nulo; esta condicin se consigue con
atenuadores pticos o elctricos. Los instrumentos ms modernos utilizan un
circuito divisor analgico o un sistema de adquisicin de datos digital seguido
de tratamiento de los datos para obtener la relacin entre la intensidad de la
emisin fluorescente y la intensidad de la fuente de radiacin.

Espectrometra de luminiscencia molecular

Componentes de los fluormetros y de los espectrofluormetros

- Fuentes
En la mayora de las aplicaciones se necesitan fuentes ms intensa
que las lmparas de wolframio o hidrgeno utilizadas en las medidas
de absorcin.
De hecho, la magnitud de la seal de salida y, por tanto, la sensibilidad,
es directamente proporcional a la potencia de la fuente Po
- Lmparas
La lmpara ms comn para los fluormetros de filtro es la lmpara de
arco de mercurio a baja presin equipada con una ventana de slice
fundida. Esta fuente emite lneas tiles para producir la excitacin
previa a la fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm. Las
lneas individuales se pueden aislar con filtros de interferencia o
absorcin adecuados. Ya que, en la mayora de los compuestos
fluorescentes, la fluorescencia se puede inducir con distintas longitudes
de onda, al menos una de las lneas del mercurio suele resultar
adecuada.

- Lseres
Desde los comienzos de los aos setenta, se utilizan tambin diversos
tipos de lseres como fuentes de excitacin para medidas de
fotoluminiscencia.
Un particular inters tienen los lseres sintonizables de colorante que
utilizan, como sistema de bombeo, un lser de nitrgeno pulsante o un
lser de Nd:YAG.
La mayora de los espectrofluormetros comerciales utilizan lmparas
(ya descritas) como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas
de uso. Sin embargo, las fuentes de lser ofrecen importantes ventajas
en determinados casos: por ejemplo, (1) cuando las muestras son muy
pequeas como en cromatografa con microcolumnas y en electroforesis
capilar donde la cantidad de muestra es de un microlitro o menor; (2) en
los sensores de control remoto, como en la deteccin fluorimtrica de
radicales hidroxilo en la atmsfera de clorofila en seres vivos acuticos,
donde la naturaleza colimada de los haces de lseres vital: o (3) cuando
se requiere una radiacin de excitacin altamente monocromtica para
minimizar los efecto de las interferencias fluorescentes.

- Filtros y monocromadores
Tanto los filtros de interferencia como los de absorcin se han utilizado
en los fluormetros para la seleccin de la longitud de onda del haz de
excitacin y de la radiacin fluorescente resultante, mayora de los
espectrofluormetros estn equipados con al menos uno y a veces dos
monocromadores de red.
- Detectores
La seal de fluorescencia tpica es de baja intensidad, por ello, para su
medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos
fotomultiplicadores son los detectores ms utilizados en instrumentos
de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento
de fotones para mejorar la relacin seal/ruido. Tambin se utiliza, a
veces, la refrigeracin de los detectores para mejorar la relacin
seal/ruido. Tambin se han propuesto, para los espectrofluormetros,
los detectores de diodos en serie y de transferencia de carga. Este tipo
de detectores permite el registro rpido de los espectros de excitacin y
de emisin y particularmente son tiles en cromatografa y en
electroforesis

APLICACIONES Y MTODOS FOTOLUMINISCENTES

Es inherente a los mtodos fluorescentes y fosforescentes el ser aplicables a
intervalos de concentracin ms bajos que las medidas espectrofotomtricas
de absorcin y se encuentran entre las tcnicas analticas ms sensibles de las
que puedan disponer los cientficos. El aumento de sensibilidad surge del
hecho de que el parmetro relacionado con la concentracin en fluorimetra y
en fosforimetra F se puede medir independientemente de la potencia de la
fuente Po. Por el contrario, una medida de absorbancia requiere la evaluacin
de Po y de P, ya que la absorbancia, que es proporcional a la concentracin,
depende de la relacin entre estas dos cantidades. La sensibilidad de un
mtodo fluorimtrico puede mejorarse aumentando Po o mediante la
amplificacin adicional de la seal de fluorescencia. Por el contrario, en
espectrofotometra, un aumento en Po da lugar a un cambio proporcional en P
y, por ello, no afecta a la A. Por tanto, los mtodos fluorimtricos tienen,
generalmente, sensibilidades que son de uno a tres rdenes de magnitud
superiores a los correspondientes de absorcin. Por otro lado, la precisin y la
exactitud de los mtodos fotoluminiscentes son habitualmente ms pobres que
las de los procedimientos espectrofotomtricos en un factor entre, quizs, dos
y cinco. Generalmente, los mtodos fosforescentes son menos precisos que sus
correspondientes mtodos fluorescentes.

Determinacin fluorimtrica de especies inorgnicas

Los mtodos inorgnicos fluorimtricos son de dos tipos. Los mtodos directos
que conllevan la formacin de un quelato fluorescente y la medida de su
emisin. Un segundo grupo, que se basa en el descenso de la fluorescencia que
resulta de la accin amortiguadora de la sustancia que va a ser determinada.
La ltima tcnica se ha utilizado ms en la determinacin de aniones.
Reactivos fluorimtricos
Los reactivos fluorimtricos de ms xito en el anlisis de cationes son los que
presentan estructuras aromticas con dos o ms grupos funcionales dadores que
permitan la formacin de quelatos con el ion metlico. A continuacin se
muestran
Determinacin fluorimtrica de especies orgnicas
El nmero de aplicaciones del anlisis fluorimtrico a especies orgnicas y
bioqumicas es impresionante.
Por ejemplo, Weissler y White han recopilado los mtodos para la
determinacin de ms de 200 sustancias, incluyendo una amplia variedad de
compuestos orgnicos, enzimas y coenzimas, agentes medicinales, productos
naturales, esteroides y vitaminas. Es incuestionable que las aplicaciones ms
importantes de la fluorimetra se encuentran en el campo del anlisis de
productos alimentarios, farmacuticos, muestras clnicas y productos naturales.
La sensibilidad y la selectividad del mtodo hacen que sea una herramienta
particularmente valiosa en estos campos.

BIBLIOGRAFA
Principio de Anlisis Instrumental. SKOOG, HOLLER y NIEMAN
Quinta Edicin. Mc Graw Hill.
Anlisis Instrumental. KENNETH A. RUBINSON y JUDITH F. RUBINSON
Prentice Hall. Madrid 2001.