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FUNDAMENTOS DE LA ESPECTROSCOPIA DE

REFLECTANCIA EN EL INFRAROJO CERCANO (NIRS)


COMO MTODO DE ANLISIS DE FORRAJES 1
Daniel Alomar y Rita Fuchslocher
Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias Agrarias
Instituto de Produccin Animal
Casilla 567. Valdivia. Chile.
NIRS
Desde la dcada del setenta se perfila a nivel mundial la espectroscopia de reflectancia cercana al
infrarrojo (NIRS), como una tcnica alternativa a los mtodos qumicos y qumico-biolgicos
tradicionales, con muy buen potencial para obtener estimaciones seguras y muy rpidas de la
composicin qumica nutricional de forrajes (Givens, 1993; De la Roza, 1993), as como de otros
productos de muy diversa ndole. Esta es una tcnica no destructiva, rpida, de gran precisin y
exactitud, siempre que se sigan los procedimientos adecuados para generar las ecuaciones de
prediccin requeridas (Marten et al., 1989; Murray, 1993; Garrido et al, 1993). En los ltimos aos
se han desarrollado numerosas aplicaciones para evaluar composicin, monitorear procesamiento
y certificar calidad de alimentos, tanto para animales, como para la poblacin humana y todo hace
suponer que las aplicaciones aumentarn (Givens et al 1997).
Bases fsicas. Cuando la luz incide sobre una muestra (Li), una piule de los fotones puede
transmitirse a travs de la muestra (Lt) y el resto es reflejado (Lr), o absorbido (La) por algunos
enlaces covalentes que actan como resortes oscilantes que se acoplan con la frecuencia (cm-1) o
longitud de onda (nm) exacta de la radiacin lumnica (Murray, 1993). Al absorber energa, los
enlaces de las molculas vibran en dos formas fundamentales: se extienden, aumentando la
distancia interatmica a lo largo del eje entre dos tomos (lo que ocurre a frecuencias ms altas o
menor longitud de onda); o se doblan (a frecuencias ms bajas o mayor longitud de onda),
cambiando el ngulo de enlace entre dos tomos (Workman, 1996). Las vibraciones de extensin
pueden ser simtricas o asimtricas y aquellas que producen pliegues, los pueden ocasionar
dentro del plano, como movimiento de tijera y oscilaciones; o fuera de ste, en forma de coleteos y
torcedoras (Shenk y Westerhaus, 1995). La vibracin resultante se disipa, provocando un mero
calentamiento de la muestra. La absorcin es selectiva y depende de los grupos moleculares
involucrados. As, la absorcin de luz se estima por diferencia entre la luz incidente y la reflejada o
transmitida. Cuando se trabaja en el modo de reflexin, se utiliza una muestra lo suficientemente
opaca para que la transmisin (Lt) sea igual a cero, calculndose la absorcin de luz por diferencia:
La = Li - Lr, (Murray, 1993).
En el modo de transmisin, se define absorbancia (A), como log 1/T, en tanto que en el modo de
reflexin, A corresponde al log 1/R. Se asume que ambos casos obedecen a la ley de BeerLambert, que establece que la absorbancia a cualquier longitud de onda, es proporcional al nmero
o concentracin de molculas absorbentes presentes en el camino recorrido por la radiacin
(Murray, 1993).
En trminos ms rigurosos, la energa total reflejada por una muestra, es la suma de la reflexin
especular (superficial o en forma de espejo) ms la reflexin difusa, que es aquella temporalmente
absorbida y luego re-emitida por la muestra (Figura 1). Slo esta ltima forma (reflexin difusa)
entrega informacin til acerca de la naturaleza o composicin de la muestra (Davies y Grant,
1987), lo que pone de manifiesto el problema de dispersin de luz, que afecta a la reflexin difusa y
que depende del tamao de partcula de la muestra. Esto complica el anlisis NIRS, especialmente
en reflexin, en que no se controla el camino recorrido por la luz debido a la dispersin y hace
indispensable el uso de un computador (Murray, 1993).

Figura 1. Interaccin de la luz con la materia.


Las bandas de absorcin en la regin NIR del espectro electromagntico (700-2.500 nm), estn
relacionados a las de la regin infrarroja (2.500-25.000 nm), donde se producen las bandas de
absorcin fundamentales por la vibracin de los tomos en las molculas constituyentes. Las
bandas de absorcin en NIR corresponden a "ecos" o "rebotes" de esas absorciones
fundamentales, consistentes en sobretonos armnicos de las bandas fundamentales de absorcin
y sus combinaciones, aproximadamente a un medio o un tercio de la longitud de onda en que ellas
ocurren (Coleman y Murray, 1993; Davies y Grant, 1987; Barton, 1989). Esto determina que para
una muestra de naturaleza qumica heterognea, o con numerosos componentes qumicos, como
sera un forraje, el espectro obtenido en la regin NIR, ser una compleja combinacin de bandas
o picos de absorcin parciales sobrepuestos o muy cercanos, que suelen confundirse en una lnea
suavizada en que se encuentran picos, valles y curvaturas en forma de hombros y que slo cobran
sentido cuando dicha informacin se puede interpretar con la ayuda de un computador.
En su aplicacin al anlisis de forrajes y otros compuestos, la tcnica se basa entonces en que el
espectro lumnico cercano al infrarrojo puede proporcionar informacin acerca de los principales
elementos estructurales asociados a los organismos vivos, ya que los grupos funcionales que
responden a la radiacin en este espectro son C-H, O-H, N-H y probablemente S-H y C=O (Davies
y Grant, 1987; Shenk y Westerhaus, 1993). As, los principales componentes del tejido vegetal, que
consisten en combinaciones muy diversas de los grupos citados, tienen por lo mismo, propiedades
de absorcin en esta piule del espectro, es decir, entre los 800 y 2500 nm (Barton, 1989), que
pueden usarse para diferenciar un componente de otro (Norris, 1989). En el Cuadro 1, se
presentan las bandas de absorcin de los principales componentes orgnicos en los alimentos y
los enlaces tentativos que los representan.
Cuadro 1. Bandas de absorcin de enlaces qumicos en la regin NIRS.
Longitud de onda (nm)
1200
1440
1730
1780
1940
1980
2080
2180
2320
2350
(Davies y Grant, 1987).

Constituyentes
Lpidos
Agua y Carbohidratos
Lpidos
Lpidos
Agua
Protenas
Carbohidratos
Protenas
Lpidos
Lpidos

Enlace asignado
C-H
O-H
C-H
C-H
O-H
N-H
O-H
C=O,N-H
C-H
C-H

Una ventaja de trabajar en la regin NIR del espectro, consiste en que al utilizar longitudes de onda
menores (en relacin al infrarrojo medio, o MIR), la penetracin de la radiacin es mayor, debido a
que el grado de absorcin es ms dbil con cada armnico sucesivo, en comparacin con la banda
de absorcin fundamental en el sector MIR. Esto determina que es posible analizar por reflectancia
una muestra slida de mayor grosor, obteniendo informacin ms representativa y al mismo
tiempo/es posible trabajar en modo transmisin (o transmitancia) en muestras hmedas
heterogneas bastante ms gruesas y con ms facilidad de manejo que en la regin MIR (Murray,
1993).
Avances. Desde las primeras incursiones en el uso de esta tcnica en la valoracin de forrajes, en
que se lleg a predecir la composicin, digestibilidad y hasta el consumo voluntario potencial de los
animales (Norris et al, 1976), el avance ha sido tal, que al comparar diversas tcnicas de
laboratorio de uso comn para predecir la digestibilidad de ms de 150 ensilajes evaluados in vivo,
en Gran Bretaa, Barber et al., (1990) concluyeron que NIRS es la mejor tcnica disponible en la
actualidad en trminos de precisin y exactitud, siempre que se cuente con calibraciones
apropiadas.
Los principales adelantos que explican el xito de esta tcnica, estn en las reas de diseo de los
equipos (filtros fijos, filtros incunables y monocromadores) y del software desarrollado e
incorporado por las compaas especializadas, el que, junto a la posibilidad de contar hoy con
computadores personales de alto poder, permite utilizar la informacin espectral y qumica, para
generar, evaluar y aplicar, mejores ecuaciones de calibracin. De este modo, los programas
disponibles pueden seleccionar segn su espectro a las muestras ms apropiadas para el
desarrollo de una calibracin y pueden tambin identificar en la fase de calibracin y en la posterior
de anlisis de rutina, a aquellas muestras que, por sus caractersticas espectrales, no
corresponden al mismo tipo de producto, marcndolas como muestras extraas, aberrantes o
"outliers" (Garrido et al., 1993). La ventaja de esto ltimo es que permite ya sea descartar la
muestra por pertenecer a otro tipo de sustancia, o incorporarla a la calibracin enriqueciendo su
cobertura y mejorando su valor predictivo.
Instrumentos de filtros fijos o de interferencia.
Se basan en el uso de filtros especiales que al ser iluminados por la fuente emisora, slo dejan
pasar una longitud de onda. Al disponer de varios filtros que al desplazarse se interpongan en el
camino seguido por la radiacin, se pueden generar distintas longitudes de onda para irradiar la
muestra (Figura 2).

Figura 2. Diseo de un equipo NIRS de filtros fijos.

Estos equipos de filtros de interferencia, llevan entre 6 y 20 filtros montados en un dispositivo


(rueda o trrela) que permite cambiar fcilmente la posicin y generar una longitud de onda
especfica. Son equipos tiles para anlisis de rutina de sustancias poco complejas. Uno de los
primeros equipos de este tipo que se comercializ, corresponde a un analizador de granos, dotado
de 6 filtros, para la medicin de agua (1940 nm), carbohidratos ( 2100 nm), protena (2180 nm) y
aceite (2310 nm). Adems se incluan dos filtros con mnima absorcin para esos constituyentes
(1680 y 2230 nm), los que servan como referencia (Norris, 1989).
Instrumentos de filtros incunables. Estos poseen varios filtros, tpicamente 3 en los ms simples
y hasta 7 en los ms complejos, los que se montan en un eje que al girar provoca una inclinacin
del filtro, cambiando el ngulo de la luz incidente sobre l, lo que cambia la longitud de onda que
pasa a travs (Figura 3). Con esto se pueden obtener muchas longitudes de onda, considerando al
conjunto de filtros (Clark et al, 1991).

Figura 3. Diseo de un equipo NIRS de filtros incunables.


Los instrumentos de filtros incunables se pueden usar igual que los de filtros fijos, para generar
longitudes de onda fijas, o como espectrofotmetros de barrido, con un rango limitado de
longitudes de onda (Norris, 1989). Davies y Grant (1987) citan como ejemplo un equipo de filtros
incunables con 7 filtros, que puede generar un rango de barrido continuo entre 1380 y 2380 nm.
Monocromadores de barrido. Utilizan el mismo concepto del modelo de filtros incunables, sin
embargo, en lugar de usar filtros, utilizan una especie de prisma (red de difraccin) que provoca
dispersin de la luz, generando diferentes longitudes de onda (Clark et al., 1991). Uno de los
modelos ms avanzados que se encuentra hoy en da, permite irradiar las muestras en el rango de
400 a2.500 nm, es decir, desde el espectro visible, hasta el final del NIR (ISI, 1992). Estos equipos,
por su versatilidad, permiten amplias perspectivas de desarrollo de nuevas aplicaciones, siendo la
alternativa ms apropiada para centros de investigacin. Son tambin los ms costosos y eso
indudablemente constituye una seria limitacin, ya que su costo normalmente excede el lmite que
financian algunas agencias de apoyo a la investigacin.
Con respecto a las marcas de equipos disponibles en el mercado, existen diversas marcas y
compaas fabricantes de equipos NIRS, aunque a travs de los aos varias han cambiado de
nombre y propiedad, concentrndose sta en pocas compaas. Entre las marcas ms conocidas
estn NIRSystems (ex Pacific Scientific, USA), Tecator (Suecia), Bran+Luebbe (ex Technicon,

Alemania) y Perten (Suecia). Las dos primeras son fabricadas por la compaa Perstorp Analytical,
originalmente del grupo Perstorp de Suecia, pero que ha sido adquirida por Foss Electric, de
Dinamarca. El boletn NIRnews de abril de 1997, publicado por The International Cominee for Near
Infrared Spectroscopy, con sede in Inglaterra, informa de una docena de compaas que estn
ofreciendo nuevos productos en la lnea NIRS, incluyendo espectroscopios y accesorios para la
presentacin y el manejo de muestras, con ocasin de la conferencia internacional de EEUU sobre
qumica analtica y espectroscopia aplicada (PittCon-97).
Coleccin de los espectros. Existen diferentes estrategias de diseo para colectar los espectros
o presentar las muestras al respectivo instrumento. Algunos equipos disponen de una cavidad
donde se introduce la muestra, la que se presiona contra una ventana de vidrio o cuarzo (Davies y
Grant, 1987). Otros disponen de celdas o cubetas removibles que se insertan con la muestra en su
interior. Los primeros equipos disponan de pequeas celdas que se lean en posicin fija, lo que
limitaba la superficie de barrido y arrojaba un grado importante de error, especialmente en
muestras heterogneas, como son los forrajes (Abrams et al., 1988). Hoy se dispone de accesorios
ms apropiados para evaluar este tipo de producto, incluso al estado fresco, con mayor superficie
de barrido, reduciendo el error de valoracin espectral (Murray, 1993). El elevado costo de stos y
otros componentes, sin embargo, contina siendo un obstculo para su uso masivo.
Entre las opciones disponibles, hay celdas con una ventana de cuarzo, apropiadas para muestras
secas y relativamente homogneas; cubetas rectangulares de mayor superficie, para muestras
fibrosas (forrajes) y ms heterogneas (forrajes, carnes). Tambin se dispone de cubetas de
cuarzo con doble ventana, para muestras lquidas, o pastosas, para trabajar en el modo de
transmisin. Estas celdas o cubetas se insertan en un mdulo especfico que, adosado al
instrumento, permite irradiar la muestra dentro de su celda, la que, segn el diseo del
instrumento, puede estar fija, girar, o desplazarse en forma rectilnea, para aumentar la superficie
de barrido y permitir as un mayor nmero de lecturas por muestra, las que se promedian. Existen
tambin accesorios que permiten tomar lecturas espectrales por medio de sondas provistas de
fibra ptica, apropiadas para trabajar en reflectancia o transmitancia, que pueden ser utilizados en
diferentes aplicaciones. Los espectros de muestras slidas se colectan por reflectancia, en tanto
que los de muestras lquidas, por transmitancia. Los ensilajes al estado fresco, se pueden leer por
reflectancia, si se pone una capa lo suficientemente gruesa en una cubeta apropiada, que no
permita que la luz la atraviese totalmente (Murray, 1993).
Una vez que se irradia la muestra, la luz difusa reflejada (R) por la muestra, es registrada por
detectores, normalmente de sulfuro de plomo, amplificada, digitalizada, transformada en log 1/R y
comunicada a un computador para su almacenamiento o procesamiento. En forma pareada a la
seal digital de luz reflejada, el computador recibe una seal que representa la longitud de onda
utilizada, de modo que a cada valor de reflectancia almacenado, le corresponde una longitud de
onda, lo que permite el ulterior procesamiento de los datos (Norris, 1989a). El conjunto de valores
a diferentes longitudes de onda para una muestra dada, constituye su espectro, que representa
una suerte de "huella dactilar" de esa muestra. En la Figura 4 se presenta un conjunto de 150
espectros de ensilajes de pradera de la zona sur de Chile (IX y X Regiones) que representan una
amplia cobertura en trminos de calidad nutricional y rasgos espectrales.

Figura 4, Coleccin de 150 espectros de ensilajes de pradera.


Manejo de datos espectrales. Los datos de reflectancia (R), en la forma de log 1/R, se pueden
someter a transformaciones y, aunque los instrumentos basados en filtros slo pueden utilizar la
forma logartmica, hoy es comn la transformacin del espectro obtenido con monocromadores de
barrido, lo que permite reducir el efecto de tamao de partcula de la muestra, destacar rasgos del
espectro y facilitar el anlisis de regresin. La transformacin sirve entonces a dos objetivos
bsicos: Reducir el "ruido" en los datos y aislar o destacar la informacin espectral que se pueda
relacionar con los datos qumicos (Westerhaus, 1989a).
El tratamiento ms comn corresponde al clculo de una primera o segunda diferenciacin o
pseudoderivada (Figura 5) que aunque tambin se denomina derivada, en realidad corresponde a
una diferencia entre segmentos del espectro, que previamente se han suavizado o promediado
(Murray, 1988, Davies y Grant, 1987). Se puede calcular una segunda diferenciacin (u otra de
mayor orden), repitiendo el proceso en un espectro previamente derivalizado y este nivel de
transformacin ha dado buenos resultados en forrajes (Barton, 1989).
Otros tratamientos permiten eliminar "ruido" en los valores espectrales, a travs de suavizacin de
los datos, como es la transformacin de Fourier (Davies y Grant, 1987). Se dispone de software
especfico para stas y otras transformaciones, dependiendo del tipo de instrumento a utilizar. Un
ejemplo de tratamiento de datos sera: 1-10-5. El primer nmero indica el orden de derivacin o
diferenciacin, el segundo es la amplitud o distancia entre los segmentos a sustraer y el tercero la
longitud del segmento (puntos de datos) a ser suavizado (Dardenne et al, 1996). En la Figura 5 se
muestran los mismos 150 ensilajes de la Figura 4, pero sometidos a un tratamiento 1-10-10
(Alomar y Fuchslocher, no publicado). Se aprecia una notable reduccin de variacin de lnea base
entre ensilajes.
No existe una regla fija en cuanto al tratamiento matemtico ms conveniente de los datos, sino
que esto depender de la calidad de la calibracin obtenida, luego de probar diferentes
combinaciones (ISI, 1992). Como ejemplo de esto, Dardenne et al, (1996) en la aplicacin de NIRS
al anlisis de muestras de alfalfa fresca, describen la aplicacin de 60 tratamientos matemticos a
los datos espectrales, previamente a someterlas al anlisis de regresin o desarrollo de la
calibracin propiamente tal. Trabajando con forrajes frescos, estos autores encontraron que el
elevado contenido de agua causa fuertes bandas de absorcin y slo una segunda derivacin con
una gran amplitud (tratamiento: 2,20,5) es eficiente para mejorar el modelo de prediccin.

Figura 5. Espectros de 150 ensilajes de pradera con una primera diferenciacin.


Desarrollo de calibraciones. Para estimar la composicin qumica de una muestra, se requiere
previamente hacer calibraciones, para lo cual se necesita contar con un conjunto amplio de
muestras representativas de una misma poblacin, colectar sus espectros, analizar las muestras
mediante un mtodo de referencia confiable, desarrollar las ecuaciones de calibracin que
relacionen los datos espectrales con los resultados del mtodo de referencia y, finalmente, validar
dichas ecuaciones con otras muestras de la misma poblacin general, pero que no formen parte
del set de calibracin (Gabrielsen et al, 1988; Barber et al., 1990; Garrido et al, 1993).
Segn Murray (1988), el set de muestras seleccionadas para desarrollar una calibracin debe
cumplir ciertas condiciones ideales:
representar un rango amplio de composiciones o calidades;
tener una distribucin uniforme y pareja (no normal) respecto de la poblacin total;
ser tpicas de las que se encuentren en la realidad, y
contarse con datos precisos de su composicin analtica.
Las ecuaciones de calibracin tienden a tener mejor valor predictivo cuando se desarrollan sobre
muestras de naturaleza relativamente homognea o correspondientes a un mismo tipo de producto
(ej., henos de alfalfa). En cambio, cuando se intenta desarrollar calibraciones para poblaciones
ms heterogneas de base ms amplia (ej. pajas, henos y ensilajes de distintas especies
vegetales en conjunto), la precisin y exactitud tienden a disminuir. Un ejemplo lo entrega Reeves
(1994), quien trat de evaluar mediante NIRS, muestras de 18 alimentos diferentes, que incluan
henos de gramneas, leguminosas y mixtos; pajas, corontas de maz, cscaras de man, soya y
arroz. Todo ello, combinado con diferentes tratamientos qumicos. En estas condiciones, el uso de
NIRS no fue satisfactorio, a pesar de que las predicciones mejoraron algo al eliminar muestras
marcadas como extraas o aberrantes por el software respectivo. Por ello, es importante
establecer los lmites apropiados de compromiso entre la amplitud de cobertura y el error de las
predicciones.
Uno de los primeros aspectos que se plantean al desarrollar una calibracin, es el nmero de
muestras que ser necesario incluir para obtener resultados satisfactorios. No existe un nmero
mnimo definido, sino que ste depender de la entidad a predecir y de la naturaleza del producto a
evaluar. Cuando se pretende analizar entidades qumicas simples, de productos relativamente
homogneos, como es el nivel de nitrgeno (para estimar protena bruta) en granos de trigo, puede

bastar con 30 a 40 muestras; en cambio, si se pretende evaluar el contenido de protena en


productos ms heterogneos, o productos con mayores niveles y variedad de protenas, se
requieren ms de 100 muestras (Shenky Westerhaus, 1993). En este sentido, Murray (1993) indica
que es poco probable obtener calibraciones robustas en su uso rutinario para analizar forrajes, si
se cuenta con menos de 100 muestras, excepto cuando se utilizan para predecir componentes
simples como el contenido de humedad y nitrgeno.
Otro aspecto a destacar, es la posibilidad de transferir calibraciones desarrolladas desde un equipo
a otro. Dado que los aparatos presentan variaciones en sus lecturas, provenientes del mecanismo
ptico, fuente emisora de luz, sustancias de referencia interna y en los detectores, es necesario
estandarizarlos para corregir estas desviaciones. Ello es posible a travs del uso de software
especializado (Shenk y Westerhaus, 1991). Aun-que esto abre interesantes posibilidades, se
puede usar una calibracin "importada", siempre que se trate del mismo tipo de muestras, ya que
no se debe extrapolar en NIRS. Adems, obliga a utilizar los mismos mtodos de referencia y la
misma manera de presentar la muestra a la lectura, en la operacin de rutina posterior. Esto puede
constituir una seria limitacin para transferir ecuaciones de un lugar a otro, debido a diferencias
entre laboratorios en la forma de preparar las muestras y conducir los mtodos analticos. Parece
interesante entonces, desarrollar ecuaciones de calibracin de valor local y al mismo tiempo,
estudiar el comportamiento de calibraciones externas.
Clculo de ecuaciones. Al desarrollar una calibracin, se relaciona la informacin espectral con la
informacin de referencia (composicin qumica), definiendo entre otras cosas, el tratamiento
matemtico de los datos, el segmento del espectro a incluir y el mtodo de regresin a emplear.
Existen varias alternativas para modelar la relacin entre los datos espectrales y los datos de
referencia. Para esto se utiliza el anlisis de regresin y entre las tcnicas disponibles estn la
regresin mltiple, regresin mltiple paso a paso, componentes principales y cuadrados mnimos
parciales. En general se encuentran mejores resultados con las ltimas dos tcnicas, en que se
reduce toda la informacin espectral a un grupo ms pequeo de variables independientes
(componentes principales) y al mismo tiempo se controla el riesgo de sobreajuste (ISI, 1992). El
uso de redes neuronales es otra tcnica que se perfila con gran potencial, ya que es capaz de
resolver relaciones no lineales en los datos espectrales, lo que mejora la exactitud (Shenk y
Westerhaus, 1995).
Debe tenerse presente que una buena correlacin entre los datos espectrales y los de referencia,
puede ser el resultado de un sobreajuste de los datos, cuando se cuenta con pocas muestras
(menos de 50) y se incorporan demasiados trminos a la ecuacin. Si eso ocurre, la ecuacin ser
de validez para esos datos o muestras en particular, pero probablemente se comportar
pobremente al probarla en un set de muestras de validacin, en una poblacin abierta (Murray,
1993).
Dentro del software disponible para desarrollar calibraciones, destaca el elaborado por Infrasoft
International, que permite realizar una validacin cruzada con las muestras empleadas en la
calibracin. Este proceso consiste en subdividir el grupo de muestras en varios subgrupos,
separando uno como si fuera un grupo de muestras "externas" para validacin y generando con el
resto una ecuacin de calibracin. Este proceso se repite hasta que todos los grupos de muestras
han sido predichos a partir de los restantes, lo cual permite una mayor confiabilidad en la ecuacin
generada, ya que limita automticamente el nmero de trminos en la ecuacin, evitando el
sobreajuste (ISI, 1.992).
Criterios de seleccin de ecuaciones. Las diferentes opciones de tratamientos matemticos y
tcnicas de regresin permitirn disponer de muchas ecuaciones posibles para cada una de las
variables a predecir. Es necesario entonces seleccionar aquella que se considere ms confiable,
es decir, que tenga un elevado coeficiente de determinacin (R2) y un bajo error estndar de
calibracin (SEC).

El SEC corresponde en general al error estndar de la diferencia (ISI, 1992) y, aunque no tiene una
forma de expresin universalmente empleada, al parecer la ms aceptada (Davies y Grant, 1987;
Murray, 1993; ISI, 1992) es:

Donde:
y = es el valor de referencia (laboratorio).
x = Valor predicho por NIRS.
nc = Nmero de muestras en el set de calibracin.
t = Nmero de trminos en la ecuacin de regresin.
Una vez seleccionada una o ms ecuaciones, deben someterse a prueba con una muestra
independiente de validacin, que no debe formar parte del grupo de calibracin. Como situacin
intermedia, el software de ISI, que incluye la validacin cruzada de las muestras de calibracin,
entrega un error estndar de validacin cruzada. Al predecir un set de muestras externas para
validacin, se calcula tambin un R2 y, con los desvos de los valores predichos respecto de los
valores de referencia, se calcula un error estndar de prediccin, o performance, (SEP) que en
general se acepta como:

Donde:
y, x = igual que en SEC
nv = nmero de muestras en el set de validacin.
El SEP es un indicador confiable de la calidad de la ecuacin desarrollada, ya que a diferencia del
SEC, que mejora (disminuye) a medida que se le agregan nuevos trminos a la ecuacin, el SEP
mejora slo hasta que comienza a producirse un sobreajuste de la ecuacin, aumentando
(empeorando) posteriormente con cada nuevo trmino (Westerhaus, 1989b).
El SEP siempre ser algo mayor que el SEC, pero como criterio general, se puede afirmar que una
ecuacin es considerada como aceptable cuando la magnitud del SEP es menor a un tercio de la
desviacin estndar de los datos de referencia (Kennedy et al, 1996).
Muestras extraas o outliers. En el desarrollo de una ecuacin, una de las primeras fases a
atender, es detectar muestras que se consideren extraas o aberrantes (en ingls referidas como

"outliers"), que no encajan o no corresponden a la calibracin. Para clasificar una muestra como
extraa, se usan dos criterios. Uno es el residual (desvo) entre el valor de prediccin (NIRS) y el
de referencia (laboratorio), para cada muestra. El software disponible calcula un trmino t, que
equivale a la relacin entre el valor residual (desvo) y el SEC para el grupo. El valor t lmite es
definido arbitrariamente, pero frecuentemente se utiliza un valor de 2,5 por defecto (Murray, 1993;
ISI, 1992). El otro criterio estadstico para caracterizar, ahora desde el punto de vista de sus
valores espectrales a una muestra, es el valor H, calculado mediante tcnicas de anlisis
multivariado a travs de componentes principales, y que corresponde a lo que en estadsticas se
conoce como la distancia de Mahalanobis (Murray, 1993). Este valor permite por tanto, discriminar
si una muestra forma o no parte del grupo de calibracin a travs de su distancia al valor espectral
promedio. Dado que cada grupo puede tener diferencias, se usa un valor H estandarizado, al
dividir por el valor espectral promedio del set de calibracin. Frecuentemente se establece un valor
lmite 3,0 y muestras con valor H estandarizado mayores, se consideran aberrantes (ISI, 1992).

Cuadro2. Aplicaciones de NIRS al anlisis de forrajes y estimadores de su eficiencia


predictiva.

R2cal: Coeficiente de determinacin de la calibracin: R2pred: Coeficiente de determinacin para la


validacin; SEC: Error estndar de calibracin; SEP: Error estndar de prediccin (Validacin);
SEValid.Cruz: Error estndar de validacin cruzada; Prom: Promedio datos de referencia desviacin.
Cuando aparecen outliers t, es recomendable repetir el anlisis de referencia y si repetido ste
permanece como muestra discriminada, eliminarse de la calibracin. Si los outliers H representan
muestras que se considera que deben estar en la calibracin, pueden retenerse. Una alternativa es
acumular ms muestras de stas y agregarlas al sel de calibracin para ampliarlo. Si el nuevo
modelo no mejora el ajuste para las muestras aberrantes, stas deberan separarse para intentar
conformar con ellas una calibracin diferente (Shenk y Westerhaus, 1993).

Aplicaciones. Por la diversidad de trabajos encontrados en la literatura especializada. Casi se


podra decir que las aplicaciones limitan con la imaginacin. En el cuadro2 se entrega un listado
parcial de ejemplos de uso de NIRS en valoracin de forrajes.
En algunas experiencias no se han logrado predicciones seguras de ciertas fracciones analticas
(coeficientes de determinacin bajos o variables y trminos de error elevados). Entre ellas se
encuentran fracciones fibrosas (Valds et al., 1985) como la fibra detergente neutro (FDN) y fibra
detergente cido (EDA), (Goering y Van Soest, 1970). Debe tenerse presente sin embargo, que es
probable que los datos espectrales obtenidos en NIRS representen con mayor exactitud la
estructura qumica real de la muestra, que entes determinados por "qumica hmeda" como la fibra
cruda, FDN, EDA, etc., que no corresponden a entidades moleculares definidas (Abrams et al.,
1987) sino ms bien a determinaciones empricas que, por tanto, no permiten definir los reales
grupos qumicos involucrados (Barnes y Marten, 1979).
Los mtodos qumicos utilizados como referencia para desarrollar las calibraciones, estn sujetos a
errores y variaciones que pueden ser mayores que los datos espectrales. Como ejemplo puede
citarse que el contenido de humedad y por consiguiente el contenido de materia seca,
habitualmente se estima mediante secado de las muestras a 105 C. A esa temperatura ocurre
prdida de algunos compuestos, obtenindose ms bien una suerte de "humedad bruta" (Garrido
et al, 1993). Tal es el caso del ensilaje, en que hay prdida de alcoholes y otros compuestos
voltiles. Por otra parte, en la preparacin de la muestra para propsitos analticos, debe tenerse
presente que el calor excesivo en el proceso de secado, puede producir "artefactos" indigestibles.
Por esto, si se desea mantener la integridad estructural y qumica de las muestras, el mtodo ms
recomendable de secado sera el de liofilizacin (Coleman y Windham, 1989) o alternativamente,
analizarlas muestras directamente al estado fresco. Deinum y Maassen (1994) demostraron que
las condiciones de secado (tiempo, temperatura) y manejo previo (congelacin) de muestras,
pueden afectar la determinacin de paredes celulares en varios forrajes, debido a formacin de
productos de Maillard y desnaturalizacin de protenas que pierden solubilidad en detergente
neutro.
Entre las aplicaciones estudiadas para productos agropecuarias diferentes a los forrajes, se puede
citar, aparte de las ya mencionadas, la prediccin del nivel de nitrgeno y protena degradable
ruminal en poroto soya (Tremblay et al., 1996), protena, aceite y humedad en poroto soya intacto
(Takahashi et al., 1996), protena y Usina en granos de higo y cebada (Williams et al., 1984),
calidad cervecera de cebada (Li et al., 1996), contenido de protena y fracciones proteicas de leche
de oveja (Pascual y Molina, 1996), composicin y parmetros de calidad en peces (Solsberg,
1996), propiedades sensoriales en carne bovina (Hildrum et al, 1995), distintas fracciones en la
carne de conejo (Masoero et al., 1994) y calidad del tejido adiposo de jamones de cerdo (Bellati et
al., 1996).
El uso de NIRS se proyecta tambin al anlisis cualitativo, que permite diferenciar sustancias
parecidas, pero con diferentes grupos funcionales, a travs de anlisis discriminante (Downey,
1994). Esto abre un importante campo de aplicacin en el control de calidad a nivel agropecuario e
industrial. Entre las aplicaciones novedosas que se han reportado en esta lnea, est la prediccin
(con un 97% de exactitud) del sexo de larvas vivas de gusanos de seda, as como larvas muertas,
mientras an se encuentran dentro de sus capullos (Jin et al., 1995).
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