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Begriffsdefiniton:

Molekularbiologie beschftigt sich mit der Grundlage des Lebens auf molekularer Ebene
Betrachtung der Funktion, Regulierung und Interaktion verschiedener Biomolekle
Basis der Genetik = Vererbungslehre bildet das Genom ( = Bauplan zur Bildung eines Lebewesens)
- molekulare Grundlagen der Vererbung (Molekulargenetik)
- Verteilung bestimmter genetischer Ausprgungen in unterschiedlichen Populationen
(Populationsgenetik)
- Weitergabe von Information, die nicht in der DNA gespeichert ist, an Tochterzelle (Epigeneik)
Gentechnik = Teilgebiet Biotechnologie, wo biologische Vorgnge technologisch angewendet
werden Erforschung von Methoden, deren Grundlagen Eingriffe in die Erbsubstanz bilden,
Gentechnik = technische Anwendung dieser Methoden
Zellen (Adipozyt, Myozyt, Immunzelle)
Grundeinheiten des Lebens, unterschiedlich in Form und Funktion
Alle Organismen bestehen aus Zellen
bestehen aus Makromoleklen und sind funktionelle Bausteine
Molekle (DNA, Lipid, Protein, ..) = aus Atomen aufgebaut und Zellen aus Moleklen
Gewebe (Muskel, Fett, BG) = geordnete Ansammlung hnlicher Zellen mit koordinierter Funktion
Organe = aus mehreren Geweben, die im Zusammenspiel funktionieren, sie bilden Organsysteme
(Herzkreislaufsystem) wie das Nervensystem
vielzelliger Organismus = wiedererkennbares, in sich geschlossenes Individuum, Komplexe aus Organen
und Organsystemen aufgebaut
Population = Gesamtheit der Individuen einer Art in einem bestimmten Lebensraum

Archae + Bacteria = prokaryotische Zelle


Eukarya = Eukaryotische Zelle
Tier-, Pflanzenzellen
Zellorganellen mit spezif ischen Funktionen (Zellkern (Nucleus), Mitochondrien, ER, Golgi,
Lysosomen, Vakuolen, Chloroplasten)
daneben (nicht mit Membran umhllt): Ribosomen, Centriolen, Cytoskelett, extrazellulre

Matrix
vermutlich aus Prokaryoten entwickelt
Erwachsener aus 1014 Zellen, 50 x 106 sterben pro Sekunde
stndige Neubildung
Verschiedene Lebenszyklen: Darmepithelzelle (1-2 Tage), Leber (8 Monate), Knochen (30 Jahre)

Zellkern (Nucleus)
enthlt DNA
Ort der DNA- Replikation
kleine Molekle diffundieren frei durch die Poren, Proteine z.B. brauchen bestimmte ASsequenz
(Kernlokalisierungssequenz, NLS)
Nucleolus (Zusammenbau der Ribosomen- Untereinheiten aus Proteinen und rRNA)
Kernhlle bildet ein Kontinuum mit dem ER
Kernlamina (Netzwerk aus Proteinfilamenten, das sich unmittelbar an der Innenseiet der Kernhlle
befindet und an diese angeheftet ist) steht in Wechselwirkung mit dem Chromatin und sttzt die
Kernhlle
Kernporen sind von 8 Proteinkomplexen umgeben, Proteinfibrillen auf der Kerninnenseite bilden eine
kfighnliche Struktur
Zellkern ist von Doppelmembran umgeben, typische Strukturen des Kerns = aus Doppelmembran
bestehende Kernhlle, Kernlamina, Kernporen, Nucleolus, manchmal mehrere Nucleoli
Poren = Pforte fr Protein, die aus Cytoplasma in den Kern und fr genetisches Material und
zusammengebaute Ribosomen- Untereinheiten, die aus Zellkern ins Cytoplasma

DNA + Protein = Chromatin besteht aus bestimmter Anzahl an Chromosomen (Mensch 2n = 46,
Maus 2n = 40, Nashorn 2n = 84, Hund 2n = 78)
Bei Zellteilung: Verdichtung des Chromatins, dass Chromosomen sichtbar werden

Endomembransystem aus:
Zwischenraum der Kernhlle
Endoplasmatische Retikulum:
Raues (enthlt Ribosome, Ort der Proteinbiosynthese)
glattes (chemische Modif ikation von Proteinen, Lipid- und Steroidsynthese, Glykogenabbau)
Golgi-Apparat (weitere Modif ikation, Verpacken von Proteinen in Vesikeln, Glykosylierung)
Proteinhaltige Vesikel aus ER befrdern Substanzen zur cis- Seite des Golgi-Apparat, der modif iziert
die Proteine im Lumen chemisch und verschickt sie an die korrekten Adressen
Lysosome
Transportvesikel
Golgi-Apparat und Lysosom
Lysosom in Tierzellen
Zerlegung von Makromoleklen in Monomere
Primres Lysosom (Verdauungsenzyme)
Stoffe oft von auen in die Zelle (Phagosom, Phagozytose)
1a) das primre Lysosom wird vom Golgi-Apparat gebildet
1b) Nahrungspartikel werden durch Phagozytose aufgenommen
2) das primre Lysosom fusioniert mit dem Phagosom
3) durch die Verdauung gebildete kleine Molekle diffundieren in das Cytoplasma

4) unverdautes Material wird freigesetzt


Mitochondrien
Kraftwerke der Zelle
Erzeugung von ATP aus KH und FS unter Verbrauch von O2
Zellatmung (die Cristae enthalten die
Proteinkomplexe zur Bildung von ATP)
Zahl der Mitochondrien varriert
knnen sich unabhngig vom Zellkern teilen
innere Membran bildet Mitochondrienmatrix (enthlt Proteine, aber auch Ribosomen und DNA) =
wichtigste Barriere zwischen Cytoplasma und den mitochondrialen Enyzmen
Chloroplasten
im Vergleich zu Mitochondrien sind sie gro
enthalten ein ausgedehntes Netzwerk aus Thylakoidmembranen, in die Chlorophyll eingelagert wird,
das Lichtenergie sammelt
fr die Synthese von KH aus CO 2 und H2O genutzt
also in chem.
Energie umgewandelt
ATP fr Umwandlung von CO2 und H2O in Glucose, findet im Stroma statt
Plasmamembran
Grenzt die Zelle ab
Kontrolliert Stoffaustausch zwischen Zellinneren und Umwelt
umschliet das Cytoplasma
flssiges Cytosol (H2O, gelste Ionen, kleine Molekle, lsl. Makromolekle)
unlsliche Partikel (z.B. Ribosomen)
Ribosomen
Teils frei im Cytoplasma, teils an die Membran des ER gebunden
aus ribosomaler RNA und Proteinen
Entstehung der Organellen

Cytoskelett
Halt, Reifestigkeit, Form
Fixierung von Zellorganellen in ihrer Position
tritt mit extrazelluren Strukturen in Wechselwirkung
ermglicht: rasche Transportvorgnge in den Zellen, Formvernderung und Fortbewegung,
Kontraktion

Actinfilamente
Zellbewegung

Sttze in den Mikrovilli

Intermedirfilamente
nur in Tierzellen
Mensch: mehr als 50 verschiedene Typen (in 6 versch. Klassen) von Intermedirfilamentproteinen
z.B. - Keratin (Haare, Ngel,...)
Verankerung von Zellstrukturen an ihrem Bestimmungsort
Widerstand gegen Zugspannungen (Desmin in Muskelzellen, Neurofilamente, )
Mikrotubuli
stabiles inneres Skelett in manchen Zellen
Bauen Schienensystem fr Motorproteine auf (Tubulin (alpha, beta), Dimere, Ketten)
Mikrotubuli- Organisationszentrum (MTOC); Centriolen
Spindelapparat
Zellteilung

Extrazellulre Matrix 50% der mensch. Krpermasse


bei Tierzellen
fibrillre Proteine (Kollagen), Proteoglykane
Zusammenhalt der Zellen in Geweben
bestimmt mechanische Eigenschaften (Knochen, Knorpel, Haut,... )
Filtration von Substanzen beim Austausch zwischen Organen (z.B. Niere)
Signalbermittlung von Zelle zu Zelle (Integrine, )
Funktionelle Gruppen bestimmten die Eigenschaften von Biomoleklen (Polaritt bestimmt Raumstruktur
und Wechselwirkung mit anderen Moleklen)

Bildung und Spaltung


Proteine
Enzyme (ermglichen oder beschleunigen Reaktionen)
Abwehrproteine (erkennen und bekmpfen
Fremdstrukturen)
Hormone und regulatorische Proteine (kontrollieren
physiologische Prozesse)
Rezeptorproteine (empfangen molekulare Signale aus
der Umwelt)
Speicherproteine (Depot von AS)
Gerstproteine (Kollagen)
Transportproteine (befrdern Stoffe z.B. Hmoglobin)
Motorproteine (Muskel)
Regulatorische Proteine (steuern zellulre Prozesse
wie Genexpression)
fr AS gibt es 3- und 1- Buchstabencode, die Grundstruktur ist
immer gleich, nur andere Seitenketten
AS mit elektrisch geladener hydrophiler Seitenketten:
Positiv: Arginin (Arg, R), Histidin (His, H), Lysin (Lys, K);
Negativ: Asparaginsure (Asp, D), Glutaminsure (Glu, E)
AS mit polarer, aber ungeladener Seitenketten (hydrophil):
Serin (Ser, S), Threonin (Thr, T), Asparagin (Asn, N), Glutamin
(Gln, Q), Tyrosin (Tyr, Y)
Spezialflle: Cystein (Cys, C), Glycin (Gly, G), Prolin (Pro, P)
AS mit unpolarer, hydrophober Seitenkette: Alanin (Ala, A),
Isoleucin (Iso, I), Leucin (Leu, L), Methionin (Met, M),
Phenylalanin (Phe, F), Tryptophan (Trp, W), Valin (Val, V)

Peptidbindungen
relativ starre C- N- Bindung
benachbarte - CAtome knnen nicht frei rotieren
Einschrnkungen
der Faltungsmglichkeiten
Asymmetrische Ladungsverteilung
begnstigt
Wasserstoffbrcken
hohe Anzahl an mglichen Verbindungen

Primrstruktur + Sekundrstruktur (kovalente Bindungen)

Molekulare Chaperone

z.B.
Hitzeschockproteine (untersttzende Rollen in Stressphasen (Denaturierung), aber auch allgemeine
Proteinfaltung)

Tertirstruktur (Konformation)
Wechselwirkung zwischen den Seitenketten und AS

Quartrstruktur
Viele Proteine enthalten 2 oder mehr
Polypeptidketten, Selbstassemblierung

Hmoglobin
Sauerstoffbindung
Konformationsnderung
Affinitt fr Sauerstoff

Erhhung

5 Isomere der Lactathydrogenase: M4, M3H, M2H2, MH3, H4


Enzyme:

der

Enzymklassen
EC 1 Oxidreduktasen (Dyhydrogenasen, Oxidasen, Reduktasen)
EC 2 Transferasen (bertragung von Atomen oder Moleklgruppen auf andere Substanzen, z.B.
DNA- Polymerase)
EC 3 Hydrolasen (Proteasen, Nucleasen, Phosphatasen)
EC 4 Lyasen (Lsen oder Bildung chem. Bind. z.B. Citrat- Synthase)
EC 5 Isomerasen (Neuanordnung von Bindungen innerhalb eines Molekls)
EC 6 Ligasen (Bilden Bindungen, frher Synthtasen, z.B. Pyruvat- Carboxylase)
Kohlehydrate Biologische Funktion
Transportable und speicherbare Energieform
Kohlenstoffgerst
Signal- oder Erkennungsstruktur bei vielen molekularen Prozessen
100- 100.000 Dalton
Monosaccharide: Glucose, Ribose, Fructose
Disaccharide: 2 Monosaccharide ber kovalente (glykosidische) Bindung verknpft, Saccharose,
Lactose
Oligosaccharide: 3- 20 Monosaccharide
Polysaccharide: mehrere 100 Monosaccharide (Strke, Glykogen, Cellulose, Chitin)
Monosaccharide
Glucose (C6H12O6): 4 chirale C- Atome
24 =
16 Stereoisomere (D-/ L- Glucose, D-/ LMannose, D-/ L- Galactose, )
Fructose: Strukturisomer

Isomere der Glucose

Disaccharide

Polysaccharide

Chemisch modif izierte Kohlehydrate

Lipide
Hydrophobe Kohlenwasserstoffe aggregieren miteinander ( Meidung der polaren Wassermolekle)
durch schwache Van der Waals Krfte zusammengehalten
keine Polymere im engeren Sinn
wirken allerdings als funktionelle Einheit
Funktionelle Eigenschaften
Engergiespeicher
Phospholipide
Membranen
Carotinoide
Pflanzen (Einfangen von Lichtenergie)
Steroide und modif izierte FS
Hormone, Vitamine
Lipidmantel bei Nerven
elektrische Isolierung
Wrmeisolator
An der Hautoberflche
wasserabstoend
Esterbindung zwischen FS und Glycerol
Sttigung: Doppelbindungen
Knicke
bestimmen die Packung

Phospholipide
biologische Membranen (Phospholipid- Doppelschicht)
eine der FS wird durch Phosphat ersetzt

Steroide und Vitamine


Cholesterol
Membran, Ausgangssubstanz fr Testosteron, strogen, and. Steroidhormone
Vitmaine
A, D, E, K

Carotinoide
Unpolare Struktur
Licht absorbierende Pigmente (Photosynthese, Frbung)

Base + Zucker + Phosphat = Nukelotid


Base + Zucker = Nukleosid
Basen: Purin (G, A) oder Pyrimidin (C, T)
Zucker: Ribose oder Desoxyribose
Phosphat: Mono-, Di-, Triphosphat
Bausteine der DNA/ RNA, Coenzyme, cAMP,
cGMP als intrazellulre Boten hormoneller Signale
DNA Doppelhelix
Normal in B- Form
in Gegenwart organische Lsungsmittel A Form (breiter,
krzer, Basen stehen nicht senkrecht zur Helixachse)
Z- Form: linksgngig, (CG)n Abschnitte

Basenpaarung
Wasserstoffbrckenbindung

RNA

Denaturierung

Primr-, Sekundr-, Tertirstruktur


Faltung
Haarnadelstrukturen

Zellteilung bei Prokaryoten


Reproduktionssignale (Nhrstoffangebot, Temperatur,
)
Replikation der DNA (bei den meisten Prokaryoten
ringfrmig): ori
ter
Segregation (Auftrennung)
Cytokinese (eigentliche Teilung)
Zellteilung bei Eukaryoten
Reproduktionssignale (spezialisierter, vom gesamten
Organismus abh.)
Replikation der DNA (mehrere Chromosomen, auf
einen bestimmten Zeitabschnitt innerhalb des
Zellzyklus beschrnkt)
Cytokinese (eigentliche Teilung)
Mitose (DNA der Tochterzellen indentisch zur Ausgangszelle)
Meiose (bei Zellen, die an der sexuellen Fortpflanzung
beteiligt sind, genetische Vielfalt durch Verschiebung des
genetischen Materials)
Zellzyklus
Zeitabschnitt zwischen den Zellteilungen
Mitose + Interphase (besteht aus)
G1- Phase (Lnge unterschiedlich, oft
Ruhephase G0)
S- Phase (Replikation der DNA)
G2- Phase (Vorbereitung auf die Mitose)

Cyclin abhngige Kinasen (Cdk)


Bindung von Cyclin an Cdk, aktiviert den
Cyclin- Cdk Komplex
Spezif ische Proteine knnen nun binden
und werden phosphoryliert
Retinoblastomprotein fr G1/ S bergang

Cyclin- Cdk Komplexe des Zellzykluskontrollsystems

Hemmende Mechanismen

Wachstumsfaktoren (WF)
WF sind Proteine
Binden an spezif ische Rezeptoren an Zelloberflche
Induzieren Signalwege
Synthese von Cyclinen
Aktivierung von Cdk
PDGF (platelet derived growth factor): von Thrombozyten produziert
Wundheilung
Interleukine: zur Bildung von roten und weien Blutkrperchen aus hmatopoetischen
Vorluferzellen
Limitation der Zellteilung
Viele Zellen unterliegen einer Beschrnkung der Anzahl der Teilungen
replikative Zellalterung
Vernderungen der Telomerstruktur (repititive Wiederholung an den Enden der DNA)
bei Zellen ohne Telomerase werden die Telomere immer krzer (Hayflick Limit)

Als Zellschaden erkannt


Zellzyklusstillstand
bermige Zellteilung Krebs
Krankhafte Vernderung von positiven (Wachstumsfaktoren) oder negativen Regulatoren
Onkogene Proteine (HER2 Wachstumgsfaktorrezeptor)
Inaktive Tumorsuppressorproteine (RB- Protein)

Mitose und Meiose


Interphase: Chromosomen sind
fadenfrmige Strukturen, die DNA wird
repliziert
vor der Mitose wird die DNA in kompakte
Chromosomen verpackt (in der MPhasen- Zelle)
Humane DNA fast 2m lang, Zellkern nur 5 m DM
Verpackung der DNA

Phasen der Mitose


Vorbereitung der Interphase:
S- Phase: DNA und Centrosom (Zentralkrperchen) verdoppeln sich
G2/ M- bergang: Centrosomen wandern an gegenberliegende Ende der Kernhlle (Bilden Pole)
Prophase
Chromatiden werden sichtbar
Spindelapparat bildet sich aus
Pol- Mikrotubuli
Kinetochor- Mikrotubuli
Das Chromatin wird spiralisiert
wird kompakter und zu sichtbaren Chromosomen kondensiert,
Chromosomen bestehen aus identischen, gepaarten Schwesterchromatiden
Prometaphase
Kernhlle zerfllt
Chromosomen (aus 2 Chromatiden) binden sich an Kinetochormikrotubuli
Metaphase
Chromosomen ordnen sich an der quatorialebene an
Anaphase
Trennung der Schwesterchromatiden
Bewegung zu den Polen
Telophase
Nach der vollstndigen Trennung wird eine neue Zellkernhlle gebildet
Spindel verschwindet
Cytokinese
Furchung der Plasmamembran (kontraktiler Ring)
Genau gleiche Verteilung der Chromosomen gewhrleistet
Ribosomen, Mitochondrien, mssen nicht gleichmig aufgeteilt sein
bei manchen Zellen keine Cytokinese
mehrkernige Zellen (Syncytium; z.B. Skelettmuskelzellen)
Eukaryotische Zellteilung

ungeschlechtliche (vegetative, asexuelle) Fortpflanzung beruht auf mitotischer Teilung


geschlechtliche (generative, sexuelle) Fortpflanzung
genetisch keine vollstndige bereinstimmung mit den Eltern
erfordert Gameten (einfacher Chromosomensatz, haploid)
Meiose zur Bildung haploider Zellen
Meiose
2 Zellkernteilungen (Meiose I, Meiose II)
nur 1 DNA Replikation
Verringerung der Chromosomenzahl von diploid auf haploid
vollstndiger Chromosomensatz in jeder haploiden Zelle
Erzeugung von genetischer Vielfalt
Meiose I:
frhe Prophase I: Chromatin beginnt nach der Interphase zu kondensieren
mittlere Prophase I: bei einer Synapsis lagern sich homologe Chromosomen zu Paaren zusammen und die
Chromosomen kondensieren weiter
spte Prophase I: Chromosomen spiralisieren und verkrzen sich immer strker. Chiasmata zeigen
Crossing- over an, den Austausch von genetischen Material zwischen Nicht- Schwesterchromatiden bei
einem homologen Paar. In der Prometaphase zerfllt die Kernhlle.
Metaphase I: homologe Chromosomen ordnen sich in der quatorialebene als quatorialplatte an.
Anaphase I: homologe Chromosomen bewegen sich zu den entgegengesetzten Polen der Zelle

Telophase I: die Chromosomen sammeln sich in Zellkernen, die ursprngliche Zelle teilt sich
Meiose II:
Prophase II: Chromosomen kondensieren wieder nach einer kurzen Interphase, in der die DNA nicht
repliziert wird
Metaphase II: die Centromere der Chromosomen ordnen sich in jeder Zelle in der quatorialebene an
Anaphase II: die Chromatiden trennen sich und werden eigenstndige Chromosomen, sie werden zu den
entgegengesetzten Polen gezogen. Aufgrund des Crossing- overs und der unabhngigen Verteilung erhlt
jede neue Zelle eine andere genetische Ausstattung
Telophase II: die Chromosomen sammeln sich in neuen Zellkernen und die Zellen teilen sich
Endergebnis: jeder Zellkern der 4 Tochterzellen trgt einen haploiden Chromosomensatz
bei der Meiose werden die 2 Chromosomenstze auf 4 Tochterzellen aufgeteilt, jede erhlt halb so viele
wie die ursprngliche Zelle
4 haploide Zellen
Unterschiedliche Lebenszyklen

Abbildung 1: Pilze, Grnalgen

Pflanzen

Mensch & Tier, Braunalgen

Abbildung 2: Fehler bei Meiose


Abbildung 3: Crossing Over

Fehler bei Meiose


Aneuploidie ist relativ hufig (10-30%)
meist tdlicher Verlauf
Ausnahme: Trisomie von Chromosom 21 (Down
Syndrom)
Gregor Mendel (1822- 1884)
fhrte genetische Experimente durch:
Kreuzungsversuche (beobachtete Merkmale
von 24034 Nachkommen)
Merkmal (Samenoberflche)
Merkmalsausprgung (glatt/ runzelig)
Auswahl von reinerbigen Eltern
Entfernung der Staubgefe
Monohybridenkreuzung

Abbildung 4: Deutung
Deutung der Ergebnisse:
Unformittsregel (1. Mendelsche Regel): Kreuzt man 2 reinerbige Eltern, die sich nur in einem Merkmal
unterscheiden, so sind die Individuen der F1 Generation phnotypisch und genotypisch gleich.
Spaltungsregel (2. Mendelsche Regel): Kreuzt man Individuen der F1 Generation, so gehen daraus
Nachkommen hervor, die sich einem bestimmten Zahlenverhltnis aufspalten.

Abbildung 5: Ergebnisse

Abbildung 6: Rckkreuzungsexperimente

Meiose bewirkt Trennung der Allele


Gen: DNA Sequenz, die an einem
bestimmten Ort (Locus) liegt
Allel: verschiedene Zustandsformen des
Gens

Abbildung
Unabhngigkeitsregel (3. MR)
Dihybridkreizungen aus der F2 Generation
Unabhngige Segregation von S/s und Y/y
Auftreten der Phnotypen im Verhltnis 9:3:3: 1
(nicht mehr allg. gltig)

7: Trennung Allele

Wenn sich die homologen Chromosomen whrend der


Metaphase I in der quatorialebene anordnen so hat die
Verteilung von S und s, keinen Einfluss auf die
Verteilung von Y und y. Die Meiose setzt sich in einer
von 2 Orientierungen fort.
bertragung auf Humangenetik:
Retinoblastom, Hypercholesterinanmie, Maligne
Hyperthermie, Sichelzellenanmie,

Abbildung 8: Punnett Quadrat


Albinismus, Galaktosmie, Lippenkiefer- Gaumenspalte, Zystische Fibrose, Thalassmie,

G- 6- PD- Mangel,
Hmophilie A und B
(Bluterkrankung),
Muskeldystrophie, RotGrn- Blindheit

Abbildung 9: X- Chromosomaler rezessiver Erbgang

familire phosphatmische
Rachitis

Abbildung 10: X- Chromosomaler dominanter Erbgang


Allele entstehen aus dem Wildtyp durch Mutationen
es knnen auch mehr Allele in einer Population vorhanden sein
z.B. Hasen

Codominanz
beide Formen treten in der
heterozygoten Form auf
AB0 Locus (Glykoproteine,
Oberflche der Erythrozyten)
Struktur der DNA
Watson/ Crick/ Frankling
Doppelhelix
Antiparallele Strnge
Rechtsgngige Helixachse
Nucleotidbasen im Inneren
Chargaff Regel
(Anzahl Purine = Anzahl
Pyrimidine)
Pyrimidin
Purin
Basenpaarung

3 denkbare Mechanismen der Replikation


semikonservative Replikation: 2 DNA Molekle entstnden, die sich jeweils aus einem komplett alten
und einem vollstndigen neuen Strang zusammensetzen.
Konservative Replikation: der ursprngliche DNA Strang bliebe erhalten und zustzlich entstnde ein
neuer
dispersive Replikation: 2 DNA Molekle entstnden, bei denen sich alte und neue DNA aller vier
Strnge verteilt

DNA Replikation erfolgt in 2 Schritten:


Entspiralisierung der DNA (Trennung der Matrizenstrnge)
einige Nucleotide bilden mit der Matrizen DNA komplementre Basenpaare, mit
Phosphodiesterbindungen miteinander verknpft
DNA Wachstum

DNA- Polymerase
1. die Primase bindet an den Matrizenstrang und synthetisiert einen RNA- Primer
2. Sobald der Primer fertig gestellt ist, wird die Primase freigesetzt, die DNA Polymerase bindet und
synthetisiert neue DNA

Abbildung 11: weitere Enzyme

Abbildung 12: Okazaki Fragment


DNA Klammer zur Erhhung der Effizienz
1. eine Klammer bindet an die DNA
2. die DNA Polymerase bindet an den Klammer- DNAKomplex
3. die Klammer hlt die Polymerase stabil an die DNA
gebunden, sodass bei einem einzigen
Bindungsergebnis viele Nucleotide angehngt werden
knnen
4. die Klammer ist das aus 3 Untereinheiten bestehende
Protein PCNA

Abbildung 13: DNA Ligase

Telomer- Replikation

DNA Reparatur:
a) DNA Korrekturlesen
1. whrend der DNA Replikation kann eine falsche Base in die wachsende Kette eingebaut werden
2. die Proteine des Replikationskomplexes schneiden die falsche Base sofort heraus
3. die DNA Polymerase fgt die richtige Base ein, die Replikation wird fortgesetzt
b) Fehlpaarungsreparatur
1. es kann zu einer Basenfehlpaarung kommen
2. die Fehlpaarungsreparaturproteine schneiden die fehlgepaarte Base und benachbarte Basen heraus
3. die DNA Polymerase fgt die richtige Base ein
4. im letzten Schritt repariert die DNA Ligase den verblieben Strangbruch
c) Excisionsreparatur
1. eine Base wird beschdigt, ist funktionslos
2. die Excisionsreparaturproteine schneiden die beschdigte Base und benachbarte Basen heraus
3. die DNA Polymerase fgt die richtigen Basen durch 5'
3' Replikation des kurzen DNA Abschnitts ein
Informationsfluss von der DNA zum Protein
Transkription: die Information eines Genes (einer DNA- Sequenz) wird auf eine komplementre
RNA- Sequenz berschrieben
Translation: die RNA- Sequenz dient als Vorlage fr das Polypeptid
DNA

(Transkription)

RNA

(Translation)

Protein

Viren als Ausnahme


Influenza-, Poliovirus, (RNA als genetisches Material)
RNA R NA
Protein
HI Virus (RNA als genetisches Material, erzeugt DNA aus RNA reverse Transkription
ins Genom der Wirtszelle)
DNA
RNA
Protein

Einbau

RNA (Ribonucleinsure)
Einzelstrngig
Zucker = Ribose
Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil (statt Thymin)
mRNA (Transkript): Info von der DNA zum Ort der Proteinbiosynthese (Ribosom)
tRNA: trgt AS zum Ribosom
rRNA: Katalysiert die Bildung der Peptidbindung
Wo Genexpression?
Transkription und Prozessierung im Zellkern
Translation im Cytoplasma
Transkription
Initiation
startet am Promotor (spezielle DNA- Sequenz, Initiationsstelle)
Promotor richtet die RNA Polymerase aus (welcher Strang soll abgelesen werden)
Elongation
RNA- Polymerase entspiralisiert die DNA
Ablesen der DNA in 3'
5' Richtung
Neue Nukelotide werden ans 3' Ende gehngt
Keine Korrekturlesefunktion
Fehler (1:104 bis 105)
Termination

bestimmte Sequenz legen das das Ende der Transkription fest


RNA- Transkript verlsst die DNA
Ableserichtung

Der genetische Code


wurde in den 60er Jahren
geknackt
Jeweils 3 Basen (Triplett)
bilden das Codon: 4 x 4 x 4
64 Mglichkeiten
Stoppcodons
eindeutig, aber redundant
(fast) universell
Struktur von eukaryotischen Genen
Promotor
Introns (nicht codierende
Sequenzen)
Exons (exprimierte Region)
Terminator
Prozessierung (Spleien)

1. kleine nuclere Ribonucleoproteinpartikel binden an die Consensussequenzen in der Nhe der 5'
und 3' Spleistelle
2. durch Wechselwirkungen zwischen den beiden snRNPs und anderen Proteinen bildet sich ein
Spleiosom
3. Zwischen den 5' Exon und dem Intron erfolgt ein Schnitt
4. Nach dem ersten Schnitt am 5' Ende bildet das Intron einen geschlossenen Ring, hnlich einem
Lasso
5. die freie 3' OH Gruppe am Ende des geschnittenen Exons reagiert mit der 5' Phosphatgruppe am
anderen Ende
6. das 3' Exon wird geschnitten und das 5' Exon gespleit; danach wird die reife mRNA fr die
Translation exportiert
7. das gespleite Intron wird im Zellkern abgebaut
Alternatives Spleien

Prozessierung (Modif ikation der beiden Enden)

Bindung der mRNA an Ribosom untersttzt


Schutz vor Abbau durch Ribonucleasen
Polyadenylierung
100- 300 Adenine
untersttzt Export aus dem Zellkern?
Stabilitt der mRNA
Translation
Adapter Hypothese
Translation von mRNA zum Protein erfordert ein Molekl, das die Info aus den Codons mit den
spezif ischen AS koppelt
tRNA
tRNA

Wobble Effekt
Nicht 64 verschiedene tRNAs
Spezif itt am 3' Ende des Codons wird nicht immer genau eingehalten
GCA, GCC und GCU werden von derselben tRNA erkannt ABER: nur jede tRNA trgt eine

bestimmte AS
Kopplung der tRNA mit AS
1. das Enzym aktiviert die AS, indem es eine Reaktion mit ATP katalysiert, sodass eine energiereiche
AMP- AS und ein Pyrophosphation entstehen.
2. Das Enzym katalysiert eine Reaktion der aktivierten AS mit der richtigen tRNA.
3. Die Spezif itt des Enzyms stellt sicher, dass die richtige AS mit der zugehrigen tRNA
zusammengebracht wird.
4. Die beladene tRNA bringt bei der Translation die passende AS zum sich verlngernden
Polypeptidprodukt.
Ribosom
Tausende Ribosomen pro Zelle, d = 25nm
4,2 x 106 Dalton
Groe und kleine Untereinheit:
Groe UE: 3 verschiedene rRNAs + 49 Proteinmolekle
kleine UE: 1 rRNA + 33 Proteinmolekle
3 Stellen an denen tRNA binden kann (Codon- Anticodon- Wechselwirkungen zwischen tRNA und
mRNA nur zwischen P- und A- Stelle)
A: Aminosure Stelle
P: Polypeptidstelle
E: Exitstelle
sind unregelmig geformt
Translation
Initiation
1. die kleine ribosomale UE bindet an ihre Erkennungssequenz auf der mRNA
2. die mit Methionin beladene tRNA bindet an das Startcodon AUG und vervollstndigt damit
den Initiationskomplex
die groe ribosomale UE tritt zum Initiationskomplex hinzu, sodass die mit Methionin
beladene tRNA jetzt die P- Stelle besetzt
Elongation
Erkennen des Codons: Anticodon einer ankommenden tRNA bindet an das Codon, das an
der A- Stelle zugnglich ist
Bilden der Peptidbindung: Pro wird durch die Peptidyltransferase- Akitivitt der groen UE
mit Met verknpft
Elongation: Whrend sich das Ribosom um ein Codon weiterbewegt, gelangt die freie tRNA
in die E- Stelle und wird dann freigesetzt; das wachsende Polypeptid bewegt sich zur PStelle.
Wiederholung
Termination
Binden eines Release- Faktors (Stopp Codon) an den Komplex, wenn ein Stoppcodon an
die A- Stelle gelangt.
Freisetzung der tRNA aus der P- Stelle und trennt das Polypeptid ab.
Zerfallen der UE
Polysome
Mehrere Ribosomen knnen gleichzeitig aktiv sein
Vielzahl an Kopien des Proteins werden erzeugt
Poly(ribo)som
die Polypeptide wachsen weiter whrend die Ribosomen zum 3' Ende der mRNA wandern
Bestimmungsorte der
Proteine

Bestimmungsort: Zellkern
z.B. Histonproteine
Kernlokalisierungssequenz (- Pro Pro- Lys- Lys- Lys- Arg- Lys- Val-), NLS (nuclear localisation
signal)
Signalsequenz bindet an Docking Protein (an der ueren Membran des Organells bedindet)
Bildet nach Bindung einen Kanal
Bestimmungsort: ER
15- 30 hydrophobe AS
Translation unterbrochen und Ribosom wird zum ER gelenkt
Signalsequenz bindet an Signalerkennungspartikel (SRP)
Blockiert Synthese bis Ribosom an Rezeptorprotein in der Membran des rauen ER gebunden hat
Bildung eines Membrankanals
Fortsetzung der Proteinsynthese
Protein
ER
Golgi- Apparat
endgltiger Bestimmungsort

Posttranslationale Modif ikation


Proteolyse: das Zerschneiden des Polypeptids ermglicht es den Fragmenten, sich zu
eigenstndigen Proteinen zu falten, z.B. Entfernung der Signalsequenz
Glyokosylierung: das Anhngen von Zuckern (Glykoproteinen) ist wichtig fr gezielten Transport und
Erkennung
Phosphoylierung: Angehngt Phosphatgruppen verndern die Struktur des Proteins
Somatische Mutation
treten in den Krperzellen (somatischen Zellen) auf
werden an die Tochterzelle weitergegeben
nicht aber bei sexueller Fortpflanzung vererbt
Keimbahnmutation
bei Gameten
werden bei der Befruchtung an den neuen Organismus weitergegeben
Phnotypische Effekte von Mutationen
stille Mutation (keine Beeinflussung der Proteinstruktur oder -funktion)
Neutrale Mutation (ASsequenz wird verndert, aber Proteinfunktion bleibt gleicht=
Funktionsverlustmutation: codiert ein funktionsloses Protein
Funktionsgewinnmutation: codiert ein Protein mit neuer Funktion
Mutation vs. Polymorphismus
99.9% unserer DNA sind ident
Sequenzvariation alle 1 0 00 Basen
Polymorphismus, wenn bestimmte Variation in mehr als 1% der Population vorkommt

Punktmutation

Genetik und Umwelt

Chromosomenmutation
Deletion: durch Verlust eines Chromosomenabschnittes
Duplikation mit Deletion: wenn homologe Chromosomen an 2 ungleichen Stellen zerbrechen und die
Abschnitte austauschen
Inversion: wenn ein herausgebrochener Abschnitt in umgekehrter Orientierung wieder eingefgt wird
reziproke Translokation: wenn nicht- homologe Chromosomen Abschnitte austauschen
Genommutation
Vernderung der Anzahl der Chromosomen: Trisomie 21
Positive Regulation: die Bindung des Aktivatorproteins stimuliert die Transkription
Negative Regulation: die Bindung des Repressorproteins blockiert die Transkription
Regulierung der Genexpression

Epigenetische Vernderungen
DNA- Methylierung
meist neben CpG Inseln
stark methylierte Gene in der Regel inaktiver
Histonmodif ikationen
die Modif izierung der Histone durch die HistonAcetyltransferase lockert die Befestigung des
Nucleosoms an der DNA
Remodeling- Proteine binden und lsen die
Nucleosomenstruktur auf
dann kann der Transkriptionskomplex binden und die
Transkription beginnt
Genomische Prgung
fr jedes Geschlecht spezif ische Methylierungsmuster
Gen bei Mann aktiv, bei Frau inaktiv

Regulation der Transkription


Transkriptionsfaktoren und RNAPolymerase II binden an Promotor
TATA box (Erkennungsstelle mit
Consensussequenz TATA A/ T A A/T)
TFII (Transkriptionsfaktoren fr die RNA
Polymerase II)

Repressoren und Aktivatoren


Enhancer Sequenzen (hier
binden Aktivatorproteine)
Silencer Sequenzen (hier
binden Repressorproteine)

Koordination der Genexpression


wenn verschiedene Gene gleichzeitig gebraucht werden
Koordination ber Wachstumsfaktor
1. ein Stressfaktor (etwa Trockenheit) aktiviert die Transkription eines Gens fr ein regulatiorisches
Protein ber einen trockenheitssensitiven Transkriptionsfaktor.
2. die Bindung des regulatorischen Proteins an das Stress Response Element stimuliert die
Transkription der Gene A, B, C
3. die Gene produzieren verschiedenen Proteine, die bei der Stressreaktion mitwirken
Regulation der Transkription

Regulierung der Translation


MicroRNAs
Unmodif iziertes GTP als CAP nicht transferiert
Repressorproteine blocken die Translation direkt
MicroRNAs (miRNA)
kurze (19-24 Nucleotide), nicht codierende RNAs
Regulieren ca. 2/3 aller Sugetier Gene
Inhibieren Genexpression
Degradierung der mRNA
Inhibierung der Translation
Oft Gewebe Spezif isch exprimiert
Intrazellulr + extrazellulr
MiRNA Bindung
Bindung der miRNA an die Ziel- mRNA (imperfect base- pairing)
ca. 2578 verschiedene miRNAs
jede miRNA
tausende Target Gene
Regulierung ber Abbau
Ubiquition/
Proteasom System

Signaltransduktionswege
Umsetzen eines extrazellulren Signals in eine zellulre Reaktion
Signale knnen physikalischer (Licht, Schall, ..) oder chemischer Natur sein
STW regulieren beinahe alle bekannten zellulren Prozesse
Steuerung krperlicher Funktionen ber Botenstoffe
Nervensystem
Hormonsystem
Immunsystem
Grundschema der Signaltransduktion
Rezeption
Transfer in das Zellinnere
Signalamplif ikation

Modulation von Effektorsystemen


Adaptation (negative Feedbackschleifen)
Liganden (Signalmolekle)
Autokriner Signalmolekle binden an Rezeptoren auf derjenigen Zelle, die sie sezerniert
Parakrine Signalmolekle binden an Rezeptoren auf Zellen in der Nhe
Zellen ohne Rezeptoren reagieren nicht auf dieses Signal
Endokrine Signalmolekle (Hormone) werden durch das Kreislaufsystem transportiert und binden an
Rezeptoren an weit entfernten Zellen
Allgemeiner Signalbertragungsweg
Ziel: kurz- und/oder langfristige molekulare nderungen (kurzfristige Effekte: Enzymaktivierung,
Zellbewegung, langfristig: genderte Transkription der DNA)
1. Signalmolekle werden von anderen Geweben freigesetzt.
2. ein Signalmolekl bindet an ein Rezeptorprotein an der Zelloberflche oder im Cytoplasma.
3. Die Bindung des Signalmolekls verndert die dreidimensionale Struktur des Rezeptors und
macht sein aktives Zentrum zugnglich.
4. Der aktivierte Rezeptor aktiviert einen Signaltransduktionsweg, der die zellulren Vernderungen
in Gang setzt
Osmoregulation in E. Coli
Chem. Signal = Konzentrationszunahme eines gelsten Stoffes
Rezeptor = EnvZ
Effektor = OmpR
Effekt = Produktion des OmpC Proteins > Verhinderung des weiteren Eintretens gelster Stoffe
1. Signal: gelste Stoffe gelangen bei E. Coli durch groe Poren in der Auenmembran in den Spalt
zwischen den beiden Membranen.
2. Rezeptor: Das EnvZ Rezeptorprotein verndert als Reaktion auf die hohe Konzentration von
gelsten Stoffen seine Struktur und katalysiert das Anhngen einer von ATP stammenden
Phosphatgruppe.
3. Effektor: das Phosphat von EnvZ wird auf das OmpR Protein bertragen und das phosphorylierte
OmpR verndert seine Struktur, sodass es an DNA binden kann und die Transkription des ompCGens stimuliert.
4. Effekte: das OmpC Protein setzt sich in die Auenmembran und verhindert das Eindringen
gelster Stoffe, sodass der uere Bereich der Zelle osmotisch im Gleichgewicht ist.
Signalauslsende Molekle

Lokalisation der Rezeptoren


Plasmamembran (viele einzelne Molekle, um Signal
zu verstrken)
Zytoplasma (bei Membran- durchdringenden Stimuli
wie Licht, hydrophobe Molekle (Steroidhormone, NO,
O2, )
Rezeptoraktivierung
Spezif itt durch komplementre Struktur von Ligand und Rezeptor
Affinitt bestimmt Strke der Wechselwirkung (je hher Affinitt desto geringer ist die
Ligandenkonzentration, die zur Aktivierung notwendig ist)
Konformationsnderung:
Aktivierung nachgeschalteter Signalwege (metabotrope Rezeptoren)
ffnen eines Kanals (ionotrope Rezeptoren)
Rezeptoren
Ionenkanal- gekoppelte Rezeptoren
G- Protein-gekoppelte Rezeptoren
Enzym- gekoppelte Rezeptoren
Rezeptor- Tyrosin Kinasen (RTK)
Rezeptor- Serin- Threonin- Kinasen
Rezeptor Phosphatasen

Rezeptor- Guanylatzyklasen
Rezeptoren ohne instrinsische Enzymaktivitt: Zytokinrezeptoren
Zytoplasmatische Rezeptoren
Nuklere Rezeptoren
Lsliche Guanylatzyklase- Rezeptoren
Ionenkanle
Transmitter- kontrollierte Ionenkanle
Acetylcholin- kontrollierte Kationenkanle
Serotonin- kontrollierte Kationenkanle
Glutamat- kontrollierte Kationenkanle
GABA- kontrollierte Cl- Kanle
Glycin kontrollierte Cl- Kanle
Spannungsunabhngige Ionenkanle
Vernderungen im Membranpotenzial
Na+, Ca2+, K+ Kanle
Ionenkanal
Gesteuerter Ionenkanal (Acetylcholinrezeptor)
fr Na- Ionen
aus 5 UE
steuert Membranpolaritt
1. 2 Acetylcholinmolekle binden an AchR- UE, wodurch sich die Struktur des Kanals ndert und er
sich ffnet.
2. Der Kanal ist mit negativ geladenen AS ausgekleidet, sodass es Na + - Ionen mglich ist, in die
Zelle zu strmen.
3. Die Na+ - Zunahme in der Zelle fhrt zur Muskelkontraktion.
G- Protein gekoppelter Rezeptoren
G- Protein fungiert als Vermittler zwischen Rezeptor und Effektor
1. Die Bindung des Hormons an den Rezeptor aktiviert das G- Protein. GTP ersetzt GDP.
2. ein Teil des aktivierten G- Proteins aktiviert ein Effektorprotein, das Tausende von Reaktanden in
Produkte umwandelt und so die Aktivitt eines einzigen Signalmolekls verstrkt.
3. Das GTP am G- Protein wird zu GDP hydrolisiert, bleibt aber am Protein gebunden.
GTP bindende Proteine
Heterotrimere G- Proteine
Kleine G- Proteine (Ras, Rho, Arf, Ran)
Cofaktoren der Translation (Initiationsfaktor elF2a, Elongationsfaktor eEF1a, Translokationsfaktor
elF2a)
G- Protein-gekoppelter Rezeptor
aus 3 UE ( , , )
knnen zwischen aktivem (GTP) und inaktivem GDP Zustand wechseln
ca. 1000 verschiedene GCPs (50% zur Erkennung von Geruchsstoffen)
Struktur

Aktvierung
Nach Aktivierung
Dissoziation
Vermittlung des Signals an Effektorproteine (Adenylatcyclase oder Phospholipase C)
Bildung von second messengers (cAMP, DAG, IP3) und/ oder Beeinflussung von Ionenkanlen
Adrenorezeptor Signaling
Adrenalin/ Noradrenalin
Fight-and-Flight- Reaktion
Stimulation der Herzaktion
Erhhung des Blutdrucks
Bereitstellung von Glucose und FS
Drosselung der Verdauungsaktivitt
Adrenorezeptoren (Adrenerge Rezeptoren)

- Rezeptoren ( 1-3)

- Rezeptoren ( 1, 2 )
Adrenorezeptor Signaling

Kleine G- Proteine
1.
Ein Wachstumsfaktor bindet an seinen Rezeptor, der
sich selbst phosphoryliert
2.
der aktivierte Rezeptor lst eine Kette von Ereignissen
aus, durch die Ras GTP binden kann und aktiviert wird
3.
das aktivierte Ras bindet an Raf und aktiviert es
4.
das aktivierte Raf ist eine Proteinkinase, die viele MEKMolekle phosphoryliert.
5.
Das aktivierte MEK- Protein ist eine Proteinkinase, die
viele Molekle der MAP- Kinase phosphoryliert.
6.
Wenn die MAP- Kinase durch Phosphorylierung
aktiviert, wurde, kann sie in den Zellkern gelangen
Signaltransduktion & Krebs
Ras = G- Protein, das Zellteilung reguliert
Dauerhafte Aktivierung bei einigen Tumorarten
Zellteilung

unkontrollierte

Rezeptor Tyrosin Kinasen


Phosphorylieren intrazellulre Signalproteine an Tyrosin
Resten
meist monomere integrale Membranproteine
Liganden: v.a. Wachstumsfaktoren (EGF, PDGF, FGF,
Insulin)
58 bekannte RTKs beim Menschen
RTK Ativierung
RTKs hufig in Tumorzellen aktiviert (HER2 bei 30% der
Mammakarzinome, VEGFR
Angiogenese, )
a) Ligandenbindung

b) Dimerisierung
c) Transphosphorylierung
d) Bindung von Adapter- und Substratproteinen
Spezif itt
Signaldiversif izierung durch Homo- und Heterodimere von PDGF und PDGFR
Insulinrezeptor
Heterotetramer (2 extrazellulre - UE, 2 transmembrane - UE)
Insulinrezeptorsubstrat 1
PI3K
PDK- 1
PKB oder PKC (z.B. GLUT4 Transport zur
Membran)
Serin/ Threonin Kinasen
TGF- Pathway (Hemmung der Zellteilung in differenzierten Zellen)
BMPs (Bone morphogenic proteins, induziert Differenzierung von Knochenzellen)
Zytokinrezeptoren
wichtig v.a. Im Immunsystem
Zytokin bindet gleichzeitig an 2 Rezeptorketten
Dimerisierung
Viele unterschiedliche Zytokine und Rezeptoren, aber Familien mit gleichen UE
JAK- STAT- Signalweg
JAK (Janus- Kinasen)
Transaktvierung + Phosphorylierung an Tyrosinresten
STAT (signal transducers and activators of transcription)
Zytoplasmatischer Rezeptor
z.B. Cortisonrezeptor
an ein Chaperonprotein gebunden
bei Bindung von Cortison

Freisetzung des Chaperons

Eindringen in Zellkern

Bindung an DNA

Aktivierung der Transkription


Steroidhormonrezeptoren
Glukokortikoidrezeptoren Regulation von Stoffwechsel und Immunfunktion
Mineralkortikoidrezeptoren Regulation von extrazellulren Flssigkeitsvolumen und Blutdruck
strogenrezeptoren
Progesteronrezeptoren
Androgenrezeptoren mnnliches Erscheinungsbild
Schilddrsenhormonrezeptoren
Vitamin D- (Kalzitriol)- Rezeptoren
Retinsurerezeptoren Nervengewebe
direkte/ indirekte Signaltransduktion
direkt: alle Vorgnge spielen sich in der Nhe des Rezeptors ab
indirekt: ber sekundren Messenger (Signal selbst = primrer Messenger)
Intrazellulre Messenger
Second Messenger: Calciumionen, Zyklische Nukleotide, Inostiol- 4, 5 biphosphat
Kinasen und Phosphatasen
GTP- bindende Proteine
Adapterproteine
Ubiquitin Ligasen (regulierte Proteolyse)
Transkriptionsfaktoren
Calcium
Gradient der Ca2+- Konzentration (niedrige Spiegel intrazellulr)
Ca- bindende Proteine

Zyklische Nukleotide
cAMP
cGMP
aus GTP (katalysiert von Guanylatcyclasen)
Geftonus der glatten Muskelzelle
Phospholipidderivate
Phosphatidylinostiol an der Membran
Phosphorylierung durch PI3K (Phosphatidylinositol- 3- kinase)
PI3P (- phosphatase)
Signalfunktion ber PKB (Protein- Kinase B)
Phospholipase C
PIP2
DAG + IP3
DAG
Protein- Kinase C
IP3
Mobilisierung von Ca- Ionen
Sekundre Messenger IP3/ DAG
Phospholipase C spaltet Phopholipid (PIP2) in IP3 und DAG
1. Der Rezeptor bindet an das Hormon.
2. die aktivierte UE des G- Proteins dissoziiert und aktiviert die Phospholipase C.
3. das aktivierte Enzym produziert die sekundren Messenger DAG und IP3 aus PIP2
4. IP3 ffnet Ca2+- Kanle.
5. DAG und Ca2+ aktivieren die Proteinkinase C (PKC).
6. Die PKC phosphoryliert Enzyme und andere Proteine
Signaltransduktion
Hintereinanderschaltung von Signalen
Signalkaskade
Steuerung vieler physiologischer Prozesse
postitive und negative Signale
Vernderung der Enzymaktivitt
Sinneswahrnehmung
RTK- Signalkaskade

Regulierung der Signaltransduktion


Erzeugung von aktiven Signalbertrgern
Proteinkinasen
G- Proteine
cAMP
Inaktivierung (rot)

Vernderung der Enzymaktivitt


Leberzellen reagieren auf Adrenalin
Aktivierung von G- Proteinen
cAMP
Proteinkinasekaskade (Hemmung der Umwandlung von Glucose in Glykogen, Stimulierung
der gespeicherten Glucose)
Verstrkung des Adrenalinsignals
Die durch die Adrenalinbindung ausgelste Phosphorylierung inaktiviert die Glykogensynthase und
verhindert so, dass Glucose in Form von Glykogen gespeichert wird.
Die Proteinkinasenkaskade verstrkt das Signal. Hier werden fr jedes gebundene Adrenalinmolekl
20 Molekle cAMP erzeugt, die alle jeweils ein Molekl der Proteinkinase A aktivieren.
Die Glykogenphosphorylase wird durch die Phosphorylierung aktiviert und setzt aus Glykogen
gespeicherte Glucosemolekle frei.
Die Freisetzung von Glucose liefert Energie fr die Kampf- oder Flucht- Reaktion.
Geruchswahrnehmung
Geruchsstoffe
Signalweg (ffnen von Ionenkanlen)
Einstrom von Na + und Ca+ Aktvierung
von Nervenzellen
1. Die Bindung eines Geruchsmolekls an seinen
Rezeptor aktiviert ein G- Protein.
2. das G- Protein aktiviert die Synthese von cAMP.
3. cAMP aktiviert das ffnen von Ionenkanlen.
4. Durch Vernderungen der Ionenkonzentrationen
innerhalb der Zelle wird ein Signal an eine spezif ische
Hirnregion geschickt, was dort zu einer
Geruchswahrnehmung fhrt.
Nervenzelle
Zellkrper (Soma)
Fortstze (Dendriten, Axone)
Informationen von Dendriten aufgenommen, in Form
kurzer Spannungsimpulse (Aktionspotentiale) an Axon
weitergeleitet und auf Zielzelle bertragen (Synapsen)
Energiestoffwechsel
Gehirn (ca. 2% des Krpergewichts)

verbraucht 15% des Sauerstoffs

Energietrger fast ausschlielich Glucose (120140g/ Tag), keine FS

keine Glykogenreserven

lange Hungerphasen (Umstellung auf Ketonkrper)

Blut- Hirn- Schranke (Endothelzellen der Gehirnkapillaren)


Aufbau der Membranspannung
Membran muss wie Isolator wirken
Konzentrationsgradient
Ionenkanle kontrollieren Fluss von
Ionen
Spannungsaktivierte Ionenkanle
offen/ geschlossen/ inaktiviert
Ionenselektivitt
Synapsen
Elektrische Synapsen (Kopplung
groer Zellverbnde)
Chemische Synapsen (gerichtete
bertragung mit Hilfe von
Transmittern)
Neurotransmitter
Acetylcholin
Aminosuren
Biogene Amine
Purine
Neuropeptide
Endocannabinoide
NO
Rezeptoren
nACHR: Neuromuskulre Endplatte (Blockierung durch Curare, - Connotoxin, Sarin)
Glutamat R: Nicht selektiv, immer exzitatorische Signale
Geschmackswahrnehmung
s: Zucker und kohlenhydratreiche Nahrung
Umami: Proteinreiche Nahrung
Bitter: warnt vor giftigen Alkaloiden
Sauer: warnt vor unreifen Frchten,
verdorbenen Speisen
Salzig: Regulierung des
Wasserhaushalts
Geschmackssinneszellen
ca. 50 Geschmackssinneszellen in
einer Geschmacksknospe
2000- 5000 Geschmacksknospen in
den Geschmackspapillen auf der
Zunge
Gustatorische Transduktion
Depolarisierung, Einstrom von
Ca- Ionen
Erregung der Nervenfaser und
Weiterleitung an Gehirn
Chemotransduktion
WW zischen Geschmacksstoff und Rezeptor
Salzig: reagiert auf Na+
sauer: reagiert auf H+
Bitter, s, umami: G- Protein-gekoppelter Mechanismus: groe
Vielfalt an Bitterrezeptoren
Sehwahrnehmung
Photorezeptoren (lichtempfindliche Zellen der Netzhaut)
Stbchen (120x 10^6, sehr lichtempfindlich, Dmmerung,
Disks im Auenglied)
Zapfen (6x10^6, Wahrnehmung von Farben,
Membranfaltung im Auenglied)
Sehpigmente
Stbchen: Rhodopsin
Opsin
Retinal (Vit A- Derivat)
3- Zapfen- Opsine: Blau, Rot, Grn
Signalkaskade
Im Dunkeln: cGMP gebildet
ffnet CNG- Kanle
Na/ Ca
strmen ein, K aus
Depolarisierung
Ausschttung von

Glutamat
Lichtantwort: Signalkaskade
Abbau von cGMP, CNG schliet, K- Ausstrom berwiegt
Hyperpolarisierung
signalisiert Licht
Endokrine Regulation

Abbildung 14: Wirkungsweise von Hormonen


Prinzipien endokriner Regulation
bergeordnete Kontrollund
Kommunikationsfunktion
Hormonklassen
AS derivate und
biogene Amine
Catecholamine
(Andrenalin,
Noradrenalin,
Dopamin) aus
Tyrosin
Serotonin und
Histamin aus
Tryptophan bzw.
Histidin
Peptid- und
Proteohormone
in sekretorischen Vesikeln gespeichert und durch Exozytose freigesetzt
oft aus Prohormon (bei adrenocorticotrope Hormon (ACTH), Insulin)
Modif ikation (z.B. Glykosilierung mglich)
Cholesterinderivate (Steroidhormone: Cortisol, Aldosteron, stradiol, Progesteron,
Testosteron; Vit. D)
Derivate von FS und Phospholipiden (Eicosanoide)
Freisetzung von Insulin
GLUT2 transportiert Glucose bei hohem Blutglucosespiegel ber die Membran.
Die stimulierte Glykolyse fhrt zur Produktion von ATP.
ATP hemmt ATP- sensitive Kaliumionenkanle.
Dies fhrt zur Depolarisation der Zellmembran.
Als Folge ffnen sich spannungsgesteuerte Calciumionenkanle.
Der Calciumioneneinstrom fhrt zu einer gesteigerter Ca2+ Freisetzung aus dem ER.
Ca2+ ermglicht eine Exozytose von Insulin.
Stoffwechselwirkungen von Insulin
Kohlenhydratstoffwechsel
Glucosetransport (GLUT4)
Glykolyse, Gluconegenese, Glykogensynthese, Glykogenolyse
Lipidstoffwechsel
Lipolyse
FS Oxidation
FS- und Triglyceridsynthese
Proteinstoffwechsel
zellulre ASaufnahme
Proteinsynthese (mToR)

Abbildung 15: Signaltransduktion durch IR

Signaltransduktion

Regulierung Genexpression
1. Remodelling des Chromatins
2.
Kontrolle bei der Transkription
3.
Kontrolle durch Prozessierung
4.
Kontrolle durch Transport
5.
Kontrolle durch Stabilitt der
mRNA
6.
Translationale Kontrolle der
Proteinsynthese
7.
posttranslationale Kontrolle
der Proteinaktivitt
8.
Proteinabbau
Transkriptionsfaktoren binden
an der TATA- Box an den
Promotor
RNA- Polymerase II bindet
Weitere Transkriptionsfaktoren
kommen dazu
Beginn der Genexpression

Koordinierung der Genexpression


Einschaltung von mehreren Genen zur selben Zeit (z.B. als Stressantwort)
Gene in Form eines Operons angeordnet (von einem einzigen Promotor kontrolliert, aber SREs
(Stress- Response- Elemente) in der Nhe
Transkriptionsfaktor (regulatorisches Protein bindet dort und initiiert Genexpression
Epigenetik
Conrad Hal Waddington (1905-1975)
Beobachtung von Vererbungsmuster, die sich nicht durch die Mendel'sche Vererbungslehre erklren
lassen
Fragestellung der Epigenetik
Wie entwickeln sich bei gleicher genetischer Ausstattung von Zellen unterschiedliche
Genexpressionsmuster, die bei der Zellteilung stabil vererbt werden knnen?
Entwicklung unterschiedlicher Krperzellen aus embryonalen Stammzellen?
Wirken Umweltfaktoren (Ernhrung, Sport, ) ber epigenetische Mechanismen?
Epigenetische Genregulation
DNA- Methylierung
1-5% der Cytosine durch Methylierung modif iziert
Besonders bei Cytosinen, die neben Guaninen liegen (CpG- Inseln)
DNA- Methyltransferase (DMT)

Vererbung: Maintenance Metyhlase


Reversibilitt: Demethylase
1. Die DNA- Methylase katalysiert die Bildung von 5- Methylcytosin in CpG- Regionen. Die
Transkription wird dadurch blockiert.
2. Nach der DNA- Replikation sind die Cytosine im neuen Strang nicht methyliert.
3. die Maintenance Methylase katalysiert die Methylierung von Cytosin im neuen Strang.
4. Die Demethylase entfernt die Methylgruppen. Die Transkription wird aktiviert.
DNA Methylierung am Promotor

DNA Methylierung sorgt meistens fr eine Deaktivierung (Stilllegung)

Histon- Modif ikationen


positiv geladene AS (Lysin) an den Histonschwnzen
Histon- Acetyltransferasen (HATs)

Acetyl- Lysin

Ladungsnderung

Affinitt der Histone zur DNA nimmt ab

Nucleosom ffnet sich


1. Modif izierung der Histone durch Histon- Acetyltransferase lockert die Befestigung des
Nucleosoms an der DNA.
2. Remodeling Proteine binden und lsen die Nucleosomenstruktur auf.
3. Jetzt kann der Transkriptionskomplex binden und die Transkription beginnt.
DeAcetylierung
Aktivierung der Transkription
Acetylierung (Histon- Deacetylasen, HDACs)
Reprimierung der Transkription
daneben:
Histonmethylierungen (Histon- Methyltransferasen, HMTs)
Phosphorylierung
Ubiqitinierung
Was bestimmt die epigenetischen Vernderungen?
Zwillingsstudien
identische Genome
identische Epigenome?
Beitrag der Genetik fr Alters- assoziierte Erkrankungen
Umwelt, Genetik & KHK
20966 Zwillinge (Schweden)
4007 KHK- Todesflle (2208 Mnner, 1799
Frauen)
Einfluss der Genetik: bei Frauen 0.57, bei
Mnnern 0.38
der Einfuss der Genetik sinkt mit dem Alter,
insbesondere bei den Mnnern
Epigenetik und Krebsentstehung
Krebsentstehung mehr als nur Akkumulation
von Mutationen

Genspezif ische DNA- Hypermethylierung (in


Promotorbereichen von Tumorsupressorgenen)
oder Hypomythelierung

Globale DNA- Hypomethylierung


Vernderungen in den
Histonmodif ikationen
Verlust genomischer Prgung
Vernderung des Methylierungsmuster
schon sehr frh in der Tumorentwicklung
Biomarker fr Frherkennung (Blut,
Stuhl, )
Vidaza Medikament interagiert mit
DNA- Metyhltransferasen
(Hypermethylierung wird aufgehoben)

Ernhrung und Methylierung


SAM (S- Adenosyl- Methionin)
SAH (S- Adenosyl Homocystein)
Epigallocatechin- 3- gallat, Vitamin B6 und B12, Folat, Methionin, Cholin,
Epigallocatechin- 3- gallat

Agouti Mausmodell

Unterernhrung und Epigenetik


Niederlndischer Hungerwinter (1944)
1000kcal
580kcal
4.5 Mill. Menschen betroffen, 18.000 Tote auf
Grund von Unterernhrung
---> Dutch Famine Birth Cohort Study

Folat

Ernhrung und Schwangerschaft

Genetische Prgung
fr eine kleine Anzahl von Genen ist es wichtig, ob sie vom Vater oder von der Mutter vererbt wurde
Vterlich vererbte Kopie aktiv, whrend die mtterliche Kopie still gelegt wurde
Genomic
imprinting
Chromosom 15, Region 15q11
unterschiedliche Prgung in den weiblichen und mnnlichen Gameten
Chromosomale Deletion
nur weibl. Oder mnnliches Prgungsmuster wird vererbt
Nur Mnnliches Muster vorhanden: Angelman- Syndrom (Epilepsie, Tremor, stndig lachender
Gesichtsausdruck)
nur weibliches Muster vorhanden: Prader- Willi- Syndrom (Muskelschwche, Fettleibigkeit)
Inaktivierung des X- Chromosoms
Euchromatin (aktive DNA) Heterochromatin (kondensiert)
weibliches Individuum 2 X- Chromosomen, mnnliches Individuum nur 1 X- Chromosom

Unterscheidung in der Gendosis der X- gekoppelten Gene

Dennoch: Transkriptionsrate bei den Geschlechtern ident

Inaktivierung einer Kopie des X- Chromosoms bei weiblichem Embryo (Barr- Krperchen, stark
methylierte DNA)

Auswahl rein zufllig

MicroRNAs (miRNAs)

TCF7L2 (TCF4)
Transkriptions Faktor 4
Wnt signaling pathway
Assoziiert mit DMT2
Mediterrane Dit und (Epi-) Genetik
Polymorphismus
Risiko
Epigenetische Mechanismen
DNA Methylierung
Histon Modif ikation
miRNA Expression

Wie Nahrung unser Erbgut beeinflusst


http://www.youtube.com/watch?v=mOEveMhLfX0
Nutrigenomik: Effekte der Nahrung auf
Genexpression
Transkriptomics
Humanstudien
Blutproben (Vollblut,
PBMCs, Subfraktionen, )
Biopsien (Fett, Muskel)
Tierstudien: Einzelne Organe/
Gewebe
Zellkulturstudien
Warum PBMCs?
Untersuchungsgegenstand:
Genexpressionsvernderungen
durch Nhrstoffe/ Nahrungsmittel
Vernderungen grundstzlich
spezif isch fr einzelne Zelltypen
Besonders interessant: Leber, Muskel, Fettgewebe

PBMCs wandern ber den Blutstrom zu verschiedenen Geweben

Infiltration der Gewebe

Reflexion vieler Vorgnge in anderen Geweben (Crosstalk)

Abbildung 16: cDNA Microarray


Bei Sugern Bildung von Doppelbindungen an
hheren Kohlenstoffatomen als C9 nicht
mglich
Aufnahme mit Nahrung

Elongation (Hinzufgen von C- Atomen)


Desaturierung (Hinzufgen von DB)

FS- Zusammensetzung

Abbildung 17: Microarray

Studienteilnehmer
TMD (Traditional Mediterranean Diet)
VOO (virgin olive oil, polyphenols
328mg/kg)
WOO (washed olive oil, polyphenols
55mg/kg)
Intervention (5 Wochen)
hard gelatin capsule containing
6.3 mg reservatrol (daily dose
equivalent to 4l red wine)
tomato extract containing
3.75mg lycopene (like 500ml
tomate juice)
94.5mg green tea extract
90.7mg a- tocopherol
125mg vitamin C
soft gel capsule containing
1200mg cold water fish oil (380mg EPA, 260mg DHA, 60mg other polyunsaturated fatty
acids)
Placebo contained
365mg microcrystalline cellulose
1360mg soy lecithin
Nutrigenetik: Zusammenhang zwischen genetischer Varianz und ihre Auswirkung auf ernhrungsbedingte
Prozesse
Nahrungsbedingt Einflsse
Genotypisierung:
meist Zellen der Mundschleimhaut oder Blutzellen
Identif ikation von genetischen Varianten
Kandidatengene (ernhrungsrelevante Gene)
Arrays, Sequenzierung (genomweite Assoziationsstudien)
vom Human Genome Project zum HapMap- Projekt
Sequenzierung von 1000 Personen (unterschiedliche Ethnien und geographische Regionen)
SNPs in kodierenden Regionen mit einer Hufigkeit >1% werden katalogisiert
Haplotypen
Genetische Varianten/ Polymorphismen
Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs)
ca. 2/3 der SNPs durch Austausch von Cytosin durch Thymin (Cytosin hufig methyliert (5Methylcytosin)
spontan auftretende Desaminierung
Thymin)
Insertion/ Deletion
Tandemrepeats
Copy number variations
kodierende Gene knnen mehrfach bzw. unterschiedlich hufig im Genom vorkommen
Ernhrungsrelevante SNPs

Lactase
Neugeborene: Lactase- Phlorizin- Hydrolase (LPH)
Verwertung der Lacots (Muttermilch) als KHquelle
Bleibt nicht bei allen Menschen erhalten:
Lactoseintoleranz (ausgeprgte geographische Verteilung v.a. Sdliche Hemisphre, OAsien)
Lactasepersistenz v.a. In Nordeuropa (geht in Hand mit der Domestizierung von Rindern von
ca. 5000 Jahren
Selektionsvorteil)
Minichromosome Maintenance Gene 6 (MCM6)
LCT 1390 C > T Polymorphismus zu 90% mit dem Auftreten Lactasepersistenz assoziiert, aber 35%
hheres Risiko fr bergewicht
Speichel- Amylase (AMY1)

CNV (Copy number variant): 2-16 Kopien im humanen genom


positiver Zusammenhang zwischen Kopienanzahl und Amylase Konz. Im Speichel

hchster Strkeverzehr in Amerika, Russland, Australien, Europa


Apolopoprotein E
Apo E
Ligand des LDL- Rezeptors
Eliminierung des LDL aus Plasma
Versorgung der Zellen mit Cholesterol
Varianten:
E2: geringe LDL- Rezeptor- Affinitt, bindet bevorzugt HDL
E3: hohe LDL- Rezeptor- Affinitt, bindet bevorzugt HDL
E4: hohe LDL- Rezeptor- Affinitt, bindet bevorzugt VLDL und LDL (Assoziation mit
Ateriosklerose und Alzheimer)
Intervention:
Low- fat- diet (24% fat, 8% SFA, 59%KH)
high- fat, high SFA (38% fat, 18% SFA, 45% KH)
HSF diet supplemented with 3.45gDHA/d
Genomweite Assoziationsstudien
Identif izierung genetischer Determination von ernhrungs(mit)bedingten Erkrankungen (Adipositas,
Hypertonie, Diabetes, Ateriosklerose, Tumorerkrankungen)

K a nditatengenansatz
Genetische Determinanten

Sensor fr Nhrstoffangebot
je nach Nhrstoffangebot Anpassung der Zellen
Koordinierung von anabolen (energieverbrauchenden) und katabolen (-gewinnenden) Prozessen
mTOR Signalweg im Zentrum dieser Prozesse: frher: Mammalian Target of Rapamycin, heute
Mechanistic

Grundstzlich
Nhrstoffreiche Umgebung
Aktivierung von mTOR und damit von anabolen Prozessen
(Protein-, Lipid-, Nukleotidsynthese), Inhibierung von katabolen Prozessen (Autophagie)
Nhrstoffarme Umgebung
Inhibierung von mTOR
mTOR: Serin/ Threonin Kinase
mTORC1: Zellwachstum
Protein-, Lipid-, Nukleotidsynthese
Inhibierung von Autophagie
Substrate: Ribosomale S6 Kinase (S6K), Translations- Initiierungsfaktor 4E
Bindungsprotein (4E BP)
mTORC2:
Actinpolymerisation
Phosphorylierung von Akt, PKC , SGK
Nicht sensitiv fr Rapamycin
Glucose und Energieregulation
fr anabole Prozesse ist ATP notwendig
aus Glucose
Verringerung der Glucose oder der mitochondrialen Atmung

ADP/ ATP; AMP/ ATP

Sensor: AMPK (AMP- abhngige Proteinkinase)


AMPK inhibiert mTOR
Aminosuren
Mangel
Inaktivierung von mTOR
Glutmain, Leucin, Arginin am potentesten in der Aktivierung von mTOR
Aktivierung ber Rag GTPasen ( Rheb GTPasen bei Glucose)
mTOR und Fasten
Glucose- und Asspiegel im Blut sink t
Insulin sinkt
AMP/ ATP steigt
Inhibierung von mTOR
Aktivierung der Autophagie/ Mitophagie (Autophagie von Mitochondrien)
unmittelbare
Energiebereitstellung
Leber (Recycling von Glyogen, Proteinen und Mitochondrien)
Muskel (AS
von Leber aufgenommen (Ala)
Glucose
Fettgewebe (Lipide
freie FS
b- Oxidation in Muskel und Leber)
mTOR und Krebs

mTOR und Altern

ROS (Reaktive Sauerstoffspezies)

Intrazellulre ROS

Antioxidative Verteidiung

Oxidativer Stress und bergewicht

Nf B- Signalweg
Transkriptionsfaktor
Weitgehend in allen Zelltypen experimentiert
Vielzahl von Stimuli
Westenliche Rolle bei Immunantwort, entzndlichen Prozesse, Stessantwort,
ROS- Nf B Crosstalk

Nf B Aktivierung

Chronic low- grade inflammation

Diseasosome of physical inactivity

Systemische inflammatorische Marker


erhht bei bergewicht, Typ 2 Diabetes, kardiovaskulren Erkranungen
postiv assoziiert mit Insulinresitenz

Leukozyten
Akutphaseproteine: Hs- CRP, Serum amyloid A (SAA)
Gerinnungsfaktoren: Plasminogen Activator Inhibitor 1, Fibrinogen
Pro- inflammatorische Zytokine: TNF- a, IL1- b, IL6
Inflammation und Fettgewebe

Anti- inflammatorische Therapie von T2DM?


Blockierung von IL- 1b: Anakrina, Gevokizumab,
Verbesserung der b- Zellfunktion
Aspirin, Salizylat, Salsalat: Verbesserung der
glykmischen Kontrolle (ber NfkB)
Anti- TNFa: nur Pilotstudien, nicht erfolgreich um
Insulinsensitivitt bei T2DM zu verbessern
(schon bei rheumatischer Polyarthritis)
Aufschluss/ Homogenisation
Isolation
Konzentrationsbestimmung
Anwendung
Aufschlussmethoden
Wahl des Verfahrens in Abhngig von:
Art des Probenmaterials (Pflanzen, tier.
Gewebe, Insekten)
zu isolierender Probenmenge
Probenzahl (paralleler Aufschluss mehrerer
Proben)
Ultraschall
osmotsiches Verfahren
Freeze- Thaw Verfahren
Mrser und Pistill
Kugelmhle (Kugeln aus Zirkonia oder Edelstahl)
Blender (schnell rotierende Messer, 1ml
-100L)
DNA- Isolierung
Herausforderungen:
DNA sehr langes homogenes
Molekl, teilweise sehr dicht
gepackt
Fragmentierung sehr leicht
mglich
Trennung von anderen
zellulren Komponenten (RNA,
Proteine, Lipide)
Dnasen/ Rnasen
bauen DNA (RNA) ab
Dnasen einfacher zu inaktivieren (Abhngigkeit von zweiwertigen Kationen
Autoklavierung + Backen (>8h bei 180C)
Behandlung mit Diethylpyrocarbonat (DEPC)
Schaffung eines serparaten Teils im Labor fr DNA / RNA Arbeiten

+ EDTA)

Strstoffe

Grundlegende Schritte:
Lyse (Aufbrechen der Zelle/ Zellkerns) & Homogenisierung (Detergenz)
Denaturierung von Proteinen und Nukleoprotein- Komplexen (Protease/
Denaturierungsagenz)
Inaktivierung von endogenen Nukleasen (sog. DN asen)
Isolierung und Aufreinigung der DNA (Abtrennung von Proteinen, RNAs, )
Denaturierungssubstanzen
ionische Detergentien (SDS) brechen hydrophobe Bindungen und Wasserstoffbrcken auf
Chaotrope Reagenzien (Harnstoff, Guanidinhydrochlorid, Phenol) entfernen Hydrathllen von
Biomoleklen, pos. geladene Salze knnen Salzbrcken bilden
Reduzierende Agenzien zum Aufbrechen von Disulf idbindungen
Salze interagieren mit geladenen Gruppen und erhhen die Proteinlslichkeit
Wrme bricht Wasserstoffbrckenbindungen und unpolare Bindungen auf
(Protease (Proteinase K) und RN ase)
Mglichkeiten zur Abtrennung von Proteinen und Zellrckstnden:
Organische Extraktion
DNA ist polar (neg. geladen durch Phosphatrckgrat)
unlslich in organischen LM
Traditoniell: Phenol/ Chloroform Extraktion
DNA
wssrigen Phase (oben)
Denaturierte Proteine
organische Phase
(unten)
1:1 Phenol: Chloroform oder 25: 24 : 1
Phenol: Chloroform : Isoamyl- Alkohol
Phenol: denaturiert Proteine
Bildung einer
festen Interphase zwischen organischer und
wssriger Phase
Chloroform: erhht die Dichte der
organischen Phase
Isoamyl- Alkohol: verhindet Schaumbildung
Aussalzen/ Ethanolfllung
am hufigsten verwendet
70% EtOH (1 vol DNA Lsg + 2vol 96% (v/v)
Ethanol
Ethanol entzieht der DNA die Hydrathlle,
neg. geladene Phosphatgruppen bilden z.B.
mit Na+ ein Salz
DNA wird przipitiert
Reinigungschritt
unerwnschte Stoffe werden entfernt
DNA/ RNA wird konzentriert
berfhrung in neuen Puffer mglich
Isopropanolfllung
Finale Konzentration 40-50%
Hufig eiskalt, 30 min. bei -20

Zentrifugation
waschen mit 70%
Ethanol
Zucker und NaCl
werden mitgefllt
nicht so effizient
PEG (Polyethylenglykol)
Fllung
schwer zu entfernen
strt viele Enzymreaktionen
Selektive Bindung von DNA an
Hilfsmaterial
Anionenaustauscher
(Dextran, Cellulose mit
pos. geladenen
Gruppen): Strke der
Bindung fr DNA, RNA
und Proteine ist
unterschiedlich und vom pH
und der Ionenstrke des
Puffers abhngig
Silikat Sulchen: binden in
der Gegenwart hoher
Konzentrationen chaotroper
Salze spezif isch DNA, die
nach dem Waschen
problemlos mit H2O oder TePuffer eluiert und direkt
weiterverwendet werden
kann
+ Schnell, einfach, keine org.
LM, automatisierbar
- DNA Fragmentierung
Vielzahl an Kits
meist spezif isch fr bestimmte
Gewebe/ Ausgangsproben
fr verschiedene Gren (Mini/ Midi/ Maxi Preps)
Low budget- Marktfhrer
Automatisierung

Isolation von hochmolekularer DNA


stark sensibel gegenber Scherkrften
Entstehen beim Vortexen, wiederholten Auf- und Abpipettieren,
Meist:
CTAB- Fllung
Zugabe von EtOH im berschuss
DNA fllt aus und kann auf einem Glasstbchen aufgerollt werden
vorsichtig trocknen, Lsen in H20 fr mehrere Tage bei 4

Gnige RNA Methoden

RNA- Isolierung
hnliche Prinzipien wie bei DNA Isolierung
Aber: hohe Sensitivitt gegenber RN asen
Handschuhe
eigener Laborbereich
eigene Reagenzien (RN ase frei, nur fr diesen Zweck)
Autoklavieren von Gefen, dann backen
Ev. Verwendung von Gefen von DEPC vor dem Autoklavieren
asen, zerfllt in H2O und EtOH
DEPC Behandlung

Inaktivierung der RN

Tipps zur Erzielung hoher Ausbeute


mglichst frische Proben
mglichst schnelle Extraktion
DNA- Modif izierung (unerwnscht) werden durch hohe DNA Konzentrationen gehemmt
Lagerung DNA: aufgereinigte dsDNA bei 4C in H2O oder TE Puffer, erst bei Lagerung >1 Woche
-20C
Quantif izierung von Nukleinsuren
zur Bestimmung der Menge, aber auch Qualitt (Reinheit)
Methoden unterscheiden sich in: Arbeitsaufwand, Kosten, Genauigkeit
Photometrische Methoden
Aromatische Strukturen absorbieren Licht bei bestimmter Wellenlnge
Basen der Nukleinsuren bei 260nm
AS mit aromatischen Seitenketten bei 280nm
Spektrophotometer
unspezif isch ber weiten Wellenlngenbereich (UV- Bereich notwendig)
spezif isch fr DNA/ RNA/ Proteine
Spektrophotometer vs Nanodrop
Unterschied v.a. In der notwendigen Probenmenge
Klassischer Spektrophotometer (50 l 1ml)
Nanodrop (0.5 5 l)
Verbrauchsmaterial
Quarz Kvette (Spektrophotometer)
Keines auer Pipettenspitze
Konzentrationsbestimmung
aus der optischen Dichte (Absorption) bei 260 nm (OD260)

Qualittsbestimmung

andere Methoden zur Quantif izierung


Agarosegel
0.5 2%-ige Agarosegele fr DNA- Fragmente zwischen 300 und 5000 Basen
Groe DNA- Fragmente durchlaufen Agarosegele langsamer als kleine
Frbung der DNA
Ehtidiumbromid Giftig! Dringt auch durch normale Handschuhe
Nitrilhandschuhe
SYBR Green I, SYBR Green II, OliGreen oder PicoGreen (hhere Empfindlichkeit,
aber teurer)
Grenstandards (DNA- Leiter)

Quantif izerungs semiquantitiv ber


entsprechende Software
RNA- Agarosegel
RNA neigt zur Ausbildung von
Sekundrstoffen (Formaldehyd oder
DMSO und Glyoxal)
RNA Grenmarker
Gesamt- RNA besteht zu 80% aus
rRNA (Eukaryoten 18S, 28S rRNA)
mRNA unterschiedlich Lang
Schmier
Strstoffe:
Ethanol: die Banden ziehen Schweife hinter sich her, auch bei z.B. Isopropanol
Natriumchlorid: Banden, die nach oben gebogen sind und langsamer laufen
auch Ammoniumacetat (Grenverschiebung, gebogene Banden) und CTAB (keine
distinkten Banden) verursachen Probleme
Fluorometrische Bestimmung (Hoechst 33258)
Bioanalyzer

Polymerasekettenreaktion (PCR)
Prinzip der PCR
Denaturierung: Trennung der
doppelstrngigen Ausgangs- DNA
(Template DNA)
Anlagerung (Annealing): kurze DNAStcke (Primer, Sense- Antisense)
lagern sich an komplementren
Sequenzen der Ausgangs- DNA an
Elongation (Extension):
Thermostabile DNA Polymerase
baut die vorhandenen dNTPs
komplementr zur Ausgangs- DNA
beginnend bei den Primern ein
(72C)
Thermostabile DNA- Polymerasen
notwendig, damit man nicht nach
jedem Denatuierungsschritt die
Polymerase neu zugeben muss
Saiki et. al. Thermus aquaticus (thermostabiles grampos.
Bakterium, heie Quellen)
Taq Polymerase
Vielzahl an Polymerasen
Proofreading Polymerase (mit Exonuclease Aktivitt)
PhusionTM (fusioniert mit dsDNA Bindedomne
sehr
lange Amplif ikate und hohe Synthesegeschwindigkeit)
Puffer und Primer
blicher Weise vom Hersteller der Polymerase mitgeliefert
Tris- Hcl
MgCl2, Kcl
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Primer (DNA- Stcke)
Typischer Weise zwischen 15 und 30 Basen lang (-150
Basen)
selbst designed
kommerziell erhltlich
Annealing Temperatur 3-5C unter der Schmelztemp.,
ergibt ishc aus Basensequenz und Lnge des Primers

PCR Gerte
Thermocycler: zyklisch arbeitende Thermoelemente
Gradientcycler: Temperaturbereich (z.B. wenn die genaue
Annealingtemp. Unbekannt ist)
Speedcycler: schnellere Heizraten (10C/s statt 2C/s)
Gradienten PCR:
mehrere gleiche PCR Anstze
Annealing Temp. Fr jede Probe unterschiedlich
Nested PCR:
wenn unspezfische Amplif ikate auftreten
bei niedriger Effizienz der Amplif ikation
erste PCR wie Standard PCR
1/10 bis 1/100 der des ersten PCR Ansatzes fr 2. PCR mit
neuen Primern, die innerhalb des
amplif izierten DNA- Bereiches liegt
Multiplex PCR
verschiedene Breiche der Ausgangs DNA durch
unterschiedliche Primerpaare amplif iziert
Reverse Transkriptions PCR (RT- PCR)
2 Reaktionen, die nacheinander im gleichen
Reaktionsgef stattfinden
Reverse Transkription (Reverse
Transkriptase wandelt RNA in cDNA
(complementary DNA) um
PCR: Amplif ikation der cDNA
Quantitative PCR (qPCR)
Thermocycler + Fluereszenzphotometer

Messung der Menge der gebildeten DNA schon whrend der Amplif ikation in Echtzeit am Ende jedes
Zyklus (Real time PCR), bei herkmmlicher nur am Ende der Gesamtreaktion (Endpunkt PCR)
Kombination von RT und qPCR erlaubt die Quantif izierung von mRNA
Fluoreszenzfarbstoffe
SYBR Green (unspezfisch)
TaqMan (spezif isch)

TaqMan SNP Genotyping

Anwendung der PCR


Analyse und Klonierung von DNA- Fragmenten
Molekulare Diagnostik
Identifzierung von Bakterien, Parasiten,
Erkennung von Mutationen/ Polymorphismen
Forensische Medizin
Vaterschaftstest
Lebensmittel- Analytik
Nachweis von gentechnis vernderten Organismen
DNA- Sequenzierung
Sequenzierung nach Sanger (Didesoxy- Methode)
Denaturierung der DNA
Sequenzierprimer bindet an DNA
dNTP (ein Teil davon fluoresenzmakiert ohne OH- Gruppe am 3' Ende) werden eingebaut
Auftrennung nach Gre

Weitere Methoden
Identif ikation einer bestimmten Nukleinsure aus einem Gemisch an Nukleinsuren
Southern Blot (DNA)

Northern Blot (RNA)


Herstellung einer Sonde
Makiertes DNA Molekl, das an eine komplentre Sequenz bindet und diese sichtbar
machen kann
30- 40 Basen bis zu 500 Basen
Makierung
Radioaktiv (32p)
indirekte Makierung (Molekl wird eingebaut, das spter mit einem
Antikrper nachgewiesen werden kann, Biotin, Fluorescein, Digoxygenin)
Fluorophore (Cy3, Cy5)
Hybridisierung
Absichtliche sequenz- spezif ische Zusammenlagerung zwischen 2 komplentren NucleinStrngen
in vitro
einer der Partner ist auf einer festen Oberflche immobilisiert
Anlagerung der NS
Fixierung an der Trgeroberflche (ca. 2h bei 80C, UV Crosslinking)
Blocken der freien Oberflche (Absttigung mit fremder DNA)
eigentliche Hybridisierung der Sonde (42 ber mehrere Stunden)
Abwaschen der berschssigen Sonde
Detektion
DNA- Chips oder Microarrays

Proteinaufreinigung
Homogenisation
Extraktion von Proteinen
Dialyse und Konzentrierung
Weitere Aufreinigungsschritte
Quantif izierung von Proteinen
Ausgangsmaterial?
Welche Menge des Proteins wird
bentigt?
Wie rein muss das gesuchte
Protein sein?
Muss das Protein noch
biologisch aktiv sein?
Vorerfahrung (eigenes Labor,
Literatur)?
Aufschlussverfahren
mechanisch und nicht
mechanisch
Proteasen & Phenoloxidasen
Bauen Proteine ab (Hydrolyse der Peptidbindung)
Endopeptidasen (Trypsin Arg, Lys; Chymotrypsin
Trp, Tyr, Phe; Pepsin, )
Exopeptidasen (nicht spezif isch, bauen Proteine vom Ende her ab)
uerst stabil
normale Funktion: Abwehr von Phatogenen

in unterschiedlichen Mengen im Ausgangsmaterial vorhanden


Proteaseinhibitoren (meist:
Verwendung von
Proteaseinhibitor Cocktail)
Extraktion aus Pflanzen/
Pilzen
bei Isolation von
Proteinen aus
Pflanzen oder Pilzen
Enthalten
Polyphenole
(Quercetin,
Kaffeinsure, )
Polyphenol- ProteinAggregate
unlslich, fallen aus
Oxidation durch
Polyphenoloxidasen,
Peroxidasen,

Zusatz von synthetischen Polymeren (PVPP, PVP)

Zusatz von Oxidationshemmern (Diethyldithiocarbamat (DIECA), Dithiothreitol (DTT),...)


Homogenisationspuffer
mglichst physiologische
Umgebung (pH,
Salzgehalt, )
Lagerbar, preiswert,
keinen Einfluss auf
nachfolgende Analyse
(Phosphatpuffer nicht
geeignet fr ATP abh.
Enzyme)
Weiterverarbeitung
Abtrennen von Zell- und
Gewebetrmmern
(Filtern, Zentrifugation)
Rohextrakt
Fraktionierung
Entfernung lslicher Zellbestandteile (Kh, Nukleinsure, )
Fraktionierung des Proteingemisches
Reversible oder irreversible Proteinfllung (Abtrennung unerwnschter Substanzen,
Konzentrierung, Umpuffern)
Ammoniumsulfat (Verlust der Hydrathlle)
Polyethylenglykol
Butanol, Aceton
Trichloressigsure
Salting out (hohe Konz. An Salzen) und in (destilliertes Wasser)
Dialyse
Diffundierung ber eine
semi- permeable
Membran
Niedermolekulare
Teilchen (Salze, )
knnen diffundieren,
groe (Proteine) nicht
Pufferaustausch
Einstellen eines
Gleichgewichts (mehrere
Stunden bei 4C)
Ultrafiltration
Ultrafiltrationszelle
Effizient, schnell
Chromatographische Auftrennung
Auftrennung eines Gemisches durch Wechselwirkung eines Stoffes in der mobilen Phase mit einer
stationren Phase
Flssigkeitschromatographie (WW mit Sure)
Ionenaustausch chromatographie (Proteinladung bestimmt wie lange das Protein

interagiert)
Affinittschromatographie (sehr spezif ische Interaktionen z.B. Enzym Ligand)
Gelf iltration (porse Matrix, groe Mol wandern schnell durch, kleine verfangen sich
in der Matrix)
Detektion der Proteine (Chromatogramm)
UV- Detektor
Fluoreszenzdetektor

Quantif izierung
Absorption bei 280nm
ungenau
Farbstoffe, die mit Protein reagieren
Proteinbestimmung nach Bradford: Bindung von Coomassie Brilliant Blue an Proteine (eig.
Arg) Absorptionsmax. Bei 595nm
Proteinbestimmung nach Lowry
BCA- Test (Bicinchoninsure): Proteine bilden mit Cu2+ im alkalischen Milieu einen
Komplex, Reduktion des Cu2+ zu Cu+, Bilden mit BCA einen Farbkomplex, Absorptionsmax.
Bei 562nm
Tests und Strstoffe
der zu verwendende
Test ist abhngig
von Stoffen aus der
Isolierung

Gelektrophorese
Gellauf wird durch folgende
Eigenschaften bestimmt:
Gre, Ladung (abh. Von
pH), Form
Polyacrylamidelektrophorese
(PAGE)
Ablauf
Probenvorbereitung
Herstellen des Gels:
Ansetzen Gellsung
(Acrylamid, Bisacrylamidm,
APS, TEMED)
Auftragen der Proben
Gellauf
Sichtbarmachen der
Proteinbanden im Gel

SDS- Page
Auftrennung nach Gre
Maskierung der anderen Eigenschaften
Denaturierungs der Proteine (Aufkochen)

Umhllung mit Detergens (SDS) zur Maskierung der Ladung


DTT spaltet bei Hitze Disulf idbrcken auf
Gelladung und lauf
Auftragen einer gleichen Menge an Protein
Anlegung von Spannung (100- 200 V)
Stromstrke ca. 12-15mA

Frbemethoden

Isoelektrische Fokussierung (IEF)


Proteine werden auf Grund
ihres isoelektrischen Punkts
aufgetrennt
pH- Gradient wird im PA- Gel
erzeugt (Ampholyt Gemische
fr bestimmten pH- Bereich)
Proteine laufen im Gel so weit
bis der umgebene pH- Wert
ihrem isoelektrischen Punkt
entspricht
2D Gelelektrophorese (Proteomik)

Abbildung 18: sauer

Immunprzipition
Antigen und Antikrper (polyklonal)
werden in Lsung vermischt
Bildung von Aggregaten
fallen in
Abh. Von Konz. An Antigen und
Antikrper aus: optimale Konz. In der
quivalenzzone
Zentrifugation

IEP

basisch

Immunbiochemische Methoden

Trgerbasierte immunbiochemische Verfahren

Trgerbasierte Immunfrbung

Trgermaterialen

Makierungsverfahren

Meist werden mehrstufige Verfahren eingesetzt, die zu Verstrkung des primren Signals fhren. Es muss
ausgeschlossen werden, dass der sekundre Detektionsantiokrper unspezif isch an weitere Proteine bindet.
Sandwich ELISA: der Fngerantikrper wird an Platte gebunden. Das Antigen im Proteingemisch bindet an
diesen. Alle anderen Proteine werden ausgewaschen. Die Detektion erfolgt mit einem 2. makiertem
Antikrper, dem Detektionsantikrper, dessen Signal proportional zur Menge des gebundenem Antigens ist.
Kompetitiver ELISA: eine bekannte Menge eines makeritem Anitgens konkurriert mit unmakiertem Antigen
der zu untersuchenden Probe um die Bindun gan den gekoppelten Antikrper. Je mehr Antigen in der Probe,
desto weniger makiertes Antigen kann binden und desto schwcher ist die resultierende Frbung. Je
weniger Antigen in der Probe, desto strker die Signalstrke. Viele Varianten
wichtig: Nachweis von
Antigenen im Blut Antikrper aus der Blutprobe kompetieren mit den makierten um das immobilisierte
Antigen. Wenn Infektion (viele Antikrper im Blut)
Signal schwach.
Western Blot: nach eigentlichem Transfer aus dem Gel
auf eine Membran werden alle freien Bindungsstellen
abgesttigt und nachfolgend durch den Einsatz von
Antikrpern wird ein spezif isches Protein identif iziert.
Selterner: Dot Plot
das Proteine wird ohne vorherige
Auftrennung im Gel auf eine Nitrozellulosemembran
getropft
danach Immunfrbung

Transfer der Proteine vom Geld auf Membran im


elektrischen Feld
Wet Blot
Semi Dry Blot

Immunittschromatographie: Antikrper wird an eine


Sulenmatrix bebunden, dadurch kann Antigen sehr
spezif isch aufgereingt werden. Oft auf polyklonale Seren
ber Affinittschromatographie aufgereinigt Antigen
wird an Sule gekoppelt. Die erhaltenen Anitkrper
werden als affinittsgereingt bezeichnet.

Durchlfusszytometrie

FACS Zellsorter
Die Zellen werden aufgrund ihrer OberflchenAntigene durch fluoresenzgekoppelte Antikrper
makiert. Die Fluoreszenz wird in einer
Durchflusskapillare detektiert und die Zellen am Ende
der Kapillare in elektrisch geladene Trpfchen
eingefasst. Im elektrischen Feld werden die makierten
Zellen abgelenkt, whrend leere Tropfen und
unmakierte Zellen unbeeinflusst das Feld passieren.