Genética Molecular Procariotas y Eucariotas

Gentica
Molecular.
Biologa. Curso 2007-08.

Carlos F. R.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 2
NDICE
Tema 1: La Transcripcin Procariota.
Tema 2: La Transcripcin Procariota: Regulacin.
Problemas.
Tema 3: La Transcripcin Eucariota I.
Problemas.
Tema 4: La Transcripcin Eucariota II.
Problemas.
Tema 5: La Transcripcin Eucariota III.
Extra Tema 5: Tcnicas.
Problemas.
Tema 6: La Transcripcin Eucariota IV.
Problemas.
Tema 7: La Traduccin.
Tema 8: La Replicacin Procariota.
Problemas.
Tema 9: La Replicacin Eucariota.
Tema 10: Reparacin de las Mutaciones en Procariotas I.
Tema 11: Reparacin de las Mutaciones en Procariotas II.
Problemas.
Tema 12: Reparacin de las Mutaciones en Eucariotas.
Problemas.
Tema 13: Recombinacin General: Introduccin.
Tema 14: Recombinacin General: Mecanismo Enzimtico.
Problemas.
Tema 15: Recombinacin de Sitio Especfico.
Tema 16: Transposicin Procariota.
Problemas.
Tema 17: Transposicin Eucariota.
Tema 18: Biologa de los Retrovirus.
Tema 19: Retrotransposones y Retrogenes.
Problemas.
Tema 20: Inmunoglobulinas.
Problemas.
Exmenes.
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TEMA 1: LA TRANSCRIPCIN PROCARIOTA.

La transcripcin consiste en sintetizar RNA a partir de
DNA. El dsDNA es el DNA de doble cadena (y el ssDNA, el DNA
de cadena simple). Por consenso, siempre nos dan el extremo
5-P arriba a la izquierda. Abajo suyo hay un 3-OH.
La cadena sense del DNA es la que NO contiene la
informacin, es decir, la que no lee la RNA Polimerasa. La
cadena antisense es la que tiene la informacin para
pasar a gen, es leda por la RNA Polimerasa.
La transcripcin siempre es en 53 de la cadena que se
sintetiza.
Hay 3 etapas en la Transcripcin:
- Iniciacin: La RNA Polimerasa se une al promotor, abre la
burbuja e inicia la transcripcin.
- Elongacin: La RNA Polimerasa se desplaza elongando el
RNA.
- Terminacin: La RNA Polimerasa, el RNA y el DNA se
separan.
1. La Iniciacin.
El promotor es la secuencia de bases a la cual se une la
RNA polimerasa. Forma parte del gen, en la regin
upstream del gen (no se transcribe, regula, est a 5).
El downstream es desde el inicio de la transcripcin
hasta el final.
La base +1 en el DNA se asigna al primer nt que se
encuentra en el RNA, es decir, es el primer nt que se
transcribe. La numeracin de las bases del promotor, por
tanto, ser negativa.
El promotor tiene una secuencia de bases hacia la cual la
RNA polimerasa tiene mayor o menor afinidad. Pero siempre
tiene
unas
cajas
de
secuencia
consenso,
que
es
invariable, en la misma posicin. A saber:
Caja -35. Dominio

de reconocimiento.
TATA box caja-10

Pribnow Box
Dominio de desenrollamiento.
Caja CAT. En el 90% de los

casos, la base +1 (la primera
en el RNA) es una A.
No se procesar el RNA.
Las distancias entre la caja -35 y la tata box, y entre

la tata box y la caja CAT son de 16 a 19 pb y de 5 a 9
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pb respectivamente. Siempre se debe mantener ste nmero de

bases que las separe. Lo que se puede variar es la
secuencia de bases que contienen. As, si mutamos stas
bases podemos obtener mutaciones UP si son bases hacia
las cuales la RNA Polimerasa tiene alta afinidad:
incrementa la tasa de transcripcin (DOMINANTE, promotor
fuerte); mientras que sern mutaciones DOWN si son bases
hacia las cuales la RNA Polimerasa tiene poca afinidad:
baja tasa de transcripcin (RECESIVO, promotor dbil).
De ste modo, la RNA Polimerasa se une a la caja -35 y a
la tata box, desenrolla desde la tata box, se mueve
sobre el DNA sintetizando RNA complementario al DNA, en
53. Estrictamente, en la iniciacin se sintetizan unos
pequeos trnscritos abortivos (oligos de RNA no unido)
desde antes de -10, pero el RNA definitivo siempre se
sintetiza a partir de la base +1. Los promotores fuertes
tienen una durada pequea de la fase abortiva, al revs que
los dbiles. As se forma el complejo de transcripcin
cerrado (dsDNA + RNA polimerasa). A partir del inicio de
la transcripcin se forma el complejo ternario (dsDNA +
RNA polimerasa + RNA). Una vez hechas las transcripciones
abortivas e iniciada la elongacin, se pueden separar
subunidades de la RNA polimerasa que ya no sean necesarias
para elongar.
La RNA polimerasa Procariota (slo hay 1 tipo):
- Subunidades : Ensamblan. Interaccionan con prots. reguladoras.
Reconocen a las secuencias UP
ELEMENTS(estn en el promotor,
aumentan la tasa de transcripcin).
- Subunidades y : Reclutan
rNTP.
Son
el
verdadero
centro
cataltico,
forman
enlaces
fosfodister.
- Subunidad : reconoce a la caja -35 con su dominio 4 y
a la tata box con su dominio 6. Las subunidades son
intercambiables, hay una diferente para cada gen.
2. La Elongacin.
Se aaden los rNTP complementarios al DNA antisense, en
53. Llega un momento en el que se pierde la subunidad
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, y ms adelante tambin se pierden las dos . Slo

queda el centro cataltico.
3. La Terminacin.
En Procariotas depende de secuencia seal. Se clasifican
segn si interviene cierta protena o no (Rho).
3.1. Terminacin Rho-Independiente Intrnseca: slo
necesita secuencias en el DNA, no interviene Rho. Cuando se
ha transcrito la secuencia en el RNA se para la
transcripcin, porque primero se forma un hairpin (o
loop) debido a una regin de bases complementarias entre
ellas, rica en GC (esto hace que pese ms el RNA).
Despus se transcribe una regin con muchos U, los cuales
tienen slo 2 enlaces con la A del DNA (la tensin que hace
el hairpin es suficiente) y se arranca el RNA.
3.2. Terminacin Rho-Dependiente Extrnseca: se

transcribe una secuencia llamada RUT (en el RNA) a la cual
se le une Rho. Est a 50-70 nt del codn STOP, en el 3UTR.
Rho es un hexmero que se desplaza 53 gastando ATP, a
una velocidad muy rpida. As llega a chocar con la RNA
polimerasa, hacindola saltar. Se rompen los enlaces de H2
entre el RNA y el DNA molde porque tambin tiene actividad
helicasa.
Tambin se forma en ste caso un hairpin rico en GC, pero
es insuficiente para hacer saltar el RNA. No hay cola de U.
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TEMA 2: LA TRANSCRIPCIN PROCARIOTA:

REGULACIN.
Los genes Procariotas se organizan en operones, ya que el
mRNA que producen es policistrnico (= tiene varios lugares
de inicio de la traduccin, cada uno con su STOP, y
codifica para varias protenas diferentes). A la regin
reguladora (en el Operador) se unen protenas represoras,
para hacer como un muro que impiden que fsicamente
avance la RNA Polimerasa (repasar sto de Gentica
General).
As, en Procariotas, el modelo tpico de regulacin es
mediante el Control Negativo (C-) de la transcripcin, en
el que por defecto las protenas represoras se unen a la
regin reguladora, ya que basalmente hay transcripcin. En
Eucariotas, sin embargo, es al revs: hay un Control
Positivo (C+) de la transcripcin, en el cual es necesario
activar
a
una
serie
de
molculas
(Factores
de
Transcripcin) para que pueda iniciarse la transcripcin,
ya que basalmente es inactiva.
Tambin encontramos en Procariotas (aparte de las protenas
represoras):
-el inductor: induce la transcripcin porque bloquea a la
protena represora. Lo es, por ejemplo, la lactosa y la
protena CAP (Catabolic-gene Activation Protein) activada.
Permiten un sistema de C- inducible por lactosa (bloquea al
represor y permite la transcripcin) y un sistema de C+
inducido por CAP (estimula a la RNA Polimerasa).
-el
correpresor:
estimula
a
la
protena
represora
bloqueando la transcripcin. Lo es, por ejemplo, el
triptfano. Permite un sistema de C- reprimible por
triptfano.
Por tanto:
Op. Lactosa: C- inducible por lac: Inductor + represor =
transcripcin. C+ inducido por CAP: Inductor + represor +
activador (CAP) = Mucha transcripcin.
Op. Trp: C- reprimible por trp: represor + correpresor = no
transcripcin.
No se conoce ningn opern donde haya un C+ reprimible, ya
que sera absurdo metablicamente.
Se comentarn a continuacin 4 ejemplos en los que la
regulacin de los genes Procariotas se lleva a cabo en
diferentes situaciones, usando diferentes estrategias.
Nota: Por una va metablica que no se comenta aqu, cuando hay mucha glucosa
= poco AMPc = poco CAP activado. Y al revs: poca glucosa = mucho AMPc = mucho
CAP activo. CAP + AMPc = CAP activado (= CRP segn algunos).
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1. EL OPERN ARABINOSA.
Contiene los genes (B, A y D) que metabolizan la arabinosa
para obtener energa. Se activa en presencia de arabinosa
(similar al opern lactosa: sistema de C- inducible por
arabinosa).
La protena C es la represora, y la protena CAP (con AMPc)

es la protena activadora. Basalmente, la protena C es
represor, pero al unirse a la arabinosa, no solo deja de
reprimir sin que se convierte en un activador de la
transcripcin y acta sinrgicamente a CRP (el CAP activado
se une a la regin CRP Binding Site, al lado del OI).
Para que haya transcripcin se necesita que no tengamos
glucosa en el medio (mucho CRP) y que haya arabinosa (se
inhibe la represin de la protena C). Si hay glucosa y
arabinosa no hay transcripcin porque falta el CRP (no hay
activador); y si no hay ni glucosa ni arabinosa tampoco hay
transcripcin porque la protena C est reprimiendo.
Las dianas de la protena C son AraI (con I1 y I2), AraO1
(con O1L y O1R) y AraO2.
Debido a que el Promotor de la protena C solapa con el
AraO1, se dice que la protena C regula su propia sntesis.
Basalmente se sintetiza protena C, y cuando su [ ] es
alta, se une a sus 3 dianas bloqueando la transcripcin;
mientras que si su [ ] es baja, se desengancha y se produce
ms protena C. Es un feedback -. Para regular la
transcripcin de AraC, la regin AraO2 es optativa.
La verdadera funcin de AraO2 es regular la transcripcin
de los genes BAD:
- cuando hay poca arabinosa y mucha glucosa, la protena
C se une a AraO1 y simultneamente a AraO2 y AraI, haciendo
un loop en el DNA. No funciona ningn promotor, porque se
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tapa fsicamente el contacto de CRP con la RNA Polimerasa

(la activara). Tampoco se sintetiza ms protena C.
Las 3 dianas de AraC son
AraO2, AraI (tiene I1 e
I2, la protena C se une
a I1) y AraO1 (tiene O1L
y O1R, la protena C se
una a ambos).
- cuando hay mucha arabinosa y sin glucosa, sucede que

la arabinosa se une a la protena C haciendo que no inhiba
y se vuelva activadora; no se puede unir a AraO2 ni a
AraO1, con lo cual hay ms protena C que hace de activador
(porque hay arabinosa). S que se puede unir a AraI (a sus
dos subregiones, I1 y I2), y acta sinrgicamente a CRP
(porque
no
hay
glucosa)
y
se
estimula
mucho
la
transcripcin de los genes BAD.
Se deshace el loop en el DNA, las subunidades de la RNA

polimerasa tocan a el CRP que
est unido al CRP Binding Site (un UP ELEMENT)y a la vez la
protena C unida a arabinosa es activador, hay mucha
transcripcin.
Molecularmente, la protena C es un homodmero. Por el
dominio Cterminal se une al DNA y por el dominio
Nterminal se une a la arabinosa y a otro monmero de
protena C.
As, cuando se forma el loop hay 4 monmeros de protena C
(=2 homodmeros); y cuando se deshace el loop hay 2
monmeros de protena C (=1 homodmero) unidos cada uno a
arabinosa.
2. LA RESPUESTA SOS EN E.COLI.
Sirve para detectar si hay mutaciones en el DNA, generando
masivamente enzimas que reparan el DNA. Basalmente esto
est reprimido y se activa slo con daos en el DNA.
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Implica a las protenas LexA y RecA (sta ltima es muy

importante, siempre tiene un pool basal en la clula).
Debido a que cuando hay lesiones en el DNA y se realiza la
reparacin (en muchos de los sistemas de reparacin, ver
Tema 11 y Tema 12), en un momento dado hay un fragmento de
ssDNA que es el sustrato de RecA. Unida as al ssDNA, RecA
empieza a moverse por todo el DNA en busca de la protena
LexA, la cual de manera constitutiva se ha expresado y est
unida a las cajas SOS (= operadores de LexA = dianas de
LexA dentro de los promotores de los genes SOS, est all
bloqueando la transcripcin). Una vez que RecA toca a LexA,
hace que LexA se separe del promotor y se autoproteolice.
Los genes que tenan LexA en el promotor bloqueando su
expresin eran UVR-A, UVR-B, RecA, LexA (reprime su propia
sntesis), los genes SOS. As toda la protena LexA
desaparece autoproteolizndose, ya sea la que haba
reprimiendo como la que aparece de nueva sntesis.
3. LA ESPORULACIN EN Bacillus subtilis.
Es muy similar a la de Bacillus antraci. La bact. se divide
por biparticin mittica, si las condiciones son ptimas.
Pero si las condiciones del medio son desfavorables,
entonces la bact. inicia el proceso de esporulacin. En l,
la bact. no se divide, sino que replica su DNA y forma una
pared sctum que separa dos compartimentos internos
cada uno de los cuales tiene un genoma. El compartimento
grande es la madre y el pequeo es la proespora (espora
incipiente que an no se ha separado).
Finalmente, la proespora se separa y se vuelve espora,
queda en estado de quiescencia y la madre se autolisa.
Todo ello se regula genticamente y el proceso lo empezamos
a estudiar cuando se ha formado la proespora incipiente,
con el sctum. El objetivo final del proceso es conseguir
que en la clula madre se activen los genes de autolisis y
la proespora active los genes para definir el sctum en
pared y as separarse.
A medida que se va avanzando por la cascada de sealizacin
se van cambiando las subunidades . De hecho, los genes que
se activan mientras avanza el proceso son los genes que
codifican para las subunidades especficas del siguiente
gen. Es la transcripcin diferencial, la RNA polimerasa
tiene diferentes en funcin del momento.
Las diferentes que aparecen son:
- A, E, K: han de quedar en la madre.
- H, F, G: han de quedar en la proespora.
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OJO: Las subunidades estn presentes por todos los

compartimentos,
pero
slo
son
funcionales
en
el
compartimento correspondiente gracias a la accin de
protenas secuestradoras que atrapan a la subunidad que
no corresponde al compartimiento.
stas protenas secuestradoras son:
-AA: basalmente fosforilada (inactiva) en la madre y en
la proespora. Se activa desfosforilndose cuando pasa
al compartimento de la hija.
-AB: basalmente activa en la madre y en la proespora.
Secuestra a la subunidad F en ambos compartimientos.
En la proespora, AB es secuestrada por AA y F queda
libre.
-Protenas del sptum:
Fosfatasa 2A.
Proteasa transmembrana activada por 2r.
Proteasa transmembrana activada por 4b.
(Ver esquema del funcionamiento en la siguiente pgina).
Hay dos puntos de control en todo el proceso para mantener
los ritmos de transcripcin de los genes de las subunidades
al ritmo correcto:
- Para que E se active al mismo tiempo que F, F en la
proespora transcribe para 2r, proteasa transmembrana
con dominio cataltico en la madre que activa a E.
- G en la proespora transcribe para 4b, que activa a
la proteasa del sptum que activa a K en la madre.
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CONDICIONES ADVERSAS (MUCHA T, CO2)
(extracelular)
SPTUM
MADRE
Quinasa
Termosensible
OFF
Quinasa
Termosensible
ON
Quinasa
Termosensible
OFF
SpoA-P ON (prot.
Master)
SpoA OFF
PROESPORA
Quinasa
Termosensible
ON
SpoA-P ON (prot.
Master)
SpoA OFF
inact
inact
AB
AB-F
AB
AB-F
AA
AA-P
Dom. Pasa
AA-AB
act
inact
Pi
act
Transcribe
para 2r
2r
E
Transcribe
para
Dom.
proteasa
act
Transcribe
para
G
act
Transcribe
para 4b
K
inact
4b
K
act
Dom.
proteasa
GENES
QUE
DETERMINAN LA
FORMACIN DE
LA PARED.
GENES QUE INICIAN

LA AUTOLISIS EN
LA MADRE.
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4. EL FAGO .
El fago lambda () es un virus atemperado, es decir, que
puede hacer el ciclo ltico (lisis) si decide matar a su
husped cuando se divide y as infectar a las clulas
vecinas, o bien puede hacer el ciclo lisognico (lisogenia)
cuando integra su genoma en el del husped (siempre en el
mismo sitio) cuando no se divide. El genoma de un virus
integrado en el genoma del husped recibe el nombre de
profago (fago = virus; bacterigafo = tipo de virus cuyo
husped es una bacteria).
Su genoma es lineal pero dentro del husped se circulariza
por los extremos cos. Necesita usar la maquinaria del
husped para realizar sus funciones (es decir, los
promotores de sus genes son bacterianos). Se replica por el
modelo del crculo rodante.
La integracin de en el genoma de E.Coli siempre es en el

mismo
lugar
(mediante
una
recombinacin
de
sitio
especfico, ver tema 15) y queda en estado de provirus.
Organizacin:
- Opern Izquierdo (OL): sib-attP-Int-Xis-abc-CIII-N
- CI: no es un opern, es un gen. Tiene 2 promotores.
- Opern Derecho (OR): Cro-CII-O-P-Q-S-R-cos
- Opern Tardano (OR): S-R-cos-Cpside-Cola. Solapa
parcialmente con OR. Lleva a la lisis.
Cuando el fago entra en E.Coli, se circulariza y sus

promotores PR (del opern derecho) y PL (del opern
izquierdo) se comienzan a transcribir inmediatamente con la
RNA polimerasa procariota. Se codifican las protenas N
(antiterminadora de la transcripcin) y Cro (represora de
la transcripcin, lleva a la lisis). Se mantiene as un
rato, haciendo el pool de N y Cro. Se cree que la
terminacin de la transcripcin es dependiente de Rho.
Cuando N tiene [ ] suficiente, se une a las secuencias RUT
en el RNA (eran las cajas NUT del DNA). Las cajas NUT
estaban en el DNA despus de PL y despus de Cro. N compite
con la afinidad de Rho para unirse al RNA, y N tiene ms
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afinidad, as se llega a unir a la RNA Polimerasa y hace

que no salte, permitiendo que se pueda saltar la seal de
terminacin de la transcripcin que haba (= tR tL).
nutL
CI
nutR
N y Cro son las protenas primerencas, que vienen de los

genes primerencos. Los genes primerencos tardanos son de
CII hasta Int (para OL) y de CIII hasta Q (para OR). Los
genes tardanos son de S hasta la cola (para OR).
De momento sto lo hace siempre: se transcribe el opern
izquierdo todo y el derecho hasta Q. As hace la lisogenia
por defecto, porque al final del OL est la integrasa que
lo integra en el genoma del husped (ya veremos cmo se
expresa).
Si queremos hacer lisis, la clula se tiene que dividir,
hemos de pasar de Q en la transcripcin y llegar a activar
al promotor del OR (el PR) para hacer los genes de lisis
(ver esquema completo en pgina 19).
Si pasamos de Q, se hace la lisis. Al final de Q, hay tR3
(=tR). Gracias a la protena Q, se puede saltar sta seal
de terminacin, ya que Q acta unindose a las cajas QUT
(que se transcriben en el RNA) y hace la misma funcin que
N. Tanto N como Q son protenas antiterminadoras de la
transcripcin. Q nos lleva a los genes de la lisis. Si Q se
acumula hay transcripcin de todos los promotores del OR
hasta el final.
La seal de terminacin tR3 afecta a dos trnscritos: el
que viene desde PR y el que viene de PR. En ste ltimo
caso, el trnscrito es muy pequeo, sin informacin. PR
siempre funciona, es un promotor constitutivo, pero como
tiene tR3 al lado, salta la polimerasa enseguida. Necesita
a Q para saltar el tR3 y llegar a la lisis.
En el caso de Cro, es una protena represora de la
transcripcin. Reprime a PR y PL. En principio, Cro tiene
baja afinidad por su diana (que reprime a los promotores) y
por tanto para poder actuar debe estar a alta [ ]. Ello
requiere tiempo, que es el tiempo que tarda en decidirse si
hace lisis o lisogenia. Cuando la [ ] es alta, se une a los
promotores y los bloquea, haciendo que se vaya hacia la
lisis. Si PL y PR no paran de funcionar, llevan hacia la
lisis (considerando que la clula se divide). Si PL y PR
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son reprimidos por Cro, har ciclo ltico si la bacteria se

divide pero lo har lisognico si no se divide.
Cro tambin se une a un promotor de CI para bloquearlo, ya
que CI es lisognico. Concretamente, Cro bloquea a PRM de
CI a baja [ ] porque le tiene mucha afinidad.
PRE
PL
PRM
PR
Con lisis (la clula se divide): se transcriben N y Cro; N

permite que se transcriba todo OL y OR; se degrada
CII/CIII; se bloquea CI por Cro rpidamente; se produce Q;
se acumula Cro. Cuando hay Q, ya hay suficiente Cro y Cro
bloquea a PR y PL (ahorro). Q hace su funcin: transcribir
genes lisis. Cuando la clula se divide, tiene unas
protenas (HflA y HflB) que se cargan a CII/CIII.
Con lisogenia (la clula no se divide): se transcriben N y
Cro, N permite que se transcriba todo OL y OR, no se
degrada CII/CIII, hay CI; se expresa el PantiQ, no hay Q,
no hay Cro, se llegan a bloquear PR y PL por CI, se expresa
Pint y se integra. En lisogenia la clave son CII/CIII, un
heterodmero. Las dianas de CII/CIII son:
- El promotor AntiQ (PantiQ) es estimulado por CII/CIII,
en lisogenia. Se encuentra entre Q y qut. Est en
direccin opuesta a PR. Produce un RNA que es
complementario al 3 del RNA que produce PR, sobretodo
en la regin de Q. As los RNA son complementarios e
hibridan, forman un dsRNA y no se puede traducir la Q
y no hay lisis. Es parecido a la tcnica del miRNA.
- El promotor de la Integrasa se debe expresar en
lisogenia. La integrasa y escicionasa se transcriben
desde PL, y pero la clula se carga Int en lisis (por
la regin sib). En lisis, tambin se carga a CII/CIII
pero por mecanismo distinto.
- El promotor de CI: PRE. Se activa por CII/CIII y lleva
a la lisogenia.
En cuanto al gen CI, es un gen lisognica. Tiene 2
promotores que apuntan en la misma direccin, uno de los
cuales solapa parcialmente con Cro (para hacer lo parecido
al miRNA que hibrida con Cro y no expresar Cro, ya que Cro
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y CI tienen funciones
respectivamente).
opuestas;
ltica
lisognica
La organizacin de los promotores PR y PL de es:

PR: Tiene 3 operadores. OR3-OR2-OR1.
PL: Tiene 3 operadores. OL1-OL2-OL3.
stos operadores del promotor son dianas de las mismas
protenas pero con diferentes afinidades:
- PR solapa con OR2 y OR1.
- PL solapa con OL1 y OL2.
- PRM solapa con OR3.
PE
PRM
Cro
PR
CI es una protena lisognica. Se expresa gracias a
CII/CIII desde PRE. Sus dianas son PR y PL (reprimirlos,
igual que Cro pero a muy baja [ ] porque les tiene mucha
afinidad) y estimular su propia sntesis desde PRM (despus
de que CII/CIII la haya estimulado para que empiece a
concentrarse).
Cro y CI tienen acciones opuestas sobre PRM pero iguales
sobre PM y PR.
CII/CIII:PantiQ
LISOGENIA
PRE
Pint
Cro: bloq. PR y PL a mucha [ ]
bloq. PM a poca [ ]
CI: bloq. PR y PL a poca [ ]
bloq. PM a mucha [ ]
estim. PM a poca [ ]
LISIS
LISOGENIA
Molecularmente, la protena CI presenta un dominio de unin

al DNA hlix-loop-hlix bsico, por lo cual, dimeriza.
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Tambin tiene dominios de unin a la RNA Polimerasa y a

otras CI dimerizadas. En principio, es un homodmero pero
segn la situacin puede llegar a ser un homotetrmero.
Presenta
diferentes
afinidades
por
los
diferentes
operadores. Todo lo que hace en el OR tambin lo hace en el
OL: inmediatamente, un dmero de CI se une a OR1 y recluta
a otro dmero de CI que se une a OR2. Se bloquea el PR con
ste homotetrmero. As lleva a la lisogenia. A la vez,
ste homotetrmero estimula a la RNA Polimerasa para que se
una al PRM y regula as su propia sntesis. Cuando hay [ ]
muy alta de CI, tambin se une a OR3 y bloquea su sntesis,
quedando todo bloqueado. Por tanto, las afinidades de CI
son OR1 = OR2 > OR3. En cuanto a la protena Cro, es la
primera en sintetizarse; tiene una elevada afinidad hacia
OR3, se une a l y bloquea momentneamente la sntesis de
CI. Nos lleva hacia la lisis. A la larga, si llega a tener
la [ ] suficientemente alta, se une a OR2 y OR1 bloqueando
la transcripcin desde PR (ahorradora). Por tanto, las
afinidades de Cro hacia los operadores son OR1 = OR2 < OR3.
Recordemos que el PRE, que es estimulado por CII/CIII,
transcribe para CI (lisognica), pero el RNA que se produce
solapa parcialmente con Cro, hibridan y no hay Cro
(ltica).
La protena CI a la larga lo llega a bloquear todo (PR, PL
y PRM), formando loops en el DNA. Hay lisogenia. Si tiene
poca [ ] estimula su propia sntesis.
Dcha: CI con poca [ ]. Izq: CI con mucha [ ]. Ntense los

homotetrmeros de CI.
La protena CII/CIII es clave en todo el proceso: si est,
nos lleva a la lisogenia; y si no est, hacia la lisis.
Cmo puede estar o no estar? Cuando la bacteria se divide,
expresa unas proteasas llamadas HflA y HflB, que degradan
CII/CIII (lisognicas). As, el fago sabe cundo se divide
el husped y va hacia la lisis porque no tiene CII/CIII.
Si queremos la lisogenia, debemos tener CII/CIII, PL activo
y estimular al Pint para hacer Integrasa. Pero PL se
bloquea por CI, entonces, para hacer la Integrasa, el Pint
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debe activarse por CII/CIII. EL Pint est dentro de Xis

(escicionasa).
Cuando el fago se ha integrado, slo puede producir
protena CI. La protena CI bloquea los PR y PL, no se
transcribe nada (lisogenia avanzada); CI estimula su propia
sntesis. As, si una bacteria ya ha sido infectada
previamente con un fago, no puede volver a ser infectada
por otro fago lisognico ya que la protena CI que espresa
cuando est infectada tambin se une a los PR y PL del
nuevo fago que entra, impidiendo que exprese sus PR y PL
desde el principio. As, no hay ms infeccin que la
primera. ste fenmeno se da gracias a la Regin Inmune del
fago , la cual es el gen CI con sus dos promotores.
Sobre la secuencia sib del fago : Si hay mucha Xis y poca
Int, se entrar en fase de lisis. Esto podr estar
ocasionado por niveles bajos de CII/CIII, con lo que la
transcripcin desde Pint ser baja y la mayor parte de la
transcripcin se har a partir del PL. En este caso
deberamos tener igual cantidad de Xis que de Int. Pero
despus de transcribir int, existe la secuencia sib, que
tambin se transcribe. Esta secuencia formar un bucle que
atraer la RNAasa III, con lo que se degradar. Se
degradar tambin en parte int, pero el dao al RNA no
llegar a xis, con lo que se podr transcribir la protena
Xis. Este tipo de regulacin se llama retroregulacin. No
se trata de regulacin a nivel de transcripcin, sino que
afecta a la estabilidad del transcrito.
Y si hay lisogenia, pues como CII/CIII estimulan al Pint,

se transcribe la integrasa hasta el tLque hay detrs de
ella, y no se forma ni bucle ni se degrada nada. Hay
integrasa para consumar la lisogenia.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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Sobre la induccin de , consiste en la desinsercin del

genoma de del genoma de E.coli. Se hace mediante luz UVA,
produce daos en el DNA, cuando se repara por recombinacin
se genera ssDNA que es sustrato de RecA, RecA unido al DNA
se mueve buscando a LexA. Cuando LexA es tocada por RecA,
aparte de autoproteolizarse, busca a CI y la degrada. As,
si no hay CI, se llega a expresar Q y hay lisis. Tambin se
transcribe para la escisionasa (Xis) que desintegra (lo
separa) el genoma de de el de E.coli.
Una bacteria con integrado es lisognica siempre excepto
si se induce la escisin con luz UVA y se vuelve ltico.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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PROBLEMA TRANSCRIPCI 1
En absncia de glucosa, E.coli pot metabolitzar l'arabinosa utilitzant un conjunt de gens indubles que estan
disposats en tres grups en el cromosoma. Un d'aquests grups est format pels gens araABCD. Els gens araA, araB
i araD codifiquen enzims implicats en el metabolisme de l'arabinosa, mentre que el gen araC codifica una
protena reguladora que coordina l'expressi dels gens de l'oper arabinosa. (Els altres dos grups de gens
codifiquen protenes implicades en el transport de l'arabinosa a travs de la membrana).
Per entendre les propietats reguladores de la protena araC es va allar un bacteri mutant amb una deleci en el
gen araC. Tal com es mostra a la taula que es dna a continuaci, la soca mutant no expressa el producte del gen
araA quan s'afegeix arabinosa al medi.
A) Penseu que la protena araC s un regulador positiu o un regulador negatiu de l'oper arabinosa?
Resposta: La protena araC s un regulador positiu en presncia darabinosa. Quan la protena araC s funcional
(araC+), laddici darabinosa fa que la transcripci del gen araB augmenti 1000 vegades. Per si el gen araC est
mutat (araC-) i, per tant, no hi ha protena araC funcional, aquest augment dels nivells de transcripci no es
produeix.
B) Com serien els resultats de la taula si la protena araC fos una protena reguladora de tipus contrari?
Resposta: Si araC fos un regulador negatiu, els resultats serien:
araA Gene Product

Genotype
araC+
araC-
Minus Arabinosa
1
1000
Plus Arabinosa
1000
1000
Si fos un regulador negatiu, en estar mutat (araC-) no podria reprimir i, per tant, la transcripci seria mxima fins
i tot en absncia darabinosa.
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Diferents bacteris amb mutacions a l'oper arabinosa reaccionaran de manera diferent davant de diferents
concentracions de sucres. Completeu el segent quadre suposant que les mutacions que afecten llocs d'uni de
la protena araC no afecten la uni de la RNA polimerasa. Considereu que la concentraci de glucosa s baixa i la
d'arabinosa s alta.
Resposta:
Control de loper arabinosa
Constitutiva
No
S (regulada)
No
S (regulada)
No
S (regulada)
No
araO1
Explicaci: Una inserci dun nucletid al principi de la pauta de lectura fa que no hi hagi protena. Per tant, araC
no pot reprimir la transcripci del gen araC i aquesta se sintetitza de forma constitutiva. Per com que no es
produeix protena araC, no es transcriuen els gens estructurals que necessiten araC com a activador
transcripcional.
araI s el lloc duni daraC per activar la transcripci dels gens estructurals. Per tant, si est mutat, els gens
estructurals no es transcriuen. En canvi, aquesta mutaci no afecta la transcripci del gen araC, que es transcriu
com sempre (de forma regulada).
Amb al lloc duni de CAP-AMPc passa al mateix. Els gens estructurals necessiten dos activadors: araC y CAPAMPc, i si aquest no es pot unir, no es transcriuen.
Perqu la transcripci del gen araC sigui constitutiva, araO1 ha destar mutat. Aix araC
no es pot unir i no pot inhibir la transcripci del gen araC. Una mutaci a araC tindria el
mateix efecte, per els gens estructurals no es transcriurien i, en canvi, segons el
plantejament del problema, s que ho fan.
Gentica Molecular.
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El bacterifag pot formar una associaci estable amb el cromosoma bacteri perqu el virus produeix un
repressor. Aquest repressor impedeix que el virus repliqui el seu DNA i produeixi lisozimes i tots els altres
elements necessaris per a destruir el bacteri. Quan sindueix el virus amb llum UV, es destrueix el repressor i el
virus entra al seu cicle ltic normal. Aquest repressor s el producte del gen cI i s part del genoma salvatge del
virus. Un bacteri lisognic per + est ple de repressor, i aix li dona immunitat contra qualsevol virus que infecti
aquests bacteris. Aquests virus poden injectar el seu DNA per el repressor del virus resident evita la replicaci
mitjanant la seva uni a loperador del nou virus. Es coneixen diverses mutacions al gen cI. La mutaci ci produeix
un repressor inactiu.
A) Un fag que cont una mutaci ci, pot lisogenitzar? Per qu?
Resposta: No, no pot lisogenitzar perqu per la lisognia s necessria la protena cI activa i ens diuen
que la mutaci ci produeix un repressor (cI) inactiu,
B) Si infecteu un bacteri simultniament amb fags salvatges i mutants ci, es poden obtenir lisgens
estables? Per qu?
Resposta: S, es poden obtenir lisgens estables perque cI actua en trans. Aix vol dir que la protena cI
produda pel fag salvatge pot reprimir tant els operadors del seu propi DNA com els operadors del
DNA del fag mutant.
C) Quin tipus de mutaci hauria de tenir un fag capa dinfectar i lisar un bacteri lisognic?
Resposta: Hauria de tenir una mutaci a la regi operadora que impedeixi luni de cI. Aquests mutants
existeixen, sn els mutants vir, vir per virulents.
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Quin seria el fenotip dels segents mutants de : cro, N, cII, cIII, Q, int ?
Resposta: Podrem analitzar el problema en dues situacions diferents: en condicions ltiques i en

condiciones lisogniques.
Mutant
Condicions lisogniques
Condicions ltiques
cro
lisognia
extremes: lisi
no extremes: lisognia
Si no hi ha Cro, CI inibeix PR i PL i hi haur lisognia. Noms en condicions ltiques extremes, en qu CII

no pot engegar la sntesi de CI, hi hauria lisi.
N
no viable
no viable
La protena N s necessria per passar de la transcipci primerenca a la primerenca retardada, per tant
s necessria tant per a la lisi com per a la lisognia. Sense N, el fag no s capa de desenvolupar cap
dels dos cicles.
cII
lisi
lisi
La protena CII s necessria per engegar la sntesi de CI. Si no hi ha CII no hi pot haver CI i, per tant, no
hi pot haver lisognia. Sempre hi haur lisi.
cIII
lisi
lisi
La protena CIII s necessria per protegir CII i que aquesta pugui engegar la sntesi de CI. Si no hi ha CIII,
not pot haver-hi CII i no hi pot haver CI. Per tant, no pot haver-hi lisognia. Sempre hi haur lisi.
Q
lisognia
extremes: res
no extremes: lisognia
La protena Q s necessria per engegar la transcripci tardana. Si no hi ha Q no pot haver-hi lisi i

sempre hi haur lisognia. Noms en condicions ltiques extremes, en qu CII no pot engegar la sntesi
de CI, no hi hauria lisognia, per com que tampoc pot haver-hi lisi (es necessiten els productes dels
gens tardans), el fag no seria viable.
int
probablement lisi
lisi
La protena Int s necessria per la integraci del profag en el procs de lisognia. Si no hi ha Int, no pot
haver-hi lisognia. En condicions ltiques hi hauria lisi. Per en condicions lisogniques s dificil de
determinar. Potser finalment es fa la lisi o potser el profag es mant sense integrar-se i llavors no seria
viable.
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Carlos F.R.
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A la regi regualdora del fag els promotors PR i PRM estan associats a loperador OR que consta dels
suboperadors OR1, OR2 i OR3.
A) Indiqueu a la taula inferior si a diferents concentracions (alta i baixa) de protena repressora cI i de
protena cro, els suboperadors estarien ocupats (+) o lliures (-), i si els promotors PR i PM
sestimularien () o es reprimirien ().
protena
cI
cI
cro
cro
concentraci
protena
baixa
alta
baixa
alta
suboperador suboperador
OR1 OR2
+
+
+
+
+
+
suboperador Efecte sobre efecte

OR3
PR
sobre PM
B) Expliqueu quin seria lefecte duna mutaci en la regi OR2 que impeds la uni de protena.
- No shi podria unir la protena cI (repressor) i, per tant, no hi podria haver transcripci a partir del promotor PM ja
que necessita cI com activador. Aix implicaria que sha de produir lisi. Per altra banda, no afectaria a la uni de la
protena cro, necessria per a la lisis, ja que t ms afinitat per OR3 .
Per tant, seria un fag ltic.
C) Es coneixen diferents tipus de mutants en el fag : els mutants cI, cII, i cIII, que no produeixen protena cI,
cII i cIII funcional, respectivament, i el mutant cy que t una mutaci al promotor que limpedeix utilitzar la
protena cII com a regulador positiu. Indiqueu si les segents parelles dinfeccions fgiques podrien
complementar-se i donar lisgens i expliqueu per qu:
1) cI i cII
2) cII i cIII
3) cy i cI
4) cy i cII
1) cI no sintetitza protena cI per si cII
cII no sintetitza protena cII per s cI, amb lajut de la protena cII produda per laltre fag. Com que
en conjunt es sintetitza cI, es podran donar lisgens estables.
2) cII no sintetitza protena cII per si cIII
cIII no sintetitza protena cIII per s cII. Com que en conjunt es sintetitza protena cII i cIII, es podr
sintetitzar cI i es podran donar lisgens estables.
3) cy no pot fer transcripci a partir de PE ja que no shi pot unir lactivador cII. Per tant, tampoc es
podr fer transcripci a partir de PM. s a dir, aquest fag no sintetitza cI.
cI no pot sintetitzar protena cI funcional. Com que cap dels dos fags pot sintetitzar cI, no es podran
donar lisgens estables.
4) cy no pot fer transcripci a partir de PE ja que no shi pot unir lactivador cII. Per tant, tampoc es
podr fer transcripci a partir de PM. s a dir, aquest fag no sintetitza cI. Per pot sintetitzar cII
cII no pot sintetitzar protena cII per pot sintetitzar cI mitjantjant la protena cII de laltre. Com que
en conjunt es sintetitza cI, es podran donar lisgens estables.
-
D) Per qu els lisgens de no sindueixen per les radiacions UV a les soques recA ?
-
Les soques recA no produeixen protena RecA funcional. Es necessita lactivitat proteoltica de la protena RecA
activada per degradar el represor cI. Per tant, cI no podra ser degradat en les soques recA
E) Indiqueu sobre quins promotors del fag actuen les protenes cI, cII i cro i quina s la seva funci.
cI.- Actua com a repressor sobre PR i PL i com activador sobre PM. A altes concentracions tamb com a repressor
sobre PM
cII.- Actua com a activador sobre PE Pint i Panti-q
cro.- Actua com a repressor sobre PM. A altes concentracions tamb com a repressor sobre PR i PL
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Mitjanant experiments de mutagnesi, uns investigadors obtingueren una soca de fag amb
una mutaci sensible a la temperatura en el gen cI, de tal manera que a 30OC la protena cI
funciona normalment, per a 42OC no s funcional. Anomenaren aquest mutant condicional tscI. Lelevada temperatura no afecta els fags salvatges. Obtingueren a ms els segents
mutants:
Mutant ts-Q: Mutant condicional que dna protena Q activa a 30OC i inactiva a 42OC
Mutant ts-cI + ts-Q: Doble mutant condicional que dna protenes cI i Q actives a 30OC i
inactives a 42OC
Mutant OR1: Afecta la subregi operadora O R1 tot impedint la uni de la protena cI per no de
cro
Mutant inv (O L3-O L2-O L1): Presenta una inversi de la regi operadora de loper esquerre
(sense afectar el promotor P L), segons el segent esquema:
Fag normal
N
OL1
OL2
OL3
Inv (OL3 - OL2 -OL1)

N
OL3
OL2
OL1
A continuaci realitzaren diversos experiments dinfecci duna soca bacteriana d E.coli i

observaren els resultats.
1. En infectar E.coli amb el fag mutant ts-cI:
a) A 30OC i en condicions lisogniques, la protena cI bloqueja la transcripci dels
gens primerencs immediats a partir de PR i PL. En canvi, a 42OC es transcriuen els
gens N i cro i se segueix la via ltica.
b) A 30OC la protena cI activa la transcripci dels gens primerencs immediats a
partir de PR i PL, tot afavorint la via ltica, i a 42OC no se sintetitzen ni N ni cro.
c) A 30OC la protena cI bloqueja la transcripci dels gens primerencs immediats a
partir de PR i PL, tot afavorint la via lisognica, i a 42OC es transcriu cro per no N,
de manera que els fags sn inviables.
d) Cap de les anteriors s correcta.
2.
a)
b)
c)
d)
En infectar E.coli amb el fag mutant ts-cI + ts-Q a 42OC:

El fag s inviable perqu no pot seguir ni la via ltica ni la via lisognica
El fag segueix sempre la via ltica
El fag segueix sempre la via lisognica
El fag segueix la via ltica o la lisognica depenent de lestat de la cl.lula hoste.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 25
3. En co-infectar E.coli amb el fag mutant ts-cI i el fag mutant ts-Q a 42OC,
a) depenent de les condicions, els fags poden seguir tant la via ltica com la lisognica
perqu hi ha compelmentaci
b) els fags sn inviable perqu no poden seguir ni la via ltica ni la via lisognica
c) els fag noms poden seguir la via ltica
d) els fags noms poden seguir la via lisognica
4. En infectar E.coli amb fags portadors de la mutaci a OR1, quin s el fenotip viral
resultant?
a) Predomina la via ltica perqu cal molta ms quantitat de protena cI per activar
el promotor PRM, i en conseqncia s ms probable que simposi lefecte de la
protena cro.
b) Predomina la via lisognica, perqu cal molta ms quantitat de protena cI per
activar el promotor PRM, i en conseqncia s ms probable que simposi lefecte
de la protena cro.
c) Els fags no sn viables perqu cI no pot unir-se a la regi operadora de loper
primerenc dret
d) Cap de les anteriors s correcta
5. En infectar E.coli amb fags portadors de la mutaci inv (O
passar:
L3-O L2-O L1)
pot
I. A diferncia dels fags silvestres, en els estadis inicials de la infecci viral cro
inhibiex la transcripci del gen N a partir del promotor PL quan la concentraci de
cro s encara baixa.
II. De la mateixa manera que els fags silvestres, en els estadis inicials de la
infecci viral cro inhibeix la transcripci del gen cI a partir del promotor PRM.
III. La transcripci a partir de PL no canvia respecte als fags silvestres perqu cro
t la mateixa afinitat per les tres subregions operadores.
a) I i II sn certes, III s falsa
b) I i II sn falses, III s certa
c) I s falsa, II i III sn certes
d) Cap de les tres afirmacions s certa
Soluciones: A, A, A, A, A.
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TEMA 3: LA TRANSCRIPCIN EUCARIOTA I.

En Eucariotas, la transcripcin se da en el ncleo y la
traduccin en el citoplasma, es una separacin espacial y
tambin temporal.
El mRNA Eucariota sufre una serie de modificaciones posttranscripcionales: capping en el 5, adicin de una cola de
poliadenina (PolyA) en 3, Splicing y recientemente se ha
descubierto una nueva modificacin, llamada edicin del
RNA. Gracias a stos procesos, la vida media del mRNA
Eucariota es mayor que la vida media del mRNA Procariota.
En Eucariotas se realiza un Control + de la transcripcin,
se necesitan a los Factores de Transcripcin (TF) para
poder activar a la RNA Polimerasa. Los TF pueden ser:
- Basales = Generales = GTF. Estn por todo. Son
imprescindibles. TF2D, etc Se explican en ste tema.
- Constitutivos = No Inducibles. Son accesorios, slo
estn
en
algunos
tejidos,
pero
siempre
estn
activados. SP1, etc Se explican en el Tema 5.
- Inducibles. Son accesorios, slo estn en algunos
tejidos. Necesitan activarse porque basalmente estn
inactivos. HR, etc Se explican en el Tema 6.
Adems, aqu hay 3 RNA Polimerasas diferentes, cada una de
las cuales transcribe para un grupo de genes concreto.
El mRNA Eucariota es monocistrnico, es decir, contiene
informacin para codificar una protena (con un inicio de
traduccin AUG y un final STOP de traduccin).
sto es el pre-mRNA hnRNA
mensajero primario. Una vez
se le hace el Splicing (ver
Tema 4), pierde los intrones
y se vuelve un mRNA maduro
mensajero secundario.
Corresponde al ppal. tipo de
trnscrito de los genes de
tipo 2.
Pero no todos los RNA son as, depende el tipo de gen.

Tipos de RNA Polimerasas Eucariotas:
- RNA Polimerasa I: Transcribe los genes de la clase I.
Est en el nuclolo. Insensible a la -amanitina.
- RNA Polimerasa II: La principal. Transcribe los genes
de la clase II. Est en el nucleoplasma. Sensible a la
-amanitina.
- RNA Polimerasa III: Transcribe los genes de la clase
III. Est en el nucleoplasma. La sensibilidad a la amanitina es especfica de cada especie.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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- mtRNA Polimerasa: es
amanitina. Similar a
- cpRNA Polimerasa: es
-amanitina, similar
mitocondrial. Resistente a la la Procariota.

cloroplastdica. Resistente a la
a la Procariota.
Todas las RNA polimerasas Eucariotas tienen estructura

similar, tomaremos como ejemplo la de la RNA Polimerasa II.
Tiene diversas subunidades, es una holoenzima como la RNA
Polimerasa Procariota y las polimerasas de DNA.
1. Subunidad de unin al DNA: Tiene el dominio
CTerminal, que corresponde a la cola. Se llama CTD
(Carboxi-Terminal Domain) y se activa cuando se
fosforila. Recluta enzimas. El CTD tiene secuancia de
AA repetida (YSPTSPS). Equivale a la Procariota.
2. Ncleo cataltico. Equivale a la Procariota.
3. Subunidades que equivalen a las 2 Procariotas.
Genes de Clase I.
Son los que forman el RNA ribosmico (rRNA). No sufren
capping ni poliadenilacin, aunque son cortados (pero no es
Splicing porque lo que se corta no son intrones). El
ribosoma Eucariota tiene:
- Subunidad Grande: 28s-rRNA, 58s-rRNA, 5s-rRNA (ste
lo hace un gen de la clase III) y protenas.
- Subunidad Pequea: 18s-rRNA y protenas.
Los genes de la clase I codifican para 28s-rRNA, 18s-rRNA y
5,8s-rRNA. Tienen promotores fuertes, estn repetidos a lo
largo del genoma, en cluster.
El rRNA que genera los genes de la clase I es:
Un cluster es una unidad de x genes que se van repitiendo

en tndem (uno tras otro) por el genoma. Se encuentran en
el brazo corto de los cromosomas, en el nuclolo. En ste
caso corresponde a la unidad de transcripcin del pre-rRNA.
A partir de un promotor, se obtiene un RNA que genera
varios productos (18S, 5.8S y 28S-RNA). NO se traduce.
El final de la transcripcin, de manera excepcional en
Eucariotas, consiste en unas pequeas secuencias (8) que
agotan qumicamente a la RNA Polimerasa I, que se
encuentran una tras otra a 3 del 3ETS, dentro de la
unidad de transcripcin.
La IGS es la InterGenic Sequence. Es lo que hay entre dos
clusters. Se transcriben parcialmente porque tienen un
promotor a 3.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 28
El ITS/ETS son los Internal Spaciator y External Spaciator.

Estn en el pre-rRNA.
Se transcriben en forma de cromosoma plumoso/rbol de
Miller.
Parece
un
rbol
de
Navidad.
En el proceso de cortar los ETS/ITS, que no tienen
informacin gnica, acta una endorribonucleasa (snoRNA).
No es Splicing porque los ETS/ITS no son intrones. Sucede:
1: se corta a 5 del 18S.
2, se corta a 5 del 58S (por dentro del 5ITS) y a dos

productos:
3, se aparean por complementariedad el 58S y el 28S,

quedando as:
4, se corta el 3ETS del 28S y el rabito 5ITS de 58S,

quedando el rRNA maduro.
El promotor de los genes de clase I se encuentra dentro de

la IGS. Tiene entre -150pb y -100pb el Up-stream Promotor
Element (UCE UPE). Es accesorio. Entre -45 y +20pb hay el
Core Promotor (CP). Es parcialmente interno, porque se
transcribe 20pb.
No tiene tata box. A ste promotor se unen los siguientes
factores de Transcripcin Generales/basales:
- UBF1: Se une a UCE. Dobla el DNA haciendo un loop.
Interacta con
- SL1: se une al CP (segn algunos, al UCE). Tiene 4
factores, uno de los cuales es la TBP (tata binding
protein), una protena posicionadora que interacta
con la RNA Polimerasa I. SL1 se une a su regin en el
DNA por dos factores que NO son TBP (porque no hay
tata box). La TBP mira hacie fuera y posiciona a la
RNA Polimerasa I.
UCE
C.P.
Sobre la regin IGS, tiene:

- 2 promotores que transcriben para RNA abortivo, sin
funcin. Tienen el objetico de traer a la RNA
Polimerasa I para que se acerque al promotor del
cluster.
- Promotor del clster: tiene lo que hemos visto arriba.
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La regin IGS se transcribe parcialmente, ya que el

promotor de los genes de clase I es parcialmente interno.
Genes de Clase II.

Son los que transcriben para el mRNA y todos los snRNP
(excepto snRNP-U6). Su promotor presenta variabilidad de
secuencias.
- Promotor con tata box mRNA
- Promotor sin tata box (genes tata-less) snRNP y
mRNA de genes house- keeping, vitales en el
metabolismo celular.
Dentro del promotor tambin hay las secuencias InR
(Iniciation Region), con las cajas CAT (en el 50-60% de los
casos, el 1er nt transcrito es una A).
La tata box, si est, tiene funcin posicionadora. Es un
elemento upstream. Los que no la tienen, la transcripcin
comienza dentro del leader (5UTR) gracias a secuencias
llamadas
DPE
(Downstream
Promotor
Element,
promotor
interno).
Pero lo ms frecuente es que el promotor tenga la tata
box en upstream y la secuencia InR (secuencia especfica =
caja). Si slo tiene tata box e InR, es el promotor
basal. Pero suele tener secuencias diana de mltiples
factores de transcripcin (caja BREdiana de TF2B, etc),
elementos downstream, enhancers (no forman parte del
promotor!)
InR
La caja InR es reconocida por el GTF llamado TF2D, que

contiene entre otras, a la TBP (tata Binding Protein).
Aqu, la TBP se une a la tata box, produciendo un efecto
posicionador de la RNA Polimerasa II. Si el promotor del
gen de tipo II no tena tata box, entonces el TF2D
tambin se une a InR, pero NO usa la TBP, sino a las otras
protenas, las TAF (TBP aditional factor), que se unen a
las cajas DPE en downsteam.
Factores implicados en la transcripcin de los genes de
tipo II (son los GTF):
- TF2D: Contiene a TBP (se une a tata box) y TAF (se
une a DPE). Usa a una de las 2.
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- TF2A: se une a TF2D estabilizndolo. Si es un gen que

transcribe para mRNA, el TF2A hace saltar a TAF porque
entorpece a TBP
- TF2B: No est siempre (es constitutivo), se une a caja
BRE si est. Tiene efecto de helicasa y marca como
molde a la cadena de ssDNA que ser transcrita.
- TF2F: Formado por 2 subunidades, a saber: Rap54
(helicasa que puede ayudar a TF2B) y Rap38(captura a
la RNA Polimerasa II).
Hasta aqu se ha formado el complejo de iniciacin de la
transcripcin: todos los TF que se unen al DNA antes de que
llegue la RNA Polimerasa II (TF2D, A, B, F).
La cola CTD de la RNA Polimerasa II reconoce a TF2D.
- TF2E: Se une a la RNA Polimerasa II y recluta a
- TF2H:
Tiene
mltiples
efectos;
es
quinasa
que
fosforila a la cola CTD, es ATPasa que hace saltar a
todos los TF y es helicasa. Tambin, TF2H contiene a
XPB y XPD (helicasas) para participar en la reparacin
por NER en Eucariotas.
La RNA Polimerasa II est fosforilada y libre, empieza a
transcribir.
Hay
TF
no
basales/accesorios
(los
constitutivos
e
inducibles) que se unen a cajas accesorias en el promotor,
o a elementos muy lejanos al promotor que tambin afectan a
la tasa de transcripcin de un gen (los enhancers
silencers).
stos TF no basales/accesorios tienen un dominio de
interaccin con la secuencia del DNA que reconocen y un
dominio de interaccin con el complejo iniciador de la
transcripcin con el complejo mediador (protenas que
actan entre el TF y el complejo inic. de la transcr.).
Tambin pueden interaccionar con protenas que acetilan
histonas (HAT) con protenas de remodelan la cromatina.
Pueden suceder las 3 cosas a la vez (lo veremos con mas
detalle ms adelante). Hacen loops en el DNA.
Los genes de clase II sufren una serie de modificaciones

post-transcripcionales (nunca en Procariotas):
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 31
1) Capping: consiste en aadir un nt nuevo al 5 del RNA

que antes no estaba, llamado CAP (es una 7-metil-guanina).
Se consigue mediante un enlace 55 trifosfato. Los
enzimas que actan son reclutados por la cola CTD. stos
enzimas son una fosfatasa que quita el fosfato en 5 del
RNA, luego una transferasa que une una Guanina con el
enlace 55 trifosfato y una metilasa que aade el metil
a la guanina.
A veces se metilan los 3 siguientes nt del RNA.
sto sucede en el ncleo. El CAP
tiene
funcin
de
atraer
al
ribosoma y proteger el mRNA de
las exorribonucleasas que actan
en 5.
2) Poliadenilacin: consiste en aadir una serie de
adeninas, aproximadamente 200, en el extremo 3 del mRNA.
Los enzimas necesarios para ello tambin son reclutados por
la cola CTD. Todos los seales necesarios para la
poliadenilacin
vienen
despus
del
codn
de
STOP
traduccin.
En orden, estn(en el RNA):
LTIMO EXN CON STOP-()-AAUAAA-(20-30nt)-CA-(10nt)-GUbox-()-3.
La caja AAUAAA es reconocida por CPSF (Cleavage &

Polyadenilation Specific factor). La caja GU es reconocida
por CStF (Cleavage & Stimulation Factor). Se unen las dos.
No cortan. Reclutan a CF1 y CF2 (Cleavage Factor 1 & 2) que
corta
al
RNA
en
la
caja
CA.
Se
recluta
a
PAP
(PolyAdenilation
polymerase)
que
aade
los
200
nt
aproximadamente de Adenina en el 3 del corte. Se recluta a
PAB II (PolyA Bonding II) que se une a la cola de PoliA que
se est elongando y hace saltar a PAP, por lo cual, es
PABII que determina la longitud de la cola de PoliA. Debido
a que se corta para poner la cola de PoliA antes de que
pare la transcripcin, hay un pequeo trozo de mRNA que
queda en la polimerasa. Funcin: terminar de transcribir?
no se sabe. Si se sabe que la funcin de la cola de
PoliAdenina que se aade es atraer al Splicesome.
3) Splicing: Ver el Tema 4.
4) Edicin del RNA: Ver el Tema 4.
Genes de Clase III.
Transcriben para el tRNA, 5S-rRNA, snRNP-U6, snoRNA, scRNA,
7SL-RNA (Alu) Son RNA no traducibles. No sufren ningn
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Carlos F.R.
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procesamiento, excepto el tRNA que sufre modificaciones y

un Splicing diferente al de los RNA de genes de tipo II.
Tienen seales de terminacin de la transcripcin que son
ricas en G-C y en secuencias con muchas T.
Tienen un promotor con 2 regiones: una externa y una
interna
(=ICR,
Internal
Control
Region),
con
dos
subregiones. La mayora no tienen tata box. Los casos ms
tpicos son (ver dibujo en la siguiente pgina):
- El 5S-RNA: Secuencias muy conservadas. Tiene 2 cajas
que constituyen la regin interna (=ICR) del promotor:
la caja A y la caja C. Estn a 3 del inicio de
transcripcin, a +55 pb. La regin externa la
constituye la secuencia de unin de TF3B (es TF3B
quien tiene la TBP.
A la caja A se une TF3A, recluta a TF3C que se une a
la caja C (son GTF). TF3C hace saltar a TF3A y avanza
en direccin 5 (al inicio de la transcripcin),
serindose (=polimerizndose sobre el DNA, muchos TF3C
uno tras otro en dccion 5).
Cuando llega a -30pb aprox, se encuentra con la caja
de unin de TF3B, lo recluta y puede iniciarse la
transcripcin (la TBP hace posicionar a la RNA
Polimerasa III, aunque no haya tata box).
El inicio de la transcripcin, por tanto, est entre
+55nt y +80 antes de la caja A.
- El tRNA: La ICR la constituyen las cajas A y B. Ambas
cajas son reconocidas por TF3C. No interviene TF3A. va
serindose en 5 hasta llegar a la caja externa de
unin a TF3B (el que tiene TBP), ste se une y recluta
a la RNA Polierasa III. Las distancias son parecidas.
- snRNP-U6, otros RNA pequeos: es parecido a los genes
de clase II porque hay un promotor que tiene la tata
box. Pero aqu quien tiene TBP es TF3B.
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RESUMEN: LA TBP
- En genes de clase I, est en SL1. Atrae, posiciona y
toca a la RNA polimerasa I. No hay tata box.
- En los genes de clase II, que tienen tata box, TBP
est en TF2D pero toca a la caja tata. Si no hay tata
box, la TBP tiene poca importancia porque la TAF se
une a DPE y hace la funcin de posicionar a la RNA
polimerasa II.
- En los genes de clase III, que no tienen tata box,
la TBP forma parte del TF3B. Tiene efecto posicionador
de la RNA polimerasa III.
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Una de les primeres regions promotores que es va analitzar per introducci de mutacions va sser la del gen de
la timidinquinasa (tk) del virus de lherpes simple. Els resultats obtinguts per a la regi 100 del gen es mostren a
la figura, on cada caixa representa la posici d'una regi que cont de 6 a 10 substitucions de nucletids juntes.
a) Indiqueu la posici de regions especfiques importants per a la transcripci eficient del gen tk.
Hi ha tres regions duni de factors de transcripci, que sn aproximadament les
segents:
-100 a -80
-60 a -45
-28 a -23
b) Quin tipus delement de control representa cada una daquestes regions importants per a la
transcripci?
La regi [-28, -23] podria correspondre a la caixa TATA, tamb anomenada caixa GoldbergHogness, que normalment est situada entre 25 i 35 nucletids abans de linici de
transcripci del gen, i que s reconeguda per la protena TBP, un component del factor de
transcripci basal TFIID. Les altres dues regions serien elements de control situats ms
upstream, diana per factors de transcripci no basals.
c) Quina daquestes regions s probable que contingui dos elements de control vens?
La regi [-100, -80] t uns 20 nt de longitud, mentre que les altres no passen de 15. Aquesta s lnica que
per extensi pot contenir dos elements de control vens.
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Una de les tcniques emprades per identificar elements de control al DNA s lanlisi de lefecte de delecions
sobre la transcripci gnica. A la figura es representen els efectes de diverses delecions sobre la transcripci del
gen 5S-rRNA eucariota. A la part (a) de la figura els mutants que es transcriuen sindiquen amb un signe +, i els
que no es transcriuen, amb un signe -. Els productes resultants daquestes delecions sanalitzaren per
electroforesi i autoradiografia (part (b) de la figura).
a) Direu que la transcripci del gen 5S-rRNA depn de seqncies situades cap a 5?
El gen noms deixa de transcriures quan eliminem la regi situada entre -80 i +63, que inclou tot el
segment situat abans de linici de transcripci. Per tant, les seqncies situades upstream (5) del gen
tindrien poca importncia per a la transcripci.
b) Quina s la posible localitzaci de la regi de control que regula el gen 5S-rRNA?

Per la banda 5 del gen, la primera deleci que afecta a la transcripci del gen inclou el segment [-80,
+63]. Per tant, el lmit 5 de la regi potencialment important per a la transcripci el marcaria la deleci
immediatament ms curta que aquesta, que acaba en el nucletid -47. Per la banda 3 del gen, la primera
deleci que afecta la transcripci s la [+75, +190]. La deleci immediatament ms curta que s que dna
transcripci s la [+85, +190].
Per tant, els lmits de la regi de control de la transcripci daquest gen serien [+47, +85], que podrem
acotar una mica ms si hagussim analitzat totes les possibles delecions de la regi. Aquest gen, de la
classe III, es caracteritza perqu la seva transcripci est regulada mitjanant seqncies que es
transcriuen, i que constitueixen lanomenada ICR (Internal Control Region).
c) Si la regi de control del gen 5S-rRNA es desplacs 60 pb cap a 5 o cap a 3, quin seria lefecte
probable sobre la producci i la mida del 5S-rRNA?
Abans de respondre a aquesta qesti hem de tenir en compte que lanlisi de delecions seriades indica
que no hi ha cap seqncia situada a 5 o a 3 del gen que sigui important per a la transcripci. Linici de
transcripci est determinat per la ICR, que comena aproximadmant 50 nucletids en direcci 3
respecte a linici de transcripci. Per tant s la posici de la ICR la que determina on sinicia la
transcripci.
Si desplacem aquesta ICR, la transcripci comenaria sempre uns 50 nt abans. La longitud del transcrit
resultant estaria determinada per la posici de la primera seqncia dacabament de la transcripci (una
srie de timines, tpica del gen del RNAr-5S).
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TEMA 4: LA TRANSCRIPCIN EUCARIOTA II.

Estudiaremos el splicing en detalle. El splicing es el
proceso por el cual se cortan todos los intrones de un premRNA y se vuelve mRNA maduro. Sucede en el ncleo. Gracias
a la cola de poliadeninas, se puede dar. Si se deja algn
intrn en el RNA se corta algn exn (o ambos) se trata
de splicing alternativo o diferencial.
Existen varios grupos de intrones que sufren splicing: el
grupo principal (mRNA) el tRNA, el grupo I, el grupo II y
el grupo AU-AC. Se sospecha que puede haber ms. Se pueden
clasificar en autocatalticos (ribozimas) o no.
Los intrones no-autocatalticos.
Son el tRNA, el mRNA y los del grupo AUAC.
autocatalticos porque requieren de protenas o
accesorias que catalizan la reaccin.
No son
enzimas
1- El tRNA: viene codificado por genes de clase III. Se

considera que los tRNA inmaduros tienen un nico intrn (en
levaduras, aunque hay algunos que no tienen intrn). Los
enzimas que actan son los siguientes: endorribonucleasa
que reconoce la estructura con hairpins y secuencias
palindrmicas del tRNA inmaduro, corta el intrn y deja
extremos 5-OH y 2-3 P, no aptos para ligar. A
continuacin acta una fosfodiesterasa que deja 5OH y 2P3OH. Despus acta una quinasa que fosforila dejando un
5P y finalmente una ligasa que une el 5P con el 3OH.
2- El mRNA: son la mayora de los intrones. No depende de
estructuras como el tRNA, sin de secuencias especficas
conservadas el 100% de las veces dentro del intrn (GU-AG).
Se pasa de un pre-mRNA inmaduro (hnRNA mensajero 1) a un
mRNA maduro secundario. El splicing de la mayora de los
intrones sigue la regla del GU-AG (porque el GU-AG est
100% conservado).
Para eliminar los intrones se dan 2 transesterificaciones

seguidas: son enlaces entre el 5P de un nt y el 3OH del
nt no contiguo (lejano). La 1 se da debido a que la A del
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branchpoint tiene un 2OH que ataca nucleoflicamente al

5P de la G del 5 del intrn. ste enlace 52 forma un
lairat
o
lazo,,
1
lairat
=
1
intrn.
La
2
transesterificacin se produce cuando el 3OH de la G del
exn que ha quedado libre ataca nucleoflicamente al 5P de
la G del siguiente exn formando un enlace normal en
53. El lairat queda separado, se linealiza y es
degradado por nucleasas.
stas dos transesterificaciones las realizan unas protenas
llamadas snRNP. Las snRNP constituyen el splicesome
(pseudo-orgnulo que cataliza el splicing). Una snRNP=
proteinas + snRNA.
Las snRNP vienen de los genes de tipo II, por tanto tienen
CAP en el extremo 5. Excepto snRNP-U6 que viene de un gen
del tipo III y no tiene CAP. No hay cola de poliadenina.
Estructura de la snRNP:
proteina
proteina
Modelo
vlido
para
snRNP-U2 y snRNP-U5.
snRNP-U1,
Modelo vlido para la snRNP(U4-U6). Basalmente es as.

snRNA de U4 y de U6, unidos,
pero comparten protena.
Los snRNA de las snRNP son complementarios a regiones

especficas del intrn del RNA. Considerar siempre la
orientacin de las cadenas del RNA (debajo de un 5 siempre
va un 3, etc).
Para referirnos a las snRNP, usaremos la terminologa Ux
para abreviar, donde x es el nmero de la snRNP.
Hay que saber qu hace cada Ux, si se une por
complementariedad de bases en el RNA por afinidad de las
protenas, o por unin de protena con RNA, en qu momento
del splicing entra y dnde entra.
Mecanismo de splicing del mRNA:
- U1 se une al 5GU del intrn (unin RNA-RNA).
- U2AF35 se une al 3AG del intrn. U2AF65 se une al
(Py)n (uniones protena-RNA). BBP (Branchpoint Binding
Protein = SF1) se une al Branchpoint (unin protenaRNA).
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Pgina 38
- U2 se une al Branchpoint haciendo saltar a BBP (=SF1).

Es una unin RNA-RNA.
- Llega el complejo (U4-U6)+U5. Unidas por afinidad de

protenas. U5 se une al exn en 5, dando estabilidad
al complejo; hace saltar a las U2AF; unin protenaRNA. U4-U6 basalmente unidas por RNA-RNA, U6 se une a
U2 (RNA-RNA) y salta U4 (mantena estable a U6).
U1 se acerca a U2-U6 sin llegar a tocarlas, pero
formando una pequea protuberancia en el intrn que
acerca el 5GU al branchpoint, lo que permitir que se
d la 1 transesterificacin.
- Se ha formado el ncleo cataltico del splicesome

(U2+U6). Se da la 1 transesterificacin.
- Como consecuencia de ello, U1 llega a tocar a U2
(protena-protena) y U1 salta. Su lugar (5GU) queda
ocupado por U6 (RNA-RNA), unida as al 5GU.
- Se da la 2 transesterificacin, juntndose los dos
exones, salta el lairat con U2 y U6. Salta U5. Se
separan los U2 y U6 del lairat y ste es linealizado y
degradado en el ncleo.
As,
los
intrones
del
tRNA
y
del
mRNA
no
son
autocatalticos y la mayora de ellos siguen la regla del
GU-AG.
3- Grupo AU-AC de Intrones: Tambin necesitan a Splicesome,
porque no son autocatalticos. Participan otras snRNP. Al
5AU se une la U11 y al 3AC y al Branchpoint se une la
U12. El resto del proceso es igual. Slo coinciden en la
U5.
Los Intrones autocatalticos.
Son aquellos intrones que no precisan de snRNP (no
requieren splicesome) para eliminarse, sino que ellos solos
pueden hacerlo.
- Grupo I de Intrones: son ribozimas autocatalticos. No
interviene la A del Branchpoint, sin un nt libre que suele
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Carlos F.R.
Pgina 39
ser una G que ataca el enlace entre el Exn y el Intrn 1.

Se da en los intrones de orgnulos.
Grupo
II
de
Intrones:
tambin
son
ribozimas
autocatalticos. La A del branchpoint hace toda la primera
transesterificacin, el resto lo hace el propio intrn.
Tambin se da en los intrones de los orgnulos.
Recientemente se han descubierto las protenas SR (ricas en
Serina-Arginina, a veces llamadas SF2). Se unen al dominio
de unin a SR en el pre-mRNA. stos dominios pueden ser
zonas de activacin ESE (Exon Splicing Enhancer) o ISE
(Intron Splicing Enhancer), o zonas de silenciamiento de
splicing ESS (Exon Splicing Silencer) o ISS (Intron
Splicing Silencer). Los ESS, ESE, ISS, ISE estn sobre un
exn o un intrn respectivamente, y si son los activadores,
estimulan el splicing en lugares crpticos (dbiles,
basalmente ocultos, no se usan en principio) o lo bloquean
en los lugares normales si son silenciadores. Los dominios
que activan el Splicing, ISE y ESE, se unen a SR y atraen a
sa regin a U1 y a U2AF35, estabilizndolas . De manera
opuesta, ISS y ESS atraen a sus SR y desestabilizan a las
snRNP o compiten con ellas por su afinidad al RNA, todo
para silenciar el splicing y que no se d en las regiones
adyacentes (las que se d normalmente).
As, gracias a las protenas SR que se expresan en tejidos
especficos, se da el Splicing Alternativo, en el cual se
cortan algunos exones y/o algunos intrones se dejan. A
partir de un mismo pre-mRNA se pueden obtener diferentes
mRNA maduros. Se cree que mas de la mitad de nuestros genes
hacen splicing alternativo. Consideremos un gen que produce
el siguiente pre-mRNA:
Se le pueden dar diferentes tipos de splicing alternativo

al mismo pre-mRNA:
- splicing normal: deja los exones 1-2-3 unidos, sin
intrones.
- exon skipped: se unen los exones 1-3 y se pierde el 2 y
los intrones.
- exon extension: se dejan los exones unidos y un poco de
algn intrn. Si son 3 bases (o mltiplo de 3), no pasa
nada. Si no, hay corrimiento de la pauta de lectura y
dependiendo de lo avanzado en la traduccin que est el
intrn aadido, puede hacer ms o menos efecto.
- retencin de intrones si hay ISS.
- coexistencia de 2 transctitos maduros a la vez (raro en
una misma clula).
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Es frecuente que dentro de un intrn haya un final de

traduccin de una protena, y que debido a secuencias
flanqueantes dentro del intrn (ISS), no se corte el intrn
y al traducirse, produzca una protena mas corta porque al
leerse el RNA, se topa con el STOP del intrn que
normalmente no est. Puede ser tambin que las ISS hagan
que el Splicesome se vaya a cortar a un lugar crptico, que
se usa porque los otros estn bloqueados.
O al revs, que haya un final de la traduccin en un exn y
que debido a secuencias ESE se activen lugares crpticos de
splicing que atraen hacia s el Splicesome y se corte el
exn, perdindose el STOP prematuro y producindose
protena ms larga.
Depende de qu protenas SR exprese el tejido y en qu
momentoSplicing Alternativo
La determinacin del sexo en Drosophila melanogaster:
Es un caso tpico de splicing alternativo. En primera
instancia, la determinacin de sexo es cromosmica; ya que
si el n de cromosomas X/n de juegos de autosomas es
mayor a 1, sale hembra, mientras que si es menor a 1 sale
macho. Esto se debe a que en el cromosoma X hay los genes
que codifican para unas SR (=SF2) que hacen el splicing
alternativo, y si es hembra tiene 2 cromosomas X: mucha [ ]
de SR (o almenos ms que el macho).
Hay 4 genes implicados en determinar el sexo, que son
SexLethal (SL SXL), Transformer (TRA), Transformer2
(TRA2) y DoubleSeX (DBX). Son miembros de la familia de las
SR (excepto DBX, que es un TF). Interaccionan con ellas.
- Basalmente, se transcribe el gen de SXL en machos y en
hembras. Si es hembra, hay las SR y se hace splicing
alternativo.Se hace Exon skipped y se produce una
protena larga, mientras que en los machos no se hace
el splicing alternativo y en el exn que la hembra
eliminaba, hay un STOP de la traduccin prematuro, por
lo que produce una SL demasiado corta.
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Pgina 41
- La protena SL es un represor de splicing normal y

activadora del Splicing alternativo. Acta sobre el
mRNA de la protena TRA. Se une a secuencias (ISS) en
el 3 del intrn que impiden que entre la maquinaria
normal de Splicing (impide que U2AF65 entre a unirse a
(Py)n), as que la maquinaria de splicing se va a
cortar a un lugar crptico de splicing que est dentro
del exn, produciendo que se pierda un trozo del exn
que justamente contena un STOP de la traduccin
prematuro (HEMBRAS).
Los
machos
al
no
tener SL funcional,
hacen
splicing
normal
y
la
traduccin se para
en el STOP prematuro
del exn, ese trozo
de
exn
que
se
perda en la hembra.
Se
produce
en
el
macho protena TRA
demasiado corta.
- La protena TRA hace lo mismo que TRA2, funcionan

igual. Ambas son estimuladoras del splicing normal,
sobre el mRNA de DSX. TRA y TRA2 son SR. Actan
unindose a un exn en la hembra (ESE), se solvatan
(envuelven) de todas las SR y evitan que se corte el
exn donde est TRA2. As, se estimula que se corte el
exn posterior porque se activa el lugar de splicing
crptico.
En machos se realiza un splicing que elimina los
intrones y el exn en el cual se une TRA2 en las
hembras, dejando intacto el exn posterior.
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- Finalmente, en ambos casos se genera la protena DSX,

que es un factor de transcripcin, pero en machos es
ms corta (estimula a los genes de desarrollar macho y
bloquea a los de desarrollar hembra); y en hembras es
ms larga (estimula los genes de desarrollar hembra y
bloquea a los genes de desarrollar macho).
La Edicin del RNA: Mecanismo recientemente descubierto,
consiste en modificar el mRNA maduro para obtener protenas
diferentes en tejidos especficos, ya que en cada tejido se
expresan los enzimas que lo modifican. Es el cuarto
mecanismo de modificacin del RNA. Ejemplo: el caso de la
ApoB.
En el intestino, el pre-mRNA de la ApoB hace su splicing y
se eliminan sus intrones. En el mRNA hay el codn
CAAglutamina, pero se expresa independientemente una
enzima desaminasa, que edita el mRNA, cambiando una C
por una U: se produce un codn STOP prematuro y se genera
una protena corta. Mientras que en el hgado, no se
expresa la enzima desaminasa y cuando el mRNA de la ApoB
aparece, se traduce normalmente sin que haya ningn STOP
prematuro, dando lugar a una protena larga.
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Carlos F.R.
Pgina 43
La transcripci del gen de la figura requereix la uni de la protena X a la caixa x. La protena X es troba
a fetge, a ovari i a testicle. A la resta dels teixits no se sintetitza aquesta protena. A l'ovari es produeix la
sntesi constitutiva de la protena OP, que presenta afinitat per la seqncia op. La uni d'aquesta
protena impedeix l'ensamblatge del spliceosoma al lloc 5' de splicing L1. Al testicle se sintetitzen les
protenes OP i TP. Aquesta ltima s'uneix a la caixa tp i s necessria per a la utilitzaci del lloc 5' de
splicing alternatiu L2. Al fetge no se sintetitza ni protena OP ni TP. (R s el lloc 3' d'splicing)
caixa
x
caixa
TATA
+1 ATG
50
60
caixa
op
caixa
tp
L1
L2
120
cod
stop
cod
stop
seq.
poliA
100
pb
R
90
1500
3000
a) Quin tipus de gen s el de la figura i quin tipus de factor s, probablement, la protena X?

El gen de la figura s un gen de classe II ja que codifica una protena (t ATG i cod stop) i tamb t
senyal de poliA. La caixa TATA no s exclusiva dels gens de classe II ja que alguns gens de classe III
tamb en tenen.
La protena X s un factor especfic de teixit (i per tant no s basal/general) de la RNA polII.
b) Quines mides tindran els mRNAs formats per la transcripci daquest gen a fetge, ovari i testicle?
A ovari.- Hi ha sntesi de protena OP, que impedeix que sutilitzi el lloc 5 dsplicing L1, i no hi ha sntesi
de TP, que s necessria per utilitzar el lloc L2. Per tant, no es pot fer splicing. LmRNA tindr.50+60+120+90+1.500+3.000+100= 4920 nucletids.
A testicle.- Hi ha sntesi de protena OP, que impedeix que sutilitzi el lloc 5 dsplicing L1, i hi ha sntesi
de TP, que s necessria per utilitzar el lloc L2. Es far lsplicing L2-R. LmRNA tindr.50+60+120+3.000+100= 3.330 nucletids.
A fetge.- No hi ha sntesi de protena OP, que impedeix que sutilitzi el lloc 5 dsplicing L1, i no hi ha
sntesi de TP, que s necessria per utilitzar el lloc L2. Es far lsplicing L1-R. LmRNA tindr.50+60+3.000+100= 3.210 nucletids.
S ha de tenir present que a aquests valors caldria afegir-hi el nucletid que safegeix a 5 (en el procs de
capping), i tamb el fragment de RNA que va des del senyal de poliadenilaci fins el punt de tall i la cua
de As.
c) Quines longituds tindran, en nombre daminocids, les protenes codificades per aquest gen a fetge,
ovari i testicle ?
A ovari la protena tindr.- 60+120+90= 270 nucletids ->90 AA
Al testicle la protena tindr.- 60+120+3.000= 3.180 nucletids ->1060 AA
Al fetge la protena tindr.- 60+3.000= 3.060 nucletids ->1020 AA
Sha considerat que el punt que assenyala la posici del cod stop era el comenament
del cod (i no el final).
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TEMA 5: LA TRANSCRIPCIN EUCARIOTA III.

Para estudiar la regulacin en Eucariotas, se usa al
organismo modelo S.cerevisiae. Es un Eucariota muy simple,
unicelular. Tiene forma esfrica para incrementar la
superficie de absorcin de nutrientes, estmulos
En l, los genes GAL son modelo para explicar la regulacin
de la expresin gnica en Eucariotas. Estn implicados en
el metabolismo de la galactosa, codifican para permeasas,
quinasas, etc. El objetivo de la ruta metablica es
convertir la galactosa en glucosa-1-P. No son operones
porque un mRNA codifica para una nica protena.
Los promotores tienen secuencias similares, en todos hay
tata box.
-Las secuencias UAS (Upstream Activation Secuence) no son

enhancers. Siempre estn antes de la tata box y de MIG.
Siempre hay almenos 1. Son secuencias palindrmicas (se
leen igual en los dos sentidos). Son la diana de GAL4.
-GAL4 es un activador de la transcripcin. Es un
homodmero. Por un dominio, se une al DNA en UAS y por el
otro dominio toca a la RNA Polimerasa II y al complejo de
inicio de la transcripcin. ste dominio de unin a la RNA
Polimerasa II solapa parcialmente con un dominio de unin a
GAL80 (represor). De manera basal, GAL4 est unida al DNA
en UAS y a GAL80.
-GAL80 es el represor de GAL4. Basalmente est unida a l,
reprimiendo.
Gal4
La galactosa se une a GAL80 haciendo que se separe de GAL4

y permitiendo que GAL4 active la transcripcin porque tiene
el dominio de unin al complejo de inicio de la
transcripcin libre,, la galactosa activa la transcripcin.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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Si hay glucosa, quiero bloquear la transcripcin, aunque de

manera basal ya lo est.
-La protena MIG1, con glucosa (= poco AMPcno se activan
ciertas quinasas) no est fosforilada y se une a la
protena TUP1 formando un heterodmero. Juntas se unen a la
secuencia Mig1 en el DNA bloqueando la transcripcin. Si no
hay glucosa (= mucho AMPcse activan ciertas quinasas) se
fosforila MIG1, no puede unirse a TUP1 y no se une al DNA,
por lo tanto no se reprime y hay transcripcin.
-La secuencia Mig1 en el DNA est entre la tata box y la
secuencia UAS. Es la diana del heterodmero MIG1+TUP1.
Para transcribir: poca glucosa y mucha galactosa se
activa GAL4 y se bloquea MIG1,, para no transcribir: mucha
glucosa y mucha galactosa se activa GAL4 pero MIG est
entorpeciendo
la
activacin,,
mucha
glucosa
y
poca
galacosa: GAL4 est bloqueada y MIG1 est activada
entorpeciendo la transcripcin,, poca glucosa y poca
galactosa: GAL4 est bloqueada y no activa la transcripcin
aunque MIG1 no est activada.
Se demostr que en GAL4 el dominio de unin al DNA y el
dominio de activacin de la transcripcin son partes
diferentes de la misma protena, mediante el uso de
protenas recombinantes que tenan el dominio de unin al
DNA que tiene la protena LexA. A continuacin se mezclaron
in-vitro con sus secuencias diana y se observ que
efectivamente, cada dominio se une a regiones diferentes
del DNA,y el dominio de activacin de la transcripcin, se
une a la RNA Polimerasa II activndola slo si su otro
dominio est unido a UAS. As naci la Ingeniera Gentica.
En Eucariotas, los promotores tienen (la mayora) una tata
box y la caja InR. Pero aparte, pueden tener muchas
secuencias(cajas) diana de varios factores de transcripcin
no basales. As, los Eucariotas presentan promotores
modulares, es decir, que tienen muchas cajas de unin a TF
no basales. Sirve de ejemplo ilustrativo el gen de las
metalotioneias (protenas que capturan metales), que
contiene algunas de las cajas ms frecuentes:
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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Recordemos
la
clasificacin
de
los
Factores
de
Transcripcin (TF) en Eucariotas:
- GTF: generales/basales. Estn por todo, activos. Ej:
TF2Dtata box.
- TF no basal constitutivo: Slo en algunos tejidos,
ativos. Ej: SP1caja GC.
- TF no basales inducibles: Slo en algunos tejidos,
basalmente inactivos. Ej: AP2, HR
Los no basales tienen dominio de unin al DNA y dominio de
unin al GTF o al complejo mediador (formado por otros TF
no basales, entre el TF unido al DNA y el complejo de
inicio de la transcripcin). El DNA se dobla para poder
hacer todos stos contactos.
Los enhancers son exclusivos de Eucariotas. Son secuencias
que no forman parte del promotor, se encuentran alejadas de
l en upstream o downstream, y tienen la funcin de unirse
a TF no basales a fin de incrementar la tasa de
transcripcin de un gen estimulando a la RNA Polimerasa II.
El TF no basal se une por un dominio al enhancer y por otro
al GTF (raro) o al complejo mediador, curvando el DNA.
Los silencers funcionan igual pero con funcin opuesta, es
decir, reducir la tasa de transcripcin de un gen.
Los insulators son secuencias fuera del promotor, diana de
protenas que se unen y bloquean la accin del enhancer
fuera de su dominio de transcripcin; es decir: los
insulators separan dominios de transcripcin (que contiene
el/los enhancers y el gen). Todo lo que hay entre dos
insulators puede interaccionar. Actan impidiendo que un
enhancer especfico de un gen, active a otro gen que no le
corresponde,
ya
que
al
estar
tan
lejos,
podran
interaccionar. As se consigue que el enhancer active
nicamente al promotor de su gen diana.
Los TF no basales se clasifican segn la estructura de sus

dos dominios, recordemos: un dominio de unin al DNA y un
dominio activador de la transcripcin (estimula al complejo
iniciador de la transcripcin). Entre ambos dominios puede
existir un dominio conector (o de dimerizacin si es el
caso).
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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TF segn el dominio de unin al DNA:

- Dedos de Zinc: Son protenas en forma de dedo, las
cuales tienen un tomo de Zn en el centro. La
estructura con forma de dedo se repite 2 o 3 veces
para formar UN factor, que NUNCA dimeriza. Ej: TF3A,
GAL4, SP1 (se une a la caja GC)
sto es el dominio de unin al DNA de SP1, un factor

no basal constitutivo. No dimeriza nunca.
- Receptor de Hormonas Esteroideas: Es un TF inducible.

Tiene un dominio de unin al DNA con 2 dedos de Zn;
por uno se une al DNA y por el otro dimerizan. SIEMPRE
dimerizan.
La hormona esteroide (glucocorticoide estrgeno) se

une al Receptor de Hormona, haciendo que se active y
dimerice. As se une a la caja diana en el DNA: la
caja GRE la caja ERE (slo 2 AA hacen que reconozca
a una o a la otra). Se explica con ms detalle en el
Tema 6.
- Hlice-vuelta-hlice: Son 3 hlices que dan dos
vueltas. Es el dominio de unin al DNA llamado
homeodominio presente en los TF de los genes Hox
(implicados
en
el
desarrollo).
NUNCA
dimeriza.
Presente tambin en la protena Cro, CI del fago .
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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- Hlice-bucle-hlice: Tiene muchos AA bsicos. Para que

el dominio de unin al DNA funcione, ha de dimerizar
por el dominio de dimerizacin. Por tanto, el dominio
de unin al DNA ser homodimrico. Son molculas
anfipticas, SIEMPRE dimerizan, tienen una secuencia
diana invertida y sin el dominio de unin al DNA
pueden dimerizar pero no unirse. Ejemplo: Myo-D, E12,
da/ACS
- Cremalleras
de
Leucina:
Muy
similares
a
los
anteriores, SIEMPRE dimerizan y sn bsicas. La
diferencia es que en el dominio de dimerizacin, cada
monmero tiene una nica hlice anfiptica con
leucinas. Las leucinas estn mirando hacia dentro,
formando la regin hidrofbica, hacia el exterior est
la regin hidroflica y el dominio de unin al DNA
tiene los AA bsicos. Lo tienen, por ejemplo,
CEBP(=EBP) que se une a la caja CAAT, AP1 (=Jun+Fos)
OJO: la TBP no tiene ninguno de stos dominios, es una

estructura rica en lminas la que se une a la tata box.
TF segn el dominio activador de la transcripcin: Est
poco estudiado porque hay poco consenso en cuanto a
composicin y funcionamiento. ste dominio interacta con
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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el complejo de iniciacin de la transcripcin si son TF

fuertes interacta con un TF mediador (tambin es un no
basal) si son dbiles. Es el mismo efecto. Tipos de
dominios:
- Acdicos: tienen carga negativa. Con hlice .
Ejemplo: GAL4.
- Basdico: mucha cantidad de glutamina, con carga
positiva. No se conoce como van (?). Ej: SP1.
- Prolnicos: Mucha prolina, forma ngulos en la
protena. Tampoco se conoce como van (?). Ej: CTF
(=NF1) que se une a la caja CAAT.
En Eucariotas, en contra de toda regla, tambin se han
encontrado mecanismos de represin de la transcripcin.
Tipos:
- Competicin por dominio: hay un dominio de unin a
protena activadora y un dominio de unin a protena
represora. Solapan parcialmente. Lo que decide quien
gana es la [ ] de cada protena, o quien llega
priemro.
- Inhibicin: el dominio activador y el dominio represor
estn separados, pero cuando la protena represora se
une al dominio represor, tapa fsicamente el acceso de
la protena activadora al dominio activador.
- Represin directa: La protena represora unida al
dominio represor, interacta de manera directa o
indirecta (a travs de otros factores) con la RNA
Polimerasa para reducir la tasa de transcripcin.
Ejemplo: la protena CDP se une a caja CAAT y bloquea
la unin de otros activadores (CFT-NF1, CEBP). Si CDP
se une a OCT1, no hay trancripcin porque no est CTFNF1,, mientras que si CTF-NF1 se une a OCT1, hay
transcripcin
porque
no
est
el
represor
CDP
(considerar que OCT1 se une a la caja OCT, que est al
lado de la caja CAAT y estimula la transcripcin).
- Las Histonas: pueden modificar la entrada de la
Polimerasa si se altera su estado. Pueden estar
abiertas (mucha transcripcin) o cerradas (poca
transcripcin).
sto se regula por los TF no basales que se unen al
DNA y reclutan enzimas que acetilan y desacetilan
histonas:
Un TF activador se une a secuancia activadora, recluta
a HAT (Histone Acetil Transferase), que acetila las
histonas, se abren y hay mas transcripcin. Por el
contrario, un TF represor se une a secuencia
represora, recluta a HDAC (Histone DeAcetilation
Complex), que desacetila las histonas, se cierran y
hay menos transcripcin.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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Es muy frecuente que los dominios en el DNA que son

diana de TF que reclutan a HAT o a HDAC sean enhancers
o silencers.
Tambin se pueden reclutar a protenas que remodelan
la cromatina (la posicin de los nucleosomas), o que
metilan las bases del DNA para silenciarlas.
Y todo se puede dar a la vez.
Algunos elementos de los promotores Eucariotas (repaso):
No se conocen todos. Consideramos que son genes de tipo II.

Como que hay miles de genes, estas cajas pueden solapar en
algunos genes, es decir, que en el gen A a -20 haya caja GC
y en el gen B a -20 haya la caja OCT. Pero como cada tejido
espresa sus TF no basales concretos, slo se expresa un gen
concreto.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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EXTRA TEMA 5: TCNICAS

REGULACIN GNICA.
DE
ESTUDIO
DE
LOS
ELEMENTOS
DE
Son vlidas tanto para Procariotas como para Eucariotas.

1. Retardo en gel: Para determinar promotores. Estudia si
en una regin se unen protenas o no. Tomo una secuencia
conocida de DNA sospechosa de ser diana de TF, marcada en
5 con flourescencia o radioactividad. Se mezcla el
extracto de protenas sospechosas de unirse (se mira en
bases de datos para tener una idea de cuales) y se hace una
electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los carriles que pongo han de ser (no en ste orden):
- Secuencia de DNA para estudiar, sola (control -)
- Secuencia de DNA para estudiar + DNA igual pero no
marcado en 5 es el competidor especfico + protena
sospechosa de unirse. Hago varios carriles con sta
mezcla, poniendo en cada uno concentracin diferente
de protena.
- Secuencia de DNA para estudiar + DNA diferente pero no
marcado en 5 es el competidor inespecfico + protena
sospechosa de unirse. Hago varios carriles en sta
mezcla, poniendo en cada uno concentracin diferente
de protena.
DNA CON PROTEINA UNIDAPESA MSAVANZA MENOSMOVIMINETO
RETARDADO.
En los carriles de competidor
especfico se va atenuando la
banda en la regin de protena +
DNA porque la protena se va
uniendo tanto al DNA marcado como
al no marcado, que tienen la
misma secuencia. Pero como cada
vez hay ms protena, cada vez se
une ms tanto al marcaco como al
no marcado y por eso no veo
apenas la banda, porque all hay
DNA
no
marcado
unido
a
la
protena.
En los carriles de competidor no
especfico,
la
banda
tiene
siempre
la
misma
intensidad,
porque la protena siempre se une
a la secuencia marcada y no al
competidor inespecfico. sto se
debe
a
que
la
protena
es
especfica de mi secuencia.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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Si en los carriles con la protenas pongo un anticuerpo

marcado contra la protena, sera confirmatoriosuperretardo en gel.
2. DNasaI footprinting: Sirve para saber a qu secuencia se
une la protena sospechosa. Si la secuencia de DNA es diana
de la protena, entonces al unirse, la protena tapa las
bases a las que se une, no son bases degradables, dejando
destapadas el resto de bases a las que no se une, las
cuales s que son degradables.
Se pone a digerir con la DNasaI (slo degrada DNA libre, no
la protena ni el DNA que est tapado por la protena). Se
hace una electroforesis en gel de agarosa.
En los carriles hay que poner:
- DNA conocido digerido con DNasaI, que deje bandas a
una altura conocida, nos servirn para comparar con el
carril con la muestra a estudiar. Es el control.
- DNA a estudiar + protena + DNasaI. Hay que considerar
que las digestiones nunca son 100% eficientes. Se
hacen diferentes bandas. Degrada en orden los nt. La
regin que no tenga banda es la regin unida a la
protena. Es muy preciso.
3. Gene Reporter: Sirve para determinar si una protena que

yo sospecho que activa o inhibe la transcripcin de un gen
determinado, se une a alguna secuencia reguladora de la
expresin de ese gen, ya sea un enhancer o un silencer.
Debo tomar mi gen (enhancers y/o silencers + promotor +
secuencia codificante), elimino la secuencia codificante y
la sustituyo por la de un gen reportero, como por ejemplo
la luciferasa o CAT (son unos genes cuyo producto es
detectable cuanti y cualitativamente, es decir, podemos
detectar que se expresa mucho o poco, o que no se expresa).
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 53
Tambin puedo utilizar unos vectores ya preparados con el

gen de la luciferasa (o de CAT) y que debo insertar,
mediante enzimas de restriccin, la regin reguladora a 5.
Ahora hay que ir haciendo diferentes experimentos en los
que se ponen la construccin de regin reguladora +
luciferasa
+
protena
sospechosa
de
modificar
la
transcripcin. La diferencia es que en cada experimento voy
haciendo deleciones seriadas de la regin reguladora, desde
el 53. En cada delecin que hago, miro con un
luminmetro la intensidad de la luz emitida por la
luciferasa. Debo hacer el control sin deleciones y a
continuacin las deleciones seriadas, mirando la intensidad
de la luz en cada caso.
Si veo que en algn punto llega a haber ms luz que en el
control, significa que en esa regin reguladora que he
delecionado haba un silencer. Si por el contrario veo que
a partir de un punto hay menos luz que en el control,
significa que la regin que he delecionado tiene un
enhancer.
Si
observo
la
misma
intensidad
lumnica,
significa que el la regin delecionada no haba nada
relacionado con la regulacin de la expresin de ese gen.
Que haya ms o menos luz equivale a decir que se transcribe
ms o menos el gen reportero, siempre gracias a la protena
sospechosa de regular la transcripcin.
Obviamente, si observo diferencias de intensidad lumnica
respecto del original, sean las que sean, significa que la
protena se une.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 54
Has clonat alguns cDNAs parcials dun factor de transcripci en un vector dexpressi per veure si els fragments
del factor codificats pels cDNAs parcials sn capaos d'unir-se a l' "enhancer" que reconeix a la protena completa.
Tots els cDNAs sestenen des de lextrem 3' fins a punts variables en direcci 5del gen (figura A). Tu transcrius i
desprs tradueixes aquests cDNAs in vitro i desprs barreges els productes de la traducci amb un fragment de
DNA marcat radiactivament, que cont l' "enhancer". Quan s'analitzen les barreges per electroforesi en gels de
poliacrilamida, algunes de les protenes codificades pels cDNAs suneixen al fragment de DNA provocant un
endarreriment en la seva migraci (figura B, carrils 3, 4 i 5). Quan els clons 3 i 4 es barregen abans de la
transcripci i de la traducci, apareixen tres bandes a lassaig de retenci en gel (figura B, carril 6).
a) Per qu les bandes retardades estan a diferents posicions en el gel?

Els cDNAs utilitzats per a la sntesi de les protenes que suneixen a lenhancer tenen mides
diferents i per tant codifiquen protenes de mides tamb diferents. Com ms gran sigui la
protena, ms accentiada ser la retenci del segment de DNA en el gel de poliacrilamida.
b) En el factor de transcripci, on est localitzat el domini duni a l' "enhancer"?
Les protenes procedents dels clons de cDNA 2, 3 i 4 suneixen a lenhancer, mentre que la
protena procedent del clon 1 no ho fa. Per tant, el domini duni al DNA est codificat en el clon
2, 3 i 4 per no en l1. Aix ens marca clarament el lmit C-ter del domini, que s el lmit 5 del
clon 1. El lmit N-ter del domini estaria situat a lextrem 5 del clon 3, perqu el producte proteic
del clon 2, tot i que suneix al DNA, ho fa amb menys afinitat que el producte del clon 3.
c) Per qu hi ha tres bandes retardades quan es barregen els clons de cDNA 3 i 4? Qu indica
aix sobre lestructura del factor?
La banda superior del carril 6 correspondria a homodmers del producte del clon 4 (4/4), mentre
que la banda inferior correspondria a homodmers 3/3. La banda intermitja serien heterodmers
3/4. Per tant, aquest carril ens indica que el factor de transcripci funciona com a dmer. La
banda intermitja s ms intensa no perqu els heterodmers tinguin ms afinitat per lenhancer
que els homodmers, sin perqu nhi ha ms (exactament el doble, si inicialment hi havia
quantitats equivalents de les protenes 3 i 4).
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 55
Ests estudiant lexpressi del gen AGM, que sexpressa en fetge i rony per no en cervell.
-500
-400
-300
-200
-100
AGM
1.- Fas un estudi de retard en gel (gel shift, EMSA) amb extractes nuclears de fetge (F), rony (R) i cervell (C), i
un carril sense extracte (SE), i utilitzes com a sonda els fragments a, b, c, d i e (delimitats per les fletxes) de 100
pb cadascun. Lnic que et dna un resultat positiu s el fragment c. Aquest s el resultat de lexperiment amb el
fragment c com a sonda:
SE
Per qu creus que les bandes retardades estan a diferents alades?

a) Perqu el gen t una llargada diferent en diferents teixits.
b) Perqu la sonda t una llargada diferent.
c) Perqu la protena que shi uneix t una mida diferent.
d) Les tres respostes anteriors sn falses.
Resposta:
La mida del gen no hi t res a veure, ja que en aquest experiment noms participa el fragment c
del promotor del gen i no la resta del gen. Per tant, la resposta a) s falsa. La resposta b) tamb
s falsa perque la sonda t la mateixa mida en tots els casos ja que s sempre el fragment c. La
resposta c) s la correcta: si la sonda s sempre la mateixa, la causa de les diferncies en la
migraci electrofortica ha de ser la mida de les protenes que suneixen a la sonda, i que estan
presents als extractes nuclears dels diferents teixits.
2.- Fas un experiment de DNasaI footprinting amb el fragment C i extractes nuclears de fetge i de
cervell. Amb lextracte de fetge sha observat la protecci que sindica amb una lnia contnua, mentre
que amb lextracte de cervell sobserva la protecci indicada amb una lnia de punts:
...GTAGGTCTAATGCTCTTTAGGCGTATGCCGTGTCG...
Dels experiments de retard en gel i DNasaI footprinting, pots deduir que la falta dactivitat en el cervell
es deu, molt probablement, a
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 56
a) heterodimeritzaci.
b) competncia pel DNA.
c) la retenci del factor activador en el citoplasma per part duna protena inhibidora.
d) no es poden extreure conclusions funcionals daquests experiments.
Resposta:
A partir de lexperiment de retard en gel sabem que al cervell suneix una protena diferent (de
mida inferior) que la que suneix al fetge. Els resultats de la DNasaI footprinting sugereixen que
hi ha una competncia pel DNA (resposta b), ja que les dues regions protegides se solapen
parcialment. La uni del factor de cervell (inhibidor) no permetria la uni del factor de fetge
(activador). La resposta c) s falsa perque en aquest cas no hi hauria retenci en lexperiment
de retard en gel ni protecci a la digesti amb DNasaI. La resposta a) s falsa tamb perqu si
lheterodmer no suneix al DNA no hi hauria ni retenci ni protecci (com en el cas de la
resposta c) i si lheterodmer suneix al DNA, la banda de retenci estaria ms amunt. A ms a
ms la interpretaci dels resultats de lexperiment de DNasaI footprinting seria molt ms
complicada que amb la hiptesi b). Per tant, la resposta ms probable es la b).
3.- A continuaci fas un experiment de Northern amb una sonda del gen AGM i RNA de fetge i de
rony. El mRNA de fetge fa 1,4 kb, mentre que el de rony fa 1,1 kb. Quina explicaci li pots donar a
aquest fet? [Es calcula que 0,2 Kb de cada mRNA corresponen a la cua de poliA].
a) Els dos mRNAs tenen un origen de transcripci diferent.
b) Hi ha un splicing alternatiu.
c) Els dos mRNAs tenen un lloc de poliadenilaci diferent.
d) Les tres respostes anteriors sn possibles.
Resposta:
Les tres primeres respostes sn possibles i, per tant, la resposta correcta s la d). Els dos
mRNAs poden tenir mides diferents si tenen diferents orgens de transcripci (el del fetge
estaria 0,3 kb ms a 5), si fan splicing de manera diferent (per exemple, podria ser que en el cas
del rony no sincorpori al mRNA madur un ex de 0,3 kb) o si tenen dos llocs de poliadenilaci
diferents (el de fetge estaria 0,3 kb ms a 3).
4.- Fas diverses PCRs sobre DNA genmic i sobre cDNA de fetge i de rony. Els resultats sn els segents
(F=Forward, R=Revers, els nmeros sn arbritaris):
Primers (encebadors)
F128-R201
F128-R15
F128-R74
F84-R201
F114-R201
DNA genmic
cDNA fetge
cDNA rony
1,2 kb
0,8 kb
0,5 kb
0,7 kb
0,4 kb
0,9 kb
0,5 kb
0,4 kb
2,3 kb
1,6 kb
0,5 kb
1,0 kb
0,4 kb
Amb aquestes dades respon novament a la pregunta anterior. Evidentment, la resposta pot ser similar a all
que has contestat abans o diferent. Et tornem a indicar les opcions:
a) Els dos mRNAs tenen un origen de transcripci diferent.
b) Hi ha un splicing alternatiu.
c) Els dos mRNAs tenen un lloc de poliadenilaci diferent.
d) Les tres respostes anteriors sn possibles.
Resposta:
Sembla que els primers F128 i R201 estan als extrems 5 i 3 respectivament perqu les
amplificacions tenen la llargada total dels mRNAs, segons les dades de la pregunta anterior (1,2
i 0,9 kb, respectivament; sumant 0,2 kb de les cues de poli-A donen 1,4 i 1,1 kb). Utilitzant el
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 57
primer de lextrem 5 (F128) i un primer interior (R74), les mides sn iguals per als dos cDNAs.
Aix elimina la possibilitat que sutilitzin dos orgens de transcripci diferents. En la PCR amb
el primer reverse de ms a 3 (R201) i un primer forward interior (F114), les dues amplificacions
sn de 0,4 kb. Aix elimina la possibilitat que sutilizin dos llocs de poliadenilaci diferents. En
canvi, en utilitzar el primer forward F128 amb el reverse R15 (que est ms a 3 que el R74) no hi
ha amplificaci amb al cDNA de rony. I tampoc si sutilitza el primer forward F84 (que est ms
a 5 que el F114) conjuntament amb el R201. Aquestes dades fan pensar que els primers R15 i
F84 es troben en un ex que selimina al rony per que es mant al mRNA madur de fetge. Per
tant, la resposta correcta s la b).
5.- La informaci bibliogrfica ens indica que uns autors han determinat lestructura del gen a partir duna
mostra heptica, i que hi ha trobat 3 exons. Quines de les segents longituds dexons i introns sn compatibles
amb les teves dades:
a) Ex 1: 0,4 kb. Ex 2: 0,3 kb. Ex 3: 0,5 kb. Intr 1: 0,8 kb. Intr 2: 0,3 kb.
b) Ex 1: 0,5 kb. Ex 2: 0,3 kb. Ex 3: 0,4 kb. Intr 1: 0,8 kb. Intr 2: 0,3 kb.
c) Ex 1: 0,5 kb. Ex 2: 0,8 kb. Ex 3: 0,4 kb. Intr 1: 0,3 kb. Intr 2: 0,3 kb.
d) Cap de les respostes anteriors s compatible amb les meves dades.
Resposta:
El primer ex ha de tenir una llargada de (com a mnim) 0,5 kb perqu s la mida de
lamplificaci amb els primers F128 i R74. Com que hem dedut que lex 2 no est present en el
cDNA de rony, si lex 1 fos de 0,4 kb, el primer R74 estaria a lex 2 i no hauria damplificar-se
a partir del cDNA de rony. Per samplifica. Per tant, lex 1 ha de tenir un mida de 0,5 kb (o
ms). Aix elimina la resposta a). La diferncia entre els dos cDNAs s de 0,3 kb que han de
correspondre a lex 2. Per tant, la resposta correcta s la b) amb lex 2 de 0,3 kb.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 58
1.-El gen que codifica lU2snRNA t una regi reguladora una mica especial. Lanlisi daquesta regi
es va fer per introducci de mutacions (caixes grises) i clonatge en un vector que cont un gen
reporter. Els resultats van ser els segents:
-250
-200
-150
-100
-50
+1
Expressi
gen reporter
+++
+
+
+++
+++
+++
Daqu deduireu que la situaci ms exacte dels elements de control s:
a)
b)
c)
d)
entre 250 i 175 i entre 100 i 50

Resposta:
La situaci del primer element de control ha de ser entre -225 i -200 perqu quan es muten les
caixes de -275 a -225 i de -200 a -125 lexpressi del gen no queda gens afectada. Aix ens
indica els lmits a -225 a 5 i de -200 a 3. Pel segon element de control el lmit a 5 ve indicat per
la caixa de -150 a -75 i el de 3 per la de -50 a 1. s a dir, est situat entre -75 i -50. Per tant, la
resposta correcta s la d).
2.- Direu que el promotor daquest gen cont una caixa TATA?
a) no, perqu s un gen de classe III
b) no, perqu encara que s un gen de classe II no hi ha cap element de
control a 5 que correspongui a la situaci de la caixa TATA
c) s, perqu s un gen de classe II i un dels elements de control a 5
correspon a la situaci de la caixa TATA
d) s, perqu s un gen de classe III dels que no tenen promotors interns
Resposta:
La resposta correcta s la b) perqu el gen que codifica la U2snRNA, aix com la majoria de
gens dels UsnRNAs (excepte el U6snRNA) sn gens de classe II, s a dir, sn transcrits per la
polimerasa II, i en lestudi de la regi reguladora no hi ha cap element de control situat cap a 25, que s on sol estar situada la caixa TATA.
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Carlos F.R.
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3.- Al mateix temps es va fer un assaig de retardament en gel (band shift), per identificar la protena
especfica que sunia a lelement regulador de ms a 5. A continuaci es dna lesquema que
representa el resultat de lexperiment (la fletxa indica la direcci de migraci en el gel). Digueu a qu
correspon cada un dels carrils (fragment de DNA de 250 a 175 = Sq.A; fragment de DNA de 175 a
100 = Sq.B)
a) carril 1.- Sq.A marcada

carril 2.- Sq.A marcada + extracte proteic
carril 3.- Sq.A marcada + extracte proteic + Sq.A no marcada
carril 4.- Sq.A marcada + extracte proteic + Sq.B no marcada
b) carril 1.- Sq.A marcada
carril 2.- Sq.A marcada + extracte proteic
c) carril 1.- Sq.B marcada
carril 2.- Sq.B marcada + extracte proteic
carril 3.- Sq.B marcada + extracte.proteic + Sq.B no marcada
carril 4.- Sq.B marcada + extracte proteic + Sq.A no marcada
d) carril 1.- Sq.A marcada + extracte proteic
carril 2.- Sq.A marcada
Resposta:
En aquest assaig de retardament en gel (band shift), en el carril 1 es veu noms una banda de
baix pes molecular: ha de correspondre a la sonda marcada, que s la seqncia A (fragment
de DNA que cont lelement regulador ms a 5). Els carrils 2) i 4) sn iguals i shi veuen dues
bandes: una corresponent a la sonda marcada i una altra ms retardada, produda per la uni
duna protena de lextracte proteic a la sonda. Com que es tracta duna protena especfica, la
banda no perdr intensitat quan lassaig es faci en presncia dun fragment de DNA diferent
(Sq.B) no marcat. Per tant, els carrils 2 i 4 poden correspondre ambds o b a Sq.A marcada +
extracte proteic o b a Sq.A marcada + extracte proteic + Sq.B no marcada. En el carril 3) la
banda retardada s menys intensa, tot indicant que lassaig sha fet en presncia de la mateixa
sonda (Sq.A) no marcada (compedtidor especfic), que competeix amb la marcada per la uni de
la protena especfica. La resposta correcta s, doncs, la a).
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Carlos F.R.
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4.- El gen que codifica lU2snRNA est implicat en lsplicing. Una mutaci en aquest gen que impliqus
la deleci de la regi complementria a lU6snRNA impediria
a)
b)
c)
d)
que es forms lspliceosoma

que es forms el centre cataltic
la uni al punt de ramificaci
les altres tres respostes sn correctes
Resposta:
Durant el procs dsplicing, un cop sha format lspliceosoma i sha dissociat la U1snRNP, es
promou la reacci cataltica mitjanant lalliberament de la U4snRNP (prviament unida a la
U6nRNP). La U6nRNP lliure pot unir-se a la U2snRNP (que est unida al punt de ramificaci) per
complementarietat, i formar el centre cataltic. Per tant, la deleci de la regi de la U2snRNA
complementria a lU6snRNA impediria la formaci del centre cataltic. La resposta correcta s
la b).
La resposta a) s incorrecta perqu lspliceosoma, el complex que cont tots els elements
necessaris per lsplicing, es podria formar. La resposta c) s incorrecta perqu la uni de la
U2snRNP al punt de ramificaci es produeix per una altra regi, que no es veuria afectada.
5.- Lsnurp U2snRNP
a) est implicat en lsplicing dels introns AT-AC
b) necessita el factor U2AF per poder-se unir a una seqncia especfica de
lintr
c) est implicat en lsplicing dels introns del grup II
d) s una protena del tipus SR
Resposta:
La U2snRNP suneix al lloc de ramificaci per complementarietat, desplaant la BBP. Per fer-ho,
necessita que prviament la U1snRNP shagi unit al lloc 5 dsplicing i el factor U2AF al lloc 3
dsplicing. La resposta correcta s la b).
La resposta a) s incorrecta perque la U2snRNP est implicada en lsplicing del introns
majoritaris GU-AG i no en el dels minoritaris AT-AC. La resposta c) s incorrecta perque
lsplicing del introns del grup II no requereix snRNPs. La resposta d) s incorrecta perqu les
protenes SR, tamb implicades en lsplicing, no sn snRNPs.
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El llevat respon a la presncia o absncia de galactosa i de glucosa en el medi mitjanant la regulaci
coordinada de la transcripci de diversos gens estructurals que codifiquen protenes implicades en el
metabolisme de la galactosa (GAL1, GAL2, GAL7, GAL10), i tamb dels gens reguladors GAL4 i
GAL80. Mitjanant experiments denginyeria gentica es construeixen mutants estables per alguns
daquests gens. Disposem de les segents soques diploides homozigtiques per diversos al.lels del
gen GAL4 (activador transcripcional) o GAL80 (repressor transcripcional).
Soca A: llevat salvatge
Soca B: mutant GAL4 en el domini duni al DNA (GAL4 no s capa dunir-se al DNA)
Soca C: mutant GAL4 en el domini duni a GAL80 (GAL4 no s reconeguda per GAL80)
Soca D: mutant GAL80 en el domini duni a la galactosa (GAL80 no s capa dunir-se a la galactosa)
Soca E: mutant GAL80 en el promotor del gen, a nivell de la seva nica seqncia UAS (que ja no s
reconeguda per GAL4)
Soca F: mutant per la protena MIG1 en el seu domini duni a la seqncia Mig1.
Es disposa tamb del segent plasmidi:
Plasmidi G: cont un cDNA mutat de GAL4 que codifica protena incapa dunir-se a GAL80
1. Sindica a continuaci el possible fenotip de diverses soques mutants en el gen GAL4. Quina frase
s FALSA?
a) La soca B no s capa de transcriure els gens diana de GAL4, encara que hi hagi galactosa
al medi.
b) La soca C transcriu constitutivament els gens diana de GAL4, independentment de
la presncia de galactosa i de glucosa.
c) La soca A transcriu els gens diana de GAL4 en presncia de galactosa i absncia de
glucosa.
d) La soca F no s capa dinhibir la transcripci dels gens diana de GAL4 en presncia de
glucosa (i de galactosa).
Resposta:
Lafirmaci a) s certa perqu a la soca B la protena activadora GAL4 no es pot unir al DNA i
per tant s incapa, en qualsevol situaci (presncia/absncia de galactosa) dactivar la
transcripci. Lafirmaci c) tamb s certa perqu la soca A s salvatge, i per tant s capa de
transcriure els gens GAL quan les protenes repressores GAL80 i MIG1 no estan unides,
respectivament, a GAL80 i al DNA, cosa que passa quan no hi ha galactosa al medi (en el cas de
GAL80) i quan hi ha glucosa (en el cas de MIG1). Lafirmaci d) tamb s certa perqu la soca F
produeix protena repressora MIG1 incapa dunir-se al DNA (sempre que hi hagi galactosa al
medi; si no hi hagus galactosa, la soca s que seria capa dinhibir la transcripci dels gens
GAL). Lnica afirmaci falsa s la b), ja que la soca C, tot i tenir la protena activadora GAL4
constitutivament unida als promotors dels gens GAL, no podr transcriure si la protena
inhibidora MIG1 est unida al DNA, cosa que passa en presncia de glucosa.
2. Sindica a continuaci el possible fenotip de diverses soques mutants en el gen GAL80. Quina frase
s CERTA?
a) A la soca E sactiva constitutivament la transcripci dels gens diana de GAL4 tant en
presncia com en absncia de galactosa al medi (sempre que no hi hagi glucosa)
b) A la soca D sactiva constitutivament la transcripci dels gens diana de GAL4 tant en
presncia com en absncia de galactosa al medi (sempre que no hi hagi glucosa)
c) A la soca E la transcripci dels gens diana de GAL4 est sempre reprimida
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d) A la soca D la transcripci dels gens diana de GAL4 sactiva en presncia de galactosa i

absncia de glucosa
Resposta:
Lafirmaci b) s falsa perqu a la soca D la protena inhibidora GAL80 no es pot unir a la
galactosa. Per tant, GAL80 sempre estar unida a GAL4 tot inhibint la transcripci. Lafirmaci
c) s falsa perqu la soca E s incapa de produir GAL80, i en conseqncia no es podr
reprimir la transcripci dels gens GAL quan no hi hagi glucosa al medi. Laformaci d) s tamb
falsa, perqu la soca D produeix GAL80 insensible a lefecte de la galactosa, i els gens diana de
GAL4 sactiven quan GAL80 est unit a la galactosa (en absncia de glucosa). Lafirmaci a) s
que s certa, ja que la soca E no produeix GAL80 i per tant si no hi ha inhibici de la
transcripci dels gens GAL via MIG1 (en presncia de glucosa), la transcripci esdev
constitutiva.
3. Es transfecten cl.lules de la soca E amb el plasmidi G. Quin fenotip esperem?

a) La soca transfectada es comporta igual que la soca sense transfectar.
b) Dins de les cl.lules transfectades conviuen dues protenes GAL4 diferents (lendgena i la
codificada pel plasmidi), i segons quina de les dues sigui ms abundant, pot variar el fenotip
c) La soca transfectada no transcriu cap dels gens diana de GAL4.
d) Cap de les opcions anteriors s correcta.
Resposta:
Lafirmaci a) s la correcta, ja que el plasmidi G produeix protena GAL4 incapa dunir-se a
GAL80, per aix no incorpora cap novetat a la cl.lula transfectada perqu aquesta s incapa
de produir GAL80.
4. Es fa un experiment de gel shift (retard en gel) barrejant un oligonucletid de cadena doble que
cont una seqncia UAS amb extractes de protenes nuclears procedents de diverses soques de
llevat, en absncia de galactosa. Quina de les quatre opcions s correcta?
a)
b)
Soca
A
Soca
C
Soca
A
c)
Soca
C
Soca
A
Soca
C
d) Cap de les anteriors s correcta
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Resposta:
La resposta correcta s la a): A la soca salvatge el fragment de DNA suneix a lheterodmer
GAL4 + GAL 80, mentre que a la soca C, que produeix protena GAL4 incapa dunir-se a
GAL80, el fragment de DNA suneix noms a GAL4 i per tant la retenci en el gel no s tan
accentuada. Si hi hagus galactosa, la resposta correcta seria la d), perqu el fragment de DNA
suniria noms a la protena GAL4 dels extractes de la soca A i C.
5. Es construeix un plasmidi que cont un gene reporter (luciferasa) sota el control dun promotor que
cont una sola seqncia UAS. Es fan els segents experiments de transfecci en absncia de
galactosa i de glucosa:
Experiment 1: transfecci de la soca B amb el plasmidi reporter.
Experiment 2: transfecci de la soca B amb el plasmidi reporter i el plasmidi G.
Lemissi de llum s indicativa dactivitat transcripcional. Quina de les segents opcions s correcta?:
a) Experiment 1: llum / Experiment 2: llum
b) Experiment 1: no llum / Experiment 2: no llum
c) Experiment 1: llum / Experiment 2: no llum
d) Experiment 1: no llum / Experiment 2: llum
Resposta:
La resposta correcta s la d). A lexperiment 1, la soca B produeix GAL4 incapa dunir-se al
DNA i per tant incapa dunir-se a la seqncia UAS del gen reporter. A lexperiment 2,
transfectem amb el plsmid G, que produeix protena GAL4 capa dunir-se al DNA (i no
reprimible per GAL80), que suneix la seqncia UAS del plasmidi reporter i dirigeix la
transcripci de la luciferasa.
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TEMA 6: LA TRANSCRIPCIN EUCARIOTA IV.

Estudiaremos
ejemplos.
los
TF
no
basales
inducibles,
mediante
Ejemplo 1. CREM (o CREB, a nivel funcional es igual).

Basalmente inactiva, se activa con AMPc (poca glucosa =
mucho APMc). Se sintetiza constitutivamente.
La diana de CREM activado es la caja CRE (Ciclic-AMP
Response EleMent) en el DNA. Las isoformas de CREM formadas
por splicing alternativo son CREMa (predominante, es
activador, con dominio de unin al DNA y dominio activador
de la transcripcin) y CREMi (represor, slo tiene dominio
de unin al DNA). El dominio de unin al DNA tiene
cremalleras de leucina, por tanto, dimeriza.
Se regula: la poca glucosa regula al AMPc, que activa a
ciertas quinasas que tienen como diana a CREM. Una vez
activado (por fosforilacin), CREM-P se une a la caja CRE
en el DNA. La caja CRE est, por ejemplo, en el gen de la
cadena de las gonadotrofinas. Una de las cajas CRE est
al lado del promotor de ICER, que se estimula y transcribe
para ICER. ICER tiene como objetivo bloquear a CRE para que
separar CREM y que no se una ms. Adems se para la
transcripcin de CREM porque el promotor de ICER (al lado
de caja CRE, diana de CREM fosforilado)est a 3 del
promotor de CREM. Y tambin se deja de transcribir ICER. La
afinidad de ICER por CRE es mayor que la de CREM
fosforilado por CRE. As se queda CRE bloqueado.
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Por tanto, la respuesta de CREM es rpida y transitoria.

Ejemplo 2. Genes Heat-Shock (HS). Son genes que se
transcriben cuando incrementa ligeramente la temperatura.
Los Heat Shock Factors (=HSF HStF) son TF inducibles que
se activan cuando sube la temperatura, sufriendo un cambio
conformacional. Activados, su diana en el DNA es Heat Shock
Element (HSE).
Se regula: HSF inactivo tiene enlaces intramoleculares que
se rompen con el calor y abren la molcula, que al tener
cremalleras de leucina, puede dimerizar. No es obligatorio
que lo haga, pero si lo hace sube mas la tasa de
transcripcin. Una vez activado (dimerizado o no), una
quinasa reconoce su estructura y lo fosforila en el dominio
de unin al DNA, dndole as cargas negativas que estimulan
a TF2D. Estando fosforilado, se une a la protena GAGA que
le permite unirse a las secuencias GAGA en el DNA, que se
encuentran entre los nucleosomas (fuera de las histonas).
Cuando la protena GAGA se une a la secuencia GAGA, GAGA
aparta las histonas del nucleosoma, descondensando el DNA
y permitiendo que HSF fosforilado se una a HSE (estaba
envuelto por las histonas), estimule a TF2D y se transcriba
el gen HS.
Ejemplo 3. El receptor de hormonas (HR). La hormona se une
al receptor especfico basalmente inactivo y dimeriza,
activndose. As inicia la transcripcin de genes.
Las hormonas que se captan son:
Todas ellas tienen en comn que derivan del metabolismo del

colesterol, por lo cual tienen una naturaleza lipfila que
les permite atravesar las bicapas lipdicas de las clulas
y unirse a su receptor que es citoplasmtico (o incluso a
veces es nuclear). El receptor es el TF!
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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El
tipo
de
HR
que
usaremos
de
ejemplo:
GR,
el
Glucocorticoid Receptor. Capta glucocorticoides, un tipo
de hormonas esteroides. Dentro de la familia de los
receptores esteroides, muestran un grado de homologa del
50% aprox por lo que se refleja la especificidad del
receptor por la hormona individual (Genes VII ed).
El TF inducible que las capta tiene 3 dominios:
- NTerminal:
activador
de
la
transcripcin,
sin
consenso.
- CTerminal: unin a la hormona y dimerizacin.
Homologa aprox. de 50%, por lo tanto los receptores
de esteroides tiene especificidad infividual por cada
hormona esteroide (Genes VII ed). Tiene dedos de Zn.
- Unin al DNA: 42-90% de homologa en todas las dianas
de los receptores de hormonas esteroides. Significa
que la mayora de HR reconocen secuencia muy parecidas
o algo parecidas, en el DNA. Tiene dedos de Zn.
De manera basal, es una protena secuestradora (Hsp90,
chaperona que mantiene plegado al receptor) que retiene a
los monmeros de GR en el citosol evitando que dimericen.
Cuando la hormona se une al GR, Hsp90 salta y los
receptores pueden dimerizar en el citosol.
Cuando GR ha dimerizado, y estando unido a la hormona, se
transloca al ncleo y se une a su caja diana: las
secuencias HRE (Hormone Response Element). Hay dos tipos de
HRE: GRE (Glucocorticoid Response Element) que es un
enhancer y nGRE que es un silencer.
La hormona sobre el GR hace el mismo efecto que el calor
sobre HSF. Pero los dmeros de GR pueden desplazar a los
nucleosomas por s solos, mientras que los de HSF
necesitaban a GAGA.
Lo ms frecuente es que GR dimerizado con la hormona se una
a GRE y active la transcripcin, pero a veces, las hormonas
bloquean la transcripcin en lugar de estimularla, es raro
pero sucede. Involucra a la caja nGRE, un silencer.
Basalmente, nGRE est unida a una protena A que permite
que s que se transcriba el gen, pero al unirse GR activado
a nGRE, salta A porque GR es ms afn y se bloquea la
transcripcin del gen.
El GR activado y unido a GRE (o a nGRE) puede desplazar a
las histonas sin ninguna ayuda, as, remodela la cromatina
del DNA. Para ello reclutan al Complejo Remodelador de la
Cromatina (CRC). El CRC contiene enzimas que actan en
diferentes procesos:
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- Sobre el DNA, se metila la Adenina por MECP2+Sin3.

Metilado, atrae a HDAC para bloquear la transcripcin.
Desmetilando la Adenina, no vienen ms protenas
desacetiladoras y se estimula la transcripcin.
- Sobre las histonas, HAT acetila las histonas para
separarlas e incrementar la transcripcin y HDAC
desacetila las histonas para que se unan bien al DNA,
lo compacten y no haya transcripcin.
Los procesos son reversibles.
As, el DNA se puede metilar en las A para silenciar la
transcripcin, la cromatina se puede remodelar para cambiar
la posicin de los nucleosomas, y las histonas se pueden
acetilar para saltar y que se transcriba ms.
El GR unido a GRE (enhancer) recluta 1 a CRC, despus
quedan
expuestas
las
secuencias
dianas
de
los
TF
constitutivos que entran a HAT y de los TF constitutivos
(unidos
a
enhancer?)
y
basales
que
activan
la
transcripcin, y si se requiere silenciar, saltan los TF y
se metila en las A. Todo sucede a la vez!
As, el DNA metilado con histonas desacetiladas tiene muy
poca transcripcin, mientras que un DNA no metilado con las
histonas acetiladas tiene una conformacin ms laxa y la
transcripcin de genes se ve estimulada.
El RNA de Interferencia. Recientemente descubierto tambin,

inactica genes de manera selectiva, se usa para estudiar
enfermedades. Hay dos tipos:
siRNA (small interference RNA): la clula Eucariota se
defiende de los virus de dsRNA mediante 2 proteinas: DICER,
que corta el dsRNA vrico en trozos pequeos de dsRNA con
extremos protuberantes de ssRNA. Son el siRNA. Son
reconocidos por RISC que desnaturaliza en ssRNA, se une a
l y deja un extremo libre de ssRNA (gasta ATP). ste
trocito de ssRNA con RISC puede: ser degradado por RISC,
se une a otros RNA vricos por complementariedad de bases y
bloquea la traduccin parando al ribosoma, activa a DICER
que le d ms trabajo a RISC.
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Carlos F.R.
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RISC con el ssRNA tambin puede traslocarse al ncleo y

bloquear a otros RNA que se expresan en el husped que
proceden de DNA integrado en el genoma.
miRNA (microRNA): Se produce dentro del ncleo de la

clula. Regulan la produccin de protenas concretas porque
se unen por complementariedad al mRNA de sas protenas. Es
un mecanismo de regulacin de la expresin gnica muy
nuevo, en estudio. Viene de un promotor que mira en
direccin opuesta al gen que quiero regular, por eso los
trnscritos son complementarios.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 69
Cmo
-
se activan los TF inducibles:

Sintesis de TF lento.
Fosforilacin HSF.
Desfosforilacin.
Unin a ligando HR.
Corte Hidroltico.
Separacin de protena inhibidora NF-kD.
Change of Friend: En un heterodmero, cambiamos un
miembro por otro que tenga ms afinidad por el DNA y
se une.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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El gen per a la cadena lleugera de les immunologlobulines cont un "enhancer", que regula la seva expressi,
dins dun dels seus introns. Una protena anomenada NF-B, que suneix a aquest "enhacer", es troba en extractes
nuclears de cl.lules B, les quals sintetitzen activament immunoglobulines. Contrriament, a les cl.lules
precursores de les cl.lules B (cl.lules pre-B) que no expressen immunoglobulines, no es detecta activitat NF-B.
Ens interessa estudiar lestratgia per la qual NF-B regula l'expressi del gen de la cadena lleugera .
Si les cl.lules pre-B es tracten amb sters de forbol (que activen la proteina quinasa C, causant la fosforil.laci
dalgunes protenes cel.lulars), en pocs minuts apareix una activitat NF-B paral.lelament a lactivaci
transcripcional del gen de la cadena lleugera . Aquesta activaci de NF-B no es bloqueja per cicloheximida, que
s un inhibidor de la sntesi de protenes.
Descobreixes casualment que extractes citoplasmtics de cl.lules pre-B no estimulades contenen una forma
inactiva de NF-B que pot sser activada per agents desnaturalitzants suaus (els agents desnaturalitzats
destrueixen els enllaos no covalents per no trenquen els covalents). Per intentar entendre la relaci existent entre
lactivaci de NF-B i la regulaci transcripcional del gen de la cadena lleugera , alles fraccions nuclears (N) i
citoplasmtiques (C) de cl.lules pre-B, abans i desprs de lestimulaci amb sters de forbol. Llavors mesures
lactivitat NF-B mitjanant un assaig de retenci en gel, abans i desprs de tractament amb els agents
desnaturalitzants suaus. Els resultats es mostren a la figura.
a) Com canvia la localitzaci intracel.lular de NF-B a les cl.lules pre-B en resposta al tractament amb
sters de forbol?
Abans del tractament amb sters de forbol el factor NF-
B est al citoplasma (carril 6) i desprs
del tractament est al nucli (carril 7).
b) Creus que lactivaci de NF-B en resposta als sters de forbol succeeix perqu NF-B s fosforilat
per la proteina quinasa C?
Tot i que els sters de forbol activen la proteina quinasa C, no sembla probable que el NF-
B
sactivi directament per fosforilaci, ja que tamb es pot activar per agents desnaturalitzants
suaus i, per tant, el NF-
B actiu i linactiu no poden diferir en modificacions covalents.
c) Descriu breument un mecanisme molecular per a lactivaci de NF-B com a conseqncia del
tractament amb sters de forbol.
El NF-
B s inactiu al citoplasma perqu est unit a una protena inhibidora per enllaos no
covalents. Els agents desnaturalitzants suaus poden trencar els enllaos i separar lNF-
de la
protena inhibidora (aix passa en els extractes citoplasmtics).
Qu fan els sters de forbol? Poden activar el NF
B,
perqu fosforilen linhibidor que, aix
fosforilat perdria afinitat per lNF-
B. LNF-
B lliure pot dimeritzar, passar al nucli i unir-se al
DNA.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 71
TEMA 7: LA TRADUCCIN.
Consiste en sintetizar protena a partir de mRNA. No se
puede regular tanto como la transcripcin.
La estructura de los ribosomas es:
- Procariotas: Subunidad grande (5S-rRNA, 23S-rRNA, 30
proteinas)
y
Subunidad
pequea
(16S-rRNA,
20
proteinas). Coef. de sedimentacin: 70S.
- Eucariotas: Subunidad grande (5S-rRNA, 58S-rRNA, 28SrRNA, 50 proteinas) y Subunidad pequea (18S-rRNA, 30
proteinas). Coef. de sedimentacin: 80S.
La S indica la velocidad a la que va sedimentanto la
estructura. Es directamente proporcional a la masa (mucha
masa = tarda poco tiempo en caer = mucha S).
En el ribosoma Procariota, la catlisis del enlace
peptdico (actividad peptidil transferasa) est catalizada
por el 23S-rRNA de la subunidad grande. En Eucariotas, sta
actividad la realiza la subunidad grande al completo (rRNA
y las protenas asociadas).
Los AA los aporta el tRNA. En Procariotas, la transcripcin
y traduccin se dan en el mismo compartimento (protoplasma)
y casi al instante, mientras que en Eucariotas, la
transcripcin se da en el ncleo y la traduccin en el
citoplasma, en momentos separados si hace falta.
El 16S-rRNA Procaritico, de la subunidad pequea, se une
al mRNA gracias a 6 nt conservados el 100% de las veces,
que estn a 3 del 16S-rRNA en el dominio 3 menor. En el
dominio 3 mayor hay la regin de unin al tRNA y al EF-G.
Por el dominio 5 o central se une a la subunidad mayor.
Tiene muchas secuencias palindrmicas, lo que le da una
complejidad elevada.
El 16S-rRNA puede unirse al mRNA gracias a los 6 nt
conservados el 100% de las veces, que son complementarios a
una regin del mRNA llamada Shine-Dalgarno. El S-D se
encuentra a 5 del mRNA.
S-D = RBS (Ribosome Binding Site) = Leader = 5UTR.
El tRNA, como mnimo hay 20 tipos, uno para cada AA. Pero
debido que cada AA puede venir transportado por diferentes
tRNA, hay ms. Estructura en forma de trbol.
La unin de AA al tRNA se realiza en el extremo 3 del
tRNA, mediante un enlace covalente de tipo ster. El grupo
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 72
3OH de la A del tRNA y el grupo COOH del AA se unen

mediente ste enlace ster gracias a la AminoAcil-tRNAsintasa.
Hay 1 enzima para cada tipo de AA, por tanto hay 20.
Primero debe gastar ATP para activar al AA, formando AA-AMP
(=AA*) + PPi. Ahora lo puede cargar en el tRNA liberando el
AMP y produciendo AA-tRNA.
Todo sto sucede dentro del enzima gracias a que tiene

diferentes dominios: unin al ATP, al AA, al tRNA y centro
cataltico.
sto
es
vlido
para
Procariotas
como
Eucariotas.
La
estructura
del
ribosoma
(tambin
vlido
para
ambos)consiste en un orgnulo formado por el ensamblaje de
la subunidad grande y la subunidad pequea, las cuales
tienen los sitios P(peptidil, hace la cadena polipeptdica)
y A(aminoacil, lugar aceptor de AA).
El enlace ster que une el tRNA al AA en sitio P, tiene que

pasar al sitio A formando el enlace peptdico propio de las
protenas. Se produce un ataque nucleoflico entre el NH3
del AA en el sitio A y el COOH del AA en el sitio P. Ya que
es el NH3 quien roba los electrones, se dice que la cadena
polipeptdica crece en NH3COOH. ste proceso (actividad
peptidil transferasa),en Procariotas, lo cataliza el 23SGentica Molecular.
Carlos F.R.
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rRNA, y en Eucariotas lo cataliza la subunidad grande del

ribosoma.
El NH3 queda mirando hacia el exterior del polipptido

naciente. La traduccin tiene 3 fases: Iniciacin (la
subunidad pequea se une al 5), Elongacin (entra la
subunidad grande y comienza a formar enlaces peptdicos
entre los AA) y Terminacin (cuando se lee el codn STOP,
en el ltimo exn siempre, se desmonta el ribosoma y salta
la protena). Se necesitan los Factores Iniciadores (IF),
Factores Elongadores (EF) y Factores de Liberacin (Release
Factors RF), cada uno para su respectiva fase.
Especficamente en Procariotas, se encontr una secuencia
conservada el 100% de las veces a 5 del mRNA, en el
Leader. Se trata del Shine-Dalgarno. Est a 10nt del AUG
(primer codn, indica el principio del primer exn,
codifica para metionina), y es complementaria a la
secuencia en 3 del 16S-rRNA.
sto vale para Procariotas, pero en Eucariotas no es

cierto: el ribosoma reconoce al CAP en 5, que hace la
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misma funcin que S-D en Procariotas; y hay una secuencia

llamada kozak en el leader, que frena al ribosoma cuando
hace screening (ahora lo veremos). Kozak no se parece en
nada a Shine-Dalgarno, slo se parece en que ambas estn en
el leader.
1A. Iniciacin en Procariotas: Se necesita un tRNA especial
para poder empezar. El primer codn siempre es AUG, por
tanto se trata de una metionina, pero la del primer codn
es una metionina formilada el tRNA iniciador en
Procariotas tiene una N-formil-Metionina.
Primero la AminoAcil-tRNA-sintasa sintetiza el Met-tRNA
(enlace covalente tipo ster). A continuacin, una formiltransferasa le transfiere un formil al Nterminal de la
metionina, producindose un NfMettRNA (su estructura es
como el tRNA de la pg. 73 pero con Metionina formilada en
el 3) ste es el tRNA iniciador, el nico que puede entrar
en el sitip P del ribosoma ensamblado sobre el mRNA. Una
vez liberado el polipptido, una formilasa puede eliminar
el formil (o no).
Para ensamblar el ribosoma, se necesitan los IF.
- Basalmente, la subunidad pequea del ribosoma est
unida a IF1, IF2, IF3.
IF3 es el encargado de mantenerlo separado de la
subunidad grande, ayudar al 16S-rRNA a unirse al S-D y
atrae el GTP, pero no es para l.
- El IF2 capta al GTP y forma IF2-GTP. As, sin
hidrolizarlo, puede unirse al mRNA por 16S-rRNAS-D.
IF1 da estabilidad al complejo. Gracia a IF3, lo hace
justo en la zona de S-D y queda en la posicin
correcta para que puede entrar el tRNA iniciador, el
cual queda en el sitio P sobre AUG.
- Se produce un cambio conformacional el IF2 debido a
que el fMet-tRNA se une a AUG. IF2 hidroliza ahora el
GTP y saltan IF1, IF2, IF3.
- Sin IF3, se une la subunidad grande a la pequea, que
ya tiene el tRNA iniciador bien situado, ocupando el
lugar P.
La unin tRNAiniAUG se da cuando la subunidad pequea se
ha unido al mRNA.
1B. Iniciacin en Eucariotas: El tRNA iniciador es normal,
no est formilado en la metionina. Es el CAP 5 que atrae a
la subunidad pequea del ribosoma, la cual se empieza a
mover sobre el mRNA haciendo screening en 53, hasta
que encuentra a la secuencia Kozak en el leader. Ahora se
une al tRNA inicidor. En Eucariotas, la unin tRNA
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Carlos F.R.
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iniciador subunidad pequea se hace siempre antes de

tocar el AUG.
Debido a que el CAP 5 hace que el mRNA tenga una vida ms
larga que el Procariota, se pueden ir uniendo varios
ribosomas, uno tras otro, al mismo mRNA para traducir mucha
cantidad de protena. Son los polisomas polirribosomas.
En Eucariotas, el tRNAini ya estaba en la subunidad pequea
antes de que sta entrara al mRNA.
Para
ensamblar
el
ribosoma,
se
necesitan
los
IF
eucariticos (eIF).
- En el citosol hay eIF4-F, que tiene varios dominios:
eIF4-E (es el primero en actuar, reconoce y se une al
CAP en 5), eIF4-G (interacta con eIF3, con PABII
circularizando el mRNA y permitiendo que aparezcan los
polirribosomas, y da estabilidad al complejo), eIF4-AB
(heterodmero de eIF4-A + eIF4-B, evita la formacin
de hairpins). Se queda el mRNA con el eIF4-F y todos
sus dominios en 5.
- Al mismo tiempo, la subunidad pequea tiene eIF3, que
la mantiene separada de la grande (como antes). A la
subunidad pequea se une eIF2. eIF2 captura GTP. As,
eIF2-GTP puede capturar al tRNA iniciador (que no
tiene formil!). Se ha formado el complejo ternario:
tRNAini+eIF2+GTP.
- Ahora, eIF4-G unido en 5 del mRNA reconoce a eIF3 de
la subunidad pequea (que tiene el complejo ternario)
y permite que se una al mRNA.
- La subunidad pequea con el complejo ternario y el
eIF4-F se empieza a mover en 53 del mRNA. ste
movimiento se llama screening, gasta ATP. Cuando se
detecta la secuencia kozak, que es adyacente al AUG,
se para de mover y el tRNAini, que ya estaba de antes,
encaja bien sobre el AUG.
- Una vez quieto y con el tRNA unido a AUG, se recluta a
eIF5, una GTPasa que hace que el GTP de eIF2 se
hidrolice. Cuando salta eIF2, conserva el GDP unido.
- Con la energa liberada de la hidrlisis, saltan todos
los eIF. eIF2 puede reactivarse por eIF2-B, una
quinasa que fosforilara a GDPGTP.
- La subunidad grande, que ya estaba rondando cerca,
tena unida basalmente a eIF6, que la mantena
separada de la pequea. Con la energa de la
hidrlisis del GTP, tambin salta eIF6 de la subunidad
grande.
- Se pueden unir las subunidades, con el tRNAini ya en
su posicin, que ocupa el lugar P.
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Carlos F.R.
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2A. Elongacin en Procariotas: Intervienen los EF, se

forman los enlaces peptdicos.
- Con el ribosoma ensamblado, con fMet-tRNA en AUG
ocupando el sitio P, ha entrado gracias a IF2+GTP. Hay
el sitio A libre. En el sitio A slo pueden entrar los
tRNA con AA mediante EF-TU (GTPasa). Cuando ha dejado
el tRNA unido a su codn, se hidroliza el GTP y salta
EF-TU.
- Con tRNA en ambos lugares, el 23s-rRNA de la subunidad
grande cataliza la actividad peptidil transferasa y
forma el enlace peptdico como antes se ha explicado.
- El sitio P queda con un tRNA sin AA, y el sitio A con
un tRNA que carga la cadena polipeptdica naciente,
con el NH3 apuntando siempre hacia fuera. El ribosoma
se mueve 3nt en 53 gracias a EF-G, otra GTPasa y
sucede que el tRNA sin AA pasa al sitio E
(compartimento virtual que expulsa inmediatamente al
tRNA vacio), el sitio P pasa a estar ocupado por el
tRNA con la cadena polipeptdica y el sitio A vacia,
listo para volver a empezar de nuevo con EF-TU que
entra al tRNA.
Para que se desplace el ribosoma, hace falta GTP que es
aportado por EF-G. Entra en el sitio A cuando el tRNA con
la cola polipeptdica est all, hidroliza el GTP y salta
l y el ribosoma se mueve 3nt.
Atencin: EF-TU es una GTPasa que hidroliza GTP cuando
deja el tRNA en el sitio A, con el objetivo de salir ella y
reciclarse. Al hidrolizarlo, se queda unida al GDP. Afuera
le espera EF-TS, el intercambiador de nt: quita el GDP y
pone un GTP, con lo cual EF-TU puede volver a entrar en el
siguiente.
EF-G, que tambin es una GTPasa, hidroliza el GTP para que
se mueva el ribosoma, pero de manera que se separa todo y
al salir EF-G sin nada, es ella misma que capta a un nuevo
GTP, tal cual. As puede volver a entrar en el sitio A.
Las actividades GTPasa se activan en contacto con el rRNA,
con sus dominios de contacto para cada molcula. EF-TU es
diana de muchos antibiticos, como la kirromicina.
2B. Elongacin en Eucariotas: El proceso es el mismo, pero
los factores tienen el nombre cambiado:
EF-TUeEF1- , EF-TSeEF1- , EF-GeEF-2.
Recordar que para formar el enlace peptdico hay que romper
el enlace ster, por un ataque nucleoflico en NH3COOH
catalizado por la actividad peptidil transferasa de la
subunidad grande.
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3A. Terminacin en Procariotas: Intervienen los RF1, RF2 y

RF3, que se unen al sitio A cuando aparece un codn STOP
(tambin entran EF-G y EF-TU):
RF1 reconoce los codones UAA, UAG.
FR2 reconoce los codones UAA, UGA.
RF3 se une RF1 o a RF2 activndolos, cuando se han
unido al codn STOP.
Es debido a l que salta todo: el polipptido, el mRNA, las
subunidades del ribosoma, los RF. Cuando salta, la
subunidad pequea se une de inmediato a IF3.
3B. Terminacin en Eucariotas: Es ms fcil que en
Procariotas (cosa rara). Slo hay un factor implicado, el
eRF1, que hace la misma funcin que los RF Procariotas.
_________________________________________________________
La Pauta de Lectura Abierta (Open Reading Frame, ORF):
(porqu no lo explican en clase?) En Eucariotas, no hay
operones. El mRNA slo codifica para una nica protena.
Los codones (3 nt) se leen linealmente.
A veces se da que en un mismo mRNA hay dos AUG, cada uno de
ellos con su secuencia STOP. Vienen uno tras otro,
linealmente. Es como tener 2 genes diferentes en un mRNA.
Wikipedia
...se llama
marco abierto de lectura (siglas

ORF del ingls Open reading frame) a cada una de las
secuencias de ADN comprendida entre un codn de inicio
(ATG) de la traduccin y un codn de terminacin,
descontando las secuencias que corresponden a los intrones
en caso de haberlas. Se encuentra acotado por los UTRs, o
secuencias no traducidas.
En una secuencia de ADN cualquiera hay, a priori, 6
posibles sentidos en los que pueden aparecer marcos
abiertos
de
lectura;
dado
que
cada
codn
toma
3
nucletidos, existen 3 posibles lugares de inicio para
tomar los nucletidos de 3 en 3, si se tomara un cuarto
nucletido como lugar de inicio, hara coincidir el marco
abierto de lectura con el mismo que si se toma el primer
nucletido. A lo que hay que sumar los otros 3 posibles
marcos abiertos de lectura si el ADN es traducido tomando
como molde la hebra complementaria, dando el sentido de
lectura opuesto. Estos marcos abiertos de lectura se
denominan +1, +2, +3, -1, -2 y -3.
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En un ejemplo con la secuencia 5' aactgcagtacgtaacgtca 3'

+3
+2
+1
-1
-2
-3
5'
a act gca gta
5' aa ctg cag tac
5' aac tgc agt acg
3' ttg acg tca tgc
3' tt gac gtc atg
3'
t tga cgt cat
cgt
gta
taa
att
cat
gca
aac
acg
cgt
gca
tgc
ttg
gtc a 3'
tca
3'
ca
3'
gt
5'
agt
5'
cag t 5'
Cada uno de los 6 posibles marcos abiertos de lectura dar

lugar a una secuencia proteica absolutamente diferente.
En ingls el marco abierto de lectura se denomina ORF (open
reading frame).
_______________________________________________________
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TEMA 8: LA REPLICACIN PROCARIOTA.

Es una replicacin simple. Se da mediante un nico
Replicn: toda la longitud de un DNA que se replica a
partir de un nico origen de replicacin (el concepto de
Replicn es vlido para Procariotas y Eucariotas).
La sntesis de DNA es semiconservativa, lo catalizan las
DNA Polimerasas, que dependen de un molde de DNA que
contiene la informacin original. Necesitan un extremo 3OH
libre a partir del cual empezar a elongar en 53.
Siempre se elonga en 53. Tambin necesita cationes
divalentes y dNTP (cuando entran en el DNA, pierden el P en
, quedando el P en unido al DNA).
En una burbuja de replicacin hay 2 horquillas de
replicacin, cada una de las cuales avanza en la direccin
contraria a la otra.
El DNA de nueva sntesis, mientras se replica, recibe el
nombre de cadena leading(53) si est sobre el molde
en sentido 35. No da problemas. La cadena lagging
est sobre el molde en 53, y tambin se elonga en
53, pero para poder ir en el mismo sentido, va lenta y
necesita los Fragmentos de Okazaky (FO).
Las etapas de la Replicacin son:
1. Iniciacin: La secuencia OriC es el punto de origen de
la replicacin nico en el cromosoma circular de E.Coli.
Tiene 245pb y 2 subregiones:
- 3 cajas de 13pb (unos 13 mer cada una), ricas en A-T,
en repeticin directa.
- 4 cajas de 9pb (unos 9 mer cada una), con
orientaciones invertidas de la misma secuencia.
La protena DNA-A reconoce a las cajas de 9 mer de OriC

(tiene que estar metilado). Es una ATPasa.
Cuando llega a 30 monmeros de DNA-A sobre las cajas de 9
mer, recluta a HU e IHF, que se unen a DNA-A y rompen los
puentes de H2 de la regin anterior: las cajas de 13 mer.
Lo hacen porque estiran, no porque sean helicasa.
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Al agujero de las cajas de 13 mer se une DNA-C, la cual

permite que entre DNA-B (=Helicasa) gastando ATP. Cuando
DNA-C ha ayudado a entrar a DNA-B, se va. DNA-B, la
helicasa, es un homohexmero en forma de anillo, sin
especificidad de secuencia, a travs de ella pasa la cadena
de ssDNA que ser la molde a la lagging (es decir, se
coloca sobre la que est en 53).
La helicasa rompe los enlaces de H2 entre las bases. A

continuacin vienen las SSBP (Single Strand Binding
Proteins) que se unen al ssDNA, ya que el ssDNA sin
proteccin es MUY peligroso (puede recombinar, etc). Las
SSBP se separan cuando se ha replicado.
Ahora entra la DNA-G (=Primasa), un tipo de RNA Polimerasa.
No tiene especificidad de secuencia. Necesita activarse,
para ello, la DNA-G se activa al tocar a la DNA-B. Queda
enganchada a las 2 cadenas molde donde est DNA-B. El 1er
primer que se hace es el de la cadena leading. Es un primer
de RNA. Mientras la Helicasa avanza, va reclutando
Primasas, lo cual es necesario para sintetizar la lagging.
La Primasa se marcha despus de hacer el primer.
La replicacin normal dura unos 40. En cultivo con medio
rico, dura 20. Esto pasa gracias a que la activacin de
los OriC se hace antes de que acabe la replicacin
anterior. La clula hija recibe un cromosoma circular que
se est replicando.
El inicio de la replicacin se regula con dos enzimas:
- SeqA: se une a la secuencia GATC de OriC, cuando est
hemimetilado (=recin sintetizado).
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SeqA bloquea que entre la metilasa DAM, que metila.

Pero con el tiempo, se llega a soltar SeqA. Entonces
entra metilasa DAM, metila y puede entrar DNA-A
(necesita DNA metilado, no vale el hemimetilado)si hay
que replicar. La metilasa DAM y SeqA tienen la misma
diana.
- Metilasa DAM: puede aadir grupos metil a las Adeninas
que no estn metiladas, que estn en un DNA
hemimetilado. Reconoce a la secuencia GATC El DNA no
metilado es reciente. El DNA metilado es antiguo. El
hemimetilado es recin sintetizado. Cuando est
metilado en las dos cadenas, puede entrar DNA-A.
La reaccin es Adenina + SAM6-metilAdenina + SAM sin
el grupo metil.
OJO: los factores en CIS son secuencias de DNA adyacentes a
un gen. Los factores en TRANS son protenas que se mueven
por el citosol, o secuencias de otro DNA que no es del
genoma que considero.
2. Elongacin: siempre hay que tener presente que 1 burbuja
tiene 2 horquillas de replicacin.
La replicacin es bidireccional, a partir de un nico OriC.

El DNA siempre se sintetiza en 53. Un fragmento de
Okazakt (F.O.) tiene el primer de RNA + segmento de DNA
elongado por la Polimerasa III.
Los primers son fragmentos pequeos de RNA que que
sintetiza la DNA-G, al activarse en contacto con la
helicasa. El primer es de unos 10-15nt, sin diana definida,
pero suele empezar por 5-AG-3.
La cadena leading necesita un nico primer. La cadena
lagging necesita un primer por cada fragmento de okazaky.
En la lagging, la primasa va entrando y saliendo, ya que al
sintetizar el primer salta enseguida porque es poco
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procesiva. Siempre se activa al tocar a la helicasa! (la

helicasa toca a la DNA Polimerasa, la primasa no).
El 1er primer es el de la cadena leading. El de la lagging
se hace cuando la horquilla de replicacin se ha abierto un
poco.
Realmente, es el DNA que se mueve dentro de la Polimerasa y
la helicasa, no al revs. Son como dos cuerdas que se
estira cada una por el lado opuesto. Para poder acompasarse
a la leading, la cadena lagging va formando bucles para
acompasar el ritmo.
Sobre las DNA Polimerasas Procariotas son complejos
multienzimticos.
Todas
polimerizan
en
53.
Hay
diferentes tipos:
- DNA Polimerasa I: es poco procesiva (= se separa
rpido del DNA); tiene actividad exonucleasa 53 y
actividad exonucleasa 35 proofreading (corrige
errores en el DNA). Los mutantes son poco viables.
- DNA Polimerasa II: Es similar a la DNA Polimerasa III
pero es prescindible.
- DNA Polimerasa III: Hay pocas en cada clula, es un
agregado
de
10
polipptidos.
Tiene
actividad
exonucleasa
35
(gracias
a
ello
hace
el
proofreading: pone una base mal por error, lo detecta,
se para y da marcha atrs degradndola y poniendo la
buena en 53). No puede hacer exonucleasa en
53. Es la ms procesiva (aguanta mucho unida al
DNA) y rpida. Los mutantes son letales condicionales:
mueren si se han de replicar.
Su estructura tiene 3 subunidades:
Core/ncleo cataltico. Tiene 3 polipptidos:
(actividad cataltica 53, es el pulgar),
(exonucleasa 35, proofreading) y (mantiene unido
el core)
Asociacin. Tiene 2 polipptidos: (tambin llamado
Sliding clamp, es un anillo homodimrico por dentro
del cual pasa el ssDNA; toca a la polimerasa por la
parte de atrs del ncelo cataltico y tambin toca a
, pero en momentos separados) y (carga el ssDNA
dentro de Sliding clamp, es un pentmero de 5
polipptidos ,,,,; es una ATPasa que unida a
ATP carga el ssDNA dentro de Sliding clamp, y al
hidrolizar el ATP se separa).
Puente. Son dos protenas (unen el ncleo cataltico
con la subunidad de asociacin).
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Carlos F.R.
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La Sliding clamp es necesaria para mantener el core

cataltico unido al ssDNA, sin se separara de golpe
durante la replicacin (malsimo).
Gracias a que se carga el ssDNA dentro de la Sliding
clamp () gracias a +ATP. Lo hidroliza y se separa
de . Para ir poniendo las dentro de la cadena
molde de la lagging, se tiene que ir sintetizando ms
, la cual es reclutada por para anillarla al ssDNA
de la siguiente regin.
El replisoma en accin. Replisoma= conjunto de todos los

enzimas funcionando que intervienen en la replicacin.
La actividad proofreading (exonucleasa 35) de la DNA
Polimerasa I convierte el primer de RNA en DNA cuando ya
est constituido el fragmento de Okazaky, y tambin
convierte el primer de RNA en DNA de la cadena leading.
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Carlos F.R.
Pgina 84
Revisa a la nueva cadena: es una actividad exonucleasa de

RNA en 53 (por delante) y exonucleasa de DNA en 35
(slo degrada los errores, no degrada el DNA que acaba de
sintetizar la DNA Polimerasa III); evidentemente el DNA
nuevo se polimeriza en 53 (lo hace por detrs). Si
encuentra un error que la DNA Polimerasa III haya pasado
por alto (porque tambin hace proofreading) lo repara
degradndolo. Avanza as por todo el DNA.
Finalmente acta la ligasa unindolo todo, forma los
enlaces fosfodister tpicos entre los fragmentos de
Okazaky, gastanto ATP.
Actualmente hay visiones alternativas de la replicacin
(the replication factory), que afirman que aunque el
funcionamiento es el mismo, la estructura que se adquiere
es distinta.
Hasta ahora considerbamos que 1 Replisoma est sobre 1
horquilla. Una burbuja tendr, por tanto, dos replisomas.
Cada replisoma tiene una cadena molde de la leading y una
cadena molde de la lagging.
Pero segn algunos modelos recientes, una misma cadena (la

53 molde de la lagging la 35 molde de la leading)
se replica mediante el mismo replisoma, y todo el resto es
igual. Los enzimas estn quietos, se muede el DNA.
Las helicasas unidas entre ellas, inmovilizan a la DNA

Polimerasa III.
3. Terminacin: (lo explican muy mal en clase). El final
terico es la mitad del cromosoma circular, en lnea recta
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Carlos F.R.
Pgina 85
respecto al OriC. Si se pasa de ese final terico es porque

el otro replisoma se ha atascado.
La direccin de replicacin y de transcripcin de los genes
es la misma. Hay genes que se tienen que expresar durante
la replicancin, si lo hacen en la horquilla de replicacin
donde est el replisoma que no se ha pasado del final, no
hay problema porque van en el mismo sentido y no se topan.
Pero si se pasa el replisoma del final y se topa con la RNA
polimerasa que est transcribiendo en la otra horquilla, es
MUY malo porque se chocan y se estropean los enzimas.
Al tener aproximadamente la misma velocidad de replicacin
las dos horquillas, en teora deberan encontrarse en el
final terico y saltar los dos. Pero si esto no sucede
(porque uno de los dos se ha atascado), hay un mecanismo
para hacer saltar al replisoma si se pasa del final de
manera alarmante.
Pasado el final terico, hay una serie de secuencias en el
DNA llamadas TER (terminacin), hay 3 4 en cada
horquilla.
Sucede que cuando, por ejemplo, el replisoma derecho pasa

por encima de las secuencias TER trampa del replisoma
izquierdo, se activa la transcripcin de la protena TusA
en el la horquilla derecha. Va en el mismo sentido la
transcripcin
y
la
replicacin.
sta
protena
TusA
sintetizada por la horquilla derecha tiene como diana las
secuencias TER de la horquilla izquierda. As, TusA
sintetizada en una horquilla se une a TER de la horquilla
opuesta, para asegurarse que si el replisoma se pasa del
final, se pare. La protena TusA unida a TER tiene una
actividad antihelicasa que hace que se desmonte el
replisoma que viene de la otra horquilla, no haciendo nada
al replisoma de la horquilla donde est ella (se parar
cuando se tope con el DNA de la otra). Por eso se dice que
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 86
TusA acta asimtricamente.

funciona TusA.
Slo
cuando
hay
replicacin
RESUMEN DE LA REPLICACIN.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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PROBLEMA REPLICACI 1
ENUNCIAT
On es fabriquen els primers (encebadors) de RNA, en punts especfics o en punts a l'atzar de la cadena motllo?
Per estudiar aquesta questi, el DNA del fag M13 s un motllo ideal perqu no t un extrem 3'-OH lliure. Per contestar la
pregunta, es va copiar completament el cercle de M13 en presncia de DNA polimerasa de T4, el primosoma de T4 (un
complex d'helicasa i de RNA primasa), rNTPs marcats radiactivament, i dNTPs tamb marcats. En les condicions
experimentals emprades, per a cada molcula de M13 s'hi fabricava un sol primer. Els productes circulars de cadena doble
es varen digerir amb un enzim de restricci que fa un tall en una nica diana. Els productes de la digesti es varen
desnaturalitzar i analitzar en un gel de seqncia d'alta resoluci. Es varen observar moltes bandes discretes. Si els
productes de la digesti es tractaven amb RNasa abans de l'electroforesi, tots esdevenien cinc nucletids ms curts.
Com que cada producte acabava a l'nica diana de restricci, era possible deduir, a partir de la seva mida, la seqncia del
DNA motllo corresponent a la zona dels seus extrems 5' (la seqncia completa del M13 s coneguda). Algunes d'aquestes
seqncies motllo es mostren a la part esquerra de la figura. La seqncia de DNA de cadascun dels corresponents extrems
5' dels diferents productes va ser determinada desprs d'eliminar els primers de ribonucletids. Aquestes seqncies es
mostren a la part dreta de la figura, aliniades a les respectives seqncies motllo.
5'
1
2
3
4
5
6
7
8
A
T
A
A
A
A
A
C
3'
T
C
T
C
T
T
A
T
C
T
T
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A
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T
A
G
A
G
A
A
T
A
T
A
T
T
T
T
T
G
A) A partir d'aquests resultats deduu el lloc d'inici del primer de RNA en cadascuna de les seqncies motllo.
B) Quin s, probablement, el senyal que indica a la RNA primasa on comenar?
SOLUCI
Lexperiment en qu es basa el problema s una adaptaci dels que realment varen ser publicats a:
Cha, T. & Alberts, B.M., Studies of the DNA helicase-RNA primase unit from Bacteriophage T4, Journal of Biological
Chemistry 261: 7001-7010, 1986.
Cal entendre que per a cada molcula de motlle de M13 (que s un DNA circular, tancat), la primasa noms sintetitza un
sol primer, pero pot fer-ho en llocs diferents: el que precisament demana el problema s si aquests llocs tenen alguna
caracterstica en com. Aquest seria lesquema de 4 casos hipottitcs, amb les molcules circulars tancades (motlles),
els primers que la primasa ha sintetitzat en llocs diferents (segments en zig-zag), i la situaci de la diana per a lenzim
de restricci que utilitzarem per linearitzar (=obrir) aquests DNAs
Digesti amb lenzim de restricci

Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 88
Cal suposar que que sha marcat radiactivament les cadenes filles pel seu extrem 5, s a dir han quedat marcats
els primers i els primers nucletids de DNA de la cadena naixent. Per aix el que cal fer s aparellar les
seqncies de cadena motlle amb les respectives seqncies dels extrems 5 dels productes (o sigui les
seqncies de les zones com la que hi ha encerclada en lesquema anterior), desprs allargar el productes en 5
nucletids cap a 5, que s la mida que tenen els primers (segment en zig-zag).
Aix veiem (mireu lesquema de la pgina segent), que en tots els casos, el punt sobre el motlle on ha comenat
cada primer s una T o una C: o sigui una pirimidina (en negreta a lesquema).
Tamb veiem que en la zona dinici dels primers, el motlle presenta una seqncia consens:
5 G Py T 3: aquest seria segurament el senyal que reconeixeria la primasa de T4 per iniciar la sntesis dels
primers.
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Carlos F.R.
Pgina 89
ENUNCIAT
El gen dnaB d'E.coli codifica una helicasa (dnaB) que separa les cadenes complementries de DNA a nivell de la forqueta de
replicaci. Les seves propietats s'han estudiat utilitzant substrats artificials com els que es mostren a la Figura 1.
L'aproximaci experimental consisteix en incubar els substrats en diferents condicions i desprs analitzar-los per
electroforesi en gels d'agarosa. La cadena senzilla curta migrar lentament si encara est anellada a la llarga. En canvi,
migrar ms rpid si ja se n'ha separat. La migraci de la cadena senzilla curta pot detectar-se selectivament per
autorradiografia, si s'ha marcat radiactivament. Els resultats de diversos experiments es mostren a la Figura 2. El substrat
n1, l'hbrid sense cues, no va ser separat per la dnaB (Figura 2, carrils 1 i 2). En canvi, quan cadascun dels dos substrats
amb cues s'incubava a 37 C amb dnaB i ATP, l'helicasa separava una quantitat considerable de fragment petit (Figura 2,
carrils 6 i 10). Pel substrat n3, es separava el fragment amb cua 3' (carril 10) i encara es detectava una banda molt dbil
corresponent al fragment amb cua 5. Totes aquestes separacions eren totalment depenents de la hidrlisi d'ATP.
La separaci de cadenes s'incrementava considerablement si s'afegia protena que s'uneix a cadena senzilla (SSB)
(compareu els carrils 5 i 6 i els carrils 9 i 10). Una observaci interessant era que la SSB s'havia d'afegir uns tres minuts
desprs de la dnaB; si no, inhibia la separaci.
A) Per qu s necessria la hidrlisi d'ATP per separar les cadenes?

B) En quina direcci es mou la dnaB al llarg del DNA? Aquesta direcci amb qu s compatible: amb el seu
moviment sobre la cadena motllo leading o sobre la cadena motllo lagging a la forqueta de replicaci?
C) Per qu creieu que la SSB inhibeix la separaci de cadenes si s'afegeix abans que la dnaB, i en canvi l'estimula si
s'afegeix desprs?
SOLUCI
El gen dnaB d'E.coli codifica una helicasa (dnaB) que separa les cadenes complementries de DNA a nivell de la forqueta
de replicaci. Les seves propietats s'han estudiat utilitzant substrats artificials com els que es mostren a la Figura 1.
L'aproximaci experimental consisteix en incubar els substrats en diferents condicions i desprs analitzar-los per
electroforesi en gels d'agarosa. La cadena senzilla curta migrar lentament si encara est anellada a la llarga. En canvi,
migrar ms rpid si ja se n'ha separat. La migraci de la cadena senzilla curta pot detectar-se selectivament per
autorradiografia, si s'ha marcat radiactivament. Els resultats de diversos experiments es mostren a la Figura 2. El
substrat n1, l'hbrid sense cues, no va ser separat per la dnaB (Figura 2, carrils 1 i 2). En canvi, quan cadascun dels dos
substrats amb cues s'incubava a 37 C amb dnaB i ATP, l'helicasa separava una quantitat considerable de fragment petit
(Figura 2, carrils 6 i 10). Pel substrat n3, es separava el fragment amb cua 3' (carril 10) i encara es detectava una banda
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Carlos F.R.
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molt dbil corresponent al fragment amb cua 5. Totes aquestes separacions eren totalment depenents de la hidrlisi
d'ATP.
La separaci de cadenes s'incrementava considerablement si s'afegia protena que s'uneix a cadena senzilla (SSB)
(compareu els carrils 5 i 6 i els carrils 9 i 10). Una observaci interessant era que la SSB s'havia d'afegir uns tres minuts
desprs de la dnaB; si no, inhibia la separaci.
SOLUCI:
COMENTARIS A LEXPERIMENT.
Aquest problema illustra el funcionament de lhelicasa dE.coli (protena dnaB), i la seva propietat de
desnaturalitzar el DNA, o sigui separar-ne les dues cadenes complementries.
Els tres tipus de molcules de DNA que es fan servir com a substrat sn:
(A): un DNA on hi ha una petita regi de doble cadena, per no hi ha cues de DNA de cadena senzilla
(B): un DNA on hi ha una petita regi de doble cadena, amb cues de DNA de cadena senzilla als dos extrems: la
cua 5 ms curta que la cua 3
(C): un DNA on hi ha una petita regi de doble cadena, que t un gap (zona oberta) en la seva part central, amb
cues de DNA de cadena senzilla als dos extrems: la cua 5 ms curta que la cua 3
La cadena amb ***** est marcada, i per tant en lautoradiografia noms veurem aquesta cadena o els
fragments que sen derivin
Qu passa en cada substrat ??
Per a cada carril sndica a dalt si sha posat helicasa en la reacci (dnaB), si sha posat protena SSB, i si sha
escalfat el tub (el que significa que hi ha hagut separaci de les dues cadenes de DNA per calor).
Anlisi del substrat (1), carrils 1 a 4.
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Carlos F.R.
Pgina 91
-Sense helicasa, i sense desnaturalitzar (carril 4): el DNA corre tal qual est en lesquema (les 2 cadenes
hibridades, i la molcula es veu grcies al marcatge de la cadena petita)
-Sense helicasa i desnaturalitzant per calor (carril 3), es separen les dues cadenes i veiem la banda
corresponent a la petita, que s lnica que t marcatge
-Amb helicasa, ja sigui amb SSB (carril 1) o sense SSB (carril 2) , veiem el mateix que al carril 4, o sigui que no
shan separat les cadenes.
Conclusi del substrat (1): lhelicasa no s activa sobre aquest DNA (perqu no hi ha segments de DNA que
estiguin parcialment desnaturalitzats on shagi pogut carregar lhelicasa).
Els controls sense helicasa (carrils 7 i 8), sn equivalents al que passava amb el substrat 1 (carrils 3 i 4), per
tant:
-Sense helicasa, i sense desnaturalitzar (carril 8): el DNA corre tal qual est en lesquema (les 2 cadenes
hibridades, i la molcula es veu grcies al marcatge de la cadena petita)
-Sense helicasa i desnaturalitzant per calor (carril 7), es separen les dues cadenes i veiem la banda
corresponent a la petita, que s lnica que t marcatge. Noteu que com que s una mica ms llarga que la
del DNA 1, corre una mica ms amunt en el gel.
-Amb helicasa, en els carrils 5 i 6, veiem el mateix, pero amb diferents intensitats. En el carril 6 (amb helicasa,
pero sense SSB), hi ha part del DNA inicial banda superior-, i hi ha part del DNA substrat on shan separat les
cadenes, i per tant veiem banda inferior. En el carril 5, on hi ha SSB, la proporci de DNA que es
desnaturalitza s ms gran (aix ho veiem per que la intensitat de la banda inferior s major).
Conclusi del substrat (2): lhelicasa s activa, sha pogut carregar sobre el DNA perqu hi ha una regi de
cadenes separades, i ho s ms en presncia de protena SSB.
-Els controls sense helicasa (carrils 11 i 12), sn equivalents al que passava amb el substrat 1 i 2, amb la
diferncia que quan desnaturalitzem per calor (carril 11), veiem dues bandes, corresponents als dos
segments separats de DNA marcat (vegeu dibueix: amb cua 5 protuberant i amb cua 3 protuberant).
-Amb helicasa, en els carrils 9 i 10, veiem el mateix, per tamb amb diferents intensitats, com passava en els
carrils 5 i 6. En el carril 10 (amb helicasa, pero sense SSB), hi ha part del DNA inicial banda superior-, i hi ha
part del DNA substrat on shan separat les cadenes, pero de les dues que podriem veure, la que correspon al
fragment que t cua 3 protuberant s molt predominant, o sigui el segment marcat de la dreta. En el carril
9, on hi ha SSB, la proporci de DNA que es desnaturalitza s ms gran (aix ho veiem per que la intensitat de
la banda inferior s major).
Conclusi del substrat (3): lhelicasa s activa, ho s ms en presncia de protena SSB, per dels dos
segments marcats que es podrien separar del DNA no marcat, lhelicasa separa molt preferentment el que t
lextrem 3 protuberant. Aix vol dir una direccionalitat de lhelicasa:
Respecte el DNA de cadena senzilla completa (el que s circular en els substrats 2 i 3, lhelicasa es mou en
direcci 5 3 (aix concorda amb el fet que lhelicasa es carrega sobre la cadena lagging en una forqueta
de replicaci, per on es desplaa per tant en aquest sentit.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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RESPOSTES A LES PREGUNTES DEL PROBLEMA:

A) La hidrlisi dATP s necessria perqu lhelicasa necessita lenergia daquesta reacci per separar les
cadenes del DNA.
B) Recordeu que lhelicasa necessita DNA desnaturalitzat per poder entrar (o sigui que no es carregar per
un extrem rom de DNA). Els dos possibles punts dentrada estan marcats amb les segetes de color. El fet
que la major part de segment marcat alliberat sigui el de la cua 3, vol dir que lhelicasa ha actuat en el
sentit de la segeta vermella.
Aix vol dir que respecte el DNA de cadena senzilla llarg, lhelicasa es mou en direcci 5 3 (la qual cosa
concorda amb el fet que lhelicasa es carrega sobre la cadena lagging en una forqueta de replicaci, per on
es desplaa per tant en aquest sentit).
Si realmente lhelicasa es desplaa sobre una cadena 5> 3 de DNA, per qu no entra tamb pel punt B
(verd)? Segurament s que es pot carregar, per el segment de DNA on es pot carregar lhelicasa s molt
petit respecte laltre cas, que t tota la cadena senzilla de DNA, i per tant baixen molt les probabilitats
daquest segon esdeveniment. De fet en els resultats dels experiments, s que es veu que es desplaa una
petita quantitat daquesta cadena marcada (anomenada banda 5 ).
C) Si la SSB safegeix abans, inhibeix la separaci de les cadenes: per qu recobreix les cadenes senzilles de
DNA i inhibeix lacci de lhelicasa. Si safegeix desprs, millora la tasa de desnaturalitzaci perqu impedeix
la renaturalitzaci (re-hibridaci) posterior de les cadenes de DNA que lacci de lhelicasa ha separat.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 93
Enunciat
Les mutacions letals condicionals sn molt tils per a l' anlisi gentica i bioqumica de la replicaci del DNA. Les mutacions
sensibles a la temperatura (ts) permeten el creixement a una temperatura determinada (per exemple 30C), per no a una
temperatura ms elevada (per exemple 42C).
A E.coli s'han allat un gran nombre de mutants sensibles a la temperatura.Aquestes bacteries mutants sn deficients en la
replicaci del DNA a 42C per no a 30C. Si la temperatura del medi s'eleva de 30 a 42, aquests mutants deixen de sintetizar
el DNA i ho poden fer de dues maneres diferents. Els mutants de "parada rpida" aturen la sntesi de DNA immediatament,
mentre que els mutants de "parada lenta" no l'aturen fins que han passat alguns minuts.
A) Predieu si les segents protenes, en cas que fossin sensibles a la temperatura, donarien un fenotip de "parada
rpida" o de "parada lenta"
- una DNA topoisomerasa
- una protena implicada en la iniciaci de la replicaci
- la protena DnaA
- una DNA helicasa
- la RNA primasa
- la DNA lligasa
B) Es varen barrejar extractes cel.lulars d'un mutant de la DNA helicasa sensible a la temperatura i d'un altre mutant,
de la DNA lligasa, tamb sensible a la temperatura, i es varen incubar a 42C. Qu esperarieu: que la barreja
presents un fenotip de "parada rpida", de "parada lenta" o b un fenotip no mutant?
Soluci
(A)
Per resoldre el problema hem de tenir en compte que els mutants de parada rpida sn mutants de les protenes implicades
en elongaci, ja que quan aquestes perden la seva funci, immediatament es veu interrompuda la sntesi de DNA.
Contrriament, una mutaci comportar parada lenta si afecta una protena que noms estigui implicada en el procs
diniciaci (i no delongaci), perqu la sntesi de DNA noms es parar quan shagi diniciar un nou cicle de replicaci.
Per tant:
DNA topoisomerasa
Protena iniciaci replicaci
Prot. desestabilitzadora doble hlix (DnaA)
DNA helicasa
DNA primasa
DNA lligasa
Parada rpida
Parada lenta
Parada lenta
Parada rpida
Parada rpida
Parada lenta*
* En aquest cas, cal tenir present que la lligasa es necessita per lligar els diferents fragments dOkazaki que es
van sintetitzant al llarg de lelongaci, per que la manca duni dels fragments dOkazaki entre si no es posar
de manifest fins linici de la propera ronda de replicaci on, si no hi ha hagut lligasa, es desmontar el DNA
sintetitzat (mltiples fragments independents que abans restaven units al seu motllo pels ponts dH entre les
cadenes complementries).
(B)
Lexperiment que sexplica s un experiment de complementaci.
Si en la barreja dextractes cel.lulars dels dos mutant shi aporten totes les protenes (en versi correcta (wt) que
calen per dur a terme un procs o reacci, aleshores es restableix el fenotip salvatge (no mutant) i per tant es
diu que hi ha hagut complementaci. En aquest cas lextracte que prov del mutant dhelicasa, aporta una
helicasa mutant, pero en canvi una lligasa wt, i recprocament, lextracte que prov del mutant de lligasa, aporta
una lligasa mutant, per una helicasa wt. O sigui que en la barreja final hi ha present tant helicasa com lligasa
wt, i per aix presenta un fenotip no mutant.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 94
TEMA 9: LA REPLICACIN EUCARIOTA.

Se da por Replicones mltiples: hay muchos OriC sobre un
cromosoma. Aparte, hay muchos cromosomas. Son lineales y
estn encerrados en el ncleo.
Cada origen de replicacin es bidireccional. Como es ms
complejo, hay ms Replicones, aunque ello no implica que
haya ms cantidad de genoma. Un tamao pequeo del
cromosoma indica unos replicones ms largos. Los replicones
se activan cuando la clula ha de dividirse (para que un
tejido prolifere, etc), pero cada uno se puede activar en
diferentes momentos.
Ya que hay tantos replicones, hay algunos que se utilizan y
algunos que no. Los que no se llaman orgenes de
replicacin crptico.
Un origen de replicacin nunca puede ocupar nada que tenga
que ver con la transcripcin: ni la regin reguladora ni la
regin codificante. Por eso, los orgenes de replicacin
siempre estn en lugares no codificantes. Un tamao pequeo
del genoma indica muchas secuencias codificantes, muy
juntas y por tanto pocos OriC, cuyos replicones sern muy
grandes. Por el contrario, un gran tamao del genoma indica
muchas secuencias codificantes, y tambin muchas no
codificantes, por tanto hay muchos replicones, pero de poca
longitud.
En levaduras (S.Cerevisiae): El origen de replicacin se
llama ARS (Autonomous Replication Secuence). Son regiones
de 50pb imprescindibles, muy conservadas. A ella se une la
protena ORC (homloga de DNA-A). Hace que las dos cadenas
se empiecen a separar un poco ms atrs, en B2-B3. La
protena ABF1, a veces, se une un poco ms atrs de B3 y
ayuda a replicar. ABF1 no tiene correspondencia en
Procriotas.
En Mamferos: Muy relacionado con el ciclo celular. En el

punto de origen de la replicacin, el cual no tiene una
secuencia consenso, se une la protena ORC (homloga de
DNA-A). Recluta a CDC-6 y CDT-1 (son homlogas a DNA-C). En
cada horquilla se une un heterodmero de CDC6+CDT1.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 95
Reclutan a MCM7 (homloga a la helicasa, DNA-B), un

heterohexmero formado por MCM2 a MCM7. En Procariotas era
un homohexmero. Habr, tambin, uno para cada horquilla.
As se ha formado el complejo pre-replicativo (pre-RC).
Est en estado latente, pudiendo quedar mucho tiempo as
formado unido a su secuencia diana, a la espera de recibir
el estmulo que lo activa. El pre-RC se forma al final de
la telofase y al principio de la fase G1, y se activa al
principio de la fase S.
El estmulo que activa al pre-RC implica la prdida de CDT1

y CDC6, que slo ayudaban a entrar a la helicasa. Ambas son
fosforiladas por CDK y DDK, y posteriormente degradadas. La
helicasa tambin se debe fosforilar por CDK y DDK para
activarse, pero evidentemente no se degrada.
El sentido es que al final de la fase G1 se produce un
incremento en la concentracin intracelular de CDK y DDK,
por lo que se fosforila el pre-RC permite que empiece la
fase S.
Una
RC,
-
vez se han dado las fosforilaciones y activado al preentra el Replisoma Eucariota. Contiene:
RPA: equivale a las SSBP
RFC: equivale al complejo cargador Procariota. Pone
la PCNA detrs de la Polimerasa -.
- PCNA: Equivale a la Spliding clamp Procariota (=anillo
)
- MCM7: La helicasa heterohexamrica. Se activa por
fosforilacin.
- Polimerasas: (es una primasa. No hace proofreading,
hace un primer hbrido) y - (son el core
cataltico
intercambiable,
tiene
actividad
proofreading). En orgnulos, hay la (sustituye a -
en la mitocondria).
El primer hbrido que sintetiza la polimerasa tiene una
parte de RNA en 5 y una parte de DNA en 3.
Aparte, hay otras polimerasas que no participan en
replicacin asociada a divisin celular, sino en
replicacin
asociada
a
reparacin
(por
ejemplo,
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
la
la
la
Pgina 96
Polimerasa participa en el mecanismo de reparacin BER, y

la polimerasas ,,,,, en otros tipos de reparacin).
Una vez que se han fosforilado CDC6 y CDT1, se van. Se
fosforila MCM7 y empieza a separar las cadenas. Enseguida
entra la polimerasa - y la polimerasa en la que ser la
molde de la leading (en la que est 35). Hacen los
primers hibridos, la MCM7 va avanzando, entran RFC y PCNA.
Salta la polimerasa y as sigue elongando la leading. Una
vez que se ha sintetizado un trozo de la leading, empieza
la lagging.
El procesado de los fragmentos de Okazaky se realiza
mediante un enzima llamado Fen1. No acta la DNA Polimerasa
I, porque es Procariota. Las actividades de Fen1 son
exonucleasa 53 (sobre un trozo del RNA y todo el DNA
del primer)y endonucleasa de ssDNA. No polimeriza.
Modelos hipotticos para explicar su funcionamiento:
A) Modelo de la RNasaH: Actan la RNasaH y Fen1. Tenemos un
dsDNA, en el cual una cadena es la molde, de DNA, y la otra
tiene los fragmentos de Okazaky formados por el primer
hbrido. No estn unidos. Acta la RNasaH degradando un
trozo del RNA, en 53. Ahora acta Fen1 degradando el
trocito de RNA que queda y el fragmento de DNA, en 53.
Despus, la DNA Polimerasa - sintetiza el fragmento de
DNA complementario al primer degradado. Finalmente la
ligasa lo une.
B) Modelo flap. Actan la MCM7 y la Polimerasa -. Tenemos
un dsDNA, en el cual una cadena es la molde, de DNA, y la
otra tiene los fragmentos de Okazaky formados por el primer
hbrido. No estn unidos. Entra MCM7 por el 5 de la zona
con RNA y la separa del DNA, dejando al aire el trozo de
RNA. Inmediatamente entra la DNA Polimerasa - que
sintetiza el DNA complementario al fragmento de RNA que ha
levandado la MCM7. Van avanzando la DNA Polimerasa - y
MCM7 empujando el primer, haciendo que se separe,
avanzando con la sntesis. Cuando casi ha separado el
fragmento de Okazaky completo, llega Fen1, corta el ssDNA
del fragmento de Okazaky que est colgando y saltan la DNA
Polimerasa - y MCM7. No se sintetiza todo el DNA de
nuevo. Finalmente, la ligasa lo une. Se ha de resintetizar
la zona del primer porque la DNA Polimerasa no tiene
proofreading, no degrada RNA y se equivoca. La DNA
Polimerasa - s tiene proofreading.
Sucede que debido a la reparacin de los fragmentos
Okazaky, se van acortando cada vez ms los cromosomas
los brazos 5, ya que el RNA se pierde. sto pasa en
dos extremos del cromosoma, porque la replicacin
bidireccional.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
de
por
los
es
Pgina 97
De las 4 nietas, la mitad ya tiene delecion estable. Para

evitar que sto suceda (sera catastrfico para la
especie), estn los telmeros.
Los telmeros son unas secuencias de 10-15nt repetidas n
veces, en los extremos 3 del cromosoma. Son de ssDNA,
3protuberante. nicamente se encuentran en las clulas
germinales, debido a que los sinetiza un enzima llamado
telomerasa, que se expresa slo en el tejido germinal.
Acta al final del ciclo celular, aadiendo el telmero a
ambos extremos 3 del cromosoma.
En humanos, un telmero es una repeticin de 1000 veces de

la secuencia 5-TTAGGG-3. El sentido de sto es que ya que
se ha de perder forzosamente una secuencia en 5 debido a
la reparacin del fragmento de Okazaky, pues que sea la
complementaria a algo intil* (el telmero).
*es intil desde el punto de vista codificante, pero de
intil nada porque sin ellos, cada espermatozoide u vulo
que se genera tendra cada vez menos DNA extincin.
Molecularmente, la telomerasa es una DNA polimerasa
dependiente de RNA. Es un enzima de la familia de las
Transcriptasas Inversas. Sintetiza DNA a partir de un RNA
molde que tiene ella en su estructura. Es un RNA molde
igual en los organismos de la misma especie.
El telmero lo aade a los 2 extremos 3 del cromosoma,
antes de que se empiece a replicar. Se engancha al 3 del
cromosoma, y aade nt en 53.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 98
El DNA que sintetiza en ssDNA. Cuando ha acabado con la

secuencia 5-TTAGGG-3, salta y se pone en el 3 de 5TTAGGG-3. Y le aade al lado otra secuencia igual. As
1000 veces.
ste 3 protuberante de ssDNA que forma ha de evitar ser

degradado por nucleasas. Para ello, forma estructuras en
forma de lazo o loop.
En Tetrahymena, se forma un tetrmero de Guaninas que
determina a un hairpin. Ya que el telmero de Tetrahymena
tiene muchas guaninas, se dobla y se aparean 2 guaninas con
otras 2 guaninas, mediante enlaces de H2 entre ellas en
lugares que no son los tpicos.
Son 8 enlaces entre 4 Guaninas, formando un bucle cerrado.

En humanos, se forman lazos o loops terminales. El 3
protuberante (telmero) enlaza con la secuencia anterior
suya. Primero se forma el t-loop separndose las dos
cadenas, se engancha el 3 por complementariedad y se forma
el d-loop.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 99
En la superficie de ambos loops hay protenas asociadas que

interactan con la telomerasa. Siempre se unen al dsDNA, no
a la zona con ssDNA.:
- TRF1: Tiene unidas las subunidades Tankyasa y Tin2
(dmeros
tambin).
Bloquea
la
entrada
de
la
telomerasa.
Una
sobreexpresin
acorta
a
los
cromosomas. Cuando se va, entra la telomerasa. Se
encuentra distribuida por los t-loop y d-loop, de
manera ms o menos uniforme.
- TRF2: Tiene una funcin estructural, est por ambos
loops, pero a mayor [ ] en el punto donde se hibridan
las cadenas (en el d-loop).
Cuando una clula somtica se vuelve tumoral, sobreexpresa
ciclinas.
Si
adems
expresa
la
telomerasa,
como
consecuencia de que es tumoral, se vuelve inmortal.
En la lnea germinal (clulas que hacen los espermatozoides
y vulos), la telomerasa funciona. La longitud del telmero
siempre es igual.
En las clulas somticas, el acortamiento progresivo de los
brazos
de
los
cromosomas
se
debe
a
que
no
hay
Una
de
las
causas
telomerasasenescenciaapoptosis.
principales de que envejezamos.
Los telmeros cortos
en clulas somticas
cancerosas,
podran
ser
el
seal
que
induce la expresin
de la telomerasa (no
se
sabe).
La
p53
tambin
tiene
un
papel importante en
la tumorognesis, que
se activa (p53) por
telmeros muy cortos,
aunque
las
clulas
tumorales
suelen
tener mutada a p53.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 100
TEMA 10: REPARACIN DE LAS MUTACIONES EN

PROCATIOTAS I.
Las mutaciones pueden ser por bases no complementarias
(insercin, delecin, cambio de nt) o por lesiones el el
DNA
(aparicin
de
substancias
que
perjudican
la
estructura).
Frecuencia terica de aparicin de las mutaciones:
- Longitud del genoma humano: 3000x106
- N medio de replicaciones en 1 vida: 1015
- Error en seleccin de nt: 10-5 o 10-6
- Error al revisar el nt(falla proofreading): 10-2 10-3
- Error al revisar cadena ya sintetizada: 10-1 o 10-2
Tericamente se cometeran 3x1018 errores en una vida, un
nmero inadmisible. Si consideramos que para que se quede
la mutacin en el organismo han de darse los 3 errores
juntos, entonces la tasa real de errores es de 10-10 aprox.,
lo cual ya es relativamente tolerable.
El sistema de reparacin reconoce la cadena de DNA no
metilada (= nueva) para detectar posibles mutaciones en
ella. A la larga, se llega a metilar todo (ver Tema 8).
Reparacin de apareamientos errneos: Es el missmatch
repair. En Procariotas. Supongamos que cuando el DNA se
replica, la Polimerasa coloca una base equivocada.
Supongamos
tambin
que
la
Polimerasa III no se ha dado
cuenta, y que la Polimerasa I
tampoco.
As
queda
la
mutacin
en
un
DNA,
por
elegir el nt que no toca. No
se aparean las bases porque
no son complementarios, y se
forma
una
estructura
extrusionada
en
la
dble
hlice de DNA.
sta estructura que sobresale, es detectada en primera

instancia por los enzimas reparadores. Actan despus de la
replicacin. stos son:
- MUT-S: Homodmero que contacta con el punto en el DNA
que
tiene
el
apareamiento
errneo
(estructura
extrusionada). Tiene forma de manos en pregaria (?).
- MUT-L: Homodmero reclutado por MUT-S. Se une a la
cadena de DNA que est metilada (antigua), en GATC.
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- MUT-H: Endonucleasa reclutada por MUT-S que hace un

corte por debajo de MUT-L, en la cadena no metilada.
Las MUT tienen ms afinidad por la estructura extrusionada
del DNA que la Metilasa DAM por GATC.
Cuando MUT-S est sobre la zona con el error, capta ATP.

As recluta a MUT-L y MUT-H, y hace que se unan al DNA. La
diana de MUT-L es GATC metilado, quedando MUT-H debajo de
ella (en la cadena no metilada, nueva, con el error).
Entonces MUT-L se acerca
a MUT-S, haciendo que el DNA
adquiera una estructura en forma de loop entre el error y
el GATC. Entonces, acta MUT-H (endonucleasa) haciendo el
corte en 1 cadena, la no metilada. Deja un Nick (separacin
entre dos bases contiguas, no se pierde informacin, slo
se rompe el enlace fosfodister), justo debajo de la GATC
metilada (justo debajo de MUT-L).
ste sistema es bidireccional, es decir, la secuencia GATC
puede estar a 5 a 3 de la zona con el apareamiento
errneo. Segn donde est, actan diferentes enzimas
despus de hacer el corte.
- Si GATC est a 5 del error, entonces viene la
exonucleasa I y degrada en 35 aprovechando el 3
del Nick. Degrada el DNA de la cadena nueva (la del
Nick) hasta un poco pasado el error (osea, elimina la
base mal apareada). Deja un GAP (agujero en el DNA
en el que falta informacin, es una zona con ssDNA).
- Si GATC est a 3 del error, acta la exonucleasa VII
RecJ, que degradan el DNA en 53 aprovechando el
Nick, igual que antes degradan el DNA de la cadena
nueva con el error, hasta un poco ms all, y se
separan. Dejan tambin un GAP.
Los GAPS que quedan, se siga el camino que se siga, tienen
ssDNA, el cual es el sustrato favorito de RecA.
Como han dejado el mismo producto, ahora acta la DNA
Polimerasa III rellenando el GAP y la ligasa finalmente lo
une. No acta la DNA Polimerasa I porque tiene exonucleasa.
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Los mutantes de MUT no pueden reparar, causa directa de

inviabilidad. En eucariotas, mutantes en las protenas
homlogas de MUT tienen cncer.
Los Eucariotas tienen un sistema homlogo a missmatch
repair, pero con Polimerasas de DNA especficas y enzimas
concretos. Las protenas que intervienen son homlogas a
MUT y otras llamadas PMS (forman heterodmeros, se combinan
los diferentes tipos).
Las principales diferencias respecto a Procariotas son que
los
homlogos
a
MUT
son
heterodmeros
siempre(no
homodmeros) y que su ausencia causa tumorognesis.
- La MUT-S procariota tiene de homloga en S.cerevisiae
a MHS1, 2, 3, 4, 5 y 6. En humanos son MSH2, 3, 4, 5 y
6 (=GTBP).
- La MUT-L procariota tiene de homloga en S.cerevisiae
a MLH1, 2 y 3, y PMS1. En humanos son MLH1 y PMS1 y 2.
- La MUT-H procariota no tiene homlogos ni en
S.cerevisiae ni en humanos.
No se han encontrado todas las combinaciones
posibles, slo algunas. Otras no se dan nunca.
tericas
Los
complejos
equivalentes
a
missmatch
repair
en
S.cerevisiae son:
- MUT-S MSH2 (siempre est) + MSH3 (para inserciones y
deleciones de todo tipo) MSH6 (pequeas inserciones
y deleciones, mutacin puntual).
- MUT-L MSH1 (siempre est) + PMS2 (para mutaciones
puntuales,
inserciones
y
deleciones)
PMS1
(inserciones y deleciones) MLH (tambin para
inserciones y deleciones).
- MUT-H no se ha encontrado.
Los complejos equivalentes a missmatch repair en humanos
son:
- En clulas somticas:
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- En clulas germinales (hacen meiosis):
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PROCATIOTAS II.
Las mutaciones pueden ser por bases no complementarias
(insercin, delecin, cambio de nt) o por lesiones el el
DNA
(aparicin
de
substancias
que
perjudican
la
estructura).
Supongamos un punto mutado en el DNA. Si por algn motivo
no acta el mecanismo anterior, acta el siguiente. Se
pueden clasificar segn cmo actan o segn cuando actan:
- Segn cuando actan los enzimas reparadores:
- Segn cmo actan los enzimas reparadores:

1) Reversin de la lesin: Se arregla el dao en el
DNA. Lo que arregla son las bases daadas, no
errneas. Antes de replicar. Fotoliasa.
2) Escisin del trozo daado: Se arreglan bases
daadas. Antes de replicar. A continuacin se
resintetiza el trozo escisionado. Lo hacen el BER y
el NER.
3) Tolerancia de la lesin: Se permite que termine
la replicacin, funcin vital de la clula, antes de
reparar. Despus de replicar. Son el missmatch
repair (corrige bases mal apareadas), Reparacin por
recombinacin
(acta
frente
a
bases
daadas
permitiendo que siga la replicacin, pero no las
arregla) y Reparacin sobre lesin (=SOS, acta
sobre
bases
daadas
permitiendo
que
siga
la
replicacin pero no las arregla).
Estudiaremos los sistemas con detalle, basndonos en la 2
clasificacin.
1) Reversin de la lesin: Repara los dmeros entre 2
pirimidinas contiguas (CC TT), que se unen mediante 2
enlaces ciclobutilo. Se forman debido a la luz UVA (260nm).
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stos enlaces
normales.
son
transversales
los
enlaces
de
H2
El enzima que repara stos enlaces es la fotoliasa. El

mecanismo mediante el cual acta se llama fotoreactivacin:
deshace los enlaces ciclobutilo entre las dos pirimidinas
contiguas, gracias a la energa que obtiene de la luz
blanca (activa a la fotoliasa). Esto se explica teniendo en
cuenta que la fotoliasa tiene nucletidos de flavina
reducidos (FADH2). Tiene 2 FADH2. Cada FADH2, en presencia
de luz blanca, cede 2e- (se oxida) a uno de los dos enlaces
ciclobutilo (captan el e-, se reducen), dejando al final a
las dos pirimidinas sin ninguna anomala.
Se ha de unir al lugar con la anomala, y NO tiene ningn
homlogo en Eucariotas.
2A)Base Excision Repair (BER): Corta y resintetiza un
fragment de DNA. Actan enzimas llamados N-Glucosidasas
DNA-Glucosidasas. Repara bases daadas, antes de replicar.
No acta frente a dmeros de pirimidina. Excepcionalmente,
alguna tambin acta frente a apareamientoe errneos.
Cortan el enlace N-glucosdico entre la pentosa y la base
nitrogenada de un nucletido. Eliminan la base, y dejan un
lugar AP (apurnico si era una purina; apirimidnico si era
una pirimidina). La ms conocida es la N-Glucosidasa de
Uracilo, ya que tener un uracilo en el DNA es una
aberracin.
A continuacin acta
lugar AP, y luego una
AP. Se rompen as
flanqueaban al nt que
una endonucleasa que corta a 5 del

endonucleasa que corta a 3 del lugar
los dos enlaces fosfodister que
tena la anomala.
Finalmente, acta la DNA Polimerasa I y pone el nt correcto

que falta (sera mucha casualidad que se equivocara, pero,
porqu no?). La ligasa une los nicks que puedan quedar.
2B)Nucleotide Excision Repair (NER): Es el mecanismo
principal. Corta y resintetiza un fragment de DNA. Repara
bases daadas, antes de replicar. Tambin acta frente a
dmeros de pirimidina.
Lo realizan los enzimas UVR-A, B, C y D. La zona con error
de apareamiento forman una estructura extrusionada, que es
reconocida por un heterotrmero (): dos monmeros de
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UVR-A y un monmero de UVR-B. El necesita unirse a ATP

para poder unirse al DNA. Una vez unido al DNA, UVR-B
deshace los puentes de H2 de la regin con el error. Ahora
saltan los dos monmeros de UVR-A. Queda UVR-B unido, que
dobla al DNa formando un codo. UVR-B recluta a UVR-C, la
nica endonucleasa, que hace dos cortes (nicks) en la
cadena con el error: un Nick a 8nt en 5 del error y un
Nick a 4-5nt en 3 del error. Siempre mantiene las
distancias.
Entra UVR-D, que es una helicasa y separa los puentes de H2
del fragmento con los nicks (en total, 12-13nt que incluyen
al error). ste fragmento se separa, no hay ningn enlace
ya que lo una. El GAP que queda, como tiene ssDNA, puede
ser sustrato de RecA. Ahora entra la DNA Polimerasa que
resistetiza el trozo que falta y la ligasa, une.
UVR-B se puede unir al DNA gracias a que detecta la
estructura extrusionada que adquiere. Tiene unos AA con
secuencias
aromticas
laterales
que
le
permiten
intercalarse entre las bases del DNA que son errneas. As,
UVR-B queda intercalada dentro del DNA para separar los
enlaces de H2 (algunos) estirando, ya que dobla al DNA
formando el codo. Se puede incrustar en el DNA gracias a
que el punto donde la base se debera unir a la
complementaria no hay ningn enlace, porque es una base
errnea y UVR-B tiene sitio para unirse.
Es posible que la reparacin se acople con la transcripcin
si, por casualidad, la maquinaria transcripcional est
funcionando sobre una regin con un error. Entonces, se
para la maquinaria transcripcional (no salta an) y se
recluta a TRFC (Transcription-Repair Compling Factor), una
protena. TRFC se une a la RNA Polimerasa, y hidrolizando
ATP, la hace saltar ahora, junto al RNA. Entonces, TRFC
recluta a , que comienza el NER. Junto a los dos
monmeros de UVR-A, tambin salta TRFC (en Eucariotas, hay
el TCR-NER TCNER, pero es un tipo de respuesta en la que
participan diversos enzimas, no se trata de una nica
protena como en Procariotas).
3A)
Missmatch
Repair.
Se
permite
que
termine
la
replicacin, funcin vital de la clula, antes de reparar.
Acta despus de replicar. Ver Tema 10.
3B) Reparacin por Recombinacin Homloga. Se permite que
termine la replicacin, funcin vital de la clula, antes
de reparar. Acta despus de replicar. En principio no
repara por si mismo ni las bases daadas ni los dmeros de
pirimidinas, pero si despus acta la fotoliasa o el NER,
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s. El sentido es que si se para la replicacin, la clula

muere (y por eso se permite que termine).
Supongamos que hay un dao en el DNA, el cual aparece justo
antes de que la DNA Polimerasa copie el DNA. Entonces,
cuando el replisoma llega, la DNA Polimerasa III salta y
sigue ms adelante. El resultado:
La cadena de nueva sntesis complementaria a la cadena

original con el dao, tiene un GAP (=una hija tiene un gap
en la zona complementaria al dao) porque la polimerasa III
ha saltado. ste GAP con ssDNA podra ser sustrato de RecA
para procesos que no interesan.
Se arregla por recombinacin: la cadena de abajo que sera
complementaria a la mutada de arriba, es arrastrado hasta
arriba,
y
se
hibrida
con
las
bases
que
le
son
complementarias (nicamente no son complementarias por el
error).
Originalmente, la donadora del trozo de DNA y la que tiene

el dao eran las dos cadenas del DNA de la clula madre.
Ahora la ligasa los une. Para el GAP que queda en el DNA
donador, rpidamente la DNA polimerasa III resistetiza lo
que falta (sin, sera sustrato de RecA). La ligasa lo une.
3C) Reparacin Sobre Lesin (SOS). Se permite que termine
la replicacin, funcin vital de la clula, antes de
reparar. Acta despus de replicar. En principio no repara
por si mismo ni las bases daadas ni los dmeros de
pirimidinas, pero si despus acta la fotoliasa o el NER,
s. El sentido es que si se para la replicacin, la clula
muere (y por eso se permite que termine).
La respuesta SOS es una respuesta masiva, se expresan
muchos genes a la vez, y en mucha cantidad. Los genes de la
reparacin sobre el cromosoma de E.Coli son los genes SOS:
UVR (para hacer el NER), UMU-D y C, LexA, RecA, y muchos
otros.
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- RecA:
es
imprescincible
para
recombinar
en
Procariotas. Aqu no recombina, sino que aparece
porque tiene mucha afinidad por el ssDNA. Puede
considerarse, en ste contexto, producto de un gen
SOS.
- LexA: Represor constitutivo de los genes de la
respuesta SOS, est unida a la caja SOS del operador
de todos los promotores de los genes SOS. Es un
producto de los genes SOS.
- Genes SOS: reparan el DNA. UVR, UMU, RecA, LexA Todos
estn bajo el control de un promotor con caja SOS,
diana de LexA.
Basalmente, LexA est expresada. Se une a las cajas SOS del
operador de los promotores de los genes SOS (inlcuyendo su
propio promotor, regula su propia sntesis).
Como hemos visto en Reparacin por recombinacin, la DNA
polimerasa III salta cuando se topa con daos en el DNA y
sigue sintetizando un poco ms adelante. As, hay un
instante en el que hay ssDNA sin proteccin. Es ste ssDNA
el estmulo que activa a RecA, la cual se une al ssDNA.
Entonces RecA pasa a estar activada por contacto con el
ssDNA. Estando activa, se mueve por el DNA del cromosoma
buscando a LexA, la cual est unida a muchos sitios a la
vez. Cuando RecA toca a LexA, se activa la actividad
autoproteoltica de LexA, la cual se degrada a si misma, a
LexA que bloqueaba a los promotores y a toda la nueva LexA
que se pueda producir (estaba bloqueando a su propio
promotor). Es un feedback positivorespuesta masiva.
Uno de los productos de los genes SOS son las DNA
Polimerasas IV y V. La ms conocida es la DNA Polimerasa V.
Tiene subunidades codificadas por los genes UMU-D y C, los
cuales pueden transcribirse cuando LexA se autodegrada.
UMU-C basalmente es activa. UMU-D basalmente no. Necesita

procesamiento post-traduccional por RecA. Poco claro. Se
convierte en UMU-D2. Finalmente, UMU-D2 + UMU-C = DNA
Polimerasa V.
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Las Polimerasas IV y V son un tipo de polimerasas llamadas

polimerasas translesin (= TLS = Polimerasas Y).
As, cuando el replisoma llega a la regin con el error,
salta el core y el complejo cargador , todo excepto la
Sliding clamp (anillo ). Se carga el core de la DNA
Poliemrasa V al anillo , polimeriza en 53 poniendo nt
al azar sobre la regin con el dao y su regin
circundante. Adems es poco procesiva por lo cual se separa
rpido y vuelve el core de la DNA Polimerasa III, que sigue
con la sntesis normalmente.
La ventaja de ste sistema es que salva la vida de la
clula y la replicacin, lo cual es el primer objetivo.
Existen
pocos
mecanismos
para
reparar
apareaminetos
errneos frente a los que hay para reparar daos. Eso
indica que la clula se permite cierta plasticidad en
cuanto a cambios de nt, para ir variando a lo largo del
tiempo. Lo que no se tolera es daar esas bases, por eso
hay varios mecanismos para arreglarlas.
Para reparar los dmeros de pirimidinas en el DNA, se

puede:
1) Fotoliasa, antes de replicar.
2) NER. Antes de Replicar.
3) Reparacin por Recombinacin: no repara por si misma
pero permite que siga la sntesis. Si despus se da
fotoliasa o NER, s que repara. Despus de la
replicacin.
4) Sntesis sobre lesinSOS: no repara por si misma
pero permite que siga la sntesis. Si despus se da
fotoliasa o NER, s que repara. Despus de la
replicacin.
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PROBLEMA REPARACI PROCARIOTES 1

ENUNCIAT
A la figura A tens l'esquema d'una molcula lineal de 600 pb que s'ha dissenyat per a fer assajos in vitro de
reparaci d'aparellaments erronis utilitzant extractes que contenen les protenes MutS, L i H, les exonucleases I i
VII, la RecJ, la DNA polimerasa III i la lligasa.
S'han emprat tres mostres diferents, a, b i c, que deriven totes de la molcula de la Figura A per que difereixen
lleugerament entre s; desprs de l'assaig de reparaci, cadascuna d'elles s'ha sotms - per separat - a digesti
amb els enzims Hind III i Xho I; els resultats es mostren a la figura B.
Figura A:
(d1)
(d2)
Xho I
(d3)
Hind III
Hind III
GATC
CTAG
Xho I
100
100
100
300
Figura B:
Hind III
a
Xho I
c
500
400
300
200
100
Digues en qu difereixen a, b i c. Per il.lustrar-ho, fes un esquema equivalent al de la figura A per a cadascuna de
les 3 molcules.
SOLUCI
Punts a tenir en compte per resoldre el problema:
-Els enzims que ens indiquen que fem servir en el nostre assaig in vitro sn els components de la via de reparaci
daparellaments erronis (Mismatch Repair) a E.coli (RAE o MMR). Per tant hem denfocar el problema des
daquest punt de vista.
-Les dianes de tall dels enzims de restricci que es fan servir en lexperiment sn les segents:
Hind III: 5 AAGCTT 3
Xho I: 5 CTCGAG 3
3 TTCGAA 5
3 GAGCTC 5
Cal recordar que una diana de restricci exigeix integritat de la seva seqncia en les dues cadenes de DNA. Per
tant si reprodum la sequncia que hi ha en el punt de la diana 3 (d3) de lesquema, on a la cadena superior hi
ha dhaver la diana per Hind III i a la de baix la diana per Xho I, veurem que tenim:
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5 AAGCTT..3 : ha destar a la cadena superior

3 GAGCTC .. 5 : ha destar a la cadena inferior
La manera daparellar aquesta seqncies perqu siguin complementries amb els mnims punts daparellament
erroni possibles s:
5
3
.. AAGCTT ..3
.. GAGCTC . 5
I completant la seqncia (per complementeritat de bases), veiem que el punt d3 en la seqncia representa una
posici daparellament erroni, que no ser tallat per cap dels dos enzims, perqu NO reprodueix la seqncia
exacta de cap de les dues dianes (en les dues cadenes!):
5 .. AAGCTTGAG ..3
3 .. TTCGAGCTC ..5
Amb aquests raonaments, ja es pot procedir a resoldre especficament el problema, tot analitzant el producte de
les digestions a travs de les bandes que es visualitzen en lelectroforesi:
Molcula (a):
-Hind III: Bandes de 200 pb i 400 pb: Hind III ha tallat a d2
-Xho I: Bandes de 100 pb i 400 pb: Xho I ha tallat a d1 i TAMBE a d3
Cal pensar que el DNA total t 600 pb: si XhoI nomes hagus tallat a d1 veurem 100 pb i 500 pb. En canvi veiem
400 pb i 100pb, perqu a la banda de 100 pb hi contribueixen de fet dos segments diferents daquesta longitud!
Com que la diana 3 ha estat reconeguda i tallada per XhoI, aix significa que en aquest punt la seqncia ha de
ser:
5 .. AAGCTCGAG ..3
3 .. TTCGAGCTC ..5
I per tant aix implica que el punt daparellament erroni T/G ha estat corregit in vitro pel sistema enzimtic RAE
cap a C/G.
Recordem finalment que el sistema RAE reconeix quina de les cadenes porta la informaci correcta i quina la
incorrecta (i per tant sha de reparar) per lestat de metilacio del DNA. La cadena bona s la que est metilada.
La metilaci es dona en la A de la diana GATC, que est present en el DNA, en el lloc indicat en la figura. Per
tant en aquest DNA, la cadena metilada era la inferior (que no sha reparat).
Molcula (b):
-Hind III: Bandes de 100 pb, 200 pb i 300 pb: Hind III ha tallat a d2 i a d3
-Xho I: Bandes de 100 pb i 500 pb: Xho I ha tallat a d1
Seguint el raonament dabans, i com que la diana 3 ha estat reconeguda i tallada per Hind III, aix significa que
en aquest punt la seqncia ha de ser:
5 .. AAGCTTGAG ..3
3 .. TTCGAACTC ..5
I per tant aix significa que el punt daparellament erroni T/G ha estat corregit in vitro pel sistema enzimtic RAE
cap a T/A.
Per tant en aquest DNA, la cadena metilada era la superior (que no sha reparat).
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Molcula (c):
-Hind III: Bandes de 200 pb i 400 pb: Hind III ha tallat a d2
-Xho I: Bandes de 100 pb i 500 pb: Xho I ha tallat a d1
Com que la diana 3 no ha estat reconeguda ni per Hind III ni per Xho I, aix significa que en aquest punt la
seqncia ha restat la inicial, o sigui que no hi ha hagut reparaci:
5 .. AAGCTTGAG ..3
3 .. TTCGAGCTC ..5
Si no ha pogut actuar el sistema RAE, aquest DNA tenia metilades les seves dues cadenes.
Soluci global:
A la pregunta global de com diferien les molcules a, b i c, cal respondre que eren tres version de la molcula de
600 pb inicial, en diferents estats de metilaci:
DNA (a):
Xho I
Hind III
Hind III
GATC
CTAG
G
100
100
300
Xho I
100
DNA (b):
Xho I
Hind III
Hind III
GATC
TC
CTAG
Xho I
100
100
300
100
DNA (c):
Xho I
Hind III
Hind III
GATC
TC
G
CTAG
Xho I
100
100
300
100

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ENUNCIAT
A E.coli existeixen diversos gens implicats en la reparaci de lesions indudes per UV, tals com uvrA, uvrB, uvrC i recA. Les
soques d' E.coli deficients per algun d'aquests gens sn ms sensibles a la llum UV (moren ms) que les soques salvatges, tal
com es mostra en la Figura (A) per a les soques mutants E.coli uvrA i E.coli recA. Les mutacions individuals en gens diferents
poden combinar-se i crear tots els possibles doble-mutants. Les sensibilitats dels doble-mutants sn molt variables. Per una
banda, les combinacions dels diferents mutants uvr presenten sensibilitats poc augmentades respecte els mutants uvr
senzills. En canvi, la combinaci de recA amb qualsevol dels mutants uvr dna una soca que s moltssim ms sensible a la
UV, com podeu veure per al cas concret de uvrA recA en les figures (A) i (B).
A) Per qu creieu que les combinacions d'una mutaci a recA i una mutaci a algun gen uvr donen soques
bacterianes extremadament sensibles a la UV, mentre que les combinacions de mutacions en dos gens uvr
diferents no donen soques ms sensibles a UV que les mutacions individuals?
B) Per al doble mutant uvrA recA, una irradiaci de 0,04 Joules/m2 constitueix la dosi letal. Calculeu a quants
dmers de pirimidina equival aquesta dosi letal assumint que E.coli t 4x106 parelles de bases en el seu
genoma, que 50% d'aquestes sn Gs i Cs, i que la irradiaci UV a 400 Joules/m2 converteix un 1% del total de
parelles de pirimidines (TT, TC, CT i CC) en dmers de pirimidines.
SOLUCI
A) A E.coli, els diferents gens uvr codifiquen per protenes que intervenen en una mateixa via
de reparaci de DNA: la via NER. Aquesta via s independent de la reparaci per recombinaci,
on actua RecA. Si en una cl.lula estan afectades dues protenes de la mateixa via, aix fa el
mateix efecte que si noms nest afectada una: la via est tallada de totes maneres. En canvi
si estan afectades protenes de vies diferents, estan tallades vies diferents: i aix li resta moltes
possibilitats de resposta a la cl.lula. Concretament en aquets cas: dues mutacions en
protenes uvr suposen la inoperativitat de la via NER, per es pot reparar DNA per la via de
recombinaci. En canvi, la combinaci duna mutaci en un gen uvr i en recA, fa que la cl.lula
no pugui reparar el seu DNA ni per NER ni per REC. De fet, segons la grfica, quasi no pot
reparar les lesions causades en el DNA per la irradiaci, i la tasa de supervivncia a nivells ja
baixos dirradiaci s prcticament nul.la (vegeu la grfica!).
B) Si el DNA t 4 x 106 pb: aix s la longitud duna cadena de DNA.
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La probabilitat duna de les 4 bases, donat que 50% sn C i G, s del 25 % (0.25)

La probabilitat que en una cadena hi hagi dues pirimidines (C o T) contgues (condici perqu es formi un dmer
de pirimidina) s de 0.5 x 0.5= 0.25 (o 1/4), ja que es tracta duns esdeveniments independents: la base que hi
ha en una posici no condiciona la que hi ha al costat.
Aix vol dir que al llarg de tot el DNA, la probabilitat de dues pirimidines contges s de 0.25 x 4 x 106 = 106
Una radiaci de 400 J/m2 converteix l1% daquestes parelles en dmers, per tant:
1% de 106 = 104 dmers
Per nosaltres treballem amb una radiaci noms de 0.04 J/m2 , 1/10000 vegades ms petita que la de
referncia, per tant:
[104 dmers / 400 J/m2 ] x 0.04 J/m2 = 1 dmer per cadena
O sigui que en les condicions del problema, la presencia dun sol dmer per cadena s letal .
Cal considerar que si pensem en la cadena complementria hi hauria la probabilitat dun altre dmer, o sigui la
resposta si ens referim a les dues cadenes serien 2.

ENUNCIAT
A E.coli coneixem quatre mecanismes pels quals es pot fer front a un dmer de pirimidines.
A) Enumereu-los.
B) Donat aquest esquema d'un hipottic dmer de pirimidines, dibuixeu la seqncia d'esdeveniments que
comporta cadascun dels quatre mecanismes.
Dmer
B) Els productes finals, sn tots quatre iguals?
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SOLUCI
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EUCARIOTAS.
En humanos, el mecanismo ms importante es, con diferencia,
el NER. Las enfermedades genticas asociadas a mutaciones
en NER son autosmicas recesivas y los pacientes presentan
gran sensibilidad a la luz UVA. Son las siguientes:
- XP: Xenoderma Pigmentosum. Elevada predisposicin al
cncer de piel, la cual est alterada. El 25% sufre
neurodegeneracin. No hay UDS.
- CS: Sndrome de Cockayne. No tienen predisposicin al
cncer, piel alterada. Todos tienen neurodegeneracin.
Reparan con UDS, pero sin preferencia de zona.
- TTD: TricoTrioDistrofia. No hay predisposicin al
cncer. Fragilidad en piel y pelo. Descamaciones
abundantes. Retraso en el desarrollo fsico y mental.
Baja fertilidad. No hay UDS.
Genticamente,
los
fibroblastos
de
stos
pacientes
presentan patologas moleculares en la Sintesis de DNA no
Programada (UDS, Unscheduled DNA Synthesis). El UDS
consiste en que el DNA no slo se sintetiza durante la fase
S del ciclo celular, sin tambin antes y despus. Es en
stos momentos que no corresponden a la fase S cuando se
repara el DNA y hay sntesis de nuevo material gentico (la
UDS).
Ello se estudi haciendo la Prueba de Complementacin (ver
Gentica General) hibridando dos clulas y observando el
fenotipo. Hay que considerar que los enzimas reparadores
son como los enzimas de una va metablica, donde si falla
un intermediario, o uno de los iniciales, no hay producto
final:
- Al
hibridar
2
clulas
mutantes
del
mismo
genmutanteno complementa.
- Al
hibridar
2
clulas
mutantes
de
diferentes
genesnormalcomplementan. Lo que no tiene uno, lo
produce el otro.
Clula A (paciente A)+Clula B (paciente B)Fusin por
aglutinacin. Resultado: Monocarionte (no han fusionado,
porque las cosas no siempre son perfectas), Dicariontes
(heterocariontes si son A+B complementados homocariontes
si son A+A o B+B, no complementados). Los genotipos de las
clulas iniciales se saben porque se han marcado las
clulas con bolas de ltex pequeas en A y grandes en
B. Se ven al M.O.
As, se llegaron a establecer los detalles
Eucariota. El NER Eucariota tiene 2 modalidades:
Gentica Molecular.
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del
NER
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-NER-GGR: NER con reparacin Global del Genoma.

-NER-TCR: NER con reparacin acoplada a Transcripcin.
NER nunca arregla apareamientos errneos, solo lesiones.
Ambas tienen vas de entrada diferente pero el resultado es
el mismo. Ambas se encuentran operativas en individuos
sanos.
NER-GGR: Global Genome reparation. Partimos de dsDNA
genmico con una base daada. Se pone XP-algo porque se
encontraron en pacientes de XP.
- XPC: Reconoce y se une al punto de la lesin, junto a
R-23. Marca la cadena con la mutacin.
- XPE: Ayuda a XPC.
Juntas, XPC+XPE forman un heterodmero que recluta al
reparasoma, formado por:
- XPA: marca la cadena con lesin, para los enzimas de
despus.
- XPB y XPD: Son helicasas que forman parte de TF2H. Hay
un heterodmero de XPB+XPD por cada horquilla (TF2H
forma parte, tambin, del reparasoma).
- RPA: equivale a la SSBP Procariota, protege al ssDNA.
- XPG: Endonuclesa que corta en una cadena, a 3 de la
lesin, haciendo 1 nick.
- XPF: Endonuclesa que corta en una cadena, a 5 de la
lesin, haciendo 1 nick. Acta unida a ERCC1.
El reparasoma es un agregado proteico, formado por stos
enzimas y alguno ms. El ssDNA con la lesin cortado es ms
largo que el de los Procariotas (12-13 nt). La lesin no
est centrada, suele quedar hacia el 3 del trozo cortado.
El Gap que queda implica que la DNA Polimerasa - tiene
que sintetizar DNA all, y la ligasa lo une.
NER-TCR: Transcription Coupled Reparation. Acoplado a la
transcripcin, cuando la RNA Polimerasa toca la lesin, se
para. Entonces se unen las siguienes proteinas (se pone CS
porque se encontraron en pacientes de CS):
- CSA+CSB: Heterodmero que se une a la RNA Polimerasa
ya parada, y la retiran*.
Ellas reclutan al reparasoma, que como antes, tiene:
- XPA: marca la cadena con lesin, para los enzimas de
despus.
- XPB y XPD: Son helicasas que forman parte de TF2H. Hay
un heterodmero de XPB+XPD por cada horquilla (TF2H
forma parte, tambin, del reparasoma).
- RPA: equivale a la SSBP Procariota, protege al ssDNA.
- XPG: Endonuclesa que corta en una cadena, a 3 de la
lesin, haciendo 1 nick.
- XPF: Endonuclesa que corta en una cadena, a 5 de la
lesin, haciendo 1 nick. Acta unida a ERCC1.
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* No se sabe si realmente, la RNA Polimerasa se aparta

momentneamente por accin de CSA-CSB o si se separa del
complejo y se desmontan todos los factores y el trnscrito.
Se cree que se aparta momentneamente ya que los Eucariotas
producen un pre-mRNA muy largo, y si justamente hay un
error antes del final de la transcripcin, el tener que
desmontarlo todo y empezar de nuevo es muy costoso.
Interesa no perder el trnscrito, as que por eso se cree
que se aparta momentneamente.
Relacin entre mutacin y sintomatologa.
Las mutaciones en las protenas implicadas pueden estar en
dominios catalticos de accin en dominios de interaccin
con otras protenas.
Son vitales siempre XPB y XPD: las helicasas. Forman parte
de TF2H, el cual est en el reparasoma. Estn en los dos
tipos de NER: GGR (entran por XPC+XPE) y TCR (entran por
CSA+CSB).
- En pacientes de XP, se afecta la via NER-GGR. Hay una
mutacin en XPB y en XPD en el dominio de unin a
XPC+XPEno entra el reparasomano UDS.
- En pacientes de CS, se afecta la via NER-TCR. La
mutacin est preferentemente en CSA+CSB (en el
dominio de unin a XPB y XPD), pero tambin puede
estar en XPB y XPD en el dominio de unin a CSA+CSB.
Se da el GGR porque el XPB y XPD pueden unirse a
XPC+XPE, pero no a CSA+CSB, por lo tanto, no hay
preferencia de zona.
- En pacientes de TTD, se afecta al dominio de unin de
XPB y XPD con XPC+XPE, pero slo cuando XPB y XPD
estn en el transcriptoma (TF2H + RNA Polimerasa + XPB
y XPD). Hay poca transcripcin, pero la hay, no es
absoluto. No GGR porque no entra reparasomano UDS.
Sintesis sobre lesin en Eucriotas.
Acta en caso de que se encuentren dmeros de pirimidinas
en el genoma. En Procariotas, actuaban la DNA Polimerasa IV
y V. En Eucariotas, actan las DNA Polimerasas , , .
Todas ellas son polimerasas translesin (TLS) polimerasas
Y. Polimerizan en 53, ponen nt aleatoriamente sobre
dmeros de pirimidinas, por lo que cometen muchos errores.
No tienen proofreading, y por lo tanto su tasa de error es
alta. Adems son poco procesivas (factor de infidelidad).
Se estudi mediante el mutante XPV, que tena la DNA
Polimerasa no funcional. En su lugar, se observ que la
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clula utilizaba en lugar de la DNA Polimerasa - a las

subunidades y , con las caractersticas ya citadas.
Las Polimerasas Translesin tambin estn relacionadas
estrechamente con en fenmeno de hipermutacin somtica
(ver Tema 20). ste fenmeno sucede en los linfocitos B.
Primero, realizan recombinaciones somticas para reordenar
sus genes y despus, mitosis para clonarse. Pero sus
clulas hijas tienen variedad elevada, no son como las
parentales, debido a que, entre otras cosas, cuando hay
errores en la mitosis, se suelen usar las DNA Polimerasas
translesin y para reparar y replicar el DNA, junto con
la DNA Polimerasa -.
Sistema NHEJ.
Non-Homologous End Joining. Es un mecanismo de reparacin
del
DNA
Eucariota
(exclusivo)
de
muy
reciente
descubrimiento.
Si se rompe el DNA genmico generando extremos romos,
pueden suceder translocaciones, etc. No interesa. Por ello,
cuando aparecen los extremos romos se activan KU70 y KU80.
Se unen formando un heterodmero. Un heterodmero se une a
un extremo. Otro heterodmero, se une al otro extremo.
Tienen mucha afinidad el uno por el otro, y acercan los
extremos. Cuando estn muy juntos, se activa la DNA-PK
(kinasa), que fosforila a ARTEMIS. Cuando ARTEMIS se ha
activado por fosforilacion, es una endonucleasa. No se sabe
qu hace. Tambin aparece XRCC4, cuya funcin no est muy
clara, pero est relacionada con la ligasa.
Si en lugar de extremos romos se generan

protuberantes, las Polimerasas translesin los
pasndolos a romos, aadiento nt al azar.
extremos
arreglan
Actualmente se intenta relacionar NHEJ con la replicacin,

y con la recombinacin.
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PROBLEMA REPARACI EUCARIOTES 1

Problema adaptat de Kberle et al. (Current Biology 9: 273-276; 1999)
El cncer metstasic en adults sol sser incurable. No obstant, els tumors avanats de testicle es poden curar en
ms del 80% dels pacients desprs de quimioterpia amb cisplat. El cisplat s un agent mutagnic que indueix
la formaci de lesions en el DNA per creaci d'unions dins la mateixa cadena (adductes) quan troba la seqncia
GTG. Sembla ser que les cl.lules tumorals de testicle sn hipersensibles al cisplat perqu presenten incapacitat
d'extreure'l del seu DNA. A ms, tamb presenten hipersensibilitat a la irradiaci amb llum UV. Per esclarir
aquest fet, s'han obtingut extractes proteics de cl.lules en cultiu de diferents tipus de cncer de testicle i se'ls ha
comparat amb dos altres tipus de cl.lules transformades que no sn sensibles al tractament amb cisplat:
cl.lules de cncer de melsa i com a control positiu, cl.lules HeLa, que mantenen tot el sistema de reparaci per
escissi de nucletids (NER) funcional.
S'ha comprobat la capacitat reparadora d'aquests extractes proteics sobre un fragment de DNA al que s'ha
introdut una lesi per cisplat. La mida total del fragment s de 250 bp. Tal com s'indica a la Fig.1, a 74 nt de
l'extrem 3' d'una cadena hi ha l'adducte GTG-Cisplat. S'ha dissenyat un oligonucletid curt (12 nt) de seqncia
complementria a la regi immediatament flanquejant a la lesi (Figura 1) per a detectar si hi ha reparaci per
escissi de nucletids (NER).
FIGURA 1
oligo
5'
3'
Cis-Pt
GTG
3'
5'
74 bp
250 bp
L'experiment que s'ha efectuat s el segent: a cada extracte proteic se li ha afegit el fragment de DNA, amb o
sense lesi. Desprs de 30 minuts, s'ha aturat la reacci, s'ha bullit la mostra, s'ha corregut en un gel de
seqenciaci desnaturalitzant, s'ha transferit i s'ha hibridat amb l'oligonucletid complementari, marcat
radioactivament.
A la Figura 2, trobars el resultat de l'autorradiografia del seu experiment.
"+" i "-" indiquen si a l'extracte proteic s'ha afegit el fragment de DNA amb la lesi o sense lesi, respectivament.
HeLa s l'extracte proteic positiu de reparaci NER; MGH-1 sn cl.lules de cncer de melsa; 833K, B329 i B52
sn diferents lnees derivades de cncer de testicle sensibles al cisplat.
FIGURA 2
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1.- Els autors fan una srie dexperiments de complementaci gentica i dedueixen que de totes les possible
protenes implicades en el procs de reparaci per escissi de nucletids, probablement les que estn afectades
en aquestes cl.lules tumorals de testicle sn XPA, XPF i XPG. Decideixen complementar els extractes proteics
amb cadascuna d'aquestes protenes purificades per separat i amb combinaci. Quin conjunt de
complementacions (Figura 2) va donar que es restabls la reparaci per escissi de nucletids en cadascundels
extractes?
a) B52 complementa amb XPA; B329 complementa amb XPG; 833K complementa amb XPF.
b) B52 complementa amb XPF; B329 complementa amb XPG; 833K complementa amb XPA +
XPF + XPG.
c) B52 complementa amb XPG; B329 complementa amb XPF; 833K complementa amb XPA.
d) B52 complementa amb XPF+ XPA; B329 complementa amb XPG + XPA; 833K complementa
amb XPA + XPF + XPG.
RESPOSTA: La resposta correcta s la c). Si es mira el resultat de lautoradiografia es
veu que de les tres lnies de cl.lules tumorals de testicle:
les lnies B52 i B329 produeixen un tall al voltant de la lesi, per no produexien la
mida esperada de 29 nt deguda a lactuaci correcta del sistema NER. Per tant,
hem de suposar que una de les dues endonucleases del sistema NER estan
mutades. Mirant les situacions relatives de la lesi i la sonda respecte al fragment
de DNA, veiem que si est mutat el gen que codifica per lendonucleasa que talla a
3 de la lesi (XPG), la banda que es produir tindr una mida ms gran que si el
gen mutat s el que codifica per lendonucleasa que talla a 5 (XPF). Aix dedum
que B52 t mutat XPF i que 329 t mutat el gen XPG, i que per tant, laddici
daquesta protena als extractes proteics corresponents, permetr restablir la
funcionalitat del sistema NER.
Si, en canvi, ens fixem amb la lnia cel.lular 833K, observem que el patr del DNA a
lautoradiografia no varia si sha afegit cisplat (hi ha lesi al DNA) o no. Podem
deduir que no hi ha pogut actuar cap endonucleasa, pot ser per qu t mutat un
dels gens que codifiquen per les protenes de reconexeixement de la lesi (XPC,
XPE o XPA).
De totes les opcions que ens donen, noms la resposta c) t la nica resposta que inclou aquestes
deduccions.
ULL! Aquest experiment difereix de lexperiment de complementaci gentica explicat a teoria

del sistema NER, en el que es realitzen experiments de fusi cel.lular de diferents mutants i
complementaci gentica. Aqu sha suplementat directament lextracte proteic amb la
protena correcta. Si aquest problema shagus plantejar com un experiment de fusi entre
mutants, llavors la lnia B52 hagus complementat amb tot de lnies mutants pel sistema NER,
excepte la que tingus mutada el gen XPG, la lnia B329 hagus complementat amb tot de
lnies mutants pel sistema NER, excepte la que tingus mutada el gen XPF, i la lnia 833K
hagus complementat amb tot de lnies mutants pel sistema NER, excepte la que tingus
mutada el gen XPA.
2.- Les mides de les bandes obtingudes a l'autorradiografia als carrils 3 i 5 sn:
a) 69 i 152 nt
b) 69 i 181 nt
c) 98 i 181 nt
d) 98 i 152 nt
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RESPOSTA: La resposta correcta s la c).

Tot i que el sistema NER deucariotes presenta una lleugera variaci en la mida final de
loligonucletid alliberat quan hi ha una lesi, la situaci relativa del tall respecte la lesi
s de uns 5 a 8 nt a 3 de la lesi i uns 20-25 nt a 5 de la lesi.
- Carril 3: Tenint en compte la colocaci relativa de la sonda respecte la lesi de
cisplat, i que la mutaci de la soca B52 s a XPG (i per tant no s dona el tall a 3,
per s a 5) hauriem de sumar els 74 nt ms els 3 nt implicats a la lesi i
aproximadament 20-25 nt, i ens dna una mida dentre 97 a 102 nt.
- Carril 5: Pel mateix raonament anterior per ara tenint en compte que la mutaci
de la soca B329 s a XPF (no hi ha tall a 5 de la lesi, per s a 3) hauriem de
calcular que el tall a 3 es donar a uns 5-8 nt de la lesi. Com que hi ha 74 nt des
de la lesi fins al final, vol dir que hem de restar-li uns 5-8 nt a 74, s a dir, el tall
es dna a 69- 66 nt del final. Restant-ho a 250 de la mida total, vol dir que ens ha
de donar una mida entre 181- 178.
De totes les respostes que ens donen la nica que ens dna valors entre els que hem
calculat s la resposta c).
3.- Els autors arriben a la conclusi que els tumors de testicle que sn curables per cisplat:
a) no els hi funciona correctament el sistema NER.
b) s que els hi funciona el sistema NER, per no poden reparar les lesions del DNA.
c) no els hi funciona ni el sistema NER ni la replicaci i per aix es generen les cl.lules tumorals.
d) no els hi funciona ni el sistema NER ni el sistema de reparaci d'aparellaments erronis .
RESPOSTA: La resposta correcta s la a).
En totes les lnies tumorals de testicle que shan estudiat que responen al tractament al cisplat, hi ha
alguna mutaci dun gen implicat al sistema NER. Per tant, aquesta quimioterpia consisteix en un agent
mutagnic, que el que fa s introudir lesions al DNA que daltres cl.lules poden reparar, per que
aquestes lnies no poden fer-ho ja que els hi falla el sistema de reparaci global del genoma (sistema
NER).
Les altres respostes sn incorrectes, si funciona els sistema NER, es poden reparar les lesions del DNA.
Si no funciona la replicaci, de segur que no poden generar-se cl.lules tumorals, i en cap cas sha dit ni
sha donat informaci per inferir que en aquests tipus de tumors en concret no funcioni el sistema de
reparaci daparellaments erronis.
4.- Dels segents gens implicats en el sistema NER, quina s la correlaci entre gen i funci?
1- XPC
2- XPB
3- XPG
4- XPV
A- polimerasa translesi
B- endonucleasa
C- reconeixement de la lesi
D- helicasa
a) 1- A
2- C
3- B
b) 1- B
2- C
3- D
c) 1- C
2- D
3- B
d) 1- A
2- D
3- B
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4- D
4- A
4- A
4- C
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De les protenes implicades a Xeroderma Pigmentosum i el sistema NER:

XPC, XPE i XPA intervenen en el reconeixment de la lesi. XPB i XPD sn helicases
direccionals. XPF i XPG son les endonucleases que respectivament tallen a 5 i 3 de la
lesi. I, finalment, XPV (Xeroderma Pigmentosum- variable) codifica per una de les
polimerases translesi que posa menys error quan polimeritza sobre dmers de
pirimidina.
5.- A eucariotes, el mecanisme d'escissi de nucletids (NER) quan actua sobre un aparellament erroni:
a) pot distingir quina s la cadena que porta la informaci original i quina s la sintetitzada de
nou.
b) no pot distingir quina s la cadena que porta la informaci original i quina s la sintetitzada de
nou.
c) primer reconeix l'aparellament erroni, llavors talla a ambds costats de la mutaci, i desprs
actua una helicasa, escindint un oligonucletid que cont la seqncia errnia.
d) de fet, el sistema NER no actua sobre aparellaments erronis.
RESPOSTA: La resposta correcta s la d).
El sistema NER est involucrat en la reparaci de lesions, no en la reparaci
daparellaments erronis, per tant cap de les respostes t sentit excepte la ltima. A
eucariotes, el sistema encarregat de reparar els aparellaments erronis s el diversos
complex format per diferents heterotetrmers de MutSH i MutSL
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TEMA 13: RECOMBINACIN GENERAL:

INTRODUCCIN.
ste tema es introductorio y conceptual. Se explica cmo se
resuelve la cruz de Holliday, un intermediario presente en
todo proceso de Recombinacin Homloga Procariota.
Recombinar es reordenar genes marcadores gnicos siempre
como consecuencia de un intercambio fsico. Funcionalmente,
consiste en cortar un trozo de DNA y unirlo en un lugar
diferente al original. La Recombinacin puede ser Natural
(Homloga, de Sitio Especfico, Transposicin) Artificial
(la que provoca la Ingeniera Gentica, con enzimas de
restriccin). La Artificial acta sobre la Natural.
Tipos de Recombinacin (Natural):
1. Recombinacin Homloga: Es lo visto en Gentica
General, acta sobre regiones grandes del genoma (de ms
de 100pb) que han de ser homlogas (casi iguales en cuanto
a composicin de nt, pero iguales estrictamente en cuanto
a la regin que ocupan del
genoma) en los dos DNA.
La Recombinacin Homloga origina la Recombinacin General
(se considera sinnimo de Recombinacin Homloga, implica
apareamiento
y
entrecruzamiento
en
los
cromosomas
homlogos, con cambio o no de orden en los alelos)
Recombinacin
Ilegtima
(=Recombinacin
no-homloga,
sucede por error, dos regiones no homlogas o con muy poca
homologa recombinan entre s, sin cambiar el orden de los
genes). Temas 13 y 14.
2. Recombinacin de Sitio Especfico: Interactan 2

DNA con una pequea regin de homologa de unos 10-15 nt,
demasiado pequea para que pueda actuar RecA. sta regin
de 10-15 nt es igual en cuanto a composicin de nt.
Lo hacen Integrasas, Resolvasas (resuelve intermediarios de
la fusin) Invertasas. Ver Tema 15.
Gentica Molecular.
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3. Transposicin: Se escinde un dsDNA de un sitio

donador, se mueve por el citoplasma libremente y se integra
en un sitio receptor, totalmente al azar. No requiere
ningn tipo de homologa. Slo se da en momentos concretos
de la vida de la clula, y se da en mltiples organismos.
Implica la actividad de la Transposasa. Hay muchos tipos,
se estudia en los Temas 16 a 19. Un ejemplo:
Otra Clasificacin:
Gentica Molecular.
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La Recombinacin Homloga. En Procariotas, se resuelve

mediante la cruz de Holliday, siguiendo el modelo de
Holliday (1960). Se ha demostrado que la recombinacin
homloga Procariota no es estrictamente as, pero se
explica por ser didctico y sirve para entender el que se
cree que es el verdadero modelo (el de Meselson-Radding,
Tema 14). Eso si, TODOS los modelos comparten que hay un
intermediario comn, llamado la cruz de Holliday.
Son, por ejemplo, un dsDNA lineal

que
he
introducido
para
transformar y otro dsDNA lineal
que pueda hacer en el citosol. La
polaridad
de
las
cadenas
no
hermanas ha de ser la misma. Es
AB/ab. Necesitan una regin de
100pb de homologa MNIMO.
Una endonucleasa hace 1 nick en 1 cadena de
cada una de las cromtidas no hermanas.
Suponemos entre A y B.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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Una ligasa une una cadena cortada con la otra.

Es la invasin.
Se ha producido ENTRECRUZAMIENTO =
RECOMBINACIN FSICA. ste es el 1er
Intermediario. Es la juntura de
Holliday. La zona con la cruz es el
Branchpoint punto de ramificacin.
Siempre,
los
intermediarios
requieren una resolucin.
Migracin del Branchpoint.
Al moverse el branchpoint por accin
de una helicasa, la cadena de abajo
sube hacia arriba y la de arriba
baja hacia abajo. Se aparean con la
otra porque eran homlogas. Es el 2
intermediario.
sto es un DNA heterodplex: regiones de un dsDNA donde
cada una de las dos cadenas viene de un origen distinto.
El 2 intermediario se estira:
Un enzima gira
la
parte
de
abajo 180 sobre
s misma.
Esto es la cruz
de Holliday.
Se puede resolver de dos maneras diferentes, cada una de

las cuales tiene 1/2 de probabilidades de suceder (al
azar):
- Corte Este-Oeste: Una endonucleasa corta a la cruz de
Holliday de derecha a izquierda, por el centro. Genera
2 dsDNA heterodplex en los cuales no ha habido
reordenacin de alelos: es un recombinante fsico (por
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Pgina 128
el entrecruzamiento)pero no un recombinante gnico. Es

como los dsDNA parentales, los mismos alelos.
- Corte Norte-Sur: Una endonucleasa corta de arriba
hacia abajo por el centro de la cruz de Holliday.
Genera 2 dsDNA heterodplex que tienen cada uno un
alelo que antes no tena. Son recombinantes fsicos
(por el entrecruzamiento) y recombinantes gnicos (por
los nuevos alelos).
Dos DNA homlogos son aquellos que comparten la misma
regin fsica del genoma de 100nt o ms, aunque no tienen
el 100% de sus bases iguales (de hecho nunca lo tienen).
El entrecruzamiento recombinacin fsica consiste en que
diferentes cadenas de ssDNA se juntan y forman el
heterodplex, no se aparean perfectamente porque la que
sube del cromosoma de abajo al de arriba (por ejemplo),
puede tener alelos diferentes (con bases diferentes). ste
problema se solventa con la conversin gnica. Se detecta
mediante los recombinantes genticos (1/2 veces), usando
genes marcadores.
Consideremos ahora 3 genes. Tambin se resuelve por la cruz
de Holliday. Seguimos en Procariotas.
Igual que antes, considero
lineales
bajo
las
mismas
ABC/abc.
Nick en
cadena.
una
cadena
entre
B.
Invasin
dos dsDNA
premisas.
de
Primer Intermediario. Branchpoint.
Migracin del Branchpoint.

Segundo Intermediario. Heterodplex.
Nueva distribucin de B.
Se gira lo de abajo 180.
Cruz de Holliday.
Tiene 2 resoluciones, N-S E-O. Cada
una tiene 1/2 de probabilidades.
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- El corte E-O forma un heterodplex que no tiene nuevas

combinaciones de alelos, es recombinante fsico a
secas. Sigue siendo ABC/abc. Apedazado.
- El corte N-S forma un heterodplex que aparte de

recombinante fsico, es recombinante gnico porque
tiene nuevas combinaciones de alelos respecto al
parental. Es ABc/abC. Empalmado.
La conversin gnica es consecuencia de la recombinacin

fsica (entrecruzamiento) que forma regiones heterodplex.
Inmediatamente se da la reparacino no.
Consideremos el gen B en el ejemplo anterior. Evidentemente
se trata de un dsDNA.
El gen B tiene dos alelos B:
b:
Cuando llegamos al heterodplex final, producto del corte
N-S, tenemos que:
ste pequeo error genera problemas de apareamiento, debe

repararse (o no). Considero que:
- No repara ninguno de los dos dsDNA se queda as.
-
Repara uno de los 2 dsDNA
- Repara a los dos dsDNA, lo

ms frecuente. Dependiendo
de cual de las dos bases se
repare,
tendremos
uno
u
otro alelo.
de que se
repare 1 de las dos cadenas
de 1 dsDNA X que se
repare una de las 2 cadenas
del otro dsDNA = 1/4. Hay 4
combinaciones posibles:
bb, bB, Bb, BB.
Gentica Molecular.
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de que sea
.
Puede reparar la TC
() y hacer alelo b,
o la GA ()y hacer
alelo B
de que repare
.
Puede reparar la AG
() y hacer alelo b,
o la CT () y hacer
alelo B.
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En Eucariotas, la meiosis implica siempre entrecruzamientos

(recombinacin fsica). Si no sale recombinante gentico,
se llama heterodplex parental. Si sale recombinante
gnico, se llama heterodplex recombinante, que puede ser
en regin no codificante (poco importante a nivel de
expresin del gen) en regin codificante: se da la
conversin gnica, la cual puede reparar ninguna, una o
ambdas cadenas de dsDNA. Es decir, se calculan las
proporciones igual que antes.
Esto
se
demostr
en
Neurospora
(hongo
Eucariota,
ascomiceto, ciclo haplodiplonte, mitosis post-meitica que
duplica las clulas despus de hacer meiosis, era 2n antes
de hacer meiosis). No mantena proporciones de herencia
mendeliana de un gen porque hay recombinacin que puede o
no repararse.
Se demuestra partiendo de un individuo 2n
heterocigoto
para B (Bb de genotipo). Se resuelve igual que el ejemplo
con el gen B de antes. Recordar que una vez que se ha
terminado la meiosis, las clulas n hacen mitosis.
Volviendo a Procariotas, el modelo de la cruz de Holliday

se puede aplicar a dsDNA circular tambin. De nuevo, las
cadenas deben estar en la misma polaridad (se indica con +
-).
Resolucin
con
Corte
E-O:
endonucleasa corta por fuera y
ligasa
une.
Recombinante
no
gnico. Cambia orden de alelos
en 1 plasmidio.
Endonucleasa corta en lugar

especfico
de
recombinacin
entre A y B. Hace un Nick en
cada dsDNA. Cuando invade una
cadena el otro DNA, se forma la
Cruz
de
Holliday
(con
el
branchpoint).
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Se gira la parte
de abajo. Primer
intermediario
Resolucin con Corte N-S: endonucleasa talla

por dentro, ligasa une y se forma el 2
intermediario el COINTEGRANTE.
Pgina 131
El Cointegrante no es el final de la resolucin N-S. Tiene

secuencias diana de enzimas especficas que son reconocidas
por nucleasas. Siempre, los intermediarios requieren una
resolucin.
El cointegrante se resuelve generando

circulares que son recombinantes gentivos
dos
dsDNA
La cruz de Holliday siempre aparece en Procariotas cuando

hay
recombinacin
Homloga.
Rene
una
serie
de
caractersticas:
- Primero se sinapsan los dsDNA (se juntan mucho uno con
otro), y despus se cortan.
- Se hace un corte en una sola cadena (Nick) en cada
dsDNA.
- Los heterodplex que se generan son 100% recprocos.
Supongamos que tenemos dos dsDNA
lineales homlogos que van hacen
recomb. homloga. Los dos brazos
cortos de la cruz y los dos
brazos largos de la cruz tienen
la misma longitud, y si sumamos
la longitud en pb de un brazo
corto
y
un
brazo
largo,
obtenemos la longitud de la
molcula
original
de
dsDNA:
porque son RECPROCOS (todo lo
que lo que le falta a uno de los
dos dsDNA, lo tiene el otro).
Los Eucariotas tambin hacen Recombinacin Homloga y
generan DNA heterodplex, pero no es vlido el modelo de la
cruz de Holliday porque los Eucariotas
- Primero cortan y despus sinapsan los homlogos.
- El corte que hacen es un corte de doble cadena, se
corta un dsDNA.
- No tienen porqu hacer un heterodplex 100% recproco.
Los Eucariotas siguen el modelo de Szstack (=DSB), no de
Holliday.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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TEMA 14: RECOMBINACIN GENERAL: MECANISMO

ENZIMTICO.
La recombinacin General sucede, realmente (o eso creemos),
por el modelo de Meselson-Radding en el que se resuelve la
cruz de Holliday. En Procariotas, la Recombinacin General
(la principal consecuencia de la Recombinacin Homloga)
tiene 3 grandes etapas en las cuales se resuelve la cruz de
Holliday:
1. Iniciacin: Se rompe el dsDNA y se generan extremos de
ssDNA. Lo hace RecBCD.
2. Invasin: Se cambia de cadena, la cadena de ssDNA va a
aparearse con la complementaria de la otra molcula de DNA.
Lo hace RecA.
3. Desplazamiento y Resolucin: Migra el branchpoint, gira
180 y se corta. Lo hace RuvABC.
1. Iniciacin. Lo inicia todo RecBCD. Es un heterotrmero
formado por:
- B: helicasa lenta basal en 35, endonucleasa 35
basal y endonucleasa 53 crptica.
- C: Funcin poco clara. Reconoce secuencia ?
- D: ATPasa dependiente de ssDNA, helicasa rpida en
53 crptica.
Se comienza uniendo RecBCD a 1 de los extremos romos de uno
de los 2 dsDNA. Se situa, segn el dibujo, en la cadena de
arriba. La orientacin de la molcula sigue el consenso.
Acta RecB como helicasa lenta en 35, sobre la cadena
de arriba, separndola de la de abajo. Mientras, va
haciendo de endonucleasa 35 dejando trozos de ssDNA que
se van. Tambin se va usando la endonucleasa para la cadena
de abajo, pero muy poco. Va avanzando hasta que RecC
detecta la secuencia en la cadena de arriba.
La secuencia slo es la cadena de arriba, y se lee en

35. Es un hot-spot de recombinacin. Una vez leda la
secuencia , se inactiva la helicasa lenta 35 de RecB y
cambia su nucleasa 35 por la nucleasa 53 crptica.
Se activa la helicasa 53
empieza a hacer cosas ahora.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
rpida
de
RecD,
la
cual
Pgina 133
Ahora se degrada la cadena de abajo porque las actividades

enzimticas as lo permiten. El extremo de ssDNA con en
el extremo no se degrada, porque se ha bloqueado esa
actividad enzimtica 35.
Se degrada un trocito ms de la de abajo, para definir bien
el fragmento de ssDNA protuberante con en el extremo.
RecBCD no se separa an.
Ahora, se unen las SSBP y RecA al ssDNA. Se unen por todo.
En principio, la afinidad de SSBP por el ssDNA es algo
mayor que la afinidad de RecA por el ssDNA. Se soluciona
gracias a que cuando RecA se une al ssDNA y toca a RecBCD,
su afinidad por el ssDNA se vuelve mucho mayor, y empieza a
cargarse sobre el ssDNA en 53 desplazando a las SSBP.
Slo se carga RecA sobre el fragmento de ssDNA con en el
extremo, porque es en esa cadena a la que se haba unido
RecBCD.
Segn stos dibujos, el extremo con ssDNA y la secuencia

envuelto en RecA sera el que presenta el 3 invasor. Esto
no tiene porque ser as siempre, RecA se unir siempre al
que aporte el ssDNA, tenga el 3 o el 5 libre.
Los sustitutos de RecBCD en caso de que ste falle son:
- RecJ (para la nucleasa) y RecQ (para la helicasa
35 lenta) sustituyen a RecB.
- RecC no tiene sustituto, los mutantes RecC- tienen
menos capacidad de reconocer a .
- RecQ tambin tiene helicasa 53 rpida, que
sustituye la de RecD.
2. Invasin. RecA cataliza el intercambio de pareja.
Se descubri mezclando, en una proveta, RecA + ATP + SSBP +
(ssDNA circular + dsDNA linealmodelo de las 3 cadenas)
(dsDNA circular con Gap + dsDNA lineal modelo de las 4
cadenas) (dsDNA circular + ssDNA lineald-loop). SON
MODELOS QUE SE HAN DEDUCIDO IN-VITRO.
- Modelo de las 3 cadenas: RecA (bolitas) se carga sobre
el ssDNA acceptor polimerizando en direccin 53.
Es la nica cosa que se mueve. La traccin que genera
hace que la molcula de ssDNA gire en 53 como
indica la flecha curvada, y mientras gira, se va
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 134
uniendo a la cadena de DNA complementaria que aporta

el 3 libre: la invasora. sta se mueve en 35.
Finalmente queda dsDNA con un Nick (no haba ligasa) y
ssDNA.
- Modelo de las 4 cadenas: RecA se une a la zona de

ssDNA que hay en el Gap del dsDNA. RecA polimeriza en
53 sobre la aceptora haciendo traccin, por lo que
sta gira como indica la flecha curva (en 53)
mientras se va uniendo a la cadena invasora que aporta
un 3 libre, la cual se mueve en 35. Obsrvese la
cruz. Finalmente queda un dsDNA circular con un Nick
porque no haba ligasa y un dsDNA lineal con Gap en
los extremos. Cada uno de los dsDNA tiene una de las
dos cadenas que perteneca al otro, es decir, son dos
HETERODPLEX.
- Modelo d-loop: RecA se carga sobre el ssDNA en 53

como siempre, pero en ste caso, es tambin el DNA
invasor (porque aportar el 3). As, cuando se
introduce en el dsDNA para unirse a la complementaria,
desplaza a la cadena exterior sin romperla. La cadena
de ssDNA que tena RecA (la invasora en ste caso
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 135
porque aporta un 3) se mueve en 35, desplazndose

como indica su flecha debido a la traccin de RecA,
mientras que la aceptora va girando en 53 por la
traccin, como indica la flecha curva. Obsrvese la
cruz.
Finalmente se extrusiona la cadena de DNA exterior intacta,

y queda un dsDNA circular con Nick.
Los fragmentos a unir tenan en los 3 casos, regiones
homlogas de unos 50nt, o con diferencias de bases mnimas.
Si
no
las
tuvieran,
no
podran
hibridar
por
complementariedad (porque por eso se unen).
Lo que los 3 modelos comparten es que la protena RecA
(p.m. de 38 KDa) se une al ssDNA con mucha afinidad,
SIEMPRE. El DNA invasor ha de aportar SIEMPRE un 3OH
libre, y girar en 35. El receptor girar, por
tanto, en 53 (a veces coincide que el invasor con el 3
es de ssDNA, ser l quien tiene a RecA por ser de ssDNA).
Los DNA giran porque RecA hace traccin, es lo nico que
se mueve.
In-vivo, RecA se une al ssDNA formando un nucleofilamento =
filamento presinptico. El ssDNA al que se une puede ser un
fragmento tal cual de ssDNA, un gap en un dsDNA o un
extremo protuberante del dsDNA.
Debe haber una homologa de mnimo unos
invasor que incluye el 3 y el aceptor.
50nt
entre
el
RecA se carga sobre el ssDNA, en el centro, polimerizando

en
53
de
manera
helicoidal,
para
formar
el
nucleofilamento. Cada vuelta de RecA son 6 monmeros, y
ello ocupa unas 19 bases. Tambin se ha visto que se carga
en 35, pero tan lenta que es despreciable. RecA estira
al filamento, lo pone rgido, recubrindolo hasta el
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 136
extremo. Se ha visto tambin que si se trata de recubrir un

gap en un dsDNA, RecA puede pasarse un poco cuando recubre
el ssDNA y llegar a ponerse sobre el dsDNA. Por afinidad,
llega a desplazar a SSBP. Los monmeros que salen por un
extremo pueden entrar por el otro, haciendo treadmilling
(intercambio rotatorio).
Funcionamiento de RecA (consideremos un ssDNA de un extremo

protuberante 3 que ser invasor y un dsDNA circular que
ser invadido).
- Se
forma
el
nucleofilamento
(ssDNA
+
RecA)
polimerizando RecA en 53.
- El nucleofilamento captura al dsDNA en principio en
cualquier zona.
- Los dos DNA giran uno respecto al otro hasta que las
regiones homlogas quedan sinapsadas. RecA debe tener
ATP para hacer esto, aunque an no lo hidroliza.
- RecA cataliza la desnaturalizacin del dsDNA (es
helicasa, aunque sigue sin hidrolizar el ATP) formando
una burbuja y une el nucleofilamento (el 3 invasor)
al DNA invadido (el dsDNA circular).
- Se forma un branchpoint que va migrando debido a que

RecA hace traccin sobre las cadenas de DNA. Sigue
usando su actividaa helicasa. Al unir un DNA con el
otro de la otra molcula, forma los heterodplex. Para
hacer los puentes de H2 entre las bases, hidroliza el
ATP. Las bases se unen porque son complementarias (han
de estar en regiones homlogas, si hay alguna base de
diferenteconversin gnica).
El dominio de intercambio de las cadenas de RecA puede
formar una triple hlice (ssDNA + dsDNA) o una cudruple
hlice (dsDNA + dsDNA), segn. RecA se une fsicamente a
las cadenas que han de intercambiarse, las toca. Como por
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 137
el otro lado puede tener la complementaria (puede ser un

dsDNA), puede haber triples y cudruples hlices. Slo
dentro de RecA, momentneamente. No son los tpicos enlaces
de Watson y Crick.
RecA aparea unos 100nt, despus se va y entra RuvBCD. NO

TIENE NINGN SUSTITUTO, los mutantes de RecA no pueden
recombinar. Se venden mutantes RecA- para que no recombinen
de manera imprevista si se hacen otros experimentos.
3. Desplazamiento y Resolucin. Lo hace RuvABC. Es un
complejo multienzimtico. Acta cuando RecA ha unido 100
nt.
- RuvA: Tetrmero que reconoce la estructura de la cruz
de Holliday y se une con un monmero en cada parte.
Tiene un pequeo centro cataltico.
- RuvB: Dmero, cada uno de sus 2 monmeros tiene 6
subunidades. Cada monmero se une a un dsDNA que
recombina. Es una helicasa dependiente de ATP. Cuando
se une a RuvA (y forma RuvAB), desnaturaliza las
cadenas de dsDNA y permite que se siga formando el
heterodplex mediante la migracin del branchpoint.
- RuvC: Es una endonucleasa de ssDNA. Se ponen dos
monmeros
en
cada
uno
de
los
dos
ssDNA
del
branchpoint. Tiene un hot-spot de corte, 5-ATTG-3.
Hace 2 cortes en total. Tambin es la encargada de
hacer girar 180 la parte de debajo de la cruz de
Holliday. No se sabe si para que entre RuvC ha de
salir RuvAB. RuvC puede hacer esos 2 cortes de dos
formas diferentes, con de probabilidad cada una: el
corte N-S el corte E-O.
Hay un sistema alternativo de Migracin y Resolucin,

suponiendo que RuvABC falle: RecG (unin a la cruz,
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 138
helicasa y ATPasa, sustituye a RuvAB) y RusA (endonucleasa

de ssDNA,, sustituye a RuvC) juntas equivalen a RuvABC.
Si en un tubo de ensayo mezclamos el intermediario primario
y
- RecG + RusA migracin y resolucin.
- RusA el branchpoint se corta justo donde ha salido
RecA, a 100nt. Apenas hay formacin de un heterodplex
significativo.
- RecG El branchpoint migra y cuando llega al final,
se para y vuelve hacia atrs desnaturalizando al
heterodplex y dejndolo todo como estaba al principio
antes de recombinar. Deja los dsDNA originales
separados, sin unirse por el branchpoint porque an no
se ha formado el enlace fosfodister que falta en el
punto de invasin, donde entraba RecA. No recombina de
ninguna manera pero conserva la integridad de los
dsDNA.
RESMEN RECOMBINACIN HOMLOGA EN PROCARIOTAS,SEGN EL
MODELO DE MESELSON-RADDING, QUE INCLUYE LA CRUZ DE
HOLLIDAY:
En Eucariotas, sto no es vlido porque los Eucariotas:

- Primero cortan el dsDNA y luego sinapsan.
- Slo se corta uno de los dos dsDNA.
- La reciprocidad no es obligatoria.
De stas 3 premisas parte el modelo de Szstack (=DSB
Double Strand Breaks) para explicar cmo los Eucariotas
hacen Recombinacin Homloga sin la cruz de Holliday. Se
estudi en S.cerevisiae.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 139
Modelo DSB de Szstack. Poco claro. Hay que entender

las generalidades y el funcionamiento de los enzimas del
principio, las homologas
DNA duplicado. Los extremos se
ponen iguales el uno respecto
al otro.
SPO11 es un homodmero con
actividad
endonucleasa
de
ssDNA. Corta las dos cadenas en
el mismo dsDNA. Cada subunidad
tiene una Tyr (con grupo OH),
que se une momentneamente al
5P. No tiene secuencia diana
especfica. La recombinacin es
aleatoria.
Una vez que SPO11 se une al
5P, viene el complejo MRX
(MREII+Rad50+XRSII), se une a
SPO11 y hace que se vaya. Se
activa la endonucleasa 53
de MRX y deja extremos 3
protuberantes. Se va al acabar.
Entra DMC1+Rad51. Rad51 es la
homloga de RecA en Eucariotas.
Se unen ambas a los ssDNA
formando
2
nucleofilamentos
(que tambin aportan el 3
libre), de los cuales slo uno
ser invasor. Especficamente,
en meiosis hay DMC1+Rad51, y en
mitosis slo Rad51.
Sucede que baja uno de los
dos
nucleofilamentos,
es
complementario con el que se
aparea.
A la vez, el DNA que ocupaba la regin en la que ahora est
el DNA invasor, sube y se une al otro nucleofilamento que
no se ha movido. Es el Primer entrecruzamiento (ver ultimo
dibujo).
Ahora entra la DNA Polimerasa Eucariota - y sintetiza
DNA, aprovechando el 3 del nucleofilamento invasor (va
empujando mientras sintetiza al DNA con el que se topa,
para que suba) y a la vez, se sintetiza DNA en el 3
libre que hay en la cadena de arriba, desde el 3 del
nucleofilamento no invasor.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 140
Debido a que la DNA Polimerasa est empujando al DNA de

abajo para que suba, llega un momento que de tanto
subir, se toca con el 5 complementario al nucleofilamento
no invasor. Entonces, ste 5 baja y se une al 3 del
extremo que se est sintetizando abajo. Se forma as el
Segundo entrecruzamiento.
Por tanto, CONCLUSIONES:
-La recombinacin est
acoplada a la replic.
-Las
polimerasas
al
empujar,
hacen
migrar
los
puntos
de
entrecruzamiento.
-Se
sintetiza
DNA
a
partir del 3 que aporta
una cadena del homlogo
y a partir del 3 del
nucleofilam. no invasor.
-Hay un 5 invasor sin
Rad51 y un 3 invasor
con Rad51.
-Se forman 2 heterodp.
abajo y uno arriba.
El heterodp. es, por
definicin,
DNA
de
cromosomas
diferentes,
no
se
forma
con
el
fragmento
sintetizado
por la polimerasa.
-NO
SON
ENTRECRUZAM.
RECPROCOS,
NO
TIENEN
PORQU.
-La homloga a RecA en
humanos es Rad51. DMC1
se parece pero no lo es
tanto,
adems
Rad51
siempre est.
-SPO11 es endonucleasa
de ssDNA, corta los dos
ssDNA del dsDNA en la
misma
posicindeja
extremos romos.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 141
-MRX es exonucleasa 53 que deja 3 protuberantes.

-Primero se corta, luego se sinapsan.
Proteinas (que se sepa) que intervienen: Spo11, MRX
(Mre11/Rad50/Xrs2), Rad52, Rad51, Rad54, Rad55, Rad57,
Rad59, Rdh54/Tid1, Dmc1, Red1, Hop1, Trd1/Rdh54, Sac3,
Msh4/Msh5, Endo X1, Endo X2...
ste mecanismo se da en la meiosis, pero sucede algo muy
parecido en la recombinacin ilegtima y en algn tipo de
reparacin.
RECOMBINACIN-REPLICACIN-REPARACIN: CONJUNTO FUNCIONAL
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 142
PROBLEMA RECOMBINACI 1
La protena RecA catalitza lalineaci de sequncies homlogues (1er pas en un procs de recombinaci) i tamb
promou la migraci de la branca (etapa subseqent). El seu paper en el procs de recombinaci comena amb la
uni de monmers de RecA a DNAcs i prossegueix amb lalineaci del filament nucleoproteic aix format amb
seqncies homlogues dun DNA dplex. Una de les reaccions ms utilitzades per a lestudi de les activitats de RecA
parteix dun DNAcs circular i dun DNA dplex homleg (com a substrats) i produeix DNA cd circular (que cont un
nick) i DNAcs lineal (vegeu figura lateral). Aquesta reacci ocorre en dues etapes: els cercles saparellen als dplexs
lineals pels extrems daquests; desprs, per migraci de la branca, sassoleix el desplaament complet duna cadena
senzilla lineal.
Una de les qestions importants sobre lactivitat de RecA s la segent: Es direccional o no la migraci de la branca?
Per estudiar-ho es va realitzar el segent experiment:
- Es van barrejar DNAcs circulars, marcats uniformement amb 32P, i DNAcd lineals, en presncia de RecA.
(A mesura que la cadena senzilla saparella amb la seva complementria del duplex lineal, es va tornant
sensible a lacci dels enzims de restricci, els quals no tallen les cadenes senzilles).
- Es van treure mostres de la reacci a diferents temps.
- Cada mostra es va incubar amb un enzim de restricci.
- Els productes de cada digesti es van separar per electroforesi en gel.
El resultat es mostra a continuaci:
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 143
A) Comparant el temps daparici dels fragments marcats amb el mapa de restricci del DNA circular (al
costat), deduu quin extrem (5 o 3) de la cadena (-) ha estat envat pel DNAcs circular. Deduu
tamb la direcci de la migraci de la branca sobre la cadena (-). (El DNAcd lineal est obert per la
diana que separa el fragment a i c del mapa de restricci).
B) Calculeu la velocitat de migraci de la branca, sabent que la longitud del DNA s de 7 kb.
C) Qu esperareu que passs si el DNAcd lineal ports entre els fragments de restricci a i e una
inserci de 500 nucletids no homlegs al DNA cs? Dibuixeu-ho.
RESPOSTA:
Qestions a tenir en compte per respondre :
-El DNA de cadena senzilla no s digerit pels enzims de restricci: aquests noms reconeixen i tallen cadena
doble. Per tant si es genera un segment de restricci vol dir que el DNA de les dianes flanquejants estava en
forma de cadena doble.
-En lautoradiografia noms es poden veure segments que incloguin marcatge: per tant no poden provenir de la
doble cadena de DNA inicial (s DNA fred), sin que per fora han de provenir de DNA recombinant : la
cadena senzilla circular marcada que saparella amb la complementria lineal.
A) A mesura que apareguin fragments en lautoradiografia vol dir que aquell segment ja existia
com a producte de recombinaci en alguna de les molcules de la reacci. Com que lordre
daparici de segments a mesura que es deixa transcrrer la reacci s : c -> d -> b -> f -> e -> a,
aix vol dir que la cadena que entra ho fa pel seu 3, i la recombinaci va avanant (3 -> 5) de
la cadena entrant, (5 -> 3) de la cadena circular.
B) Si la longitud del DNA s de 7 kb, hem de preguntar-nos quin s el mnim temps en qu veiem que
un molcula ha recombinat totalment, ja que sha de tenir en compte que no totes les molcules
comencen a recombinar immediatament quan comena lexperiment, sin que ho van fent al llarg del
temps. Aix s clarament detectable perqu les bandes en lautoradiografia van apareixent i
intensificant-se progressivament.
La primera recombinaci completa es detecta als 15 min (primer temps on veiem banda (a) que s la darrera) :
per tant :
7 kb / 15 min : uns 467 pb /min ( o 7.8 pb /s) : procs molt rpid !!!!
c) El fet que el segment de 500 pb entre (e) i (a) indicat a la figura anterior sigui present en el DNA lineal, i no en
el DNA circular receptor , significa que s un segment sense DNA homleg amb qu recombinar : la reacci es
pararia en aquest moment. La conseqncia daix en lexperiment seria que mai apareixeria banda
corresponent al segment de resttricci (a) en lautoradiografia.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 144
Quan s'extreu DNA de plasmidi a partir de cl.lules d'E.coli i s'analitza al microscopi electrnic, s'observa una
majoria de cercles monomrics i tamb altres figures diverses com per exemple cercles dimrics i trimrics, i un
1% de les molcules en forma de "8".
Per tal d'esbrinar si els "8" sn veritables figures intermdies del procs de recombinaci homloga, Potter i
Dressler van incubar la mostra de DNA de plasmidi amb un enzim de restricci que reconeix una sola diana en el
monmer. L'anlisi al microscopi electrnic dels productes de la digesti va aportar el segent resultat:
99% monmers lineals
1% figures Xi
Les formes Xi presentaven les segents particularitats:
1 - Cada figura Xi tenia dos braos llargs de mida idntica i dos braos curts tamb de mida igual.
2 - La suma d'un bra llarg i un bra curt corresponia a la mida del monmer.
3 - Les diferents figures Xi tenien el punt d'entrecreuament en posici variable.
A) Potter i Dressler van deduir que aquestes figures Xi provenien de veritables figures intermdies del
procs de recombinaci homloga. En qu es van basar? Fes-ne el raonament.
B) Si l'experiment s'hagus fet utilitzant una soca d'E.coli recA , quins resultats s'esperarien?
C) Quin aspecte tindrien les figures Xi si els "8" fossin figures intermdies d'un procs de recombinaci de
lloc especfic entre monmers?
D) Quin aspecte tindrien les figures Xi si els "8" fossin figures intermdies d'un procs de recombinaci no
homloga i totalment a l'atzar entre monmers?
RESPOSTA:
(A): Per respondre aquest problema s molt convenient que tingueu present les darreres imatges de la lli 13,
corresponents a Model de Holliday aplicat a DNAs circulars. A partir daqu, sentn que una figura en X ha
de provenir de la digesti duna figura en 8 que representi uns DNAs que estiguin realment entrecreuats. Si una
figura en 8 s simplement un DNA circular cargolat sobre si mateix (imagineu una goma elstica doblegada per la
meitat) i sobre en un punt (diana de restricci) es genera un DNA linial. O sigui que les figures en X observades
sn veritables intermediaris de Holliday de DNA recombinants circulars.
Com que la recombinaci s homloga: pot passar en qualsevol regi dels DNA recombinants, per per fora ha
dimplicar la mateixa regi en les dues molcules que hi intervenen. La distncia entre la zona de recombinaci i
la diana de restricci determinar la longitud del bra curt i llarg de la figura resultant. En cada parella de
molcules recombinants, la zona de bescanvi s diferent, i aix s el que determina que la longitud dels braos
llargs i curts pugui ser diferent. Ara b, la suma daquests dos ha de ser constant, perqu sempre representa la
longitud total del plasmidi. A continuaci es mostra un dibuix esquemtic de tres casos on dos plasmidis estan
recombinant per regions diferents, i les figures en X que donarien quan lintermediari fos digerit amb lenzim de
restricci de diana a r.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 145
(B) No shaurien detectat figures

en X, perqu no hi haurien intermediaris de recombinaci:
recombinaci de DNA a E. coli.
recA s un enzim imprescindible per a la
(C) Com que el punt dintercanvi de DNA entre dos plasmidis intermediaris de recombinaci no tindria cap
restricci de seqncia en una i altra molcula, no hi hauria cap ra perqu els braos curts i llargs de la figura X
tinguessin la mateixa longitud.
En canvi, si la recombinaci fos de lloc especfic : totes les figures en X serien exactament iguals !!!! (Ja que en
aquest cas la distncia del punt de recombinaci i la diana de restricci seria sempre la mateixa).
Les dianes Xi sn seqncies especfiques de DNA que estimulen la recombinaci homloga a E.coli mitjanant
l'enzim RecBCD. Ponticelli et.al. volien estudiar la interacci entre l'enzim i les dianes i per a aix disposaven de
protena RecBCD purificada i d'un DNA dplex lineal que contenia una diana Xi:
400 nucletids
100 nucletids
5'
3'
GCTGGTGG
CGACCACC
ESQUERRE
diana Xi
3'
5'
DRET
En primer lloc es van preparar quatre mostres diferents del DNA. A cadascuna d'elles hi havia un extrem d'una
de les cadenes marcat, aix:
mostra n 1 ..............................marcatge noms a l'extrem 5' ESQ.
mostra n 2 ..............................
"
5' DR.
mostra n 3 ..............................
"
3' ESQ.
mostra n 4 ..............................
"
3' DR.
A continuaci van incubar cada mostra amb l'enzim RecBCD, i tamb van deixar una 5 mostra (igual a la 1) en
incubaci sense enzim (control negatiu).
La reacci es va aturar quan sestimava que RecBCD havia arribat a Xi i les mostres es van bullir durant cinc
minuts per tal de desnaturalitzar el DNA. Tamb en aquest punt es va afegir un control on part de la mostra n 4
no es va bullir.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 146
Les cadenes senzilles resultants es van separar en una electroforesi en gel de poliacrilamida i el gel es va exposar
directament a un film de raigs X. Aquest s el resultat que van obtenir:
A) Els autors van concloure que RecBCD talla el DNA per la diana Xi. Per qu? En quina part del resultat es
van fixar?
B) Creieu que aquests resultats indiquen que es talla una cadena del dplex o les dues? Si creieu que s
una, quina d'elles s? Per qu?
C) Aquests resultats tamb mostren que RecBCD t una activitat helicasa responsable de separar les cadenes d'un
dplex. En quins carrils es troba aquesta evidncia?
SOLUCI:
Per respondre les tres preguntes de lenunciat, s convenient reproduir primer qu ha passat en cada una de les condicions
experimentals. Fixeu-vos que noms ens implica el que succeix fins que RecBCD reconeix Xi, i shi atura momentniament.
Primerament representarem esquemticament les 4 molcules, marcades en els 4 possibles extrems:
DNA n1:
DNA n2:
DNA n3:
DNA n4:
Qu ha passat en cada reacci? Cal tenir en compte tamb que la imatge s duna autoradiografia, i per tant els segments
que es veuen han dincloure marcatge!
-En el carril 1: s un control amb el DNA-1 on no shi ha afegit enzim, i desprs shan separat les cadenes de DNA per
desnaturalitzaci trmica: veiem doncs la cadena superior, sencera, daquest DNA:
500 nt
-En el carril 2: s el DNA-1 on sha deixat actuar recBCD fins a la diana Xi, i desprs dhan separat les cadenes de DNA per
desnaturalitzaci trmica: veiem un segment de 400 pb, en lloc del de 500 pb anterior:
400 nt
Xi 3
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 147
Sha dinterpretar que lacci de RecBCD ha eliminat la resta de 100 nt, i per tant ha dhaver comenat a actuar per lextrem
3 de la cadena que inclou el senyal Xi (recordeu que la seqncia Xi no est en les dues cadenes de DNA, noms en una!).
-En el carril 3: Evidentment encara que lacci de lagregat enzimtic RecBCD ha estat la mateixa, en el DNA-2 no visualitzem
la cadena superior, sin la inferior (s la marcada) desprs de la desnaturalitzaci. El resultat ens diu que aquesta cadena
queda intacta (500 nt) desprs de lacci de RecBCD. Conclusi: els enzims no actuen sobre la cadena que no inclou el
senyal Xi.
-En el carril 4: s el mateix cas que el carril 3, marcatge i visualitzaci de la cadena inferior, que resta intacta, encara que en
aquest cas la cadena estigui marcada en el seu altre extrem.
-En el carril 5: s un carril molt informatiu: noms veiem una banda tnue de 100 nt. Dacord amb el que hem raonat per al
carril 1, lextrem que inclou el marcatge en aquest DNA ha estat objecte de degradaci per RecBCD, que entra
precisament per lextrem amb marcatge (3). Per cal recordar que aquest sistema enzimtic no s una exonucleasa que
actui nt a nt: necessita un extrem lliure per entrar, per tallar a latzar a una certa distncia daquest extrem. Per tant no
ens ha destranyar que en algunes molcules aquest tall shagi produt prop de la diana Xi, la qual cosa produeix uns
segments de 100 nt, sencers, que conserven el marcatge i es veuen. Els segments ms petits formarien un smear en el
gel i lautoradiografia que ja no s detectable.
-En el carril 6, es reprodueixen les condicions del 5 per sense desnaturalitzar el DNA per calor: el resultat s el mateix!
Aquest fet significa que lacci de RecBCD ha de desnaturalitzar per si mateixa el DNA: sin el segment tallat restaria unit a
laltra cadena de DNA per complementeritat i veurem un segment gran i no una lleu banda a 100 nt: conclusi RecBCD
inclou una activitat helicasa.
Per tant, les respostes concretes a les preguntes del problema sn:
A) Es pot concloure que RecBCD talla per Xi a partir dels resultats dels carrils 2 i 5.
B) Noms es talla la cadena que inclou Xi, perqu laltra sempre resta intacta (carrils 3 i 4)
C) Tal com sha raonat, aquesta evidncia la dna el resultat en el carril 6, en comparaci amb el
5.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 148
TEMA 15: RECOMBINACIN DE SITIO ESPECFICO.

Suceso de recombinacin independiente de RecA, consideramos
dos secuencias de nt de dsDNA. Se les llama cajas de
homologa: son secuencias homlogas pero NO se da
recombinacin homloga (no RecA porque la secuencia es
demasiado corta, y es independiente de la replicacin).
Pueden estar en el mismo dsDNA o en distintos dsDNA. Son
pequeas secuencias de unos 10-15 nt cada una, por tener
las mismas bases: pueden recombinar. Para que recombinen,
han de superponerse una a la otra y el sentido de las
secuencias ha de ser igual. La orientacin se indica con
flechas.
Cuando recombinan, un trozo de la caja de homologa queda

en un dsDNA y el otro trozo se va al otro dsDNA. As,
despus de recombinar, cada caja de homologa tiene
aproximadamente la mitad de bases suya original y la otra
mitad, de la otra caja. Despus de recombinar siguen
estando en la misma orientacin.
Si las 2 cajas de homologa estn sobre un mismo DNA, se
trata de recombinacin intramolecular. Pueden estar:
- Misma
orientacin
=
repeticin
directa

al
recombinar se escinde el fragmento intermedio.
Se dobla el DNA.
Queda una caja de
Homologa en cada
dsDNA.
- Orientacin opuesta = repeticin invertida al
recombinar se invierte el fragmento intermedio.
Quedan las dos cajas
sobre el dsDNA y en
la misma orientacin.
Los enzimas que actan son Recombinasas (recA tambin era

una recombinasa). Son:
- Recombinacin intramolecular: Si estn en repeticin
invertida, acta la Invertasa (Inv). Si estn en
repeticin directa, puede actuar la Escisionasa (Xis,
no corta, es estructural) o la Resolvasa (Res, si es
un intermediario que requiere resolucin, slo en los
transposones).
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Carlos F.R.
Pgina 149
- Recombinacin intermolecular: lo cataliza la Integrasa

(Int, fusiona dos molculas de dsDNA diferentes, cada
una de las cuales tiene una caja de homologa).
Caso1: Repeticin Directa: El fago .
Hace recombinaciones de sitio especfico para integrarse y
escindirse del genoma del husped (ver Tema 2).
Leyenda: att (attachment=sujecin)
P= phage
Son las cajas de homologa.
B= bacteria
El DNA libre del fago se integra,
L= left
y el virus integrado se escinde.
R= right
Integracin: Es una recombinacin de sitio especfico
intermolecular. Lo protagoniza la Int de (la codifica
l). Cuando hace el ciclo lisognico, siempre se integra
en el mismo sitio del cromosoma de E.Coli: entre los
Operones Gal y Bio. La escisin permitir el paso de
lisogenia a lisis. En ambos casos, tanto en integracin
como en escisin, quien acta es la Int. La Xis es
estructural, y a elevadas [ ] bloquea a la Int.
Composicin de las secuencias:
La reaccin es dirigida por el fago, as que la secuencia

attP del fago es la ms larga siempre (porque ella lo
dirige). Las cajas de homologa son el core O, de 15pb
siempre, han de ser iguales en virus y bacteria para que se
integre y encontrarse en repeticin directa.
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Carlos F.R.
Pgina 150
La Int cataliza la integracin, la codifica . Tambin es

necesaria la protena IHF (integration Host Factor) que
viene de E.Coli, la cual dobla el DNA y permite que entren
las otras.
La Int de es muy parecida a las Res de los transposones,
que tambin hace Recombinacin de Sitio Especfico, pero
stas
ltimas
actan
resolviendo
intermediarios
de
transposicin. Caractersticas diferenciales de la Int:
- El AA activo es una Tyr.
- Se requieren 4 Int que hacen 4 cortes secuenciales (2
cortes que cruzan dos cadenas, otros 2 cortes para las
otras dos cadenas).
- Dejan un 5OH y un 3P que se une al -OH de la Tyr.
La formacin del Intasoma es el proceso en el que se
organizan en el espacio alinendose en repeticin directa
las dianas attP y attB juntamente con 4 molculas de Int y
una de IHF, para recombinar e integrarse:
- Primero se forma el core proteico con 4 Int + 1 IHF.
- El core proteico se une a attP enrollndolo.
- ste complejo se une a attB.
El sitio attP tiene (no se indicaba arriba):
Detalle del proceso molecular de integracin:

- Se unen 2 Int al attP y 2 Int al attB.
- Corta, en el dsDNA de attP, dejando un Nick en la
cadena de arriba. A la vez, corta en el dsDNA de attB
dejando un Nick en la cadena de abajo. Son los cortes
secuenciales. Ha hecho 2.
- Los extremos que deja son 3P y 5OH. Su AA activo,
una Tyr, se une por su grupo OH al 3P.
- As se mueve del 3P de arriba al 5OH de abajo
formando un entrecruzamiento. Lo mismo para el otro
extremo libre que vendr de abajo a arriba. No
depende de ATP.
- Ahora, hace lo mismo con las otras dos cadenas que an
no haba cortado.
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Carlos F.R.
Pgina 151
En el proceso se llega a formar una verdadera cruz de

Holliday. Son reversibles.
Escisin: Se trata de otra recombinacin de sitio

especfico, pero es intramolecular. Requiere la Int
(siempre corta) y la Xis (estructural). IHF podra unirse a
alguna diana del att correspondiente, pero NUNCA interviene
en la reaccin. Requiere que el dsDNA de E.Coli que tena
las secuencias en repeticin directa se doble (ver esquema
pgina siguiente).
Sentido: Si Xis no estuviera, sera un bucle constante de
integracin escicin, no fucionara nada. Xis lo regula.
IHF puede unirse a una caja durante la escisin, pero nunca
acta, gracias a que la Xis lo impide.
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Carlos F.R.
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ESCISIN.
Entran Int y Xis. Puede entrar
IHF pero NUNCA actuar.
Integracin
Entran Int e IHF. La Xis inhibe
a la Int
Caso2: Repeticin Invertida: Salmonella.

La Salmonella tiene flagelina en el flagelo, una protena
muy antignica que desencadena una respuesta inmune
intensa. Pero si alguna sobrevive a eso, se multiplica y su
flagelina ya no es reconocida por los mismos anticuerpos
originales. Sucede porque pueden codificarla diferentes
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Carlos F.R.
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genes. Puede venir del gen H1 H2. Slo hace falta uno de
los dos para que haya flagelina.
En principio, se expresan los dos Promotores a la vez. Hay

H1, H2 y H1R. Pero sta situacin acaba inmediatamente,
porque H1R es represor del Promotor de H1. As no hay H1,
hay H2.
Si queremos la H1, tenemos que transcribir el gen HIN
(activacinestrs? ). HIN codifica para una recombinasa
llamada Invertasa (Inv).
Inv reconoce a las secuencias HIX-L y HIX-R, que estn en
repeticin invertida. Las pone cara a cara, haciendo que en
el DNA se forme una protuberancia.
Cuando se han dado la vuelta por la inversin, el Promotor

de H2 queda mirando hacia fuera y no se puede transcribir
ni H2 ni el represor H1R.
As, sin el represor y gracias a la Inv, se puede expresar

la nueva flagelina H1. Se trata de una Recombinacin de
Sitio
Especfico
Intramolecular
con
secuencias
de
repeticin Invertida.
El gen de la Inv tambin se da la vuelta porque queda entre
las secuencias invertidas (no se ve en el dibujo con fondo
negro) pero no le afecta.
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TEMA 16: TRANSPOSICIN PROCARIOTA.

Un Transposn (=Tn) es un fragmento de material gentico
que se mueve en el citoplasma de la clula, sin ningn tipo
de restriccin. Se encontraron en maz. Pueden moverse
gracias a la Transposasa (Tnp=Tra). Los transposones de
Procariotas consideramos que todos son de DNA. Los
transposones Eucariotas pueden ser de DNA de RNA (ver
Temas 17 y 19).
Una de las cosas ms importantes en los transposones son
las secuencias de bases de los extremos. Si hay mutaciones
en ellas, no pueden transponerse y son defectivos. La
mayora lo son, pero consideremos que no, que funcionan
bien porque tienen bien las secuencias de los extremos.
En Procariotas
(todos DNA)
Elemento IS
(exclusivo)
Elemento IS estricto
-Slo
-En transposones Compuestos
Mdulo IS. Nunca solo, siempre en los Complejos.

Transposones
Compuestos
-Tn5
-Tn10
Complejos Tn3
Los elementos IS. Slo en Procariotas.

- Elemento IS estricto: Es lo ms simple que transpone.
Tiene lo esencial para ello: el gen de la transposasa
flanqueado por 2 secuencias Invertidas y Repetidas
(IRS = IR = ITR).
Se
puede
encontrar
slo
(raro,
flanqueado
por
secuencias DR en repeticin directa que no se pintan
aqu) o formando parte de los extremos de un
transposn compuesto (por un lado tendr la DR y por
el otro, la secuencia del Compuesto).
- Mdulo IS: No tiene vida propia, nunca est slo,

siempre forma parte de los transposones complejos.
Simplemente es un elemento IS con ms cosas aparte de
la Transposasa, con sus secuencias IR (IRS = ITR) que,
a su vez, tienen en sus extremos ms exteriores
secuencias en repeticin directa (DR = DRS) SIEMPRE.
stas DR son las secuencias del husped (escojida al
azar) que se han duplicado, dentro de las cuales se
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 155
inserta el transposn. Se transpone (=mueve) de manera

diferente al IS estricto.
Si encontramos
gentico.
sto
en
un
genoma,
es
un
fsil
El gen de la Tnp codifica para la Transposasa, una

endonucleasa. Es un heterodmero formado por una subunidad
de unin al DNA y una subunidad cataltica que corta
(tanto en Procariotas como en Eucariotas!). Corta a ambos
lados del transposn (entre la IRS y la DR) y lo hace
saltar del lugar donde est. Le ha dejado extremos romos.
Despus, corta al azar una secuencia en el genoma del
husped, dejando unos extremos protuberantes. Dentro se
pone el transposn, unido nicamente por los enlaces
fosfodister (se basan en ataques nucleoflicos)a esos
extremos protuberantes del genoma. As quedan gaps a
ambos lados del transposn con ssDNA.
Viene la DNA polimerasa Procariota y los rellena los dos en

53. Con ello, se duplica la diana del husped.
As se forman las secuencias en repeticin directa que

flanquean a todos los transposones. sto corresponde a la
transposicin no-replicativa, una de las 3 maneras que
tienen los transposones de transponer. La diana se duplica
siempre, se mueva como se mueva.
La Transposasa viene codificada por el propio transposn.
Hay varios tipos de elementos IS, y cada tipo de IS
codifica para una transposasa, la cual reconoce secuencias
en el husped de una determinada longitud pero de
composicin de nt aleatoria (se dice por ello que corta al
azar en cuanto a secuencia, pero en cuanto a longitud, cada
tipo de transposasa corta secuencias de una longitud
deterinada).
La frecuencia de transposicin es de 10-3 10-4 divisiones.
Se cree que cada IS puede tener hasta 10 copias por clula.
Ya que se insertan al azar, 10-5 10-7 causa mutacin
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Carlos F.R.
Pgina 156
porque cae dentro de un gen o una regin reguladora. La

transposicin est controlada por el propio transposn, ya
que si transpone y cae donde no toca, mata al husped el
transposn se comporta como un parsito.
Transposones Compuestos. Estudiaremos a Tn5 y Tn10. Son
regiones grandes de DNA que se mueven como un solo
bloque(si hubiera 1 mutacin en 1 IRS del IS, se movera
slo el otro IS). Siempre tiene 2 elementos IS que
flanquean un gen de, por ejemplo, resistencia a un
antibitico.
La orientacin de los promotores de la transposasa en el IS

puede ser igual en los 2 o diferente (se dice que estan en
repeticin directa o invertida uno respecto al otro segn
est el promotor de la transposasa). Puede haber uno de los
dos IS que no codifique para una transposasa funcional, ya
que si basta una sola transposasa, es redundante que haya
los dos IS haciendo transposasa. De hecho, lo ms frecuente
es que un IS haga transposasa y el otro haga una
transposasa no funcional o no haga transposasa (hay algn
transposn compuesto que tiene sus dos IS que hacen
tranposasa funcional: Tn9).
Siempre tienen la DR del husped flanquendolos, porque se
mueven por transposicin no replicativa.
Transposones Complejos. Son la familia de
ejemplo, Tn3. Su principal diferencia es
secuencia IR (=ITR) en los extremos en lugar
IS. La transposasa la codifican en la regin
a otras cosas. Estructura de Tn3:
los TnA, por

que tienen la
de un elemento
central, junto
Regulacin de la transposicin. El transposn se comporta

como un parsito intracelular, que si mata al husped,
muere l tambin. La transposicin es una herramienta de
mutagnesis elevada, ya que puede ir a parar a secuencias
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Carlos F.R.
Pgina 157
reguladoras o codificantes. Por ello puede silenciar genes,

recombinar, hacer deleciones A pesar de ello, estn
seleccionados a favor porque incrementan la variabilidad, y
han ido evolucionando disminuyendo el nmero de copias y la
tasa de transposicin.
- Tn5. Es un transposn compuesto.
IS50-L es no funcional porque tiene 1nt diferente en

el gen de la transposasa. ste nico nt de diferencia
causa un codn STOP prematuro de su transposasa. Pero
tambin, ese nt determina que se forme el promotor del
gen de resistencia al antibitico (kanamicina
neomicina). Si no hubiera esa mutacin, no habra
resistencia a antibitico y se formaran dos mRNA
complementarios (por venir de promotores en direccin
opuesta) que hibridaran y formaran un dsRNA que no
se traduceno habra transposasa.
IS50-R es funcional. Su mRNA tiene 2 AUG (ORF, ver
Tema 7): uno que codifica para la transposasa, es el
primer AUG, hace protena larga. El segundo AUG est
ms adentro y codifica protena corta represora de la
transposasa. ste represor, se cree que puede unirse
directamente a la transposasa funcional y bloquear su
dominio de unin al DNA, o bien unirse a la diana de
la transposasa en el transposn y bloquear que entre,
entorpecindola.
- Tn10: Transposn compuesto tambin.
Regula su transposicin mediante 3 mecanismos de

control. Consideramos que IS10L no es funcional.
1) mRNA: Dentro de IS10R hay 2 promotores que hacen
dos
mRNA
en
direcciones
opuestas,
solapando
parcialmente.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 158
El promotor in (Pin) apunta hacia dentro, codifica

para una protena larga, la transposasa. El promotor
out (Pout) apunta hacia fuera, codifica para un mRNA
corto no codificante. Resulta que los 36 primeros nt
de ambos mRNA son complementarios, se pueden hibridar
los dos mRNA por el extremo 5. As, no se traduce la
transposasa. El mRNA de Pout tiene 100 veces ms
afinidad por el mRNA de Pin que el ribosoma. Tambin
tiene ms afinidad por el mRNA de Pin que la RNA
polimerasa por Pin. Adems es ms estable.
Si la [ ] de mRNA de Pout es 5 veces mayor que la de
mRNA de Pin, entonces se unen. Si es igual o menor a 5
veces, no se unen porque est ms disuelto en el
citosol, y hay transposasa porque no se bloquea el
mRNA de Pin.
2) La transposasa: Supongamos que la [ ] de mRNA de
Pout es menor a 5, entonces se traduce el mRNA de Pin
y hay transposasa. La transposasa Procariota acta en
CIS: slo corta a su propio transposn Tn10. No sucede
as en Eucariotas. Ello determina que se incremente de
manera lineal la transposicin (1 transposn 1
transposasa, 2 transposones 2 transposasas, etc),
si no fuera as, todos cortaran a todos y sera un
incremento exponencial de tranposicin (malo!).
3) La metilacin: Un tranposn slo puede transponer
si est hemimetilado o no metilado. Ello slo sucede
justo cuando ha acabado la replicacin, que hay DNA
hemimetilado. Es entonces que la transposasa puede
actuar y transponer, no en otro momento. Sentido: DNA
hemimetiladoDNA
nuevoclula
jovencitosol
con
pocos
radicales
perjudiciales
y
toxinas,
pocas
nucleasas, puede enfrentarse mejor a los daos que
podra hacer el transposnbuen momento para saltar
y transponer (es como un parsito).
Tipos de transposicin:
- Transposicin no replicativa: el transposn se mueve, no
se copia. Lo hacen IS estrictor, Tn compuestos. Es lo
explicado al principio. No sabemos qu pasa con el DNA
desde el cual salta el transposn: reparadocmo?
letal?. Implica forzosamente la duplicacin de la diana
del husped.
- Transposicin replicativa: Se transpone a la vez que se
duplica el transposn. Queda en el sitio original y en
la diana. Lo hacen los transposones complejos.
- Transposicin conservativa: Se transpone durante la
replicacin pero sin duplicarse. Se reparan siempre. Es
propia de Eucariotas (ver Tema 17).
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Pgina 159
La transposicin Replicativa de Tn3. Es un transposn

complejo. Necesita la transposasa y la resolvasa, ya que se
debe resolver un intermediario hay una recombinacin de
sitio especfico.
La regin de resolucin tiene 3 subregiones. Una de ellas

es una caja de homologa, concretamente, la subregin 1. Es
la diana de la Resolvasa (TnpR), para resolver el
intermediario de la transposicin.
La transposicin replicativa se lleva a cabo por el modelo
de Shappiro. Se parte de un DNA con Tn3 (el donador) que
suele estar en un plasmidio (o no), y de un DNA sin Tn3 (el
receptor) que suele ser el cromosoma bacteriano (o no).
El Tn3 tambin est flanqueado por las secuencias DR del
sitio receptor. Recordar que es un dsDNA. El modelo de
Shappiro es as (ver pgina siguiente):
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Carlos F.R.
Pgina 160
+
La transposasa corta en el donador haciendo
nicks (entre DR e ITR), dejando el Tn3 con 3 libre
(sin separar las dos cadenas),, en el receptor
corta dejando 5 protuberantes (de ssDNA).
+
Tn3 es de dsDNA. Se separan sus dos cadenas. Cada una de las dos cadenas que
forman Tn3 tiene un extremo que finaliza con ITR y el 3 (es como si fuera un extremo
protuberante 3). As, siendo ssDNA separado, se va al receptor que est cortado y los
3 libres del Tn3 se unen a los 5 protuberantes del receptor por un enlace
fosfodister ( en realidad es un ataque nucleoflico,, no se aparea ninguna base).
As, se unen el 3 del ssDNA separado de Tn3 con el 5 del ssDNA protuberante
de la diana del receptor.
Ahora acta la DNA Polimerasa Procariota, la cual aprovecha los extremos 3
libres que quedaban en el cromosoma bacteriano, y polimerizando en 53
como indican las flechas discontinuas,
sintetiza arriba un DNA
complementario a la diana del receptor y al transposn; y abajo tambin: un
DNA complementario a la diana del receptor y al transposn. As se duplica la
diana del receptor y se replica el transposn.
Finalmente, la ligasa une los nicks que quedan. Llegados aqu, sta figura en forma de 8 es el COINTEGRANTE. Es un
intermediario, no producto final, y requiere resolucin. Recordemos que dentro del Tn3 hay la regin de resolucin, cuya
subregin 1 es diana de la Resolvasa. Ahora est duplicado el transposn, por tanto ya hay dos subregiones 1 (cajas de
homologa).
Para que acte la Resolvasa , se forma

una estructura con 4 monmeros de
resolvasa unidos a las 2 subregiones 1.
Tambin puede unirse a las otras
regiones en forma de tetrmero, pero
slo corta en la 1.
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Carlos F.R.
Recombina en Res y se une la regin donadora con la

donadora, y la receptora con la receptora,
rompindose el cointegrante. Finalmente, quedan el
DNA donador con el transposn y sus secuencias DR
originales, y en el DNA receptor, est el transposn y
las secuencias DR suyas, las cortadas al principio.
El Tn3 final, en las 2 molculas, es hrido de cadena
(porque vienen de otro sitio, recombina) y 1/2 de
cadena quimera (1/2 nuevo sintetizado y 1/2 antiguo).
Pgina 161
En total, hay 12 monmeros de Res unidos a la regin de

resolucin (4 en cada una de las 3 subregiones). Slo
cortan los de la subregin 1. Los otros 8 hacen funcin
estructural.
Los cortes que hace la Res para resolver el cointegrante:
- Hay un monmero de Res en cada una de las 4 cadenas de
DNA. Como son dos dsDNA, son 4 cadenas.
- Los cortes que hace la resolvasa son concertados: 4

cortes a la vez, en cada una de las cadenas de DNA.
- Deja extremos normales, 5P y 3OH.
- La Serina es el AA activo de la Res, y se une por su
grupo OH al 5P momentneamente.
- Giran 180 arrastrando lo que llevan unido, hacia la
molcula de DNA opuesta. Es el entrecruzamiento. R2 se
cambia con R4 y R1 con R3
- Cuando se han intercambiado las cadenas, se suelta el
5P del OH de la Ser de la Res.
- La ligasa une los 5P con los 3OH de las molculas y
queda separado.
Las recombinaciones de sitio especfico:
Integrasa de
1. Cortes
secuenciales 2 a 2
2. 3P-Int ,, 5OH
3. AA activo: Tyr
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Carlos F.R.
Resolvasa
Cortes concertados
4 a la vez
3OH ,, 5P-Res
AA activo: Ser
Pgina 162
PROBLEMA TRANSPOSICI PROCARIOTA 1

Estem estudiant el transpos Tn10 i volem determinar si la
seva transposici s replicativa o directa. Hem pensat una estratgia
basada en la diferncia fonamental entre aquests dos mecanismes: si la
transposici s directa, ambdues cadenes del Tn10 es mouran. En canvi,
si la transposici s replicativa, noms una de les cadenes es mour:
Per poder diferenciar les dues cadenes, barrejarem i hibridarem

cadenes provinents de dos Tn10s diferents.
Per introduir aquests Tn10s heterodplex dins cl.lules hoste,
utilitzarem el fag lambda com a vector. Per no ser un fag lambda
qualsevol: ens assegurarem que porti mutacions que
li impedeixin
replicar-se o integrar-se.
Aix doncs, partim de dos tipus diferents de DNAs de lambda; cadascun
dells porta una inserci dun Tn10 en un mateix punt del mapa, per
els Tn10s sn lleugerament diferents entre ells. Ambds contenen el
gen per la resistncia a la tetraciclina i el gen lacZ (codifica per a
la -galactosidasa) per en un dells el gen lacZ est inactivat per
una mutaci. Aquesta diferncia ens permetr distingir fcilment
ambds Tn10s: les colnies que portin el Tn10 lacZ+ seran blaves (si
en el medi hi ha X-gal), mentre que les que portin el Tn10 lacZ- seran
blanques.
Agafem parts iguals dels dos tipus de DNA, les desnaturalitzem i les
barregem en condicions dhibridaci. Aix produir una barreja a parts
iguals dhomodplexs i heterodplexs tal i com sil.lustra a la
figura:
A continuaci empaquetem els

DNAs en cpsides, infectem cl.lules
hoste lacZ- i sembrem les bactries
infectades en plaques de Petri que
contenen agar amb tetraciclina i Xgal.
Un
cop
introdut
dins
la
bactria, el transpos es mour (a
molt baixa freqncia)i sintegrar
en el seu genoma, des don coferir
resistncia
a
la
tetraciclina.
Aquella bactria que adquireixi un
Tn10 sobreviur a les condicions
selectives de la placa i formar una
colnia. Quan haurem comptat un nombre elevat daquestes colnies,
observarem que un 25% sn blanques, un 25% sn blaves, i el 50%
restant sn barrejades, amb un sector blau i sector blanc.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 163
a)
Expliqueu lorigen de cadascun dels tipus de colnia i discutiu si els

resultats afavoreixen el model de transposici replicativa o el de
transposici no replicativa de Tn10.
b)
En el nostre experiment haurem utilitzat una soca hosta que s
incapa de reparar desaparellaments en el DNA. Que ens passaria si
utilitzessim una soca hoste que els pogus reparar?
c)
La integraci del cromosoma de lambda en el dE.coli s molt ms
freqent
que
la
transposici.
Quins
resultats
obtindrem
si
utilitzessim un mutant del fag lambda que no es pogus replicar per
si integrar?
Soluci:
a) Base terica: en un model de transposici no-replicativa la mateixa
cpia de DNA sescindeix dall on s i sintegra en la nova
localitzaci; i en un model de transposici replicativa, es fa un
duplicat del transpos, un queda en lantiga localitzaci i laltre
sintegra en la nova.
Les construccions que tenim sn uns fags que com a tals no es poden
replicar, ni integrar en el genoma dE.coli. De fet lnica funci de
que conserven s el poder infectiu:
+
Lac Z
tet
codifica
per
resistncia
tetraciclina i -galactosidasa
(donar colnies blaves)
Lac Z
tet
codifica
per
resistncia
a
tetraciclina
i
-galactosidasa
inactiva
(donar colnies blanques)
Quan es desnaturalitzen els DNAs i es deixa que tornin a hibridar les

cadenes, es formes 25% de cadascun dels homodplexs anteriors i 50%
dheterodplexs:
+
r
tet
Lac Z
tet
Lac Z
Analitzarem qu passaria amb cadascuna de les construccions una vegada

es trobessin dins duna cllula dE.coli per infecci dun fag que
sha empaquetat in vitro. Detactem les cllules on hi ha hagut
transposici perqu adquireixen resistncia a tetraciclina: com que el
DNA del fag no es pot replicar ni integrar com a tal DNA, lnica
possibilitat que aquest DNA shagi perpetuat i expressat (donant
cllules resistents a tetraciclina) s que el Tn10 hagi actuat com un
transpos, i des de la cpia que ha entrat en el DNA injectat pel
fag shagi transposat al cromosoma dE.coli. Els processos de
transposici tenen una freqncia molt baixa i si tenen lloc, la
probabilitat que sen doni un altre en el lapse de temps en que
transcorre lexperiment s practicament nulla.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 164
Els bacteris on en el seu cromosoma shagi transposat un transpos amb

un LacZ +/+ donaran colnies blaves, i aquells on shagi transposat un
transpos amb un LacZ -/-, colnies blanques. AIx coincideix amb les
25% blaves i 25% blanques que es detecten (que provenen del 25% de DNA
+/+ i el 25% de DNA -/-, respectivament).
Les colnies informatives sn les que tenen un sector blau i un de
blanc, que lgicament han de provenir del DNA heterodplex lacZ+/- o /+. Qu passa quan aquest DNA ha entrat a E.coli
i sha de
transposar? Aix ser diferent si assumim transposici no-replicativa
o replicativa:
Segons transposici no-replicativa:
En una cllula que rebi la contrucci de ,
el DNA de Tn10 tal qual sescindir i anir a
integrar-se en el cromosoma bacteri , on es
perpetuar com una regi ms del genoma.
Tn10
+
r
Lac Z
tet
Transposici
La transposici passar en la 1 cllula

infectada pel fag, i
quan aquesta hagi de duplicar el seu DNA i
dividir-se?
E.coli
+
r
tet
Lac Z
Cada cadena servir de motlle per a una

complementria, de
manera que un dplex fill portar la informaci per a
LacZ+/+ i laltre dplex per a LacZ-/-. Cada dplex
anir a un bacteri fill daquesta bipartici, de manera que
desprs totes les cllules descendents duna rebran la informaci per
LacZ+/+ i de laltra per LacZ-/-. Pero totes aquestes cl.lules
descendents de la primera, resten juntes en lespai (en lagar en
aquest
cas)
donant
lloc
a
la
massa
que
forma
la
colnia
(desenvolupament clonal). Per tant la colnia que es formaria seria
meitat blava i meitat blanca, que s el resultat que precisament
sobserva.
Fins
aqu,
els
resultats
semblen
recolzar
doncs
transposici no replicativa.
Segons transposici replicativa:
Si la transposici fora replicativa, el DNA del transpos es
replicaria abans que la nova cpia sintegrs en el genoma bacteri.
De la molcula inicial de transpos, la replicaci crearia dos
homodplexs, un LacZ+/+ i un LacZ-/-. Un dells (a latzar),
sintegraria en la nova localitzaci (cromosoma bacteri) i laltre
restaria en el DNA de , i es perdria perqu aquest no es pot
replicar. Per fos quina fos la cpia que sintegrs, aquesta sempre
seria un HOMOdplex. En el cas que fos +/+ es generaria una colnia
blava i en el cas que fos -/- una colnia blanca. Com que les dues
possibilitats sn iguals de probables, tindrem la meitat de les
colnies dun color i la meitat de laltre, pero mai colnies mixtes.
Les colnies mixtes noms es poden explicar si el DNA del transpos es
transposa COM A HETERODPLEX, i aix noms passa en el model NOREPLICATIU.
b) Una soca que pogus reparar els aparellaments erronis de DNA no

generaria mai colnies mixtes, perqu els heterodplexs es repararien
a LacZ+/+ o a LacZ-/- en la 1 cllula.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 165
E.coli
c) Els resultats (en quant a proporcions de tipus de colnies) serien

els mateixos, pero tindrem ms colnies en les plaques, perqu es
generarien ms cllules resistents a tetraciclina, que ara serien
resultat no noms de transposici del DNA inicialment introdut en la
cllula, sin tamb dintegraci de TOT el DNA com a tal fag
(recombinaci de lloc especfic).
Tn10
+
Lac Z
tet
Transposici
E.coli
+
r
tet
Integraci
E.coli
Lac Z
E.coli
+
r
tet
Lac Z
E.coli
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 166

Correia et al. (Gene 170 (1996):91-94) han publicat el treball "Cloning and characterization of an "?"
element present in the genome of Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869"
Brevibacterium lactofermentum (Bl) s'utilitza en la producci industrial d'aminocids. Per poder
facilitar els treballs de gentica molecular d'aquest organisme seria molt til disposar d'un transpos
propi. Els autors pretenen doncs analitzar clons del genoma de Bl i buscar algun tipus de transpos.
A partir d'una genoteca de Bl agafen clons a l'atzar i els utilitzen com sondes sobre la prpia
genoteca. Els dos primers clons donen pocs senyals positius, mentre que el tercer en dona molts
ms. Ells decideixen proseguir l'nlisi detallada d'aquest tercer clon.
1. Per qu? Perqu es comporta com una seqncia repetida en el genoma (els elements de
DNA mbil sempre estan en un nombre de cpies > 1 en el genoma), i els altres serien DNA
de cpia nica.
Desprs del clonatge i seqenciaci obtenen el que veus a la figura 1 (pgina segent).
Mira-la b i respon a les segents preguntes:
2. Qu representen les fletxes? Les IR (repeticions invertides) terminals (25 nt) prpies de
lelement.
3. Qu representen els troos subratllats? Les dianes dinserci (DNA receptor) duplicades: en
repetici directa.
4. Qu representa el requadre? El cod dinici de traducci (pauta de lectura), que

excepcionalment no s ATG (s GTG), com passa en alguns casos en els procariotes.
5. Qu representen els asteriscs? El cod stop de traducci o final de la pauta de lectura.
6. Com anomenaries la zona compresa entre el requadre i els asteriscs?

s una pauta de lectura oberta (ORF) o zona (potencialment) codificadora.
7. Amb aquestes dades, pots afirmar que s un gen? per qu?

Normalment es reserva el nom de gen per a les zones codificadores que sha demostrat
experimentalment que realment es transcriuen i es tradueixen, i el nom de ORF per a les
zones que compleixen tots els requisits terics per fer-ho, per encara no sen t cap prova.
8. Marca sobre la figura on comena i on acaba l'element.

Vegeu els lmits assenyalats en vermell: la DUPLICACI DIRECTA NO FORMA PART DE
LELEMENT!
9. En el ttol apareix aquest smbol "?" indicant que s'ha esborrat una paraula. Amb totes les dades
de que disposes, pots reposar la paraula esborrada?
(Com anomenaries aquest element?)
Segons totes les seves caracterstiques s un element IS (seqncia dinserci procariota).
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 168
A continuaci, els autors fan l'experiment que es mostra a la figura 2. A partir de tres soques
diferents de Bl (anomenades ATCC 13869, recA i R31) obtenen DNA, el digereixen amb
enzims de restricci, fan una electroforesi en gel d'agarosa, transfereixen el material a un filtre i
finalment, l'hibriden amb una sonda marcada que correspon a la seqncia de la figura 1.
Mira b la figura 2 i la seva llegenda i respon a les segents preguntes:
10. Com s'anomena aquest experiment? Southern
11. Per qu creus que han fet aquest experiment? Per veure el nombre de cpies de
lelement IS i el seu grau de mobilitat
12. Resumeix el resultat obtingut i digues qu s'en pot concoure. Fixeu-vos en els carrils 5 a
7. EcoRI no t diana dins de lelement (comproveu-ho en lesquema anterior de la
seqncia). Per tant una banda en el Southern es pot interpretar com una cpia de
lelement, i el fragment corresponent es generar per les dianes flanquejants en el punt
del genoma del bacteri on shagi insertat (a latzar). Per tant es conclou que el nombre de
cpies s moderat, i que hi ha discordncia de localitzaci entre diferents soques: per
tant s actiu pel que fa a la seva capacitat de moures.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 169

Un experiment realitzat al laboratori per avaluar els processos de recombinaci homloga,
recombinaci de lloc especfic i transposici ha donat uns resultats de difcil interpretaci. Te'ls
presentem per tal que els ajudis a trobar una explicaci que estigui d'acord amb els conceptes
vigents de recombinaci molecular. L'experiment ha consistit en transformar una soca d'E.coli
(kans, lacZ-) amb un fragment de DNA (F) que no presenta cap origen de replicaci i cont els
segents elements (veieu el dibuix):
a) una part del genoma de al qual s'han delecionat els gens de la cpside (la mida que queda
s de 28 kb).
b) el gen lacZ+, d'unes 2 kb de longitud
c) el transpos Tn5, de 5,8 kb de longitud (cont el gen kanr)
Respecte el genoma de la soca d'E.coli que s'ha fet servir dhoste se sap que cont una diana
de restricci EcoRI (E) i una altra XbaI (X) que flanquegen el locus attB. La distncia entre
aquestes dues dianes s de 3 kb. (Veieu el dibuix)
Desprs de transformar aquesta soca d'E.coli amb el fragment F circular sobre-enrotllat o b
lineal, es cultiven les colnies i s'analitza el genotip resultant. El Fragment F no cont cap diana
EcoRI ni XbaI
Genoma d'
E.coli
Fragment F
E
attB
3kb
Tn5
lacZ +
circular
lacZ -
- 28kb
Tn5- 5,8 kb
lacZ- 2kb
attP
lineal
attP
Tn5
lacZ +
1 (42). Anlisi de les cl.lules kanr.

La transformaci amb DNA circular sobreenrotllat produia cl.lules kanr lacZ+. El DNA
d'aquestes cl-lules es va digerir amb EcoRI i XbaI. Emprant com a sonda el DNA de Tn5 es va
fer una prova Southern. D'acord amb els teus coneixements esperaries que la major part
d'aquests cl-lules donessin:
a) una banda de 35,5 kb
b) cap banda
c) bandes de mida variable en cada colnia
d) una banda per colnia de 38,8 kb
Duna banda les cl.lules han estat seleccionades per kanr (Tn5) i
lacZ+, per tant han dhaver incorporat el fragment F sencer. En el cas
duna transfecci amb DNA sobreenrotllat el ms probable s que el
fragment F sencer shagi integrat per una recombinaci de lloc
especfic entre attP i attB .
No observem bandes de mida variable en cada colnia perqu aix
voldria dir que el fragment F shauria integrat per transposici
(recombinaci no homloga). La transposici explicaria la integraci
r
de Tn5 (i les cl.lules resultants serien kan i lacZ ), no la del
fragment F sencer.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 170
2 (43). Anlisi de les cl.lules kans.

Quan el fragment F estava en forma lineal, les colnies obtingudes desprs de la transformaci
eren kans. Algunes poques colnies, per, eren lacZ+ . Fent un experiment de Southern amb
la sonda de Tn5, les bandes esperades en aquestes cl.lules serien:
a) una banda de 35,8 kb
b) una banda de 38,8 kb
c) cap banda
d) una banda de 3 kb
En les cl.lules kans hem de descartar que shagi integrat Tn5 per
transposici. Tamb descartem la recombinaci de lloc especific perqu
el fragment transferit no s circular i sobreenrotllat (condici
indispensable perqu tingui lloc la integraci de ).
) Finalment lnic
que pot haver succet s una recombinaci homloga entre lnic
fragment que comparteixen F i el genoma dE.coli, lacZ. Per tant en la
prova Southern emprant com a sonda Tn5 no veurem cap banda.
3 (44). Canvi del patr Southern de les cl-lules kanr, lacZ+ de l'apartat 42.
A mesura que s'anaven cultivant les cl-lules kanr lacZ+ descrites en l'apartat 42, un petit
-3
nombre de colnies (aprox. 1 x 10 ) mostraven canvis de patr en el Southern desprs
d'algunes generacions per continuaven ssent kanr lacZ+. Emprant la sonda de Tn5
s'observen bandes de diferents mides. Si analitzem mitjanant Southern el DNA d'un d'aquests
clons la mida de les bandes que s'observar s:
a) una banda de 33,8 kb ms dbil i una banda de ms de 5,8 kb ms intensa
b) una banda de 38,8 kb ms intensa i una banda de ms de 5,8 kb ms dbil
c) una banda de 35,8 kb i una banda de 5,8 kb digual intensitat
d) una banda de 5,8 kb ms intensa i una banda de 2 kb ms dbil

Desprs de varies generacions en un petit nombre de colnies hi ha hagut una mobilitzaci de Tn5 per
transposici. Donat que la transposici est regulada i s poc freqent, la banda principal continuar
essent de 38,8 kb i apareixer una banda de ms de 5,8 kb ms dbil, la longitud exacta dependr de les
dianes EcoRI i XbaI que flanquejen els nous llocs dinserci.
4 (45). Les reordenacions genmiques descrites en les preguntes 42, 43, i 44 serien, respectivament:
a) integraci per recombinaci de lloc especfic, recombinaci homloga, transposici,
b) recombinaci homloga, integraci per recombinaci de lloc especfic, transposici,
c) escissi per recombinaci de lloc especfic, integraci per recombinaci de lloc especfic, transposici
d) integraci per recombinaci de lloc especfic, transposici, recombinaci homloga,
Com ha quedat clar en les respostes anteriors les reordenacions genmiques anteriors corresponen a la
integraci de F per la integrasa de lambda (recombinaci de lloc especfic), recombinaci homloga
entre els gens lacZ i a la integraci de Tn5 per transposici.
5 (46). Les activitats enzimqtiques ms importants involucrades en aquests processos, per ordre de les
reordenacions descrites
a) transposasa, resolvasa i RecA
b) RecA, transposasa i integrasa
c) transposasa, RecA i integrasa
d) integrasa, RecA i transposasa
La resposta correcta s: Integraci de lambda, integrasa; recombinaci homloga RecA i
SOLUCIONS: D , C, B, A, D
transposici, transposasa.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 171
Imagina't que ests treballant amb un transpos Tn3 (5kb) que has modificat mnimament en
el laboratori per fer-lo servir en el segent experiment, i que tens insertat en un plasmidi
bacteri de 8 kb. Aquest Tn3 inclou dues dianes de restricci per a l'enzim RI, separades 3 kb
entre si, mentre que en el plasmidi en qesti no n'hi ha cap (fig. 1). Tamb tens molcules del
plasmidi senseTn3.
Tn3
1 kb
3 kb
1 kb
RI RI
Figura 1
RV
1.-. En un tub d'assaig barreges molcules de plasmidi amb i sense Tn3, i un extracte proteic que cont tots els
elements necessaris perqu es produeixi transposici in vitro, de la mateixa manera que tindria lloc dintre
d'E.coli. Al cap de poc temps, extreus una mostra de DNA, on coexisteixen molcules de plasmidi inicials,
plasmidis receptors de Tn3 i molcules intermediries del procs de transposici. Suposa que els Tn3 que es
transposen ho fan sempre a un plasmidi receptor que no t cap Tn3.
Si fas una digesti amb RI, quines mides de fragments de DNA esperes trobar com a resultat?:
a) 1 kb, 3kb i 10 kb lineals i 8 kb circular
b) 3 kb, 10 kb i 20 kb lineals i 8 kb circular
c) 3 kb i 10 kb lineals i 8 kb circular
d) 3 kb, 10 kb i 20 kb lineals
Hem de recordar que el transpos Tn3 s un membre de la famlia de transposons TnA, que transposen
replicativament. Aix vol dir que en el procs de la transposici es generen molcules intermediries o
cointegrats, que suposen la fusi transitria del plasmidi donador i receptor amb els dos transposons Tn3.
Aquesta molcula ser resolta posteriorment per la resolvasa del propi transpos.
La resposta d) queda directament descartada, ja que els plasmidis receptors no tenen cap diana RI i, per tant,
queden com a molcules de 8 kb circulars. Daltra banda, els plasmidis inicials que continguin Tn3, es digeriran
per EcoRI, generant una banda interna a Tn3 de 3 kb i una banda lineal de la resta del plasmidi, que t 10 kb (8
kb + 1 kb + 1 kb, ssent aquests ltims la distncia de cada RI fins al final de Tn3). I els intermediaris de la
transposici, com que sn simtrics respecte a la colocaci de Tn3 i les dianes RI sn internes a Tn3, donaran
sempre la banda de 3 kb i la lineal de 10kb.
2.-. Consideres ara una diana de restricci per a un altre enzim, RV, situada en el plasmidi de la Fig.1 equidistant
a 4 kb de cada extrem de Tn3. Si fas una digesti doble RI+RV de les molcules de plasmidi que han rebut Tn3,
desprs de tot el procs, obtindrs fragments de:
a) 3 kb i 5 kb
b) 1 kb, 3 kb i 4 kb
c) un continu de segments des de 1 kb fins a un mxim de 9 kb, amb un predomini de segments de 3kb
d) un continu de segments des de molt curts fins a un mxim de 9 kb, tots en la mateixa abundncia relativa
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 172
Donat que es tracta duna doble digesti RI + RV, i que la banda interna de 3 kb deguda a la digesti de RI es
produir sempre que qui hagi un Tn3, aquesta banda hi ser sempre present, perqu estem coniderant noms
les molcules de plasmidi que han rebut Tn3.
Ara b, com que la transposici de Tn3 no t una diana preferent, sino que s atzarosa, a cada molcula de
plasmidi on shi integri, la posici del Tn3 ser diferent per a cada molcula i, per tant, tot i que en la molcula
inicial Tn3 era equidistant a la diana RV del plasmidi, ara a cada plasmidi que ha rebut un Tn3, la distncia de Tn3
a RV variar. Aix vol dir que tenim una barreja de molcules resultants, des daquelles en que Tn3 estar tocant
a la nica RV del plasmid fins aquelles en que estar tocant a laltre extrem.
En el cas ms extrem, en que la diana RV est tocant a Tn3 (sigui un extrem o laltre) ens generar tres bandes al
fer la doble digesti RI+RV, una banda d1 kb, la interna RI de 3 kb, i una de 9 kb. Des daquesta posici extrema,
qualsevol altra mida intermdia s possible, segons on hagi transposat Tn3. Donat el gran nombre de molcules
que estem analitzant, aix ho observarem com un continu de fragments de mida variable des de 1 kb fins a 9 kb
(amb un extrem RI i laltre RV), ms la banda predominant de 3 kb (RI).
3.- Tamb tens a la teva disposici una sonda de DNA marcada radioactivament que correspon a la regi res de
Tn3. Quins dels segments de DNA de l'apartat (1) detectaries en una prova Southern hibridada amb aquesta
sonda ?
a) 3 kb
b) 3 kb i 8 kb (circular)
c) 3 kb i 10 kb
d) 1 kb i 3 kb
RESPOSTA: La resposta correcta s la a).
La regi res (la sonda) es troba aproximadament al mig del transpos Tn3 i, per tant, segons la Figura 1, dins del
fragment interna de 3 kb generat per la digesti RI. Cap de les altres bandes indicades contenen seqncies res i
no poden ser reconegudes per la sonda.
4.- Quins dels segents enzims que sn presents a l'extracte proteic no han intervingut en la reacci de
transposici in vitro:
a) DNA polimerasa
b) RNA polimerasa
c) Transposasa
d) Resolvasa
RESPOSTA: La resposta correcta s la b).
El transpos Tn3 s un membre de la famlia de transposons TnA, que transposen replicativament. Aix, doncs,
cont els gens de la transposasa i resolvasa que necessita per a transposar i resoldre la molcula intermediria i
depen de la maquinria replicativa de la cl.lula hoste per a produir dues cpies del transpos. Per tant, els
enzims DNA polimerasa, transposasa i resolvasa estan directament implicats en el procs de transposici de Tn3.
5.- Imagina't que repeteixes l'experiment inicial de transposici in vitro amb uns plasmidis que contenen un Tn3
que inclou en uns nucletids d'una de les seves cadenes de DNA un compost qumic fluorescent amb la segent
caracterstica de no interferir en cap procs molecular d'aquest DNA i poder-ne detectar fcilment la seva
localitzaci en les molcules finals de l'experiment. La fig. 2 t'assenyala com estaven colocats aquests
"marcadors". On esperes detectar-los al final de l'experiment ?
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 173
5' A
3'
a)
A
3'
5'
Tn3
b)
A
c)
A
A
d)
A
+
A
RESPOSTA: La resposta correcta s la d). Ja hem comentat que Tn3 s un transpos replicatiu i que
necessita, segons el model de Shapiro:
lactivitat de la transposasa primer per tallar el DNA receptor i el propi,
lactivitat de la DNA polimerasa de lhoste per replicar, ja que fa servir les dues cadenes del transpos original
com a motlle. Enlloc sens indica que els compostos fluorescents poden ser afegits a les noves molcules de
DNA, i molt menys en direccions oposades del DNA, per tant la resposta a) no s correcte. Daltre banda, el
resultat de la replicaci s una molcula intermediria o cointegrat amb dos transposons Tn3 (la molcula
intermediria, doncs, seria similar a la dibuixada a la resposta b). Per com que a lenunciat ens diu que la
transposici ha finalitzat, tamb ha actuat, llavors hem de considerar a
la resolvasa, que efectua una recombinaci de lloc especfic a les dianes res, que es troben aproximadament al
mig del transpos Tn3. El producte del tall i lempalmament daquests dos transposons Tn3 desprs de la
resoluci, implica que els Tn3 resultants, tenen a cada cadena un fragment de Tn3 original i un de nova
sntesi, evidentment amb el mateix sentit 5->3, tal i com est dibuixat a la Figura d) (per no a la c)
SOLUCIONS: C. C, A, B, D.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 174
TEMA 17: TRANSPOSICIN EUCARIOTA.

Puede ser por va DNA (similar al Procariota, se estudia en
el
maz
y
en
Drosophila)
por
va
RNA
(los
retrotransposones, los retrovirus).
Consideramos las panochas del maz. La panocha es una
infrutescencia. El grano de maz es el fruto. Cada grano
tiene un genoma independiente del grano de al lado. Los
granos provienen de divisin mittica de una clula
original. Si durante el desarrollo de la panocha se da
algn evento que propicia la prdida de un alelo dominante,
entonces los descendientes de sa clula tendrn esa
prdida de alelo: si la prdida del alelo sucede pronto en
el desarrollo, muchas clulas(grano) de la panocha
tendrn la prdida. Si sucede tarde en el desarrollo de la
panocha, entonces pocas clulas (grano) tendrn la
prdida. Ello se explic por movilizaciones del DNA, ya
que no cuadraba ninguna de las otras hiptesis conocidas.
Lo propuso Barbara McClintock en los aos 50 y apenas nadie
se fij en su trabajo. Pero acababa de descubrir los
transposones Eucariotas.
En el grano de maz hay 4 loci con los que se estudi toda
sta teora. Todos tienen un patrn de herencia mendeliano
con relacin de dominancia. El ms importante es C. Tener
el genotipo C_ da un fenotipo lila, porque hay
antocianinas. El genotipo cc da un color blanquecino, no
hay antocianinas.
Las mutaciones ocasionadas pueden mantenerse estables (no
revierten) o inestables (revierten a normal). As, el
transposn es Autnomo cuando procude mutaciones inestables
que pueden revertir a normal, ya que codifica para una
transposasa funcional y si entra en una regin del genoma,
tambin puede salir, por si mismo puede transponer. Por
contraposicin, el transposn es No Autnomo si produce
mutaciones estables que no revierten a normal, ya que
codifica para una transposasa no funcional y si entra en
una regin, no puede salir de ella y queda all
estable(puede entrar porque previamente haba uno Autnomo
que lo ha movido, y podra salir si un autnomo lo mueve),
por si mismo no puede transponer.
La transposasa que codifica el Autnomo puede actuar sobre
el propio autnomo que la codifica y tambin sobre otros
tranposones no autnomos que no pueden producirla, es
decir,
la
transposasa
Eucariota
acta
en
TRANS.La
transposasa la usan para saltar y para insertarse en la
diana, a la cual corta generando como siempre la DR).
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 175
Las familias de transposones en el maz son:

- AC(autnomo)-DS (no autnomo).
- SPM (autnomo)-dSPM (no autnomo).
La familia AC-DS.
Los AC (autnonos) tienen una secuencia ms larga que los
DS (no autnomos). El elemento AC es:
Miden 4563 pb. Un elemento DS es igual, pero con deleciones

en exones y algn intrn. Dependiendo del tipo faltan ms o
menos, pero siempre faltan (por eso es ms corto). Debido a
que falta siempre alguna regin exnica, la transposasa es
no funcional. CUANDO SE INSERTAN, SIEMPRE FLANQUEADOS POR
LAS DR (NO SE PINTAN).
Debido a que los AC tienen la misma secuencia IR que los
DS, son reconocidos por la transposasa de AC.
Cmo transponen: Es una transposicin conservativa. No se
copian los AC-DS por s mismos, pero pueden copiarse
durante
la
replicacin.
Slo
pueden
transponer
inmediatamente despus de la replicacin (porque el DNA
est hemimetilado). Siempre hay reparacin despus de
transponer.
Los elementos AC-DS producen mutaciones en el fenotipo que

son estables si DS entra en la clula (origen???) y cae en
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 176
un punto del genoma que rompe la pauta de lectura de un

gen, por ejemplo del color ( fen. incoloro), o bien cae
en una regin no codificante (fen. color). Sea como sea,
al ser un DS nicamente, no puede moverse y ah se quedar,
siendo un fenotipo estable.
Causan mutaciones inestables (que revierten) si hay un AC
(origen???) aparte del DS, el cual puede moverlo y hacer
que caiga en regin codificante o no codificante. Como
puede moverse, la mutacin puede revertir, generando
fenotipos con manchas. Regulacin poco conocida.
Y siempre hay reparacin del punto de escisin.
La familia SPM-dSPM.
Tambin los no autnomos (dSPM) tienen secuencia ms corta
que los autnomos (SPM), pero algn autnomo puede tener
secuencia corta tambin. Cmo? Primero hay que considerar
la estructura de un transposn salvaje:
CUANDO SE INSERTAN, SIEMPRE FLANQUEADOS POR LAS DR (NO SE

PINTAN).
El
salvaje
codifica
para
una
transposasa
funcional, por tanto es SPM (autnomo). Todos los salvajes
son autnomos.
Pero los mutantes, algunos pierden trozos de los ltimos
exones y codifican para una transposasa no funcional, por
tanto son no autnomos (dSPM). Otros mutantes pierden
trozos del intron 1 que contienen una de las dos ORF (suele
ser la ORF2). Ello da lugar a un autnomo porque aunque
falte un trozo de intrn, los exones estn todos bien, y
ello da lugar a una transposasa funcional.
Por tanto, algunos mutantes son dSPM (no autnomos) y otros
son SPM (autnomos).
Cmo transponen: Tambin es una transposicin conservativa
con reparacin del sitio de escisin. Debido a que el maz
es poliploide, a veces algn punto de escisin no se repara
(porque hay muchos) y puede dar lugar a problemas de
viabilidad aunque fuera mutacin inestable.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 177
As se rompe la pauta de lectura del locus C y debera, en

principio, quedar incoloro.
Pero pueden pasar dos cosas que hacen que a veces si que
haya algo color:
a) No haba SPM. Llega un dSPM (origen???) que con mala
suerte cae dentro del gen C, y hace una mutacin
estable: color intermedio. Es intermedio porque cuando
se transcribe a mRNA, se hace el Splicing de los
intrones normales de C y tambin del trnscrito de
dSPM, que se elimina casi todo como si fuera un intrn
tambin. sto es un caso de PSEUDOSPLICING. Debido a
que se elimina casi todo, quedan algunos nt (2-3
codones) de dSPM extra en el mRNA maduro, que no
ocasionan un corrimiento de la pauta de lectura
deleterio (porque son 2-3 codones extra). As, la
enzima del color codificada tiene algn AA extra que no
estaba en la original, aparte de todos los AA normales,
por eso su actividad se ve algo reducida y produce
menos pigmento del normal. Grano de color INTERMEDIO.
b) Haba un SPM: Llega un dSPM (origen???) que con mala
suerte cae dentro del gen C. Se produce un fenotipo
manchado en el grano, se considera null, incoloro.
Es una mutacin inestable suprimida por el SPM. Sucede
que la transposasa que codifica SPM se une, como
siempre, a los extremos del transposn dSPM para
cortarlo y hacer que salte. Entonces pueden suceder dos
cosas dentro de un mismo grano:
b.I.) La transposasa al estar unida a los extremos
del dSPM, bloquea fsicamente a la RNA Polimerasa
cuando transcribe, no
puede avanzar y salta.
Aborto transcripcional, no hay color.
b.II.) La transposasa tiene xito y corta antes de
que
llegue la RNA Polimerasa a transcribir. Hay
transcipcin de Chay color.
Ya que son cosas que pueden pasar dentro del mismo grano,
hay fenotipo a manchas. No se considera color, se le
llama null incoloro.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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En Drosophila: se estudi la transposicin mediante la

disgnesis hbrida (hbridos estriles). Era debido a los
elementos P. Moscas con el elemento P se llaman P y
moscas salvajes (sin P) se llaman M. Son transposones
Eucariotas de DNA.
Un elemento P es as:
Tiene varios lugares de Poliadenilacin diferentes (no son

el STOP del dibujo, aunque funcionalmente es indicativo),
ya que sufre Splicing Alternativo (ver Tema 4) segn el
tejido.
Por tanto, al tener diferente Splicing, hay diferente mRNA
maduro que se poliadenilan en diferentes lugares. Su
estructura es similar a Tn5:
- El splicing Normal elimina todos los intrones, se da
en clulas germinales. Codifica para la transposasa
(protena larga).
- El splicing Alternativo deja el intrn 3 con un STOP
prematuro, se da en los tejidos somticos. Codifica
para el represor de la transposasa (protena corta).
Hay dos hiptesis acerca de cmo funciona el represor de la
transposasa: Puede ser una transposasa que no tiene el
dominio cataltico, con lo cual se une al dsDNA pero no lo
corta y bloquea la entrada de la transposasa normal.
Tambien puede ser que el represor se una a monmeros de la
transposasa bloqueando que se una al DNA.
Existen muchos tipos de elementos P con diversas deleciones
internas, similar a la variedad en el maz.
Explicacin de la disgnesis hbrida: primero de todo hay
que repasar la fecundacin. La hembra hace un oocito (n) a
partir de las clulas germinales, dentro del cual hay
muchas sustancias de reserva (y otras cosas) que se
sintetizan en las clulas foliculares (somticas).
Cuando el oocito es fecundado, se vuelve vulo, se fusionan
los proncleos y se vuelve zigoto 2n. Se empieza a
desarrollar el embrin.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 179
As, se pueden explicar los resultados de los cruces:

- Hembra M X Macho M Control. La descendencia es toda
frtil.
- Hembra P X Macho P Descendencia toda frtil. Las
clulas foliculares somticas hacen el represor que va
al citosol del vulo y bloquea a la transposasa. Se
fecunda. El represor siempre se une a la transposasa
que hace el vulo y a la que viene del espermatozoide.
Se queda unida a ella para siempre, no deja que acte.
En las del polo animal quedan determinadas as, sin
proliferar ms. Las del polo vegetal por diferenciarse
en somticas hacen ms represor por su cuenta,
bloqueando toda la transposasa que pudiera quedar.
- Hembra P X Macho M Descendencia toda frtil, por el
mismo motivo.
- Hembra M X Macho P Descendencia estril. El ovulo
que hace la hembra no tiene ni transposasa ni
represor. El espermatozoide tiene transposasa. Al
fecundarse, la transposasa nunca encuentra al represor
ni en el vulo ni en el zigoto. Al volverse embrin,
en el polo vegetal se hace represor y se bloquea la
transposasa, pero en el polo animal no se puede hacer
represor y la transposasa que hay desorganiza el
genoma de all hijos estriles, y nietos inviables?
Biologa de los elementos P: Actualmente la mayora de
moscas son P, pero no siempre ha sido as, se estudi la
transposasa en lneas muy antiguas conservadas y se vi que
cuando ms antiguas, menos elementos P. En Europa y Asia,
todas eran M. En frica y Sudamrica, muchas eran P.
Tambin se ha dado el salto entre especies de los elementos
P, debido al Plasmodium (parsito) transmisin horizontal
del DNA. Origen desconocido. Por crear limitaciones
reproductivas, son un mecanismo de especiacin y se
seleccionan a favor. Los elementos P, actualmente, son la
forma ms comn de introducir mutaciones estables en
Drosophila. En 2 generaciones se puede fijar una mutacin
si se hacen los cruces correctos con la F1 y se tiene algo
de suerte (por lo de las proporciones).
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 180
TEMA 18: BIOLOGA DE LOS RETROVIRUS.

Los retrovirus tienen un funcionamiento muy similar al de
los retrotransposones (transposones va RNA, ver Tema 19).
Afectan a aves, mamferos nunca Procariotas. Causan
tumores o inmunodeficiencias. Ejemplo: el virus VIH causa
la enfermedad SIDA. El primer retrovirus que se encontr
fue el que causa tumores el las aves de corral, el RSV
(Rous Sarcomer Virus) a principios del siglo XX.
Todos los retrovirus tienen como material gentico RNA.
Integran la informacin en el genoma de DNA de los
huspedes.
ste
cambio
en
el
materia
gentico
(ssRNAdsDNA) lo consiguen mediante la RT (Reverse
Transcriptase). Gracias a ella se acab de establecer el
Dogma Central de la Biologa Molecular.
Segn ls ltimas filogenias, estan todos emparentados.

Todos los retrovirus tienen en
su estructura:
-Membrana
externa
(vida
extracel.): con protenas del
propio virus (TM y SU, una de
ellas es la famosa gp120) y
restos de membrana celular del
ltimo husped.
-Membrana Interna: MA (matriz),
CA (cpside), NC (nucleoprot.).
-Material interno: dos copias
del ssRNA, dos el tRNA, RT, Int
y Proteasa.
El ciclo vital: las protenas de la membrana externa del

virus que vienen de otras clulas ya infectadas interactan
unindose a receptores extracelulares de la que ser su
nueva clula husped (en el caso del VIH: gp120 CD4 de
los linfocitos T). El virus est disfrazado con la
membrana de las clulas husped anteriores. Hay fusin de
las membranas por endocitosis (gp41 en el caso del VIH). El
virus queda en el citosol limitado por su membrana interna.
Ahora
ha
de
retrotranscribirse
el
ssRNAdsDNA
e
integrarse. Despus, cuando se expresa, puede salir por
exocitosis y quedar envuelto por la membrana del husped.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 181
As, el virus puede estar en estado de latencia (desde la

infeccin hasta que acaba la integracin en forma de
provirus) o de virulencia (se forman nuevos virones,
exocitosis). Siempre usa las funciones del husped. No hay
acuerdo acerca de cmo el material gentico vrico
atraciesa la membrana nuclear.
Organizacin genmica de los retrovirus:
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 182
Como siempre, al integrarse se duplica la diana del

husped. Tambin se da que se pierden dos bases en los
extremos del LTR.
LTR (Long Targed Repeat)es U3 + R + U5 es ste orden,
siempre. Est en repeticin Directa, se considera respecto
a R.
El promotor es MUY fuerte (dominante) y est entre U3 y R.
Slo se expresa si el virus est integrado en el husped
(latente, profago).
R es igual en los dos LTR. Tiene un PolyA, que
funciona para parar la transcripcin en el LTR de 3.
La secuencia (psi) sirve para
empaquetar el mRNA que la tiene.
indicar
que
se
slo
ha
de
Las zonas codificantes son GAG (protenas de la cpside

viral, membrana interna), POL (los 3 enzimas), ENV
(protenas de la cubierta externa, membrana externa).
El PBS (Primer Binding Site) es el sitio de unin al Primer
en la retrotranscripcin. El primer tiene, obviamente, una
secuencia complementaria al PBS.
La Transcriptasa Reversa (RT): Es una DNA Polimerasa
dependiente de RNA o DNA. Necesita un primer que aporte un
3OH libre a partir del cual elongar. Tiene actividad
RNasaH (degrada el RNA que forma parte de los hbridos de
doble cadena de RNA-DNA, dejando ssDNA). Tambin es capaz
de moverse o saltar sobre el material gentico sin
polimerizar (????). El primer que utiliza es el tRNA que
llevaba el virus.
Funcionamiento:
El ssRNA del retrovirus entra
en la clula husped. En su
regin PBS se une el primer de
tRNA que llevaba el retrovirus.
Da
un
3OH
libre.
La
RT
polimeriza DNA (U5 y R) a
partir del primer de tRNA. Es
el 1er trozo de la 1 cadena.
Ahora usa su actividad RNasaH
slo en la zona del hbrido que
acaba de formar, dejando un
ssDNA protuberante con un 3.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 183
Se circulariza y se hibrida por

los R (que son iguales).
La
el
de
el
el
RT hace un salto y queda en

3 libre del R que acababa
sintetizar. Polimeriza sobre
molde de RNA, pero elongando
DNA.
Ahora usa de nuevo la RNasaH

degradando el RNA del hbrido
(por donde acaba de pasar)
excepto un trozo, el PPT. A
partir del 3 del PPT, se
polimeriza DNA con la RT.
Se
degrada
todo
el
RNA,
incluido el primer de tRNA y el
PPT, y se circulariza el DNA
por las secuencias PBS, que son
complementarias. Se separa de
U3, R y U5, queda unido slo
por las PBS.
Aprovechando los dos extremos
3 que dejan las dos PBS y
usando el molde de DNA, la RT
salta de nuevo y polimeriza
DNA. Ya tenemos dsDNA libre,
listo para integrar.
ste dsDNA se integra al azar en el genoma del husped,
gracias a la reaccin que cataliza la integrasa.
Los LTR (U3-R-U5) son atacados por la integrasa: les
degrada dos nt en los extremos 3, dejando un dsDNA vrico
con extremos 5 protuberantes de 2nt de longitud.
Ahora, la integrasa corta en el DNA diana del husped al
azar, dejando extremos protuberantes en 5 de 2nt o ms de
longitud. El DNA del virus de sita entre los dos gracias a
complementariedad de bases (OJO: como slo son dos nt, es
bastante probable que por azar encuentre las que son
complementarias).
A
continuacin,
la
DNA
Polimerasa
Eucariota rellena los gaps de la diana que estn a loa
extremos del genoma vrico, generando as los extremos con
repeticin directa caractersticos.
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Carlos F.R.
Pgina 184
Se suelen integrar de una a diez copias del retrovirus en

un genoma.
Expresin de los Retrovirus: Slo se expresan cuando se han
integrado. EL promotor est en el U3 del LTR 5. Es muy
fuerte (el promotor). Es especfico de la RNA Polimerasa II
(cajas CAAT). Si se modifica ste U3, no expresan nada.
El mRNA producido puede seguir dos caminos diferentes (50%
cada uno).
- Splicing: se cortan los lugares de Splicing eliminando
la secuencia de empaquetamiento , GAG y POL, como si
fueran intrones. Slo se traduce el gen ENV (prots de
membrana
Externa).
La
protena
inmadura
que
inmediatamente se traduce requiere 1 corte con la
proteasa que viajaba con el retrovirus para que salgan
los productos SU y TM.
Ya que se ha cortado , ste mRNA no es bueno para
encapsidar (falta GAG y POL). Su funcin es hacer ENV
para el bueno.
- No Splicing: se traduce desde el AUG de GAG. Hay un
STOP al final de GAG, que en el 5%-10% de los casos es
saltable* para hacer POL. El STOP de despus de POL no
es saltable. GAG codifica una protena inmadura que al
recibir los cortes de la proteasa, genera MA, CA y MC
(las protenas de la cpside Interna). Cuando POL se
ha traducido, recibe cortes de la proteasa y genera
los Enzimas del retrovirus: RT, Int y ms proteasa. La
clula husped no las degrada porque las reconoce como
propias. Ya que tiene a (lo tiene todo), se puede
encapsidar con ENV para salir de la clula e infectar
a otras.
Las terapias antirretrovirales se basan en combinar
frmacos que inhiben a las 3 proteinas a la vez y al tRNA.
*El STOP de GAG es saltable. Para expresar POL, es
imprescindible saltarse se STOP. Tampoco se puede hacer
Splicing (se eliminara POL, con GAG). Existen varias
maneras de que el ribosoma se salte el STOP: Frameshift-1,
Frameshift -2, Frameshift +1 y tRNA complementario a un
STOP.
Los frameshift consisten en cambiar la pauta de
lectura del ribosoma sobre el mRNA para que no reconozca el
codn STOP.
-Frameshift -1 (se retrocede 1 nt, el ms comn, el
del HIV).
-Frameshift -2 (MMTV).
-tRNA supresor (reconoce al codn STOP aportanto un
tRNA con cido glutmico, pero es un mecanismo MUY
raro. Virus MLV).
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 185
En el caso del HIV es un frameshift -1. Funcionamiento:

- El ribosoma llega al final de GAG y se forma un loop
en el RNA.
- El loop hace que se pare la traduccin. No salta el
polipptido ni el ribosoma.
- Se rompen los puentes de H2 entre codn y anticodn
con polipptido naciente.
- EL ribosoma se mueve una posicin hacia atrs, se
mueve -1nt. Aprovechando la wobble position del
tRNA, se mantiene el AA cambiando la tercera base. Se
une por 2 puentes de H2 entre las dos bases del
anticodn y el codn (que tiene 2 de las bases que han
parado al ribosoma), que ya estaba preparado para que
fueran complementarias.
- Se deshace el loop y el ribosoma sigue leyendo el
mRNA, pero con la nueva pauta de lectura -1. Sigue
aadiendo AA a la protena que NO haba saltado.
Los Retrovirus como transductores de oncogenes.

Un oncgen es un gen que hace tumores (estimula la mitosis)
debido a que:
- Expresa una protena nueva
- Expresa a elevada [ ] algo
- Expresa a baja [ ] algo
- Expresa cuando no debe.
Tipos de oncogenes:
- c-onc: gen normal, funciona correctamente, implicado
en la divisin celular. Regulan la mitosis, ciclinas,
factores de transcripcin Se una la terminologa conc en el contexto de los retrovirus.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 186
- v-onc: es la variante vrica de un gen que funciona

correctamente en la clula. Las diferencias son de un
3-10% respecto al c-onc en cuanto a nt. Son c-onc
que estn fuera de control.
Los retrovirus que llevan oncogenes pueden ser:
- con algn componente de menos (GAG, POL o ENV, o los
3).
- El gen tiende a estar a 3 del retrovirus.
Para
estudiarlo,
se
hace
una
infeccin
simultnea
(coinfeccin) del normal con el recombinante.
El origen de los v-onc constituye un misterio (como otros
tantos), pero se baraja alguna hiptesis al respecto:
Clula normal con c-onc (intrones) infeccin con
retrovirus (1-10 copias/genoma) el retrovirus se integra
al azar, y sta vez lo hace a 5 del c-onc por azar
tambin, se produce una delecin entre el virus y el c-onc
(delecin de POL, ENV, y el LTR de 3 por ejemplo) al
trascribirse desde el U3 del LTR de 5, se transcribe
tambin el c-onc porque no hay el seal de poliadenilacin
de la R del LTR 3 se realiza el splicing sobre el
mensajero y se obtiene un mRNA con 5R-U5-GAG-E1-E2-AAA3.
Los exones son del c-onc, ya no tiene intrones. Ahora se
dara una infeccin con el normal (de nuevo, 1-10 copias
por genoma) que aporta los genes que faltan virus que ha
recombinado con el c-onc. Le aporta los genes POL y ENV,
los codifica el normal. Ahora, se podr volver un v-onc. Se
encapsida:
- 2RNA que tengan (por probabilidad, uno de normal y
uno con c-onc).
- El resto de material.
Ahora infecta a una nueva clula. Si hay 2 RNA de moldes,
la RT puede saltar mientras retrotranscribe de un RNA a
otro, generando nuevas combinaciones de genes. El dsDNA con
c-onc se integra en la clula del husped, y se vuelve vonc.
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Carlos F.R.
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Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 188
TEMA 19: RETROTRANSPOSONES Y RETROGENES.

Un retrotransposn (=retroposn) es un transposn que
transpone en forma de RNA. Se retrotranscribe a DNA y se
integra en el DNA del husped. Slo en Eucariotas.
Es como un retrovirus que ha perdido la capacidad de pasar
de una clula a otra, y ha de hacer el ciclo dentro del
husped. Su origen, por tanto, es desconcertante: se trata
de un retrovirus que por azar perdi la capacidad de
infectar a otras clulas (env) o bien se trata de un
retrotransposn ancestral que por azar gan la capacidad de
infectar a otras clulas (env) y origin, as, a todos los
retrovirus? A da de hoy, no se sabe.
Consideramos los elementos Ty de la levadura (Transposon
yeast),
son
los
retrotransposones
que
primero
se
descubrieron. Los elementos Ty integrados son as:
Las cajas (=LTR) tambin se pueden encontrar solas en el

genoma, flanqueadas por la DR del husped. sto es debido a
que se dan recombinaciones de sitio especfico entre las
cajas para eliminar exceso de Ty.
La traduccin del mRNA del Ty:
- Normal: se traduce el TyA (desde AUG hasta el primer
STOP), hace la P1 que requiere un corte con la
proteasa para volverse P2, la forma madura. Con ella,
se hacen las VLP (virus-like proteins). Polimerizan.
- Frameshift +1: en retrovirus era -1. Se traducen el
TyA y el TyB saltndose el STOP entre ellos. Se
sintetiza una P3, que al ser cortada produce la
proteasa, RT e Int. Tambin se sintetiza la P1 que al
ser cortada se vuelve P2, para hacer VLP. El
frameshift +1 funciona cuando se acerca al codn STOP
entre TyA y TyB. No hay loop. Cerca hay un codn de
Arg (raro en levadura, no viene al ribosoma porque hay
pocos). Se para la traduccin, se separa el tRNA con
el polipptido y el ribosoma avanza 1 nt sobre el
mRNA, sin hacer nada (solo se mueve 1 nt hacia
adelante). Ahora, el codn que se lee codifica para un
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 189
AA comn en la levadura (Gly) y se sintetiza el nuevo

polipptido como si nada.
mRNA + VLP + P3 (las 3 enzimas) retrovirus que no
puede salir de la clula pero puede hacer muchas copias de
s mismo.
Hay diferentes tipos de Ty (1, 2, 3, 4, 5). Todos funcionan
como TyA y TyB. Tambin se han encontrado retrotransposones
en
Drosophila
(llamados
elementos
Copia).
Tienen
estructura equivalente al Ty de levadura. Como en Ty, hay
diferentes tipos de elementos Copia. Se estudiaron haciendo
hibridaciones con sonda sobre los cromosomas politnicos de
Drosophila.
Todos, cuando se integran, tienen la diana del husped
repetida en DR.
As, los retrotransposones pueden ser:
- Clase I: Retrovirus Like (como los retrovirus), tienen
LTR. Son Ty en levadura y Copia en Drosophila.
- Clase II: non-Retrovirus Like (no son como los
retrovirus), no tienen LTR. Son los LINE.
LINE (Long Interspersed Nuclear Element): El primero en ser
descubierto fue el LINE1. Hay muchas copias por n haploide
de cromosomas, de 50000 a 100000 copias. Todas ellas
presentan diferente longitud:
- Cortas: muchas copias, ocupan pocos centenares de
bases. Estn truncados a 5.
- Largas: pocas copias, ocupan hasta 7kb. Se les
considera completos. LINE1.
La diferencia entre unos y otros es que las cortas, siempre
estn acortadas por el 5 (ahora veremos porqu). El
extremo 3 (secuencia de Polyadenilacin) se mantiene
siempre. El LINE1 (completo) es:
No hay acuerdo sobre cmo se transcriben los LINES

truncados a 5, ya que no deberan tener promotor. Tampoco
est claro de dnde vienen.
Codifica para una RT no homloga a la de los retrovirus
(diferente seq de AA, misma funcin). Se retrotranscriben
por TPRT (Target Primed Reverse Transcription).
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 190
El ORF1 codifica para una protena llamada P40 ORF1.

Funcin poco clara. El ORF 2 codifica para una protena
llamada ORF2 que tiene 2 dominios: endonucleasa y RT.
Se forma la partcula nucleoproteica en el citosol:
ORF2+(2xP40)+mRNA del LINE. Se unen en 3 del mRNA.
Cuando entra en el ncleo, se pierden las dos ORF1 (=P40).

Ahora, gracias a ORF2, el mRNA toca al DNA del husped, en
una regin que ha de ser rica en T (considero que es en la
cadena de abajo). A ella, la ORF2 le acerca la cola de
PolyA del mRNA.
Ahora, ORF2 usa su dominio endonucleasa y hace un corte en

el extremo izquierdo de la zona con TTTT, dejando un 3
libre. ORF2 usa entonces su dominio RT aprovechando ese
3OH libre para elongar DNA. El sustrato es el RNA
enganchado con sus A a la zona de T:
La RT sintetiza la primera cadena del cDNA en 53

aprovechando ese 3 libre del Nick. Usa la actividad
RNasaH para degradar el molde de RNA y sintetiza la
segunda cadena del cDNA. Queda un dsDNA colgando, el cual
se integra bien en el lugar donde est. Hay reparacin de
los posibles daos.
En
el
momento
de
integrarse ste DNA que
cuelga, se produce un
corte
en
el
DNA
del
husped que deja extremos
protuberantes
(pasa
lo
que indica el dibujo, por
ataque
nucleoflico???),
en-tre los cuales se une
el DNA que cuelga
(muy
similar
a
los
transposones).
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 191
Por eso hay la DR que flanquea al LINE, como siempre, y

siempre se repara. En general, el TPRT es un mecanismo con
muchos puntos oscuros y poco conocido.
Debido a que la RT es poco procesiva, se desengancha con
facilidad del molde de RNA.
Ello ocasiona que se separe antes de hora, y no llegue a
retrotranscribir todo hasta el 5. Por eso, la mayora de
LINE tienen deleciones en 5, estn truncados. Se dice
que los LINE son autnomos porque codifican ellos para su
ORF1 y ORF2.
As, las ORF1 y ORF2 actan en CIS si se unen al mRNA del
LINE en el citosol. Pero a veces sucede que, como estamos
en el citosol, hay ms RNA que no son slo del LINE. Puede
suceder que las ORF1 y ORF2 (y de hecho sucede) se
equivoquen y se unan al RNA de otro gen. En stos casos se
dice que las ORF1 y ORF2 han actuado en TRANS.
Cuando actan en TRANS, pueden originar 2 cosas segn el
sustrato:
- Si actan sobre mRNA (de la RNA Polimerasa II) generan
un Retropseudogen = Pseudogen Procesado = Retrogen.
- Si actan sobre pequeos RNA (los de la RNA Polimerasa
III) forman los SINE. Los SINE pueden ser retro t-RNA
(se encontraron en ratn) o elementos ALU (en
primates).
Se
dice
que
son
todos
no
autnomos
porque
para
retrotransponerse necesitan las ORF1 y ORF2 que codifica
previamente el mRNA de un LINE, pero como las ORF1 y ORF2
se
equivocan,
van
a
stos
RNA
y
los
hacen
retrotranscribirse.
Los Retropseudogenes = Pseudogenes Procesados = Retrogenes
vienen de mRNA de la RNA Polimerasa II. Son el principal
grupo. No tienen promotor porque el mRNA molde que los
forma nunca tiene promotor,, no tienen intrones porque el
mRNA al madurar sufre Splicing,, zona rica en A-T debido a
la cola de PolyA del mRNA,, dos repeticiones directas, como
siempre, los flanquean, debido a la integracin del cDNA de
doble cadena cuando estaba colgando (ver arriba).
Al ser no codificante (no tiene promotor), no est sometido
a presin selectiva y acumula mutaciones a un ritmo
aproximadamente constante. Es como un Pseudogen, pero el
Retropseudogen no tiene intrones ni promotor, mientras que
el pseudogen s tiene intrones y no es codificante por
mutaciones en la regin reguladora (puede originarse por
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 192
duplicacin con inactivacin por

inactivacin por mutacin directa).
seleccin
simple
Los SINE (Short Interspersed Nuclear Element) se forman

cuando ORF1 y ORF2 se unen a tRNA, 5S-rRNA es decir, todos
los trnscritos de la RNA Polimerasa III. Son de escaso
tamao pero tienen un elevadsimo nmero de copias. Tipos:
- Retro tRNA: Vienen del tRNA. Se encontraron en
roedores. El AA era generalmente una Ala o una Ser.
- Elementos
Alu:
Comunes
en
todos
los
primates
superiores
(usadas
para
hacer
filogenias).
Son
pequeas secuencias producidas por los trnscritos de
la RNA Polimerasa III. Un elemento Alu es:
Son dos dmeros de secuencias (uno de 130pb y otro

de 160pb) que estn en tndem (uno tras otro, tras
otro) por el genoma, muchas veces. En total, una
secuencia Alu mide 300pb. Al venir de la RNA
Polimerasa III, son genes de clase III y tienen
promotores internos (se pueden transcribir). El nombre
de Alu viene de que tienen dianas del enzima de
restriccin AluI.
Las secuencias Alu vienen del 7S(L)-RNA. Al ser
transcrito por primera vez por la RNA Polimerasa III,
el RNA es captado por ORF1 y ORF2 (TRANS), y se
integra en el genoma. Forma un Alu. Como tiene
promotor interno, ahora puede volver a transcribirse y
volver a retrotransribirse (si es captado por ORF1 y
ORF2), y as una y otra vez. Por eso hay tantos.
El 7S(L)-RNA es citoslico, y est implicado en la
traduccin de protenas. El 7S(L)-RNA + protena
estructural forma la SRP (una ribonucleoproteina).
Est implicada en la translocacin de protenas al
Retculo Endoplasmtico Rugoso (ver Biologa Celular).
EL 7S(L)-RNA est muy replegado sobre s mismo, con
hibridaciones,
etc.
Tiene
muchas
estructuras
secundarias.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 193
Tiene dominio en comn con las

retrotransponerse, el 7S-RNA Alu.
Alu
porque
al
No se retrotranscribi todo porque falta un trozo en

la homologa con los Alu, un trozo propio del 7S-RNA.
La retrotransposicin accidental (TRANS) se da mucho
con el RNA implicado en la traduccin.
De manera comparativa, consideremos un individuo haploide.
- LINE1: es poco frecuente, entero representa el 5% de
los LINE, y truncado en 5 es el 95% de los LINE (en
humanos). En ratn, hay 300 veces ms del LINE1. 1 de
cada 1000 mutaciones en humanos es debida a un LINE1.
1 de cada 50 individuos tiene un nuevo LINE1 en la
lnea germinal.
- SINE (las Alu): 1.1x106 copias, forman el 11% del
genoma en humanos y el 3% del genoma de los ratones.
Hay 20 enfermedades genticas humanas asociadas a Alu:
por tenerlo en regin reguladora, codificante, o por
recombinar las secuencias Alu. 1 de cada 30 individuos
tiene un nuevo Alu en la lnea germinal.
Enfermedades asociadas a los Alu: nuestro DNA est lleno de LINEs y
Alus en diferente (o igual) orientacion. Ejemplo: patologa asociada
al receptor de las LDL en regin no codificante. Supongamos que en el
gen del receptor de las LDL llegan a retrotransponerse 2 7S-RNA en
forma de Alu. Hay dos Alu. Quedan, cada una, dentro de un intrn.
Adems, hay una diana de EcoR1 en un intrn que est en medio de los
dos intrones con Alu.
Un individuo sano, no habr recombinado entre las dos Alu, al cortar

el DNA con EcoR1 y hacer un Southern (con sonda determinada) se vern
dos bandas. En un individuo con la patologa, se ha dado recombinacin
entre las dos Alu y el fragmento entre ambas se ha perdido. Como tiene
exones, al codificar para el receptor de LDL sale una protena no
funcional y si digerimos el DNA con EcoRI, no se digerira porque se
ha delecionado la diana debido a esa recombinacin, y al hacer el
Southern e hibridar con la sonda especfica de antes, saldra una sola
banda.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 195
PROBLEMA TRANSPOSICI EUCARIOTA 1

Aquest s el mapa fsic del locus white a D. melanogaster que varen determinar
OHare, Levis i Rubin (PNAS, 80, p. 6917, 1983). La lnia superior representa el DNA de la
regi White (escala en kb), en una soca salvatge.
Els segments numerats inferiors representen diferents fragments de DNA que,
clonats i marcats radiactivament, varen sser utilitzats com a sondes en diferents experiments.
Es va realitzar una anlisi per Northern blot amb les diferents sondes. Les que varen donar hibridaci (+)
amb el RNA-m de 2.6 kb del gen white estan marcades en negre, les que varen donar hibridaci (-) en
blanc.
1) Indiqueu sobre lesquema que se us dna a continuaci, i raoneu desprs la resposta:
- On es situa linici i el final de la transcripci del gen white, segons aquests resultats?.
- Podrieu indicar amb aquestes dades la presncia dalgun intr i on?
Soluci apartat 1):
Per respondre aquestes preguntes s imprescindible que tingueu en compte les notes del final de
lenunciat.
Si la cadena senzilla de DNA que shibrida amb el RNA en el Northern est en direcci 5 3 segons
lesquema, vol dir que el mRNA estava la direcci contrria (3
5):
5
3
DNA
RNA
3
5
Per tant la linici de transcripci est a la dreta de lesquema i el final a lesquerra , i en les
regions que sindiquen en lesquema segent, ja que les sondes que no hibriden assenyalen
segments que no estan presents en el mRNA.
Pel mateix raonament podem assenyalar els lmits dun intr central, ja que hi ha regions senceres
intermdies
que
no
estan
mai
presents
en
el
mRNA.
transcripci
Final
transcripci
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Ex
Intr
Ex transcripci
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2) Es poden realitzar desprs, diferents anlisis per Southern blot a partir del DNA genmic de
diferents soques, i amb les sondes indicades.
Indiqueu quina seria la mida (en kb) de la banda o bandes que observareu en
lautoradiografia corresponent a cada una de les proves segents:
DNA genmic de:
Digerit amb:
Soca salvatge (w+)

Soca wa Sal I + BamHI
Sal I + BamHI
Soca salvatge (w+)

Soca wi Sal I + BgIII
Sal I + BgIII
Sonda emprada
3
3
4,14,15
4,14,15
Mida
2.2 kb
7.2 kb
6 kb
9 kb
*Notes: 1) Suposem la inexistncia de dianes per a aquests enzims en els transposons de

Drosophila
2) Les mides dels elements cpia, FB i P a Drosophila sn 5, 1,5 i 2,9 kb,
respectivament
3) Les cadenes senzilles de DNA que shibriden amb el RNAm estan en direcci
5->3 P. ex. 5
3.
a
w = inserci dun element "cpia"
wi = inserci de 3 kb del propi genoma
Soluci apartat 2):

Analitzem primer qu donaria en les soques salvatges, (escala aprox. en kb, per tant 1 cm = 1 kb)
-El segment que genera una digesti Sal I + BamHI que hibridar amb la sonda 3 s el segment
vermell, que t unes 2,2 kb.
-El segment que genera una digesti Sal I + BgIII que hibridar amb la sonda 4,14,15 s el segment
blau, que t unes 6 kb.
a
-El mutant w (white apricot) est causat per una inserci dun cpia en el punt indicat al mapa (w ),
com que s intern al segment Sal I + BamHI de 2.2 kb, i cpia no inclou cap de les dues dianes, en
les mosques mutants, la banda detectada al Southern passar a tenir 7.5 kb (2.2 kb ms les 5 kb que
t el cpia.
i
-El mutant w (white ivory) est causat per una duplicaci de 3 kb del propi DNA i la seva inserci, en
i
tandem, en el punt w . Com que aquest s intern al segment Sal I + BgIII de 6kb detectat anteriorment,
i el segment duplicat no inclou cap daquestes dues dianes, el segment tindr ara 9kb (6 kb ms les 3
kb de la duplicaci).
6kb
3 kb
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1. Boeke i col. varen publicar els resultats d'uns experiments on s'estudiava la via de transposici de Ty (Cell
40, p.491, 1985). En aquests experiments, cotransformaven cl.lules de llevat auxotrfiques per a histidina
(His-) amb dos plasmidis: un incloa un gen funcional His3, per sense promotor, i l'altre una construcci amb
un DNA de Ty de la segent estructura:
-deleci de part (1-237) del mdul de 5' del Ty

-inserci en aquest extrem 5' d'un promotor Gal de llevat (induble per galactosa)
-inserci dins del DNA de Ty d'un intr d'un gen de llevat (rp51), junt amb les
seqncies exniques flanquejants de l'intr
1.1. Per estudiar com ha tingut lloc la transposici de Ty, els autors partien de les cl.lules de
llevat que creixien en un medi sense histidina. Per qu ?
-Les cllules que poden crixer i donar colnies en un medi sense histidina han de poder sintetitzar
aquest aminocid. La soca auxotrfica per a His no pot realitzar aquesta sntesi, i per poder donar
colnies ha dadquirir un gen funcional His3 dalguna manera. Un dels plasmidis amb qu es
transformen les cllules porta aquest gen, per sense promotor i per tant el gen His3 no es pot
expressar directament des daquest plasmidi.
Si hi ha cllules que creixen s senyal que aquest gen ha adquirit un promotor. Com pot haver
passat? per transposici just a davant seu dun element Ty, ja que recordem que els mduls
inclouen promotors forts (el promotor que el 5 de lelement utilitza per a la seva transcripci ):
5
Ty que sha transposat
HIS3
Promotor
Per tant en aquestes cllules hi ha Ty que shan transposat (productes de transposici) i amb aquest
material es poden determinar caracterstiques daquest procs.
1.2. Es va constatar que si els transformants es feien crixer en un medi lquid sense galactosa i
desprs es plaquejaven en medi sense histidina, quasi no apareixien colnies. En canvi el
nombre de colnies era molt elevat si els transformants es feien crixer en un medi amb
galactosa. Quina conclusi es deriva d'aquest resultat ?
-Els elements Ty originals, com el que set mostra en el dibuix de la Fig. 1, no tenen el seu mdul 5
funcional, sino que aquest ha estat substitut per un promotor Gal. Aquest s un promotor de llevat
induble per galactosa (o sigui que la presncia de galactosa dispara la transcripci del gen que hi
hagi a continuaci). El resultat de lexperiment ens diu que perqu la transposici sigui efectiva
(recordem que el fet que apareguin colnies reflecteix esdeveniments de transposici), hi ha dhaver
transcripci del Ty original.
1.3. Per estudiar els mduls dels Ty resultat del procs de transposici varen hibridar un
Southern del DNA dels Ty inicials (carril 1) i els Ty finals (carril 3), digerit amb EcoRI i BamHI,
amb una sonda que corresponia a la seqncia 1-237 del mdul . El canal 2 corresponia a un
plasmidi sense cap Ty (control negatiu). El resultat va sser el que s'indica en la Figura 2. Quina
conclusi es deriva d'aquest resultat ?
- La seqncia 1-237 del mdul que es fa servir com a sonda s precisament la que falta en
els mduls -5 dels Ty originals o inicials (pre-transposici). Per tant veiem que en el
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 198
carril 1 del Southern noms apareix una banda, que ha de correspondre al segment que
inclogui el 3 que hibrida amb la sonda (s un segment dunes 2.1 kb). Si en els Ty finals,
resultants de transposici, apareixen dues bandes, vol dir que ara la sonda detecta 2
mduls . El nou, incls en la banda de 9.4 kb, sha dhaver generat com a conseqncia
de la transposici, per tant sembla ser que la transposici genera, o regenera, les
seqncies terminals del nou DNA (recordeu el procs de generaci de LTR en la
retrotranscripci dun retrovirus).
1.4. Per tal d'acabar de concretar la hiptesi postulada a partir dels resultats de l'apartat 1.2., els
autors varen realitzar altres proves Southern, amb els segents DNA's i les segents sondes
radioactives.
El resultat s'indica a la Figura 3. Quina conclusi es deriva d'aquests resultats ?
DNA carrils 1: DNA dels Ty inicials (abans de transposar-se)
DNA dels carrils 2 a 5: DNA dels Ty finals (resultat de transposici)
sonda A : sonda que correspon a tot el DNA de rp51 insertat en Ty (exons i intr)
sonda B : sonda que correspon a l'intr de rp51 insertat en Ty
- Recordem que el Ty inicial contenia un fragment dun intr dun gen (rp51) juntament amb
les seqncies flanquejants necessries perqu es realitzi, en el seu cas, un procs
dsplicing.
Quan analitzem els Ty inicials, les dues sondes emprades reconeixen el mateix segment: un
segment de 8.5 kb (que estar flanquejat per les dianes de lenzim de restricci amb qu
shagi digerit el DNA): aix vol dir que el DNA del segment de lintr est present en
aquesta seqncia).
Per quan sanalitzen els Ty finals, els resultats sn diferents que abans i tamb diferents
entre les dues sondes. Aix vol dir que el DNA dels Ty inicials i Ty finals no t la mateixa
seqncia. Qu podem deduir:
a) que el DNA corresponent a lintr no hi s: la sonda B no hibrida amb els DNA dels Ty
finals.
b) El segment de DNA que abans tenia 8.5 ara es reconegut com un segment de 2.3 kb,
per la sonda A.
c) Per tant: en el procs de transposici, sha produt un splicing que ha eliminat lintr i
ha ajuntat les dues seqncies exniques flanquejants. Lintr tenia doncs 6.2 kb.
Ty inicial
Intr
8.5 kb
Ty final
2.3 kb
EN RESUM: durant el procs de transposici els elements Ty necessiten transcriures, i els
elements integrats en un nou lloc sn producte de retrotranscripci dun RNA transcrit
processat: sn totes les caracterstiques dun retrotranspos: transposici =
transcripci/processament del transcrit/retrotranscripci i integraci del nou DNA
resultant. En aquest procs es generen uns terminals repetits (tipus LTR) a ambdos
extrems.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 199
En un treball publicat a Science (Kobayashi et al., Science 304, p.82, 2004), sestudiava la base molecular de la
pigmentaci dels grans de ram de tres soques productores de vi, una delles blanca (It) i les altres dues
negres (Ru, Fl). Els autors sabien que el producte dun gen anomenat Vmyb est implicat en la sntesi dels
pigments (antocianines) que donen color al ram, i per tant varen analitzar la regi genmica que inclou
aquest gen en el DNA de les tres soques, detectant que el gen Vmyb era idntic en totes tres, per la regi
immediatament a 5 del gen podia presentar dues estructures possibles (a) i (b):
La composici daquesta regi genmica en els dos cromosomes de cada soca s:

Soca It: homozigota per lestructura a.
Soca Ru: heterozigota
Soca Fl: homozigota per lestructura b.
I una detecci per RT-PCR (cpia de RNA a cDNA acoblada a amplificaci per PCR) dels transcrits de
Vmyb dna el resultat segent:
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 200
Carrils 1-8: ram soca It

9-11: ram soca Ru
12-15: ram soca Fl
I per tant dedueixen que la ra molecular ms probable del color dels grans de ram en aquestes soques s la
inserci en la regi 5 de Vmyb dun element de DNA anomenat Gret1 (10,4 Kb) que interfereix amb la seva
expressi.
1.- Segons lestructura indicada en lesquema, Gret1 s del tipus:
a) pseudogen processat de Vmyb
b) retrotranspos homleg a Ty de llevat
c) element LINE, homleg a L1 hum
d) transpos de DNA, homleg a Ds de blat de moro
Resposta:
Les regions que es senyalen en lelement Gret1 sn les regions codificadores gag i pol, i
uns extrems tipus LTR. Aix correspon doncs a un element mbil de la famlia dels
retrotransposons (transposons via RNA) de classe I, o semblants als retrovirus,
retrovirus-like, tal com els elements Ty de llevat. Per tant la resposta correcta s la (b).
2.- Els autors detecten la presncia de Gret1 de totes les soques de ram productores de vi que analitzen, i
daqu dedueixen que la seva presncia en el genoma del ram s molt antiga. Desprs, hipotitzen que en
algun cas, a partir de lestructura genmica (a) es deuria generar la (b), segons un mecanisme de:
a) retrotransposici
b) transposici via DNA
c) recombinaci entre seqncies repetides invertides
d) recombinaci entre seqncies en repetici directa
Resposta:
Els terminals LTR flanquejants de retrovirus i dels retrotransposons amb estructura
semblant a retrovirus sn capses de seqncia idntica en repetici directa, i per tant sn
substrats per a reaccions de recombinaci que originen la deleci de la seqncia intermitja.
El resultat s que queda una capsa en la localitzaci original del DNA que sha escindit, que
s exactament el que sobserca en lestructura genmica (b). Per tant la resposta correcta s
la (d).
3.- Quins sn els enzims i protenes que van intervenenir en aquestes reaccions:
a)
b)
Generaci de lestructura (a)

Protenes similars a les de la coberta
interna dun retrovirus
Transcriptasa inversa, integrasa i proteasa
Generaci de lestructura (b)

Transposasa, similar a la dun element IS
procariota
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Carlos F.R.
Pgina 201
c)
d)

Enzims responsables del mecanisme de
Transposici tipus TPRT
Protenes que intervenen en recombinaci

homloga
Recombinasa tipus excisionasa
Resposta:
Lestructura genmica (a) es va generar quan un retrotranspos Gret1 es va mobilitzar,
segons el seu mecanisme de mobilitzaci que equival a un cicle de retrovirus intracellular, i
es va la nova cpia es va integrar just a 5 del gen Vmyb. Per tant els enzims que varen
entrat en joc sn els enzims tpics de retrovirus, codificats per pol (transcriptasa inversa,
integrasa i proteasa) i les protenes de partcules VLPs, codificades per gag.
Lestructura genmica (b) es va generar per recombinaci, com hem explicat en lapartat
anterior, i per tant requereix protenes que intervinguin en recombinaci.
Per tant la resposta correcta s la combinaci (c).
4.- Els autors fan una PCR amb els primers (b) i (c) indicats en lesquema inicial sobre el DNA
duna gran varietat de soques de ram productores de vi, amb els resultats que sindiquen a
continuaci (noms analitzen els segments menors de 5000 pb):
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
carril
soca
1
Italia
2
Ruby Okuyama
3
Muscat Alexandria
4
Flame Muscat
5
Pinot blanc
6
Chardonnay
7
Riesling
8
July Muscat
9
Rosario Bianco
10
Neo Muscat
11
Green Summer
12
Riesling Lion
13
Pinot noir
14
Cabernet Sauvignon
15
Muscat Hamburg
16
Emperor
17
Trollinger
18
Cardinal
19
Seneca
20
Golden Muscat
Per tant, segons aquests resultats:
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
color ram
blanc
rosat
blanc
rosat
blanc
blanc
blanc
blanc
blanc
blanc
blanc
blanc
negre
negre
negre
rosat
rosat
rosat
blanc
blanc
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a) el fenotip ram blanc est associat a la presncia de Gret1 a 5 de Vmyb, en homozigosi

b) el fenotip ram blanc est associat a la presncia de Gret1 a 5 de Vmyb, en heterozigosi
c) el fenotip ram negre o rosat est associat a la presncia de Gret1 a 5 de Vmyb, en
homozigosi
d) no es pot concloure cap associaci genotip-fenotip dels resultats anteriors
Resposta:
Primer de tot cal veure quines relacions es poden deduir entre fenotip (color del
gra de ram) i genotip (estructura de la regi gnica Vmyb): totes els rams
blancs no dnen banda de menys de 5000 pb en la PCR. Com que els primers
sn b/c, aix vol dir que en tots aquests casos la banda amplificada era ms
gran que aquesta mida, o sigui que hi ha un retrotranspos Gret1 integrat abans
del gen Vmyb. I aix passa en els dos cromosomes, per tant Gret1 est en
homozigosi. Si un dels dos cromosomes no tingus aquesta estructura
genmica, sobtindria banda en la PCR.
En la resta de casos (ram rosat o negre), al menys un dels dos cromosomes t
el gen Vmyb sense Gret1 a 5. Per tant la resposta correcta s: (a)
5.- Segons els resultats anteriors, quina s la caracterstica que probablement diferencia les
varietats de ram rosat Ruby Okuyama i Flame Muscat (carrils 2 i 4), de la resta de varietats
rosades i negres analitzades en els carrils 13 a 18?
a) que Ruby Okuyama i Flame Muscat havien tingut Gret1 insertat a 5 de Vmyb en
algun moment de la seva histria evolutiva i les altres no
b) que les soques 13 a 18 havien tingut Gret1 insertat a 5 de Vmyb en algun moment
de la seva histria evolutiva i Ruby Okuyama i Flame Muscat mai
c)que a Ruby Okuyama i Flame Muscat, un cromosoma haviat tingut Gret1 insertat a 5
de Vmyb en algun moment de la seva histria evolutiva i laltre no
d) que sha produt una inversi del DNA entre les seqncies on shibrida
loligonuclotid (b) i el (c)
Resposta:
Les varietats Ruby Okuyama i Flame Muscat donen lloc a unes bandes de PCR
clarament superiors a les varietats 13 a 18. Aix vol dir que el segment amplificat
per la PCR amb els primers s ms llarg. Si analitzem on es situen aquests
primers, veurem que (b) shibrida a una reuni genmica prpia del DNA de ram,
just abans del punt dinserci de Gret1, i (c) hibrida a una regi interna al gen
Vmyb. Per tant un segment ms petit vol dir que aquesta regi est intacte en el
genoma de ram (no hi ha i mai hi ha hagut retrotranspos integrat), i una banda
una mica ms gran correspon a lestructura genmica (b), on abans de Vmyb ha
quedat una capsa LTR, testimoni duna anterior presncia aqu dun Gret1.
Per tant la resposta correcta s: (a).
SOLUCIONES: B, D, C, A, A.
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TEMA 20: INMUNOGLOBULINAS.

El sistema inmune consta de clulas precursoras que se
pueden diferencias en clulas linfoides (hacen la respuesta
tisular clulas citotxicas y los linfocitos T hacen la
respuesta humoral linfocitos B) en clulas mieloides
(macrfagos, plaquetas, etc).
Los anticuerpos son sintetizados por los linfocitos B. Los
anticuerpos son el principal tipo de inmunoglobulinas (las
usaremos como sinnimos, pero estrictamente no lo son).
Las inmunoglobulinas
cadena pesada. Tipos:
- IgA secuencia
- IgD secuencia
autoinmunidad.
- IgE secuencia
- IgG secuencia
- IgM secuencia
se
clasifican
segn
los
AA
de
la
de AA en cadena pesada. Saliva.

de AA en cadena pesada, regula la
en cadena pesada. Alergias.
en cadena pesada. Principal.
en cadena pesada. Constitutiva.
Estructura de la ms abundante (IgG):
Una Ig tiene dos cadenas ligeras (l) y dos cadenas

pesadas (h). Tanto la ligera como la pesada tienen cada
una su regin Constante (C) y su regin Variable (V).
Estn unidas por puentes disulfuro.
Las letras (J, C, L) de cada gen son cajas que codifican
para diferente secuencia de polipptido, habr slo 1 de
cada en la IG final. Estn en clster. Se puede elegir para
que el AC pueda reconocer muchos antgenos.
Cadena ligera, regin Variable: en la cadena ligera, puede
haber una regin variable que sea de tipo de tipo .
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- Tipo :
Poca preferencia por sta, se prefiere ms el clster

. Tiene un pseudogen en una constante. Slo se usa si
falla la . En raton, el 5% de las Ig tiene la Vl tipo
clster y hay pocas L-V donde elegir. En humanos, el
60% de las Ig tienen la Vl tipo clster , y hay
muchas L-V donde elegir.
- Tipo :
Se elige como primera preferencia. Si ste falla, usa

el clster . En raton, el 95% de las Ig tiene una Vl
tipo clster , y hay muchas L-V donde elegir. En
humanos al revs, el 60% lo tiene y hay pocas L-V
donde elegir.
Cadena ligera, regin Constante: Poca importancia, si la
variable es , la constante es . Si la variable es , la
constante es 1, 2 3 (la 4 es el pseudogen).
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Cadena pesada, regin Variable:
La variable es ms fcil de hacer que la constante. No se

indican todas aqu, pero la constante (ver siguiente
dibujo) tiene muchas posibilidades.
Se pone como ejemplo que la constante se vuelva M (ahora se
explica). Para que se forme el DNA listo para transcribir,
requiere 2 recombinaciones somticas. Hay mucho donde
elegir. Al hacer las recombinaciones somticas en el DNA,
ya queda determinado para siempre en esa clula (porque
implica que se pierda un trozo, el trozo que est entre las
dos zonas que recombinan)
Cadena pesada, regin Constante: Pueden presentar, a parte
de toda la variedad de la Variable, diferente Forma
(Ssecretable, M1 o M2 de membrana) y tambin diferente
Clase (tipo de Ig, si IgMIgD es revesible, pero si
IgMIgA, IgG, IgE es irreversible).
Suponemos que ya se han dado las 2 recombinaciones (siempre
son somticas porque son linfocitos) de la regin Variable,
y ya est determinado el DNA. Ahora, para la regin
Constante, pueden suceder diversos eventos, se combinan
los dos!
- Clase: 1 se elige la clase. Determina el tipo de Ig.
Puede ser reversible o irreversible. Por defecto,
siempre se va a transcribir a la IgM, por tanto, no es
imprescindible el cambio de clase (si no se diera
cambio de clase, quedara IgM). Cuando se han hecho
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
Pgina 206
las 2 recombinaciones somticas de la variable, el DNA

de la Constante es:
Los cambios de Clase Reversibles implican manipular el

mRNA. Es pasar de IgMIgD. Se trascribe todo hasta el
final de C-, se elige si quiero que sea IgD IgM y
despus la Forma. Para que sea IgD, tengo que hacer
Splicing alternativo y perder todo IgM. Para que sea
IgM, no tengo que tocar nada (hay STOP detrs de C-).
Luego se elige si es secretable o de membrana.
Los cambios de Clase Irreversibles implican una
tercera recombinacin somtica, pero sta se da entre
las regiones de homologa llamadas cajas Switch (SWletra). Es una recombinacin muy parecida a la de
sitio especfico, porque hay una delecin de un
segmento por recombinar dos secuencias (cajas SW)
repetidas. Las cajas Switch estn al principio de
todas las regiones C, excepto de C (no existe la SW). Siempre se recombina la SW- con la SW-diana de la
C que quiero. Se elimina el trozo de DNA de en medio
(por eso es irreversible). Luego se transcribe y se
elige si es de membrana o secretable.
- Forma: Es lo 2 que se elige. Los cambios de forma son
todos reversibles, ya que afectan al mRNA una vez se
ha elegido la Clase. Es decir, a partir de un mismo
genoma siempre se pueden generar formas secretable y
formas de membrana de la misma clase de Ig. Al mRNA se
le puede hacer un Splicing alternativo de la regin C,
en el cual se pierde la regin S, y luego se unen las
cajas M forma de Membrana, tiene AA hidrofbicos. Si
se usa una regin crptica de PoliAdenilacin, que
est detrs de S (se pierde M)forma Secretable,
tiene AA hidrfilos.
La Recombinacin Somtica: slo se dan en los linfocitos B
porque son las nicas clulas del cuerpo con las
Recombinasas Rag1 y Rag2 funcionales. Son homlogas a
Transposasas. stas recombinaciones somticas implican
regiones en el DNA con secuencias de bases en repeticin
Directa, un entrecruzamiento, y la prdida del segmento
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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intermedio (parecido pero no igual a recombinacin de sitio

especfico).
As, gracias a sta recombinacin, se unen los segmentos de
DNA pueden expresarse los genes de las inmunoglobulinas, ya
que un enhancer especfico del promotor de las Ig se acerca
a ste cuando se deleciona el fragmento intermedio por
recombinacin.
ste enhancer que activa al promotor se encuentra entre J y
C, y el promotor est a 5 de J. Por eso cuando se hacen
las dos recombinaciones somticas, se acerca el enhancer al
promotor y lo activa. Como para esa recombinacin se
necesitan a Rag1 y Rag2, y slo las expresan los
linfocitos, son las nicas clulas del cuerpo aparte de las
germinales que pueden recombinar. Y como no son clulas
germinales porque no hacen gametos, sino que son clulas
somticas, al fenmeno se le llama recombinacin somtica.
Rag1 y Rag2 actan como transposasas, catalizando todas las
recombinaciones somticas de los Linfoctos B. Son elementos
de recombinacin en Trans.
Por ejemplo, si quiero unir la caja V con la caja J (en la
cadena ligera), Rag1 y Rag2 cortan a los lados de las cajas
de homologa (no cortan dentro de ellas, por eso no es
igual que la recombinacin de sitio especfico, aunque el
resultado es equivalente).
Es fundamental que haya las cajas de homologa HeptmeroNonmero-(cosa a delecionar)-Nonmero-Heptmero. Cada una
tiene 7-9-X-9-7 bases, respectivamente. Siempre se deben
conservar las distancias de 23pb entre las 7-9 y de 12pb
entre las 9-7. No son distancias arbitrarias, son
reconocidas por Rag1 y Rag2 ya que corresponden con los
giros del DNA. stas cajas, son elementos en Cis de
recombinacin. 1 heptmero + 1 nonmero = 1 RSS. Se
necesitan 2 RSS para recombinar. Los dos RSS estn en
repeticin invertida.
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Carlos F.R.
Pgina 208
Las recombinasas Rag1 y Rag2 no cortan dentro de las cajas

7-9 y 9-7, sino que cortan en el trozo que hay entre la RSS
y el la caja V J. Funcionan como transposasas, as que no
cortan dejando extremos protuberantes.
Cmo se da la recombinacin Somtica:
- Las cajas 7-9-X-9-7 se enfrentan una con la otra
formando una protuberancia.
- Rag1 y Rag1 reconocen las estructuras y cortan,
haciendo un Nick en cada una de las 2 cadenas.
- El 3OH ataca nucleoflicamente al 5P que tiene la

cadena de abajo, y forma una estructura en hairpin.
A la vez, se separa el fragmento intermedio, con las
cajas 7-9-9-7 y la regin que se deleciona del genoma.
ste DNA que se deleciona se ha circularizado por los
extremos romos.
- Una endonucleasa corta el punto del hairpin a los

dos extremos, haciendo un Nick, la posicin del cual
es variable. Se rompen los puentes de H2 por la
tensin. Por tanto, deja extremos protuberantes 3 de
longitud variable (los nt no caen, no son goteras
xD).
stos nt protuberantes son los nt P.

- La Nucleotidil Transferasa Terminal (NTT) aade
algunos nt aprovechando el 3 libre, en 53. No
tiene molde, por tanto los pone al azar. Los nt que
pone la NTT son los nucletidos N.
- Los nt son al azar, pero basta que aada dos que sean
complementarios en las cadenas opuestas y se hibridan,
la distancia de lo cual ser, obviamente, variable.
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Carlos F.R.
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- Al hibridarse, ya hay un gap con un extremo 3 con un

gap. Una exonucleasa corta la protuberancia 3 que no
se ha apareado.
- Ahora puede venir la DNA Polimerasa Eucariota a

reparar el gap, a partir del 3 libre y usando el
molde de la otra.
Debido a que esto se da en regiones codificantes, hay
posibilidad de que haya un corrimiento de la pauta de
lectura y produzca una protena no funcional. Por eso, 2/3
veces ste fenmeno falla y no produce una cadena
funcional. Pero si funciona (1/3), hay variabilidad
generada por los nucletidos N que aade la NTT.
La Hipermutacin Somtica: igual que el fenmeno anterior,
slo pasa en los linfocitos B. Sucede en las regiones LVJ
LVDJ, dependiendo de si es pesada o ligera, pero siempre
sucede en la regin V almenos. Sucede cuando se han
producido las Recombinaciones Somticas, no antes.
Ocurre en elevada frecuencia, del orden de 1/1000 a 1/10000
veces (muta 100 o 1000 veces ms rpido de lo normal).
Consiste
en
sustituir
bases
mediante
un
mecanismo
enzimtico. Sobretodo en la regin V y sus zonas
flanqueantes.
Siempre necesita a los enhancers cerca (dos enhancers: el
E que est entre V-C a 5 de C ,, el E3 que es
caracterstico de la cadena pesada y est a 3 de C).
Tambin
necesita
secuencias
intrnicas
cerca,
para
comprobar
que
es
una
secuencia
activa
transcripcionalmente
(porque
quiere
mutar
secuencias
codificantes para generar variabilidad).
Sucede cuando una base (C, por ejemplo) es atacada por un
enzima (citosina desaminasa en ste caso) y se convierte en
uracilo. Tener uracilo en el DNA es una aberracin, y viene
la Uracilo D-Glucosilasa, que corta la base y deja un lugar
AP (con MSH, MLH, PMS no es NER porque no son bases
daadas, y no es translesin porque no son dmeros de
pirimidina). Es reparado por la DNA Polimerasa , una
polimerasa translesin. Como se equivoca mucho, slo de
las veces pone la base correcta, los otros aade una
incorrecta. As, la regin variable tiene an ms
variabilidad.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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Maduracin Y Diferenciacin de los Linfocitos B: Suponemos

que queremos producir una IgM para la membrana.
La clula madre se diferencia en clula nula cuando une D-J
en la cadena pesada. Tiene dos intentos porque es 2n. Si
falla, apoptosis.
La clula nula se diferencia en clula Pre-B cuando une VDJ en la cadena pesada. Tambin 2 intentos por ser 2n y si
falla, apoptosis. Se decide la clase de la Ig (IgM) y luego
se decide la forma (membrana). Se d la exclusin allica.
La clula Pre-B acumula las cadenas pesadas y se diferencia
en clula B cuando sintetiza la cadena ligera (1 1 2,
si falla usa . Fusin V-J). Se unen las cadenas ligera y
pesada, y se une la IgM a la membrana por la ruta
secretora, fusin vesicular.
La clula B se especializa en producir otras Ig cuando su
IgM de membrana se une al antgeno. Entonces se da un
cambio de clase reversible (IgMIgD) y se producen IgD,
tambin de membrana, para evitar la autoinmunidad. Entonces
se exponen al antgeno y:
- Se dan cambios de clase irreversibles (IgMIgA, IgG,
IgE).
- Cambios en la lnea celular porque cambia el tipo
celular clulas de memoria (acumulan Ig en la
membrana) y clulas plasmticas (Ig secretables,
expresan los factores para hacer el cambio de forma a
Ig Secretable).
La Exclusin Allica: Sucede cuando se producen las cadenas
pesadas en las clulas Pre-B. Son 2n, por tanto, tienen el
genoma duplicado. Hay dos copias de cada cromosoma, que
contiene la informacin para codificar las cadenas. Si uno
de los dos, al fusionar las cajas, rompe la pauta de
lectura o daa la cadena, se inactiva y lo intenta hacer el
otro cromosoma. Tiene otra oportunidad, pero si tambin
falla, la clula hace apoptosis.
Si ya funciona bien desde el primero, entonces el que
funciona bien bloquea al que aun no se ha activado.
Con la cadena pesada pasa algo parecido, pero si falla la
, antes se inactivar al cromosoma se pasa a la .
Numricamente, en Ratn, si se consideran todas las

probabilidades mencionadas hasta ahora, se pueden producir
ms de 270 millones de Ac diferentes para reconocer a todos
los antgenos que podran llegar al organismo.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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En humanos, hay un orden de magnitud ms (se producen ms

de 2700 millones de Anticuerpos, debido a que hay 1800
combinaciones posibles LVJC de la variable-ligera frente
a las 6 de ratn).
Factores que generan la Variabilidad:
- N de segmentos V, D, J.
- Uniones aleatorias de DJ y V-DJ es la variabilidad
combinacional, en elegir qu regin se une.
- Uniones aleatorias de DJ y V-DJ es la variabilidad
en la juntura/inprecisional, ya que se corre la pauta
de lectura pudiendo producir STOP prematuro o vete t
a saber.
- Los nucletidos N aadidos por NTT a los extremos de
las cajas VDJ.
- La
hipermutacin
somtica
en
la
regin
V
y
circundantes.
- Una cadena pesada se puede unir a cualquier cadena
ligera.
Nunca mejor dicho, en la variedad est el gusto.
Gentica Molecular.
Carlos F.R.
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PROBLEMA IMMUNOGENTICA 1
ENUNCIAT
La sntesi d'un nombre molt elevat d'anticossos diferents en el ratol i l'home s'assoleix per un
procs recombinacional que reuneix segments de diversos blocs de seqncies. Les
seqncies reordenades dicten la sntesi de cadenes lleugeres i pesades diferents.
1. Indiqueu esquemticament sobre les lnies assenyalades a) una reordenaci productiva de
cadena lleugera i
b) una reordenaci no productiva assenyalant les causes.
a)
_________________________________________________________________
b)
_________________________________________________________________
2. Sobre les senyals de reconeixement de le(s) recombinase(s) implicades en les
reordenacions anteriors indiqueu, referit a cadenes pesades, a) la seva estructura i b) on es
troben en relaci als segments de cada bloc de seqncies.
Feu un esquema per respondre a ambdues qestions
3. Canvi de classe de cadenes pesades, a) per qu s important aquest fenomen i b) quan es
produeix?
4. Quin tipus de seqncies apareixen en les regions frontera entre els segments recombinats
que no eren presents abans de la reordenaci? Quines conseqncies positives i negatives t
aquest fenomen?
5. La combinaci a l'atzar entre segments que pertanyen a blocs de seqncies diferents, la
combinaci entre qualsevol cadena lleugera i qualsevol pesada, el nombre elevat de segments
V de cadenes lleugeres i pesades, expliquen l'elevat nombre de molcules d'antics que
sintetitza un mamfer al llarg de la seva vida.
Podria anomenar altres dues causes de variabilitat? Descriviu-los breument.
RESPOSTES
1.
LV200J4
J5
Vk
a) _________________________________________
J4
b) _______LV__________________________________ deleci de tots els segments J
En la reordenaci productiva sha format una seqncia LV200J4 Vk que dictar la sntesi de una cadena
lleugera funcional
En la reordenaci no productiva, per error en el reconeixement de les seqncies senyal shan escindit
totes les seqncies J i per tant es sintetitzar una cadena defectiva
2.
a)
-----V-- 7, 9 --V-- 7, 9 ................9, 7-----D-----7, 9//9, 7-----D-----7, 9.................7, 9 J---------------C
b ) Les senyals de reconeixement son heptmers i nonmers que es troben a 3 de les regions V, a 5i 3
de D i a 5 de J 3.
s important perqu explica la sntesi danticossos que tenen la mateixa especificitat i per
actuen localitzant i destruint lantigen en diferents teixits.
4.
Apareixen els nucletids P que safegeixen als extrems protuberants que es generen despres
del trencament per RAG1 i RAG2, i els nucleotids N afegits per la nucleotidiltransferasa als
exptrems 3OH. Si laddici no s multiple de 3 es trencar la pauta de lectura i aquest
reordenament produira una cadena no funcional.
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Carlos F.R.
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5.
a) Primera causa. La variabilitat que es genera per addicions de nucletids en les regions
frontera (apartat 4). Aquesta s la base de loptimitzaci de lafinitat de la molcula dantics
vers lantgen
b) Segona causa: hipermutaci somtica. Opera sols en les regions V dels segments
reordenats de cadenes pesades i lleugeres. Consisteix en la substituci de bases de les
regions dinteracci directa amb lantgen. El procs depn dun enhancer que activa la
transcripci del locus IG implicat, sinicia per lacci duna citidina deaminasa i una uracil-DNA
glicosilasa.
ENUNCIAT
Imagina una espcie de mamfer on la regi genomica del DNA que inclou les regions
codificadores per a una cadena lleugera de les immunoglobulines t la segent estructura:
(Atenci el dibuix no esta fet a escala)
Sindica la presncia de dianes de restricci (EcoRI, E i BamHI, B) i la situaci de dos fragments de DNA que
utilitzes com a sondes (a) i (b).
Indiqueu quina sera la mida de les bandes dels experiments segents:
1. Southern amb DNA duna cl.lula heptica digerit amb enzim B i hibridat amb sonda (a)
2. Southern amb DNA duna lnia de mieloma (derivada de limfcits B) que expressa una
immunopglobulina amb la regi variable V2, la regi de juntura J3 i la regi constant
C1, digerit amb enzim B i hibridat amb sonda (a). Considereu que la regi equivalent
del cromosoma homleg s absent)
3. Southern amb DNA duna cl.lula heptica digerit amb enzim B i hibridat amb sonda (b)
4. Southern amb DNA duna lnia de mieloma (derivada de limfcits B) que expressa una
immunopglobulina amb la regi variable V2, la regi de juntura J3 i la regi constant
C1, digerit amb enzim B i hibridat amb sonda (b)
5. Northern de mRNAs totals duna cl.lula heptica, hibridat amb sonda (a)
6. Northern de mRNAs totals de la lnia mielmica de lapartat 2, hibridat amb sonda (a)
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RESPOSTES
1) una cl.lula heptica no sintetitza anticossos per tant no hi reordenaci de cap al.lel de
cadena pesada i lleugera.
Sobservar una nica banda de 780 pb (50+30+100+200+400)
2) Considerant que la regi del cromosoma homleg s absent, la reordenaci
V2J3C1 donar un fragment de:
50+30+100+200+45+1000+1200+1500= 4.125 pb
3) No hi ha hagut cap reordenaci per tant el fragment contindra les regions L3V3 J1J2J3
C1 i les regions espaiadores, en total
50+30+100+200+1400+45+20+45+20+45+1000+1200+1500=5.655 pb
4) Seguint el mateix argument de lapartat 2, la sonda b) hibridar el mateix fragment que
la sonda a), s a dir un fragment de 4.125 pb
5) el Northern no donara cap banda perqu en les cl.lules heptiques no es trancriuen
els gens de cadenes lleugeres ni pesades
6) les cl.lules de mieloma s que sinteitzen molcules dantics, per tant la reordenaci
de cadena lleugera de lapartat 2 es transcriura i el producte del RNA madur ser el
fragment de 4.125 nucletids sense els extrems i els introns (50+100+ 1000+1500=
2.650)
4.125- 2.650= 1.475 nucletids
A la figura SEGENT es representa l'estructura de la regi genmica de la cadena lleugera tipus d'un antics
(ATENCI: el dibuix no est fet a escala):
EcoRI
EcoRI
EcoRI
L1
V1
L2
V2
L3
30
200
30
200
30
V3
EcoRI
Ln
Vn
30
200 nt
EcoRI
J1 J2
J3 J4 J5
10
10
5000 nt
100
450
100
450
200 nt
100 nt
100 nt
2500 nt
10
10
10 nt
300 nt
300 300 300 300 nt
1. Purifiquem DNA de dos tipus cel.lulars:

un limfcit B madur on ha tingut lloc una recombinaci somtica entre una parella de LV i el segment J4
un hepatcit.
Si fssim un Southern amb els dos tipus de DNA digerits amb l'enzim EcoRI i hibridssim amb una sonda
especfica de la cadena constant, la banda de la hibridaci tindria una mida de
a) 9050 nt en el cas del DNA d'hepatcit i 3120 nt en el DNA de limfcit
b) 3120 nt en en el cas del DNA d'hepatcit i 9050 nt en el DNA de limfcit
c) 9050 nt en ambds casos
d) 3120 nt en ambds casos
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2. Per mutaci somtica es podria perdre alguna de les dianes per EcoRI
a) tant de la regi variable (V) com de la regi constant (C)
b) de la regi constant (C) per no de la regi variable (V)
c) de la regi variable (V) per no de la regi constant (C)
d) cap de les possibilitats anteriors s certa
3. Si fssim un Northern de l'RNA total obtingut dels hepatcits o dels limfcits, la banda que hibridaria
amb la mateixa sonda de l'apartat 1 tindria una mida de
a) 540 nucletids en ambds casos
b) 300 nucletids en ambds casos
c) no hi ha hibridaci en el RNA de hepatcits i una banda de 300 nt pels limfcits
d) no hi ha hibridaci en el RNA de hepatcits i una banda de 540 nt pels limfcits
4. La recombinaci somtica est lligada a l'activaci de la transcripci del gens de les immunoglobulines
perqu:
a) el promotor situat a 5' de la regi L-V queda activat per un enhancer situat entre les
regions J i C
b) la recombinaci somtica produeix l'activaci de factors de transcripci especfics dels
limftics B
c) la recombinaci somtica activa la RNA polimerasa II
d) el promotor situat a 5' de la regi L-V queda activat per un enhancer situat entre la
regi L i V
5. Les reordenacions dels gens que codifiquen pels receptors de les cl.lules T sn semblants a les
reordenacions dels gens de les immunoglobulines perqu:
a) la combinaci de les regions V/J/C o V/D/J/C genera variabilitat
b) en ambds casos hi han sequncies heptmer i nonmer involucrades en el procs
de recombinaci somtica
c) es produeix variabilitat en la juntura per la introducci de nucletids P i N
d) les tres anteriors sn correctes
RESPOSTES
A la figura es representa lestructura de la regi genmica de la cadena lleugera tipus
1. resposta correcta a)
La reordenacio dels diferents blocs de seqncies daquest fragment condueix a la sntesi duna cadena
lleugera dantics. Aquesta reordenaci s especfica de teixit, sols t lloc en els limfcits. Per tant es descarten
les respostes c) i d). Donat que la reordenaci sempre implica perdua de DNA, la resposta correcta s la a)
2. Tenint en compte que la mutaci somtica opera en les regions reordenades que es transcriuen i es
concentra en les regions variables, la resposta correcta s la c).
3. per la mateixa ra que lexposada en lapartat 1, la resposta correcta s la c).
4. seguint la teoria, la resposta correcta s la a), les altres sn falses
5. seguint la teoria, la resposta correcta s la d).
SOLUCIONS: A, C, C, A, D.
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RAG1 i RAG2 codifiquen per dues protenes que participen en el procs de la recombinaci somtica.
Per demostrar-ho es poden obtenir ratolins mutants per aquests gens en els quals RAG1 i RAG2 han
estat delecionats.
1. Si fem un Southern de DNA dels linfcits B d'aquests ratolins, digerit amb un enzim de restricci i
hibridat amb una sonda de la regi constant d'una cadena pesada d'un antics
a) obtindrem una banda d'hibridaci de mida diferent de la que obtindrem en un southern fet a partir de
DNA d'un hepatcit del mateix ratol
b) obtindrem una banda d'hibridaci de la mateixa mida de la que obtindrem en un southern fet a partir
de DNA d'un hepatcit del mateix ratol
c) no obtindrem cap banda doncs RAG1 i RAG2 estan delecionats
d) cap de les possibilitats anteriors s certa
2. Per allar RAG1 i RAG2 i demostrar la seva capacitat de produir aquesta recombinaci, el grup de
David Baltimore va fer experiments de transfecci de cllules. Varen utilitzar una lnia cellular incapa
de reordenar segments V(D)J que contenia un fragment de DNA que codificava per un gen de
resistncia a un antibitic. Insertat en aquest gen i trencant la pauta de lectura, hi havia un fragment de
DNA falnquejat per seqncies hetamriques i nonamriques. Aquestes cllules varen ser
transfectades amb un DNA que expressava RAG1 i RAG2. El resultat que esperaries i que
demostraven que RAG1 i RAG2 eren els responsables de la recombinaci somtica varen ser
cllules no transfectades
A) sensibles a l'antibitic
B) sensibles a l'antibitic
C) resistents a l'antibitic
D) resistents a l'antibitic
cel. tranf. amb RAG1 i RAG2

sensibles a l'antibitic
resistents a l'antibitic
sensibles a l'antibitic
resistents a l'antibitic
3. Un altre prova de que RAG1 i RAG2 participen en la recombinaci somtica es pot aconseguir
transfectant fibroblastes de ratol amb aquests gens. Aquesta lnia cellular, que no pateix recombinaci
somtica, quan es transfectat amb aquest gens presenta fenmens de recombinaci. Per veure aix es
poden fer southerns blots de DNA purificats de diferentes lnies cellulars digerits amb el mateix enzim
de restricci i hibridat amb una sonda de la regi constant de la cadena lleugera L_. Quin seria el
resultat esperat?
1: DNA de fibroblastes sense transfectar
2. DNA de fibroblastes transfectats
3. DNA de linfcits B
1
4. Assumint que aquestes lnies cellulars tenen els factors necessaris per l'expressi dels gens
funcionals de les immunoglobulines, el northern que obtindries hibridant amb la mateixa seria:
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5. La funci de les protenes RAG1 i RAG2 en el procs de la recombinaci somtica es

a) introduir els nucletids N a la juntura
b) reconixer les seqncies heptmer i nonmer i tallar el DNA
c) induir mutaci somtica
d) lligar els dos segments que han de quedar units desprs de la recombinaci
RESPOSTES
1. Els limfcits deficients en RAG1 i RAG2 no poden reordenar els fragments de les cadens
lleugeres i pesades de les immunoglobulines. Per tant es mantindr lorganitzaci daquests loci
igual que en qualsevol altre tipus cel.lular. Per tant la resposta c) s la correcta
2. les seqncies heptamriques i nonamriques sern presumiblement reconegudes per RAG1 i RAG 2, que
escindirn el fragment insertat dins el gen de resistncia i es rescatar el genotip silvestre. Per tant la resposta
correcte s la b)
3.El resultat esperat seria c). Els fibroblasts no reordenen mai els gens de les cadenes lleugeres, la reordenaci
de fibroblasts transfectats implicar segment V i J diferents que els del limfcit B,. Endems donat que es
reordena un al.lel, i que si aquesta reordenaci s productiva, no cal que es reordeni laltre, esperarem una
banda com, igual en els tres carrils (la de tamany ms gran), i una banda addicional de mida diferent en el carril
de les cl.lules transfectades i en la dels limfcits B.
4. Esperariem no expressi en el primer carril perqu els fibroblasts mai expresen els gens de les
immunoglobulines, i detectariem producte de transcripci en el carril 2 i 3, perqu en ambds casos la
reordenaci ha estimulat lexpressi. I el producte que esperem es de tamany molt semblant.
La resposta correcte s la d)
5. La resposta correcte s la d) (s? Pues yo creo que es la B)
SOLUCIONS: C, B, C, D, B!.
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ATENCIN: SE TIENEN EVIDENCIAS DE UN PACK DE

EXMENES DE OTROS AOS QUE VA PASANDO DE
MANO EN MANO. SE ACONSEJA CONSEGUIRLO, YA
QUE SE SOSPECHA QUE LAS PREGUNTAS SON
RECURRENTES. LA LTIMA PERSONA QUE FUE VISTA
CON L, ERA UNA CHICA CON EL PELO MORENO
RIZADO QUE HACE BIOQUMICA.
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PROBLEMA 1
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Genética Molecular Procariotas y Eucariotas

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Gentica

Biologa. Curso 2007-08.

TEMA 1: LA TRANSCRIPCIN PROCARIOTA.

Caja -35. Dominio

TATA box caja-10

Caja CAT. En el 90% de los

Las distancias entre la caja -35 y la tata box, y entre

pb respectivamente. Siempre se debe mantener ste nmero de

, y ms adelante tambin se pierden las dos . Slo

3.2. Terminacin Rho-Dependiente Extrnseca: se

TEMA 2: LA TRANSCRIPCIN PROCARIOTA:

La protena C es la represora, y la protena CAP (con AMPc)

tapa fsicamente el contacto de CRP con la RNA Polimerasa

- cuando hay mucha arabinosa y sin glucosa, sucede que

Se deshace el loop en el DNA, las subunidades de la RNA

Implica a las protenas LexA y RecA (sta ltima es muy

OJO: Las subunidades estn presentes por todos los

CONDICIONES ADVERSAS (MUCHA T, CO2)

GENES QUE INICIAN

La integracin de en el genoma de E.Coli siempre es en el

Cuando el fago entra en E.Coli, se circulariza y sus

afinidad, as se llega a unir a la RNA Polimerasa y hace

N y Cro son las protenas primerencas, que vienen de los

son reprimidos por Cro, har ciclo ltico si la bacteria se

Con lisis (la clula se divide): se transcriben N y Cro; N

La organizacin de los promotores PR y PL de es:

Molecularmente, la protena CI presenta un dominio de unin

Tambin tiene dominios de unin a la RNA Polimerasa y a

Dcha: CI con poca [ ]. Izq: CI con mucha [ ]. Ntense los

debe activarse por CII/CIII. EL Pint est dentro de Xis

Y si hay lisogenia, pues como CII/CIII estimulan al Pint,

Sobre la induccin de , consiste en la desinsercin del

araA Gene Product

Control de loper arabinosa

Resposta: Podrem analitzar el problema en dues situacions diferents: en condicions ltiques i en

Si no hi ha Cro, CI inibeix PR i PL i hi haur lisognia. Noms en condicions ltiques extremes, en qu CII

La protena Q s necessria per engegar la transcripci tardana. Si no hi ha Q no pot haver-hi lisi i

suboperador Efecte sobre efecte

Inv (OL3 - OL2 -OL1)

A continuaci realitzaren diversos experiments dinfecci duna soca bacteriana d E.coli i

En infectar E.coli amb el fag mutant ts-cI + ts-Q a 42OC:

L3-O L2-O L1)

TEMA 3: LA TRANSCRIPCIN EUCARIOTA I.

Pero no todos los RNA son as, depende el tipo de gen.

mitocondrial. Resistente a la la Procariota.

Todas las RNA polimerasas Eucariotas tienen estructura

Un cluster es una unidad de x genes que se van repitiendo

El ITS/ETS son los Internal Spaciator y External Spaciator.

2, se corta a 5 del 58S (por dentro del 5ITS) y a dos

3, se aparean por complementariedad el 58S y el 28S,

4, se corta el 3ETS del 28S y el rabito 5ITS de 58S,

El promotor de los genes de clase I se encuentra dentro de

Sobre la regin IGS, tiene:

La regin IGS se transcribe parcialmente, ya que el

Genes de Clase II.

La caja InR es reconocida por el GTF llamado TF2D, que

- TF2A: se une a TF2D estabilizndolo. Si es un gen que

Los genes de clase II sufren una serie de modificaciones

1) Capping: consiste en aadir un nt nuevo al 5 del RNA

La caja AAUAAA es reconocida por CPSF (Cleavage &

procesamiento, excepto el tRNA que sufre modificaciones y

b) Quina s la posible localitzaci de la regi de control que regula el gen 5S-rRNA?