Universidad Nacional Autnoma de Mxico.

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza.

Ingeniera Qumica.
Materia: Laboratorio de Ciencias Bsicas III.
Nombre: Ismael Trejo Nez.
Profesor(a): Jos Luis Len Romo.
Practica 3: cromatografa en capa fina y columna de
clorofila.
Fecha de entrega: 13/09/2016.

RESUMEN.

En la realizacin de este proyecto experimental se observ y confirmo como

ocurra una cromatografa en capa fina, as como la relevancia que tiene este
proceso fisicoqumico de separacin en el cual se extrajo clorofila de hojas de
espinaca, para posteriormente tomar una cromatoplaca ya elaborada en
acetato de etilo para la capa fina, y en ella agregar el extracto de clorofila en
una cmara cerrada que contena eluyente, que en este caso se hizo con
hexano. Se midi su Rf dando como resultado 0.67, en hexano. Tomando en
cuenta que dicho Rf (factor de retencin) se calcul haciendo una divisin de la
distancia recorrida desde el origen por el compuesto entre la distancia recorrida
desde el origen por el frente del eluyente. En cuanto a la cromatografa en
columna se empaco de una manera para que la muestra resultara como en la
literatura previamente investigada empleando ter de petrleo para
posteriormente agregar la muestra obtuvieron 3 tubos: uno de clorofilas, otro de
xantofilas y tambin de carotenos.

INTRODUCCIN.

La cromatografa es un proceso fisicoqumico de separacin de solutos,

tomando en cuenta las diferentes velocidades con las que se mueve cada
soluto en un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. Las
molculas de soluto de la mezcla son retenidas por la fase estacionaria y
arrastradas por la fase mvil, de manera que si los componentes de la mezcla
presentan diferentes afinidades por alguna de las fases, sus velocidades
medias de avance a lo largo del sistema sern diferentes. Los componentes
que sean fuertemente retenidos por la fase estacionaria se movern ms
lentamente a lo largo de dicha fase que aquellos que se unen dbilmente. La
cromatografa es una tcnica extremadamente verstil, que permite tanto la
separacin de mezclas como la purificacin de productos, la determinacin del
grado de pureza de un compuesto, el seguimiento de reacciones o la deteccin
y caracterizacin de compuestos. Su principal ventaja frente a otros mtodos
de separacin y purificacin consiste en que sta tcnica puede aplicarse a
cantidades muy pequeas de producto.
Las tcnicas cromatogrficas se pueden clasificar atendiendo a varios criterios:
naturaleza de las fases (slido, lquido, gas), relacin de polaridad de las fases
(fase normal, fase inversa), mecanismo de separacin (adsorcin, exclusin,
intercambio inico, reparto, afinidad), disposicin de las fases (en columna, en

plano) y forma de desarrollo del proceso (frontal, de desplazamiento, de

elucin).
En la cromatografa de capa fina la fase estacionaria se deposita, formando
una capa delgada, sobre un material de soporte tal como placas de vidrio o
aluminio. La fase mvil asciende a lo largo de la fase estacionaria por
capilaridad, producindose la separacin de los componentes de la muestra en
base a su diferente distribucin entre la fase mvil y la fase estacionaria. Una
de las principales aplicaciones de la CCF es seleccionar las condiciones
ptimas para llevar a cabo una Cromatografa correctamente. En la
cromatografa de capa fina la altura mxima que alcanza el disolvente en la
placa recibe el nombre de frente de disolvente, y se utiliza como referencia
para calcular las distancias relativas recorridas por los componentes de la
mezcla en el cromatograma, cuyo Rf se calcula de la siguiente forma:

El Rf depende tanto de las condiciones experimentales (temperatura, grado de

saturacin de la cmara de desarrollo y cantidad de muestra.) como de la
composicin de la fase mvil y de la fase estacionaria, pero es una constante
fsica (al igual que el punto de fusin) de cada especie qumica. Por este
motivo, para un sistema cromatogrfico dado (condiciones experimentales/fase
estacionaria/fase mvil), el valor de Rf de un compuesto determinado es
constante, permitiendo la identificacin de especies.
Otra tcnica de cromatografa conocida como de columna en la cual la
muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de una columna
no sin antes haber depositado un pequeo tapn de algodn, una fase
estacionaria como algn solido granulado o en polvo y una fase mvil como un
disolvente. Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase
estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que
cada uno de los componentes de una mezcla establecer interacciones
diferentes con la fase estacionaria y la mvil, sern transportados a diferentes
velocidades y se conseguir su separacin. As, de manera similar a otros tipos
de cromatografa, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a
travs del medio slido se corresponden con diferencias en los tiempos de
elucin por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes
de la muestra original, que se recogern en fracciones diferentes.
Las clorofilas (del griego, chloros "verde" y flon "hoja") son una familia de
pigmentos de color verde que se encuentran en las cianobacterias y en todos
aquellos organismos que contienen cloroplastos en sus clulas, lo que incluye

a las plantas y a los diversos grupos de protistas, crtica en la fotosntesis,

proceso que permite a las plantas absorber energa a partir de la luz.

MARCO TERICO.

La cromatografa es la tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la

velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser
arrastrados por una fase mvil (liquida o gaseosa) a travs de cromatoplaca
que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser slida o lquida. La
cromatografa fue descubierta por el botnico ruso de origen italiano Mijail
Tswett en 1903. Tswett separo los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo
extracto de hojas verde en ter de petrleo sobre una columna de carbonato de
calcio en polvo en el interior de una probeta. Para Cromatografa en capa fina
la muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de un cubreobjetos
que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente(fase
estacionaria). Entonces, la en una cubeta cerrada que contiene uno o varios
disolventes mezclados (fase mvil). A medida que la mezcla de disolventes
asciende por capilaridad a travs del adsorbente, se produce un reparto
diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el
adsorbente. Para la cromatografa en columna se busca la polaridad del
eluyente que afecta las velocidades relativas con las que los diferentes
componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares
compiten ms eficientemente con las molculas polares de una mezcla por los
lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazar las
molculas, incluyendo las ms polares, rpidamente a travs de la columna. Si
el disolvente es muy polar la elucin ser muy rpida y generalmente habr
poca separacin de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el
disolvente es muy apolar, no eluirn los compuestos de la columna. Por lo
tanto, la eleccin del eluyente es crucial para el xito de la cromatografa en
columna. A menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la
elucin. La clorofila fue descubierta en 1817 por los qumicos franceses
Pelletier (17881842) y Caventou (17951877), que consiguieron aislarla de las
hojas de las plantas. Pelletier introdujo los mtodos, basados en la utilizacin
de disolventes suaves, que permitieron por primera vez aislar no solo la
clorofila, sino sustancias de gran importancia farmacolgica como la cafena, la
colchicina o la quinina.
Las clorofilas son un grupo de pigmentos verdes que se encuentran en
diversas clulas eucariotas que poseen cloroplastos (plantas, algas) y algunos
procariotas Externos: (Vesculas, Lamelas, Cromatforos) y se encuentran en
el dominio eubacteria y eucarya. Las clorofilas tienen tpicamente dos tipos de
absorcin en el espectro visible, uno en el entorno de la luz azul (400-500 nm

de longitud de onda), y otro en la zona roja del espectro (600-700 nm); sin
embargo reflejan la parte media del espectro, la ms nutrida y correspondiente
al color verde (500-600 nm). Esta es la razn por la que las clorofilas tienen
color verde y se lo confieren a los organismos, o a aquellos tejidos, que tienen
cloroplastos activos en sus clulas.
OBJETIVOS:
OBJETIVO GENERAL:
Extraer y separar diferentes pigmentos vegetales empleando dos mtodos
distintos como la cromatografa en capa fina y en columna.
OBJETIVO ESPECFICO:
Escoger el material adecuado para extraer clorofilas y desarrollar una
cromatografa de capa fina. Aplicar experimentalmente la extraccin por
solventes, as como empacar y desarrollar una columna de fraccionamiento.
Indicar los diferentes pigmentos fotosintticos en la columna de acuerdo a su
polaridad.

HIPTESIS.

Las concentraciones que se agregaran a la placa de cromatografa es

totalmente afn a la fase mvil que a la fase estacionaria por lo tanto se
observara al final que las concentraciones se corrieron es decir habr un
desplazamiento desde el lugar de origen (donde fueron agregadas las
concentraciones) al otro extremo de la placa de cromatografa. Dentro de la
columna si se realiza una extraccin de las clorofilas de la espinaca que es una
planta verde, con disolventes orgnicos como el ter de petrleo en el cul las
clorofilas son solubles y adems se hace una cromatografa de adsorcin por
columna, utilizando disolventes apropiados como ter de petrleo el cul
presenta afinidad por estos pigmentos, entonces se podr separar y obtener las
distintas clorofilas que componen los pigmentos fotosintticos de las espinacas.

LISTA DE MATERIALES. (EXTRACCIN Y CROMATOGRAFIA EN CAPA

FINA)

1 mortero con pistilo.

3 pipetas de Pasteur con capacidad

de 10 ml c/u.

3 capilares.

1 tubo de ensayo.

1 jeringa
manguera.

1 vidrio de reloj.

1 embudo Buchner.

1 embudo de separacin.

3 frascos de vidrios de comida para

bebe (Gerber) limpios.

1 probeta graduada (100 ml).

2 vasos de precipitados (100 ml).

con

un

pedazo

de

1 cartulina de papel filtro.

1 Encendedor.

REACTIVOS.

45 ml de ter de petrleo.

50 gr de cloruro de sodio.

5 ml de benceno.

10 gr de sulfato de sodio anhidro.

15 ml de metanol.

EQUIPO.
Balanza analtica.
PROCEDIMIENTO.
A.- EXTRACCIN
1.- Dentro de una balanza analtica encima del vidrio de reloj, pesar 8 gramos
de hojas de espinaca.
2.-Agregar el contenido pesado en un mortero con pistilo y machacar hasta
obtener una pasta homognea y espesa.
3.-En una probeta diferente agregar 45 ml de ter de petrleo, 5 ml de
benceno y 15 ml de metanol.
4.-Colocar la pasta en un vaso de precipitados, posteriormente la mezcla de
disolventes y agitar de manera intermitente por 1 hora, logrando obtener una
suspensin.

5.-Filtrar la suspensin rpidamente en el Buchner y lavar con la mezcla

disolvente. Pasar el filtrado a un embudo de separacin.
6.-Lavar el filtrado con agua helada, mezclndolo con un movimiento rotacional,
sin agitar demasiado, para impedir la oxidacin de los pigmentos.
7.-Separar la capa de metanol-agua y la otra se lava con una solucin saturada
de cloruro de sodio (sal comn), posteriormente secar con 2 gr de sulfato de
sodio anhidro.
8.- Con ayuda de alguien, calentar con un encendedor la parte de en medio del
capilar y jalar los extremos rpidamente.
9.- Con los capilares agregar diferentes concentraciones de extracto en las
cromatoplacas de preferencia en la parte inferior en lnea horizontal y en la
placa agregar 2 diferentes concentraciones.
10.- en el frasco colocar dentro un cuadro del tamao del frasco, despus
agregar el eluyente a utilizar en cada frasco cubriendo el asiento del mismo
para que haga contacto con las concentraciones y al ltimo colocar la placa al
frasco y dejar pasar de 5 a 10 minutos.
11.- pasado dicho tiempo, sacar las placas y tomar medidas de la muestra.

Ejemplo de toma de medidas de las muestras.

RESULTADOS.
Se calcul el Rf de la siguiente manera:

Rf del hexano:
Rf=3.0/4.5=0.67
Se mantuvo en el lmite ideal de 0.65 a 0.7.
ANLISIS DE RESULTADOS.

Se emplearon disolventes como todos ellos muy voltiles, se coloc la placa de

manera que tuviera contacto con el eluyente no obstante si se consigui tener
resultados aproximados con los correctos aunque no exactos. Pudimos
comprobar nuestra hiptesis anteriormente planteada, porque si hubo un
desplazamiento dentro de las cromatoplacas en las que se trabaj y se lleg a
alcanzar un resultado dentro de lo ideal en cada cromatoplaca.

LISTA DE MATERIALES. (CROMATOGRAFIA EN COLUMNA)

1 vaso de precipitado de 150mL

1 bureta (2X20cm).

1 probeta de 100ml.

3 tubos de ensaye.

1 embudo de filtracin.

1 gradilla.

3 pipetas de 10ml.

1 pedazo pequeo de algodn.

REACTIVOS.
4 ml de extracto de clorofila.

30ml de acetona.

30ml de ter de petrleo.

30ml de ter etlico.

20 gr de Gel de slice para columna

(como adsorbente).

30 ml de benceno.

B.- PREPARACIN DE LA COLUMNA:

1.-Colocar un tapn de algodn en el extremo de la columna.
2.-Empacar cuidadosamente agregando el gel de slice, aadiendo con un
embudo, el ter de petrleo, cuidando de no forzar el empaque. La columna debe
quedar de 20 cm aproximadamente.

C.- CORRIMIENTO DE LA MUESTRA:

1.-La muestra se suspende al agregar ter de petrleo, abrir constante mente la
llave para que no se seque el gel de slice.
2.- Introducir cuidadosamente la solucin de la muestra en la columna con una
pipeta, y despus colocar un pedazo de algodn
3.-Preparar 12ml de solucin ter de petrleo, acetona y ter etlico en la siguiente
proporcin: 2:1:1. agregar a la bureta y observar el corrimiento. Colocar tubos de
ensaye debajo de la llave conforme vayan bajando y dispersndose las bandas de
colores. Cambiar de tubo cada que se obtenga una coloracin diferente.
4.- Preparar 10ml de solucin benceno y acetona en la en la siguiente proporcin:
7:3, agregar una vez que haya terminado el corrimiento de la solucin anterior.
Cambiar de tubo cada que se obtenga una coloracin diferente.

RESULTADOS.

El corrimiento de la muestra para la separacin de los pigmentos de las clorofilas

se desarroll con ter de petrleo. Poco a poco se iban separando los pigmentos y
esto se observaba en la almina. Se iban separando los pigmentos en sus
distintas tonalidades: abajo amarillo, verde claro, verde intenso y arriba quedaba
de nuevo el amarillo. Se obtuvieron los 3 tipos de clorofilas existentes en gran
cantidad: 1 tubo de xantofilas, 1 tubo de clorofila y 1 tubo completo de carotenos.
Las primeras clorofilas formadas fueron de xantofilas: La primera capa formada
fue de color amarillo transparente, despus la siguiente capa fue de color verde
claro, seguida. de un verde intenso. Por ltimo, se obtuvo un tubo completamente
lleno de carotenos en color amarillo ms intenso que las xantofilas.

ANLISIS DE RESULTADOS.
La extraccin de las clorofilas se realiz con una mezcla donde se realiz una
extraccin lquido-lquido en un embudo de separacin en solucin saturada de
NaCl (para evitar que se formaran emulsiones). Al realizar la cromatografa de
adsorcin en el que el medio fue la almina (fase estacionaria) se emple ter de
petrleo, de manera que el eluyente comenz a bajar por la columna y los
componentes de la mezcla fueron adsorbidos por la fase estacionaria con
diferente intensidad, de manera que el proceso de adsorcin-desorcin hizo que
unos componentes avanzaran ms rpidamente que otros. Aparecieron varias
bandas de diferentes colores que estuvieron ms o menos alejados de la
disolucin de ter de petrleo segn la mayor o menor solubilidad de los
pigmentos en dicha disolucin. Estas bandas tenan diferente grosor, dependiendo
de la abundancia del pigmento en la disolucin. Las que tenan ms afinidad por el
disolvente bajaban ms rpido que los otros pigmentos. Las primeras clorofilas
que se extrajeron fueron las xantofilas, las cules son de color amarillo y olivo.
Estas se obtuvieron en pequea cantidad cada uno de sus coloraciones
diferentes. Despus se obtuvo la clorofila, la cual se obtuvo en mayor cantidad.
Por ltimo, se obtuvieron los carotenos que fueron de color amarillo ms intenso
que las xantofilas y estos se obtuvieron al final debido a que eran menos afines al
disolvente empleado.

CONCLUSIONES.

Se obtuvieron los pigmentos fotosintticos de la clorofila, que son los que les dan
color a las hojas de las plantas ya que la fotosntesis es un proceso que permite a
los vegetales obtener la materia y la energa que necesitan para desarrollar sus
funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos
jvenes de pigmentos, capaces de captar la energa lumnica. Gracias a esta
prctica, se logr observar cmo cambian las tonalidades de estos pigmentos
fotosintticos que componen a las plantas y se encuentran en los cloroplastos de
la clula vegetal y les dan color al reflejar o transmitir la luz visible, adems de que
son los que constituyen el sustrato fisicoqumico de la fotosntesis mediante dos
procedimientos distinto de cromatografa: capa fina y columna.

Bibliografa.

Luis P, (1982). Bioqumica Estructural, 2da Ed. Editorial AC. Espaa, 1996.
Smith I, Feinberg JG (1965) Paper & Thin Layer Chromatography and
Electrophoresis. Shandon Scientific Company Ltd.
Bermdez A, Bernal J, Espinosa E, Cornejo W, Briceo I, Prieto JC, Arrieta L.
Propuesta para un protocolo de diagnstico, ediciones especial. Argentina, 1988.
D. T. Dennis and D.H. Turpin (eds). Plantmetabolism. Plant physiology,
Biochemistry, andMolecular Biology. Orlando, USA: Academic Press,1998.
H.W. Heldt. Plant Biochemistry and Molecular Biology. Oxford (U.K.): Oxford
University Press,2004.
Frank B. Salisbury, Cleon W. Ross. FisiologaVegetal. Mxico: Grupo Editorial
Iberoamericana,1994. (traduccin de la 4 edicin original en ingls:Plant
Physiology. Wadsworth, 1992).
L. Taiz, E. Zeiger. Plant Physiology. Sunderland,Massachussets: Sinauer
Associates Inc., 2002.