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Rassegna delle metodologie di stima dellincertezza

di misura nelle prove microbiologiche con cenni alle


novit introdotte dalla ISO 29201:2012
per la matrice acqua
Dino Spolaor
Veneto Agricoltura Istituto per la Qualit e le Tecnologie Agroalimentari

ISO 7218:2007
MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING
STUFFS GENERAL REQUIREMENTS AND GUIDANCE
FOR MICROBIOLOGICAL EXAMINATION

Scopo e Campo di applicazione - Guida per i laboratori di


microbiologia - Applicabile ad alimenti e mangimi, allambiente di
produzione e manipolazione degli alimenti.

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CALCOLO DEL CONTEGGIO


(ISO 7218)
Un grande impegno dei laboratori per
calcolare lincertezza di misura ma
assicuriamoci prima di applicare
correttamente la formula di calcolo del
conteggio!

N=

C
V(n1 + 0,1n2 )d

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UFC / g
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

Riepilogo modalit di
espressione del risultato

UFC stimate / g

m.o. presenti ma inferiori a 4/d UFC/g


m.o. inferiori a 1/d UFC/g

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ISO / TS 19036:2006
Microbiologia degli alimenti
Linea Guida per la stima dellincertezza di
misura per le determinazioni quantitative

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ISO / TS 19036:2006
Campo di Applicazione
- Prodotti destinati al consumo umano ed animale
- Campioni ambientali (aree di produzione e manipolazione
alimenti)

NON APPLICABILE
- Prove in MPN
- Prove quantitative con bassa concentrazione di m.o. (UFC<10)
Amd1:2009
- Prove QUALITATIVE
elaborazione di un nuovo documento

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sR DI UN METODO
valutazione INTRALABORATORIO
Protocollo
- Matrice (realmente contaminate /m.o. stressati)
- Sottocampione (utilizzato per prelevare la porzione
per test)

- Almeno 10 campioni per ciascuna matrice


- Diversi giorni in un lungo periodo di tempo
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SCARTO TIPO DI RIPRODUCIBILITA(sR)

QUANDO CALCOLARLO?
Per ciascun tipo di m.o. target (o gruppi)
Per ciascuna matrice (o gruppi)
Per ciascun metodo

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Problema: quali matrici?


Secondo criteri di tipo fisico
Categoria I
Liquidi e polveri (es. latte, latte di cocco, acqua, latte essiccato, caseinati,
cipolle in polvere)

Categoria II
Solidi ben miscelati (es. carne macinata, carne separata meccanicamente,
salumi, crushed meat, panna montata, gelato al latte, crema di soia, ecc.)

Categoria III
Solidi di piccola taglia (es. prezzemolo/funghi essiccati, carote e sedano rapa
grattugiati, tagliolini secchi, insalata IV gamma, gamberetti, cozze, cereali, mangimi, nocciole
tritate)

Categoria IV
Altri solidi (carni non tritate, formaggi, prodotti di pasticceria, pesce, piatti
pronti, prosciutto,)
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U = 2S R

Incertezza estesa U
UGUALE PER TUTTI?

E caratteristica di un laboratorio
E correlata ad un dato ottenuto in specifiche
condizioni (operatori, apparecchiature, reagenti, )

Non caratteristica di un metodo analitico di


per s, indipendentemente dal laboratorio che
la calcola (legame metodo-laboratorio)

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Stesso campione (instabile)


analizzato da due operatori diversi

contemporaneamente

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Stesso campione (stabile) analizzato


dallo stesso operatore in giorni diversi

GIORNO 1

GIORNO 2

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sR DI UN METODO
valutazione INTRALABORATORIO
Protocollo
- Campioni con diversi livelli di contaminazione (quelli
usuali del lab)
- Calcolo SR non per livello
- Trasformazione log dei dati (stabilizzazione della varianza di
riproducibilit / livelli di contaminazione (<10 ufc escluse!)

- Contaminazione artificiale (se richiesta): attenzione al


nuovo elemento di variabilit (simulare il pi possibile
la contaminazione naturale in termine di m.o. stressati /
di competizione / background microflora)
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sR INTRALABORATORIO
i =n

sR =

(log a log b )
i =1

2n

ai e bi = primo e secondo risultato della prova sullo stesso campione


(logai-logbi) = differenza tra i 2 risultati, espressi in logaritmo decimale
n = numero di prove eseguite in doppio (n 10)
i = 1, 2, n
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sR INTRALABORATORIO

Radice della Sommatoria/n

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ISO /TS 19036:2006 /Amd1:2009

... la ISO 19036:2006/Amd1:2009 parte dallassunto


che la stima dellincertezza di misura basata sul
calcolo dello scarto tipo di riproducibilit, limitata
alle conte superiori a 10 UFC/piastra, trascuri
lerrore casuale dato dalla distribuzione di Poisson.

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ISO /TS 19036:2006 /Amd1:2009

Se C > Clim
incertezza estesa calcolata con
scarto tipo di riproducibilit

U = 2S R

Se C Clim
vengono combinate le due
componenti

U =2

2
R

0,18861
C

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Concetto delle basse conte


200
180

U=0,20

Area di applicazione
dell'AMD 1:2009

160

140
120
Valore C lim

U=0,25

100
80

U=0,30

60

U=0,35
U=0,40

40

U=0,45
U=0,50

20
0
0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

Somma delle colonie in piastra

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INCERTEZZA DI MISURA
(ISO/TS 19036:2006 )

3. COME va espressa?
- Risultato ed Intervallo in log10
5,0 log 0,2 log(UFC)/g oppure 5,0 log [ 4,8 , 5,2 ]

Risultato ed Intervallo in Valore naturale


100.000 UFC/g [ 63.000 , 160.000 ]
105 UFC/g [ 6,3 x 104, 1,6 x 105 ]

Intervallo in percentuale
100.000 UFC/g [ 100.000 -37% , 100.000 +58% ]

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INCERTEZZA DI MISURA
(ISO/TS 19036:2006 )

4. DOVE va espressa?
Sul R. di P.: come incertezza estesa U associata al
risultato nella sua stessa forma (log, n) oppure
espressa in percentuale (%)
Definiti: il Livello di probabilit p ed il Fattore di
copertura k
Gradi di Libert: N.A.
Recupero: N.A.

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Ma se la matrice

ACQUA?

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CALCOLO DELLINTERVALLO DI FIDUCIA


UNI

ENV ISO 13843:2003. Qualit dellacqua Guida per


la validazione di metodi microbiologici
UNI 10674:2002. Acque destinate al consumo umano
Guida generale per determinazioni microbiologiche
ISO 8199:2005 Water quality General guidance on the
enumeration of micro-organisms by culture
ISO 29201 - Water quality The variability of test results
and the uncertainty of measurement of microbiological
enumeration methods
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ISO 8199:2005 Water quality General guidance on


the enumeration of micro-organisms by culture
Calcolo intervallo di fiducia (IF)

per Z20

Z
2 Z
C s 95 % IF =

Vtot
Vtot

Vs

per Z<20

Z + 2 2 Z +1
Vs
C s 95% IF =

V
V
tot
tot

dove
Cs la stima del numero espresso come UFC (conteggio) nel volume di riferimento Vs.
Z la somma delle colonie contate sulle piastre o membrane derivate dalle diluizioni
considerate nel calcolo del risultato
Vtot il volume totale del campione originale distribuito nelle piastre sottoposte a conta.
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ISO 29201:2012
Water quality The variability of
test results and the uncertainty of
measurement of microbiological
enumeration methods

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ISO/DIS 29201
Water quality The variability of test results
and the uncertainty of measurement of
microbiological enumeration methods

Presentazione di due approcci principali


Breve descrizione di altri approcci nazionali
(francese, norvegese, inglese e neozelandese)

Criteri di scelta tra i 2 approcci


Esempi applicativi

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Di cosa tratta
Component approach (adatto per i lab che
monitorano regolarmente ogni fase analitica)
Black-box approach (la via pi agevole per
laboratori che non studiano nei dettagli le fasi
analitiche)
Guida alla scelta dellapproccio pi efficiente
o pi pratico anche se in teoria dovrebbero
portare a risultati molto simili
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Component approach
Anche conosciuto come
Bottom-up o step-by-step approach
Basato sul principio della legge di
propagazione dellincertezza

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Black-box approach
Conosciuto come
Top-down o global approach
Basato sullanalisi statistica di serie di osservazioni
ripetute del risultato finale (ISO/TS 19036:2006)
Non richiesto di quantificare o conoscere
esattamente le cause dellincertezza; lincertezza
stimata sar applicabile ai successivi risultati del
laboratorio ottenuti con lo stesso metodo.

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ISO 29201:2012
Scopo e campo di applicazione
Analisi microbiologiche quantitative
Unit formanti colonie (UFC)
Most Probable Number (MPN)
Modalit di espressione
Incertezza tipo (standard uncertainty)
Incertezza tipo relativa (relative standard
uncertainty)
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Incertezza estesa
(expanded uncertainty)
Il valore di incertezza (incertezza composta
combined uncertainty) usato per valutare
soglie legate alla sicurezza igienica o alla
salute pubblica viene moltiplicato per un
fattore di copertura k = 2 (95%) per
estendere - a scopo di cautela - la fascia di
incertezza
U=kuc(y)
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Limiti del global approach


Avvicinandosi alle basse conte
i risultati imprevedibili tendono ad aumentare
Lapproccio globale mal si adatta
alle basse conte,
alla fase di conferma delle colonie,
alle conte MPN
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Global approach
modificato dalla ISO 29201:2012
Distinzione tra due parametri di precisione:
PREVEDIBILE (): incertezza della
procedura analitica (variabilit operativa)
IMPREVEDIBILE: distribuzione delle
particelle
Tenere conto di tali 2 sorgenti di incertezza fa
superare le restrizioni previste per le basse
conte
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Variabilit operativa: componenti


Sottocampionamento e miscelazione (Subsampling and
mixing)

Diluizione (Dilution)
Inoculo (Delivery of test portion(s) into the detection system
of nutrient media)

Crescita durante lincubazione (Development during


incubation)

Conteggio e conferma colonie (Counting and possibly


confirming the (presumptive) target organims)
Nellapproccio globale a tali componenti nel risultato finale si somma
lincertezza data dalla casualit di ditribuzione delle cellule microbiche

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Variabilit intrinseca
Incertezza di distribuzione
Le sospensioni microbiche di norma
seguono la distribuzione di Poisson
Quando la variabilit intrinseca aumenta
considerevolmente (parziale conferma delle
colonie o uso della tecnica MPN) la
sospensione microbica non segue la
distribuzione di Poisson
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BASSE CONTE
Alta variabilit intrinseca
No Distribuzione di Poisson

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Varianza relativa di una conta in singolo

u d2 ,rel =

1
nc

120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%
1

11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49

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36

18

Stima dellincertezza operativa

uo2 = u R2 ' ud2


100%
90%
80%
70%
60%

o
d

50%
40%
30%
20%
10%
0%

6,5

13

15

30

56,5

177

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Dallapproccio globale
il calcolo dellincertezza composta

uo2 = u R2 ' ud2


uc ( y ) = uo2 + ud2

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STIMA DELLE
PRINCIPALI COMPONENTI DELLINCERTEZZA
NELLE PROVE MICROBIOLOGICHE

Matrice e sottocampionamento
Distribuzione cellule microbiche (Poisson)
Volume di inoculo
Fattore di diluizione
Incubazione colture microbiche
Lettura delle piastre
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VALUTAZIONE COMPONENTI
COMPONENTI

SIMBOLI

DETERMINAZIONE

Matrice e sottocampionamento

urel,M

Annex H

Fattore di diluizione

urel,F

Annex K

Volumi di inoculo

urel,V, urel,V Annex I, J

Incubazione

urel,I

Annex M

Conteggio

urel,L

Annex L

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40

20

Sottocampionamento
Acqua e materiali in polvere: la varianza di
sottocampionamento non eccede la varianza
della distribuzione di Poisson
Preferibile studio delle
allapproccio globale

componenti

rispetto

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SOSPENSIONE MICROBICA BEN MISCELATA


(Bassa variabilit intrinseca - S distr. Poisson)

Es. campioni dacqua

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Sottocampionamento
Campioni solidi (la sovradispersione la regola:
preferibile lapproccio globale o studi dedicati alla
stima della varianza del sottocampionamento)
AL CRESCERE DELLETEROGENEITA
DEI CAMPIONI
MIGLIORA PROGRESSIVAMENTE
LEFFICIENZA DELLAPPROCCIO GLOBALE

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ETEROGENEITA CAMPIONI SOLIDI


(Sovradispersione tra sottocampioni)

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Annex HVALUTAZIONE SPERIMENTALE DELLA


VARIANZA DEL SOTTOCAMPIONAMENTO
Non richiesta per le matrici liquide
CAMPIONI SOLIDI
Mescolare accuratamente un campione
Prelevare k sottocampioni (min. 2)
Sospendere in diluente sterile
In condizioni di ripetibilit preparare n serie di
diluizioni (min. 2)
Seminare in piastra n serie di diluizioni e incubare
Leggere le piastre (stesso operatore)
Elaborare i dati (ANOVA) per ricavare lincidenza %
della varianza di sottocampionamento.
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Annex M EFFETTI DELLINCUBAZIONE


INCERTEZZA DOVUTA A POSIZIONE E DURATA

Piccole differenze nelle condizioni di incubazione


(tempo, temperatura, posizione delle piastre, )
possono incidere sul numero di colonie contate.
Esperimento in cui le piastre seminate da una stessa
diluizione in condizioni di ripetibilit vengono
distribuite in modo casuale su ripiani diversi
dellincubatore, in posizioni diverse di ciascun ripiano,
in posizione differente nella pila di piastre.
Dalla varianza totale tra piastre parallele vengono
sottratte la varianza intrinseca (Poisson), lincertezza di
lettura e dei volumi di inoculo, ricavando lincertezza
dovuta allincubazione.

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CALCOLO DELLE COMPONENTI DINCERTEZZA


Annex C
Incertezza dovuta alla Distribuzione di Poisson

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Annex L - Incertezza di conteggio


dovuta alla lettura delle piastre
Incertezza media di conteggio di piastre in singolo
Rilettura in ordine casuale delle piastre
Breve lasso di tempo tra le due letture
Almeno una trentina di piastre

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CALCOLO DELLE COMPONENTI DINCERTEZZA


Annex I e J
Incertezza dovuta al dosaggio degli inoculi

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CALCOLO DELLE COMPONENTI DINCERTEZZA


Annex K
Incertezza dovuta al fattore di diluizione

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CALCOLO DELLE COMPONENTI DINCERTEZZA


Annex E
Eventuale Incertezza di conferma delle colonie

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Componenti dellincertezza
Componenti incertezza

Quando contribuiscono allincertezza?

Distribuzione di Poisson
ud,rel

Comune a tutti i conteggi (di facile calcolo, inversamente


proporzionale al numero di colonie contate)

Volume inoculi e dosaggio


urel,V - urel,V

Comune a tutti i conteggi legata alla ripetibilit di dosaggio degli


inoculi. E richiesta una valutazione sperimentale della ripetibilit del
dosaggio con le pipette.

Fattore di diluizione
urel,F

In presenza di diluizioni ( legata alla numerosit delle diluizioni


allestite e alla ripetibilit di dosaggio dei volumi del diluente) E
richiesta una valutazione sperimentale della ripetibilit del dosaggio del
diluente.

Lettura piastre urel,L

Comune a tutti i conteggi, richiede una preliminare valutazione della


ripetibilit dei conteggi da parte degli operatori.

Conferma colonie urel,x

Solo se richiesta la conferma delle colonie. In tale caso comprende e


quindi sostituisce ud,rel (distribuzione di Poisson)

Incubazione urel,I

Effetto dellincubazione, necessita valutazione sperimentale

Matrice urel,M

Effetto del sottocampionamento, necessita valutazione sperimentale

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Calcolo finale dellincertezza di misura


basata sulla stima delle componenti di incertezza dellanalisi

Incertezza relativa del risultato della prova


Prove che non prevedono la conferma

uc ,rel (y) = uo2,rel + ud2,rel


dove
2
2
2
2
2
uo,rel = urel
, M + urel, F + urel,V + urel, L + urel, I

Incertezza di misura = Risultato x Incertezza relativa

u c, rel (y)

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Metodo semplificato
Basato sul calcolo del parametro G2

NON richiede il calcolo delle singole componenti di incertezza, ma


tiene conto delle componenti date da
- distribuzione di Poisson
- incertezza dei volumi di inoculo
- incertezza di lettura delle piastre

2
n 1

n
z
= 2 z i ln i
vi
i =1

Z
Z ln
V

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27

Metodo semplificato
u(y)/y =

[u( x )/ x ] + [u(F)/F ]
2

In cui

[u ( x ) / x ]

G n2 1 1
=

n 1 Z

Il metodo semplificato permette di valutare lincertezza relativa che


include tutte le componenti casuali che influenzano le conte.

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Diverse combinazioni di conta di colonie


Medesimo conteggio microbico per unit di campione
Prova

Diluizioni

Risultato
(UFC)

G 2n 1
n 1

Incertezza
estesa U

Limite
inferiore

Limite
superiore

10-5

10-5

10-6

10-6

n. 1

249

248

23

24

2,5 x 107

0,05

510.000

2,4 x 107

2,6 x 107

n. 2

240

244

33

27

2,5 x 107

0,99

2.100.000

2,3 x 107

2,7 x 107

n. 3

204

280

28

32

2,5 x 107

4,86

4.700.000

2,0 x 107

3,0 x 107

n. 4

184

300

22

38

2,5 x 107

11,57

7.300.000

1,8 x 107

3,2 x 107

2,5 x 107

ISO
19036

Esempio
0,1 log

2,0 x 107

3,2 x 107

Prove n. 1, 2, 3 e 4

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Vantaggi del metodo semplificato


Metodo semplificato: medesimo conteggio
Incertezza funzione della qualit del dato analitico
3,3E+07
2,9E+07
2,7E+07

Iso 19036

UFC

3,1E+07

2,5E+07
2,3E+07

Lim.inf.
Lim.sup.
Risultato

2,1E+07
1,9E+07
1,7E+07
0,05

0,99

4,86

11,57

Indice G2

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DOCUMENTI di RIFERIMENTO

UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e di
taratura
UNI CEI ENV 13005:2000 - Guida allespressione dellincertezza di misura
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ISO/TS 19036:2006/Amd1.2009 - Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines for the
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UNI ENV ISO 13843:2003. Qualit dellacqua Guida per la validazione di metodi microbiologici
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ISO/DIS 29201 - Water quality The variability of test results and the uncertainty of measurement of
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D.Spolaor - Rassegna delle medodologie di stima dell'incertezza di misura - 07.12.2012

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