I.

II.

III.
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PRCTICA N 5
MEDIOS DE CULTIVO:
INTRODUCCIN:
Las bacterias necesitan una serie de compuestos para su desarrollo y crecimiento
(fuentes de carbono, nitrgeno, elementos minerales y factores favorables para su
crecimiento).
Los medios de cultivo son sustratos o soluciones de nutrientes en los que crecen y se
multiplican los microorganismos en el laboratorio con el objeto de aislar las diferentes
especies bacterianas, proceder a su identificacin y llevar a cabo una serie de estudios
complementarios.
OBJETIVOS:
Preparar medios de cultivo lquidos y slidos.
Realizar diferentes formas de preparacin e identificacin de los
medios de cultivo.
Plaqueo y reparto de los medios de cultivo.
FUNDAMENTO TERICO:
Constituyentes de los medios de cultivo bacteriolgico:
Fuentes de energa: carbono, nitrgeno.
Sale minerales: azufre y fsforo.
Iones metlicos: sodio, potasio, magnesio. A concentraciones ms bajas.
Zinc, manganeso, cobre, cobalto, molibdeno.
Factores de crecimiento: cierto tipo de aminocidos ejemplo cistina,
sangre suero , extracto de levadura.
Factores de arranque: sustancias que permiten ala bacteria salir de fase
latente y comenzar con la fase de crecimiento exponencial ejemplo algn ion que
estimula el crecimiento.
Factores inhibidores: sirve para inhibir el crecimiento de determinadas
especies bacterianas no deseadas ejemplo de colorantes de anilina (Ej. Verde brillante
o eosina), metales pesados (bismuto) sustancias qumicas (azidas, citrato, selenito).
Agentes anti microbianos (por Ej. Neomicina, colistina, vancomisina, cloranfenicol).
Fuentes de carbono
Estn ligados a metabolismo energtico, corresponde a los azucares en forma de
monosacridos y disacridos: glucosa, lactosa, sacarosa, otras bacterias utilizan
azucares mas complejo para obtener energa como almidones. Existen bacterias
capaces de utilizar sustancias mas sencillas como el acido actico, citrato de sodio.
Fuentes de nitrgeno
Es una fuente menos energtica que la fuente de carbono es necesario para el
metabolismo microbiano produciendo energa, tenemos a las protenas, polipptidos y
aminocidos. Peptonas: corresponde pptidos y polipptidos.
La casena es la peptona sometida la proceso de digestin debido a la digestin acido
utilizada en muchos medios de cultivo, sobre todo en forma de peptona tripsica de
casena.
CONDICIONES PARA UN MEDIO DE CULTIVO:
Temperatura ptima:
La temperatura es una de los factores ambientales que afectan el crecimiento y la
supervivencia microbiana.
Se debe mantener la temperatura apropiada segn la especie bacteriana:
Bacterias psicrfilas: cuando crecen a temperaturas menores de 20 C
Bacterias mesfilas: crecen a temperaturas entre 18C y 45C
Bacterias termfilas crecen a temperaturas mayores de 45C
Las bacterias patgenas para el hombre crecen a temperaturas ptimas de 37C
Presin osmtica:

Se suele trabajar a condiciones isotnicas (300miliosmoles) aunque existen bacterias

que pueden crecer a condiciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotnicos;
este hecho es debido a su pared rgida que permite que el agua no penetre en la
bacteria y este se rompa.
Otro caso en bacterias halgenas su crecimiento se produce especialmente a
concentraciones muy altas de cloruro de sodio, Staphylococcus es capaz de crecer
a7.5%ClNa, Enterococcusa 6.5% de ClNa. Las bacterias no suelen tolerar las grandes
concentraciones salinas de all que la salazn es un buen mtodo de conservacin.
Presencia y ausencia de oxigeno:
Los microorganismos varan en sus necesidades o tolerancia al oxgeno. Aerobios: son
capaces de crecer en presencia de oxgeno, microaerfilos: necesitan menor proporcin
de oxgeno. Anaerobios: crecen con absoluta o relativa ausencia de oxgeno. Anaerobios
obligados solo se desarrollan en ausencia de oxgeno y anaerobios facultativos crecen
en aerobiosis y en anaerobiosis.
pH
Existen sustancias que van a establecer el pH del medio a estas se conocen como
tapones o buffers. Proporcionan al medio un pH adecuado y establece que facilita el
crecimiento bacteriano. El pH ptimo en la mayora de casos es cercano a la
neutralidad, aunque existen bacterias que pueden crecer al pH muy bajo prximo a 0 los
Thiobacilos, otros pH alcalino pH 8 Proteos, pH 9 Vibrio.
En los medios de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia del
metabolismo que se produce en la degradacin de los nutriente y fermentacin glucocida
(acidificacin del medio), degradacin proteica se alcaniliza el medio por sales de
amoniaco.

a)
b)

a)
b)
c)
a)
b)
c)

d)
o

CLASIFICACION:
POR SU ORIGEN:
Naturales: donde no hay mucha modificacin: por ej. Leche, papa, etc.
Artificiales o sintticos: Donde ha habido transformacin por medios mecnicos o
qumicos; por ej.la mayora de medios comerciales como agar nutritivo, Agar
MacConkey.
POR SU CONSISTENCIA
Lquidos: son soluciones acuosas tambin denominas caldos por ej. caldo nutritivo,
caldo BHI, leche, caldo suero.
Slidos: son los medios lquidos a los que se les ha aadido ciertas sustancias como
Agar-agar, gelatina, silicatos solo con el objeto de endurecerlos; por Ej., agar nutritivo,
agar sangre, agar sabouraud, etc.
Semislidos: son los medios que se hallan en un estado entre los dos primeros, sirven
para estudios de motilidad (flagelo), transporte y semianaerobiosis ej. El medio de SIM.
POR SU OBJETIVO
Medios de transporte: son aquellos medios que permiten mantener a los
microorganismos viables con una baja multiplicacin y conservarse en buen estado; son
mucho mejores si son semislidos; por Ej. Cary- Blair, caldo Hajna, Stuard, etc.
Medios de enriquecimiento: sirven para multiplicar bacterias antes de su siembra,
pueden o no llevar inhibidores por Ej. Caldo Selenito para Salmonella typhi, Caldo
Tetrationato para Salmonellas en general, Caldo Lactosado, etc.
Medios enriquecidos o mejorados: constituidos por un medio base corriente, al que se
le aade sustancias ricas en protenas, aminocidos o sustratos de mayor valor nutritivo.
Sirve para aislar y cultivar microorganismos de mas exigencias en nutrientes: por Ej agar
Sangre donde adems se aprecian hemlisis; suelo coagulado, para la produccin de
toxina diftrica.
Medios de aislamiento: pueden ser:
No selectivos: corrientes y mejorados.

Selectivos: poco selectivos, medianamente selectivos y

o
altamente selectivos.
o
a)

b)

c)

d)

Especiales.
MEDIOS DE AISLAMIENTO:
Medios de aislamiento no selectivos:medios mejorados
Son aquellos medios que, como su nombre dice, sirven para aislar o cultivar bacterias,
donde la mayora de ellas desarrollan porque no llevan inhibidores, y pueden ser:
medios bsicos como agar nutritivo que llevan sustancias que tienen un valor nutritivo;
mejorados como agar sangre
Medios de aislamiento selectivos:o de diagnostico
Estimulan el desarrollo y crecimiento de una especie microbiana, inhibiendo el desarrollo
de otras morfolgicamente semejantes. Mediante la adicin de ciertas sustancias como
colorantes, sales biliares
Estos medios presentan el medio base, adems llevan un substrato ms indicadores y
de manera especial inhibidores, que pueden ser sales, colorantes, antibacterianos tipo
antibiticos. A medida que sean ms complejos o lleven inhibidores ms selectivos,
pasan a la categora de poco, mediano y altamente selectivos; as entre los poco
selectivos tenemos; Agar Mac-Conkey, Agar EMB, ENDO Agar, Agar Brolacin en ellos
desarrollan todas las enterobacterias, Enterococos, Pseudomonas, Alcalgenes,
Candidas. Entre los medios selectivos SS Agar; en este medio desarrollan todas las
enterobacterias pero desarrollan mejor y rpidamente las Salmonellas y Shigellas. Entre
los altamente selectivos, que son ms especficos, desarrollan pocas especies
bacterianas, as en el Agar Chapman, Manitol Salado desarrollan las Micrococceas; en
el sulfito bismuto Agar, desarrollan Salmonellas, especficamente S. typhi; Agar verde
brillante es propio para Salmonellas.
Medios de aislamientos especficos:
stos medios son generalmente altamente enriquecidos por el medio Bordet-Gengou,
que es para Bordetella, que contiene adems del medio bsico: papa, glicerina y
antibiticos; el medio de Lowwestein que es para el Mycobacterium tuberculosis ste
medio a adems del medio bsico lleva huevo, glicerina e inhibidor de verde de
malaquita; en ste tipo de medio los inhibidores tienen relativa importancia, pues su
especificidad est en funcin a su riqueza, otro Ej. Es el Agar Saboraud, para hongos.
Medios diferenciales o bioqumicos:
Son aquellos medios que llevan un medio corriente, caldo o Agar nutritivo, al que se le
ha aadido un substrato conocido, adems lleva indicador de pH; aqu se estudiarn
desdoblamiento de substratos por accin de enzimas bacterianas es decir el
metabolismo microbiano. As tenemos; TSI, SIM, LIA, Urea, Citrato de Sinmons, Caldo
MR-VP; que sirven para pruebas especficas.

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

1.
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2.
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MATERIAL REQUERIDO:
Matraces de 250ml. 100ml. 50 ml.
Probetas de 50 ml. 100ml.
Baguetas.
Balanza.
Esptula.
Agua destilada.
Placas Petri.
Tubos de Ensayo.
MEDIOS DE CULTIVO:
Agar Mac- Conkey.
Agar TSI.

o
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3.

Agar Nutritivo.
Agar EMB
Agar Manitol Salado
Agar TCBS
Agar MiullerHinton
Caldo infusin cerebro corazn
OBSERVACIN:
Usted encontrar en sus mesones diferentes medios de cultivo que utilizaremos en
la prctica, lea cuidadosamente la composicin y descrbalos segn la utilizacin.
PLAQUEO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
1.
2.

Se debe tener el ambiente limpio, fumigado o desinfectado.

Se debe tener el material de vidrio esterilizado y fro: Placas Petri, tubos,
frascos, Castaeda, viales, segn el caso que se d.
3.
Mecheros con gas.
4.
Medios de cultivo esterilizado, licuado y a una temperatura entre 48 y 52C.

PROCEDIMIENTO:
Plaqueo o reparto de medios en Placas Petri: colocar todo el equipo necesario dentro del
cubculo sobre la mesa, y:
Abrir las placas Petri, quitando hilo y papel.
Abrir el medio a repartir y flamear una ida y vuelta sobre la llama.
Con la mano derecha coger el frasco que contiene el medio de cultivo, agitar
suavemente rotando, flamear la boca del frasco y verter dentro de la placa una cantidad
adecuada, ms o menos 15 ml.
Cerrar la placa y dejar sobre la mesa sin que el medio toque la tapa.
Proseguir con el resto del medio y placas, flameando con una ida y vuelta la
boca del frasco que contiene el medio de cultivo que se est repartiendo.
Una vez acabado de repartir, se debe enjuagar con agua de cao los
frascos.
Una vez enfriado y endurado los medios en las placas se voltean y rotulan
con lpiz de cera.
Se deja en refrigeradora a 4C.
Los medios se deben guardar a 4C ; el tiempo de duracin es relativo, por lo general
corto, el agar Sangre hasta 72 horas, el resto de medios hasta una semana; los medios
de cultivo no selectivos que han sido repartidos en placas, tubos o frascos, deben
dejarse 24 horas en estufa a 37C para el control de su esterilidad, que demuestra el
xito cuando no desarrolla ninguna bacteria u otro microorganismo.
En la preparacin de los medios, despus de pesado el medio de cultivo y haber
agregado el agua destilada, se debe disolver calentando, y cuando est a 40C se toma
y justa el pH de 7.2 a 7.4.
DESCRIPCIN Y PREPARACIN:
AGAR SANGRE:
Este agar tiene como materia prima un medio base, que es el Caldo Corriente cuyos
componentes son:
- Peptona
1.0gr.
- Extracto de carne
0.3gr.
- Cloruro de sodio
0.50gr.
- Agua destilada
100ml.

A este medio se le aade Agar-agar 1.5gr. Y se obtiene el agar nutritivo.

Preparacin:
Para su preparacin, 100ml. De agar nutritivo se esterilizan a 15 lb de presin, 121C
durante 15 min, se deja enfriar hasta 45C y luego se aade 5 a10 ml de sangre fresca
desfibrinada; la mejor sangre es la de carnero, se pueden usar otras, en estado estril
sacado con anticoagulantes.
Antes de que se enduren, se reparten en placas Petri y tubos en posicin plano
inclinado.
En ste medio desarrollan casi todas las bacterias hetertrofas, se aprecia la hemlisis
alfa o beta.
Interpretacin:
COLONIA
Blanquecina con halo verdoso
estrecho.
Crateriforme con halo verdoso
Blanquecina
con
halo
transparente, 2 a 3 veces el
dimetro de la colonia.
Falta de hemlisis.

MICROORGANISMO
Streptococcus grupo viridans, S.
faecalis
Diplococcuspneumoniae
Streptyococcuspyogenes,
algunos S. faecalis, todos los
Estreptococos. hemoliticos
S. faecalis y estreptococos no
patgenos.

AGAR CHOCOLATE:
Para su preparacin se utiliza agar nutritivo esterilizado y licuado, cuando est a 60C u
80C, se le aade 5 a 10 ml. de sangre desfibrinada; sta temperatura hace que la
hemoglobina quede libre del hemate; la hemoglobina aporta al Agar chocolate un
elemento importante, el factor X o hemina termoestable, tambin aportara el factor V o
difosfopirina nucletido, tambin aporta el factor V ste es termolbil, por tanto habra
que agregarlo en forma qumica.
Se desarrollan muchas bacterias, algunos Haemophilus y es propios para Neisseria.
Interpretacin:
COLONIA
MICROORGANISMO
Pequeas, grises, traslcidas de bordes Gonococos
enteros o festoneados, a las 48 horas visibles y
opacas.
Opaco, blanquecino, a veces amarillentas y
Meningococos.
con bordes irregulares, pueden encontrarse
colonias mucosas.
AGAR MAC CONKEY:Poco selectivos.
Se basa en la fermentacin de la lactosa, las colonias de organismos capaces de
fermentar lactosa producen una cada localizada de pH, lo cual, seguido por la absorcin
del rojo neutro, imparte un color rojo a la colonia. Las colonias de organismos que no
fermentan lactosa permanecen incoloras y traslcidas. La selectividad del medio se debe
a la presencia del cristal violeta y sales biliares que inhiben casi o completamente el
crecimiento de bacterias Gram positivas.
Composicin:
- peptona casena
17.0 gr
- Lactosa
10.0 gr.

- Peptona
3.0 gr.
- Sales biliares
1.5 gr
- Cloruro sdico
5.0 gr.
- Rojo neutro
2.0 gr.
- Cristal de violeta
0.001 gr.
- Agar-agar
12.5 gr.
- Agua destilada
1000ml.
El medio comercial se disuelve en bao mara, se ajusta el pH a 7.2, se esteriliza a 15 lb
de presin, 121C durante 15 min., y se reparten en las placas petri.
En este medio se buscan enterobacterias, adems crecen estreptococos del grupo
entrico, pseudomonas y cndida. Las bacterias degradan la lactosa haciendo variar el
pH, y el indicador vira del color lila al rosado o grosella y las que no degradan
desarrollan formando colores translucidos:
Interpretacin:
COLONIA
Incolora transparentes
Grande, rojo con halo turbio
Rosa grande y mucosa
Diminutos, esporadicos, opacos
V.

VI.
-

MICROORGANISMO
Salmonella, Shigella
E.coli
Enterobacter, klebsiella
Enterococos, estaphylococos

RESULTADOS, DISCUCIN, CONCLUSIN, REFERENCIAS:

De cada uno de los medios se les dio, identificar cuales son los requerimientos
energtico y no energticos segn la composicin.
Diferencie que tipo de medios y para que se utiliza con ejemplos.
Medios: medio agar nutritivo, Mac Conkey, TCBS, agar tripticasa soya (TSA), Manitol
salado, MiullerHinton, TSI, LIA, Saboraud.
TRABAJO ENCARGADO
Describir cada uno de nos medios de cultivo segn su clasificacin.
Realice un cuadro sinptico de los medios de cultivo y sus usos.