OBJETIVOSESPECFICOS:

Explicar en qu consiste la homogeneizacin y el fraccionamiento subcelular.

Analizar los fundamentos tericos de la centrifugacin y su utilidad.
CONTENIDO:
Homogeneizacin y el fraccionamiento subcelular.
Fuerza centrfuga relativa. Centrfugas Clnicas, Centrfugas de alta velocidad.
Coeficiente de sedimentacin.
Centrifugacin por velocidad de sedimentacin, Centrifugacin por equilibrio de
sedimentacin. Fraccionamiento en gradiente. Utilidad
El fraccionamiento subcelular
Es un conjunto de mtodos y tcnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o
enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea ste un orgnulo (mitocondrias,
ncleos, peroxisomas, etc.) una fraccin de membrana (membrana total, plasmtica,
dominio basolateral, etc.), complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtbulos,
poros nucleares, etc.). Las cuales deben encontrarse en condiciones que permitan su
aislamiento.
Fases:
o Preanaltica: Obtencin preparacin preliminar de la muestra hasta llegar al
laboratorio
o Analtica: o de aplicacin de procedimientos. Toma y tratamiento de datos, recogida
de resultados en un informe
o Postanaltica: Validacin tcnica del informe analtico.
Todo proceso de fraccionamiento se centra en dos etapas:
o Rotura de las clulas o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la
fraccin deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificacin
o Separacin de la fraccin deseada del resto de componentes de la clula o del tejido
mediante algn criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugacin
en gradientes o centrifugacin diferencial), la presencia de algn antgeno
(cromatografa de inmunoafinidad, inmunoprecipitacin, etc.).
HOMOGENIZACIN
La homogeneizacin consiste en romper las clulas y liberar sus organelos usando una
variedad de mecanismos (moler, picar, triturar, cambios de presin, choque osmtico,
congelacin y descongelacin, homogeneizacin con ultrasonidos). Las clulas se
homogenezan en una solucin isotnica, lo cual previene que se rompa su membrana por
smosis, con el pH regulado y a temperaturas bajas para prevenir daos enzimticos.

La homogeneizacin es un paso muy comn en la preparacin de muestras biolgicas antes

del anlisis de cidos nucleicos y protenas, o del estudio de clulas, metabolismo, agentes
patgenos y otros muchos objetivos.
Como resultado, queda una pasta fina que consiste de las clulas y sus organelos por
separado.
Se refiere al rompimiento de las clulas o el tejido del cual se pretende extraer la organela o
la molcula de inters biolgico.

Clulas anexas: primero se deben romper conexin es con otras clulas.

Clulas no anexas: pueden separarse teniendo en cuenta forma, densidad o
caractersticas que puedan marcarse.

Centrifugacin
La centrifugacin es una tcnica de transporte basada en el movimiento de las partculas,
suspendidas en un medio lquido especfico, impulsadas por una fuerza denominada
centrfuga, que tiende a desplazarlas hacia fuera del centro de rotacin. Tanto la viscosidad
de la disolucin-muestra (esto es de gran inters para las aplicaciones analticas) como las
propiedades fsicas de las partculas afectarn a la sedimentacin individual de las mismas.
Es un mtodo en l se pueden separar slidos de lquidos de diferente densidad. La
centrifugacin imprime un movimiento rotatorio con una fuerza mayor a la fuerza de
gravedad, provocando la sedimentacin de las partculas ms densas. Este procedimiento
separa fundamentalmente las partculas de acuerdo con su masa y su forma.
Debido a las diferencias en tamao y densidad, cada componente celular est sujeto a una
fuerza centrfuga. La fuerza generada por la centrfuga se expresa como fuerza
centrfuga relativa (RCF) en unidades de g. La RCF es una funcin de velocidad de
centrifugacin en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partculas desde el eje
de rotacin. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de
la ecuacin: RCF = 1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde
el eje de rotacin hasta el margen de afuera del tubo de centrfuga.
Instrumental
1. Tubos
De vidrio o plstico. Resistentes qumicamente (disolventes, reactivos) y fsicamente
(tensin a las velocidades elevadas que se emplean). Diversos tamaos y formas. Plsticos
especiales para altas velocidades.
2) centrifugas. Se puede regular velocidad, tiempo, temperatura. Elevadas velocidades
(102-105 rpm).

Rotores:
Dos tipos:

rotor angular o de ngulo fijo

rotor basculante

Fundamentos tericos
Modalidades:
Segn su velocidad:
Criterio aproximado:
Centrifugacin a baja velocidad

menos de 10.000 rpm

Centrifugacin a alta velocidad

entre 10.000 y 20.000 rpm

Ultracentrifugacin

ms de 20.000 rpm

Segn el propsito
La centrifugacin se puede llevar a cabo a escala preparativa o escala analtica. La primera
se utiliza para aislar partculas para su aprovechamiento posterior y la segunda permite
determinar propiedades fsicas como la velocidad de sedimentacin o el peso molecular.
1. Centrifugacin analtica.
Objetivo: medir las propiedades fsicas de las partculas que sedimentan, tales como su
coeficiente de sedimentacin o su masa molecular. Especialmente en la
variante ultracentrifugacin analtica.
Las molculas se observan mediante un sistema ptico durante la centrifugacin. Los
tubos de centrfuga deben ser de cuarzo para dejar pasar la luz visible y ultravioleta.
Rotor basculante, observacin en vertical.
Este sistema ptico permite observar la evolucin durante el proceso del centrifugado
de la muestra. Con instrumentacin moderna estas observaciones don digitalizadas y
almacenadas electrnicamente para posteriores anlisis matemticos.
2. Centrifugacin preparativa.
De uso ms comn. Objetivo: aislar partculas, clulas o molculas para su anlisis o
utilizacin posterior. En general, se emplea mayor cantidad de muestra que en la
analtica.
La centrifugacin preparativa se utiliza para separar partculas segn la velocidad de
sedimentacin (centrifugacin diferencial), la masa (centrifugacin zonal) o la densidad
(centrifugacin isopcnica).

En el primer caso se obtiene un lquido sobrenadante y un material sedimentado. En los

otros dos casos las partculas se distribuyen en fracciones de diferentes densidades de
un fluido lquido (centrifugacin mediante un gradiente de densidades).
1. Centrifugacin diferencial
El tubo se llena con muestra y se centrifuga. El comportamiento de cada componente de
la muestra depende de su forma, tamao, densidad y, lgicamente, de las condiciones de
centrifugacin. Se obtienen slo 2 fracciones: sedimento y sobrenadante.
Cuando el sobrenadante de la primera centrifugacin se centrifuga nuevamente en
condiciones de mayor tiempo y F.C.R., las partculas ms densas sedimentan
nuevamente. As, mediante la aplicacin al sobrenadante de condiciones crecientes de
centrifugacin, vamos separando los distintos componentes de la muestra inicial.
2. Por gradiente de densidad
Un mtodo que es ms complicado que la centrifugacin diferencial pero tiene algunas
ventajas; el mtodo de gradiente de densidad permite la completa separacin de algunos
o todos los componentes de la mezcla y tambin permite que se puedan realizar
mediciones analticas.
La clasificacin y seleccin del tipo de centrfuga viene dada por el valor de la F.C.R.
(Fuerza Centrfuga Relativa), especfico para cada una de ellas a una velocidad de giro
determinada, de modo que es necesario conocer el valor de la F.C.R. que debe ser
aplicado a cada muestra para elegir el tipo de centrfuga ms adecuado.
Hay dos mtodos bsicos de centrifugacin por gradiente de densidad: La
centrifugacin zonal y la centrifugacin isopcnica o al equilibrio.

Centrifugacin zonal o de velocidad de sedimentacin

Es Cuando se coloca las molculas que se quieren caracterizar sobre una base
lquida (solucin de sacarosa, cloruro de cesio, Ficoll, Percoll) cuya densidad
aumenta desde la parte superior a la parte inferior largo de un tubo de
centrifugacin. Durante la centrifugacin, las molculas de la capa superior
sedimentan a travs del gradiente. Si todas ellas tienen el mismo coeficiente de
sedimentarn en una estrecha franja, sin embargo, si hay molculas con distintos
coeficientes de sedimentacin, se separaran unas de otras a medida que se produzca
la centrifugacin y finalmente los diferentes componentes se resolvern en una serie
de zonas o bandas, de ah el nombre de centrifugacin zonal.

Su velocidad de avance (y, por tanto, el mecanismo de la separacin) depende de su

tamao, forma y densidad; todos estos parmetros se combinan en el coeficiente de
sedimentacin.
Coeficiente de sedimentacin=s=velocidad de sedimentacin / aceleracin
centrfuga.
Que se mide en unidades svedberg (1 S = 1*10-13 segundos).
La centrifugacin debe terminar antes de que alguna de las partculas separadas
llegue al fondo del tubo. Los componentes separados se recogen individualmente
aspirando con mucho cuidado las diferentes bandas o, mejor, perforando el fondo
del tubo y recogiendo en fracciones el lquido que cae.
La separacin zonal es ideal para separar partculas de tamao definido (ejemplo:
protenas, RNA y ribosomas), sin embargo, las partculas del mismo tipo son
heterogneas; en este caso, la separacin por centrifugacin zonal no es eficiente y
es ms apropiado separar las partculas en base a otro parmetro como la densidad;
por lo tanto se recurre a la separacin isopcnica.
Se puede preparar:
a) Un gradiente discontinuo o escalonado, manualmente.
b) un gradiente continuo, empleando un dispositivo formador de gradientes
c) un gradiente continuo autoformado, si se crea mediante centrifugacin,
normalmente a la vez que se fracciona la muestra

Centrifugacin isopcnica o de equilibrio de sedimentacin:

En la separacin isopcnica las partculas son separadas en base a su densidad, el
tamao solo afecta la velocidad con la que las partculas alcanzan su posicin
isopcnica. Estas separaciones se llevan a cabo en un gradiente de densidad en el
que las partculas se mueven hasta el punto en el que su densidad es la misma que el
medio.
Se utiliza tambin un gradiente de densidad, pero en este caso el tiempo de
centrifugacin es lo suficientemente largo (hasta 1 o 2 das) como para que se
alcance el equilibrio de sedimentacin (entre la fuerza centrfuga, el empuje
hidrosttico de la clula y su difusin). Para conseguirlo, se usan gradientes
continuos que cubren todo el intervalo de densidades de los componentes de la
muestra: en el fondo del tubo la densidad del medio ha de ser mayor que la del
componente ms denso. De esta forma, independientemente del tiempo de
centrifugacin, las partculas, clulas, etc. nunca sedimentarn en el fondo, sino que

alcanzan una posicin estable intermedia en el gradiente, donde se concentran en

una banda muy estrecha (mejor resolucin). Lo ms frecuente es mezclar la muestra
con el material que formar el gradiente y generar un gradiente autoformado a la
vez que se hace la separacin. Requiere velocidades muy altas (ultracentrifugacin)
para que se forme el gradiente.
Adems de la mayor resolucin, lo interesante de esta tcnica es que
separa exclusivamente segn la densidad de los componentes de la muestra, que se
sitan en la posicin del gradiente donde la densidad del medio es igual a la suya
propia (isopcnica = de igual densidad, en griego)
Esta tcnica se utiliza, por ejemplo, para separar partculas similares en tamao pero
de diferente densidad. En este sentido, la centrifugacin isopcnica es un mtodo
adecuado para separar cidos nucleicos o diferentes orgnulos celulares.
Con esta tcnica se consigue, por ejemplo, separar todos los tipos celulares
sanguneos, purificar espermatozoides viables, separar clulas viables y no viables
de tejidos desagregados y muestras con clulas en suspensin, etc.
Aplicaciones

medicin del valor hematocrito

aislamiento de protenas, cidos nucleicos y partculas subcelulares.
Con esta tcnica se consigue, por ejemplo, separar todos los tipos celulares
sanguneos, purificar espermatozoides viables, separar clulas viables y no viables
de tejidos desagregados y muestras con clulas en suspensin, etc.
separacin de los distintos componentes de una clula, principalmente de los
orgnulos
purificar espermatozoides viables
Test de seleccin de espermatozoide mas viable.
Esto es utilizado para la purificacin biolgica de materiales como proteinas, cidos
nuclicos, organelos y tipos de clulas.

Una purificacin de protenas es una serie de procesos que permiten aislar un slo tipo
de protena de una mezcla compleja. La purificacin de protenas es vital para la
caracterizacin de la funcin, estructura en interacciones de la protena de inters, por
ejemplo una enzima un receptor celular o un anticuerpo. El material inicial es generalmente
un tejido biolgico un cultivo microbiano. Hay varios pasos en el proceso de purificacin;
puede liberar a la protena de la matriz que lo confina, separar las partes proteica y no
proteica de la mezcla, y finalmente separar la protena deseada de todas las dems. Este
ltimo paso puede ser el aspecto ms laborioso de la purificacin de protenas.
Bibliogr afa/Marco electrnico

http://www.quirumed.com/es/Catalogo/ver/654/Centrifuga

http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/FRACCEL.htm
http://biomodel.uah.es/tecnicas/centrif/inicio.htm