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Microbiologa General - 2011

Facultad de Ciencias Exactas - UNLP

LABORATORIO 5
Caracterizacin fenotpica de microorganismos: pruebas bioqumicas
Fermentacin de los hidratos de carbono
Para estudiar la capacidad de un microorganismo de fermentar una determinada
sustancia se utiliza un medio base al cual se le agrega el sustrato filtrado. La
concentracin final del sustrato es de 0,5- 1%.
El medio posee adems un indicador de pH como por ejemplo azul de bromotimol y una
campana de Durham (para detectar produccin de gas).
En caso que el microorganismo sea capaz de fermentar el sustrato en estudio se
observar viraje del indicador hacia el color cido, para el azul de bromotimol ser
amarillo. La produccin de gas se evidenciar a travs de la formacin de una burbuja en
la campanita de Durham.
Medio de cultivo

Extracto de carne
3 g/l
Peptona
5 g/l
Sc. Azul de Br Timol (16%) 1 ml
Hidrato de carbono
5 g/l
pH final: 7

Lecitinasa
En esta prueba se investiga la presencia de lecitinasa (un factor de virulencia) que
acta sobre la lecitina (fosfatidil colina) de la membrana citoplasmtica. Para la prueba
se utilizan medios slidos a los cuales se les agrega yema de huevo (que contiene
lecitina). Las colonias con actividad lecitinsica formarn un halo opaco a su alrededor.
Para el caso de Bacillus cereus, se utilizar el medio de Mossel al cual se le habr
agregado una suspensin de yema de huevo al 50% en NaCl 0,85%, a razn de 1ml de
suspensin por cada 9 ml de medio.
Hemlisis
Esta prueba est relacionada con la presencia de factores de virulencia llamados
citolisinas que son capaces de formar poros en la membrana citoplasmtica de
diferentes clulas eucariticas. Un sistema indicador adecuado lo constituyen los
glbulos rojos ya que la lisis de stos (hemlisis) es fcilmente demostrable. Para la
realizacin de la prueba, se incorpora sangre de oveja o carnero al 5% en un medio
nutritivo slido estril, fundido y templado (55 C aproximadamente). Las placas se
secan a 37C y se siembra el microorganismo en estudio.
Interpretacin:
a)
hemlisis: destruccin parcial de los glbulos rojos acompaada por una
coloracin verdosa o parduzca.
b)
hemlisis: destruccin total de los glbulos rojos que se observa como una zona
transparente alrededor de la colonia.
c)
ausencia de hemlisis: no hay cambios visibles.

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Triple azcar hierro- Agar TSI


Este medio permite determinar la capacidad de un microorganismo de degradar un
hidrato de carbono especfico incorporado a un medio bsico con o sin produccin de gas
y de cido sulfhdrico (SH2). El medio contiene tres azcares: lactosa (1%), sacarosa
(1%) y glucosa (0.1%) en una relacin de 10:10:1 g/ litro, respectivamente.
La degradacin del azcar con formacin de productos cidos se manifiesta por un
cambio de color del indicador (rojo de fenol) que vira del naranja al amarillo o al rojo en
caso de alcalinizacin. El tiosulfato es reducido a SH 2 que reacciona con la sal frrica
produciendo S3Fe2 color negro.
Medio de cultivo
(Composicin g/l)

Peptona de casena
Peptona de carne
Extracto de levadura
NaCl
Lactosa
Sacarosa
Glucosa
Citrato frrico y amonio
Tiosulfato de sodio
Rojo fenol
Agar

15
5
3
5
10
10
1
0,3
0,3
0,024
12
pH final 7,4

El medio se envasa de forma tal que la zona inferior sea recta y la superior en pico de
flauta.
Los monosacridos en el pico de flauta son catabolizados por la va de la gliclisis hasta
cido pirvico y posteriormente es degradado por medio del ciclo de Krebs para dar CO 2,
H2O y energa. La regeneracin del NAD+ se realiza mediante la cadena respiratoria con
O2 como ltimo aceptor de electrones.
En la zona recta del medio de cultivo, que posee baja concentracin de O 2, los
monosacridos tambin son metabolizados por la va de la gliclisis hasta cido pirvico
pero luego son convertidos en diversos productos finales estables como cido lctico y/u
otros cidos orgnicos, aldehdos, alcoholes, CO2, H2 y energa.
Para una correcta interpretacin de esta prueba es muy importante realizar la lectura
luego de 18 a 24 hs. Lecturas prematuras o demoradas podrn conducir a
interpretaciones errneas.

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Interpretacin:
Luego de la incubacin pueden observarse:

Lectura (pico de flauta/profundidad)


Alcalino/Acido,
rojo/amarillo

con

Acido/Acido,
con
amarillo/amarillo

Interpretacin

sin

gas1

Fermenta la glucosa

sin

gas

o Fermenta
(sacarosa2)

Alcalino/Alcalino o sin cambio o rojo/rojo

glucosa

No fermentan
(sacarosa)

glucosa

lactosa
ni

lactosa

La produccin de gas provoca un desplazamiento del medio del fondo del tubo o
agrietamiento del medio.
2
La incorporacin de sacarosa permite el reconocimiento del gnero Proteus. Estos
microorganismos no utilizan lactosa o lo hacen lentamente pero si pueden fermentar
la sacarosa.
La produccin de SH2 se evidencia por un ennegrecimiento del medio.
Prueba del Rojo de metilo
Esta prueba permite comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y
mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa y
vencer la capacidad amortiguadora del sistema.
Se cultiva el microorganismo en estudio en el medio de Clark y Lubs, y se incuba a 37C
durante 24 hs.
Medio de Clark y Lubs Polipeptona
(Composicin en g/l)
Glucosa
Fosfato dipotsico
A.D. c.s.p.

7
5
5
1000ml

pH final

Para obtener un resultado vlido deber realizarse una primera lectura a las 24 hs y una
segunda luego de 2 a 5 das de incubacin a 37C.
Revelado:
Sobre una alcuota del medio desarrollado agregar unas gotas de indicador Rojo de
Metilo.
Interpretacin:

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El rojo de metilo conserva su color rojo a valores bajos de pH ( 4,2) indicando que se
han producido cidos estables capaces de vencer la capacidad buffer del medio. Si el
indicador vira al amarillo la prueba de RM es negativa (pH 6).
Prueba de Voges-Proskauer
Esta prueba permite determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir
un compuesto neutro, el acetilmetilcarbinol, a partir de la fermentacin de la glucosa.
La reaccin de VP se basa en la deteccin del acetilmetilcarbinol (acetona). En presencia
de O2 (atm) y lcali los productos finales neutros acetona y 2,3-butanodiol son oxidados
a diacetilo, que es el reactante para el color producido en la reaccin. El diacetilo
reacciona con el ncleo guanidinio de la arginina presente en la peptona, en medio
alcalino, dando un color rojizo en la superficie del medio.
La velocidad de desarrollo de color depende de la concentracin de acetona, por lo
general el color se produce de los 2 a 5 minutos, obtenindose la mxima intensidad de
color luego de una hora.
El medio de cultivo utilizado es el de Clark y Lubs, el cual se siembra y se incuba a 37C
durante 24 hs.
Revelado:
Primero: Sobre una alcuota del medio desarrollado agregar 6gotas de una solucin
alcohlica de -naftol al 5% (acta como catalizador en la oxidacin de la acetona a
diacetilo). Debe adicionarse antes del lcali.
Segundo: Luego se agregan 2 gotas de una solucin de KOH o NaOH al 40%. Se agita el
tubo suavemente favoreciendo la oxidacin de la acetona por el O2 atmosfrico.
Interpretacin:
Reaccin positiva: la aparicin de color rojo-rub en la superficie del medio indica la
presencia de acetona.
Reaccin negativa: color amarillo o cobrizo, corresponde al color de los reactivos.
Prueba del Indol
Permite determinar la capacidad de un microorganismo de degradar el aminocido
triptofano dando indol.
En el proceso de degradacin del aminocido triptofano intervienen diversas enzimas
que reciben el nombre de triptofanasas. Estas enzimas catalizan la reaccin de
desaminacin, atacando la molcula de Trp en su cadena lateral y dejando intacto el
anillo aromtico en la forma de indol.

Triptofanasa

L-Trp

+ NH3 + CH3COCOOH
Indol

Ac. pirvico

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Medio de cultivo: caldo triptona.


(Composicin g/l)

Extracto de carne
Peptona
Triptona
A.D. c.s.p.
final 7

3
5
20
1000ml

pH

Se siembra un tubo de caldo e incuba a 37C durante 24hs.


Revelado:
Se utiliza el reactivo de Kovacs: p-dimetilaminobenzaldehdo en alcohol amlico y HCl.
Agregar al tubo desarrollado 5 gotas y agitar.
Interpretacin:
La aparicin de color rojo en la capa alcohlica se debe a la formacin de un compuesto
de condensacin entre el p-dimetilaminobenzaldehdo y el indol.
Prueba de oxidacin-fermentacin
Permite determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un microorganismo sobre
un determinado hidrato de carbono
La fermentacin es un proceso metablico que no requiere O 2. Se caracteriza por la
fosforilacin inicial del hidrato de carbono (glucosa-6-fosfato) y requiere de un
compuesto orgnico como aceptor final de electrones.
Los procesos oxidativos son estrictamente aerbicos. El proceso de oxidacin directa
del hidrato de carbono, que se da en el grupo fluorescente del gnero Pseudomonas, no
requiere de la fosforilacin inicial del azcar. La glucosa se oxida a cido glucnico o 2cetoglucnico y posteriormente se fosforila y degrada a cido pirvico.
Medio de cultivo
(Composicin en g/l)

OF

Peptona
2
NaCl
5
K2HPO4
Azul de bromotimol 0,03
Agar
3
A. D. c.s.p.
1000 ml
7,1

(base)
0,3
pH final

Luego de esterilizar y enfriar a temperatura ambiente el media base, se le aade


solucin del azcar en agua destilada estril para obtener una concentracin final de
1%.
El medio utilizado es un agar semi-blando, que permite evidenciar movilidad y reducir la
difusin y dilucin de los cidos permitiendo su deteccin aun en pequeas cantidades
ya que posee una muy limitada capacidad buffer.
A partir del cultivo puro de 24 hs se inoculan con ansa recta dos tubos del medio OF.
Un tubo se inocula directamente ("Tubo con O2"). El segundo tubo es purgado
previamente para eliminar el O2 mediante el calentamiento a Bao de Mara durante 15

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minutos. Luego se enfra bajo canilla sin agitar y se siembra por puncin.
Inmediatamente se cubre con 1 cm de parafina o vaselina lquida estril ("Tubo sin O2").
Ambos tubos se incuban a 35C durante 48 hs. Algunos microorganismos requieren
hasta 2 semanas de incubacin.
Interpretacin:
Tipo de metabolismo
"Tubo abierto"
"Tubo cerrado"
Oxidativo
Acidez (amarillo)*
Neutro (verde)
Fermentativo
Acidez (amarillo)
Acidez (amarillo)
Fermentativo
Neutro (verde)
Acidez (amarillo)
Inerte**
Neutro (verde)
Neutro (verde)
* Como se produce una pequea cantidad de cido, suele aparecer amarillo solo la
superficie del agar
** El microorganismo no metaboliza el carbohidrato o no es capaz de crecer en este
medio
Prueba de la enzima citocromo oxidasa.
Esta prueba permite determinar la presencia de la enzima citocromo c oxidasa presente,
entre otras, en los gneros Pseudomonas y Aeromonas, y nos permite diferenciarlas del
grupo oxidasa negativa de la familia Enterobacteriaceae.
Esta enzima acta, en presencia de oxgeno, activando la oxidacin del citocromo
"reducido" de la cadena transportadora de electrones.
Citocromo reducido.
O2
H2O
oxidasa
Citocromo oxidado

Un sustrato artificial (reactivo) puede sustituir al dador natural (citocromo reducido)


dentro de la cadena transportadora.
Existen varios reactivos que pueden actuar como dadores artificiales de electrones:
indofenol, p-fenilendiamina, como ejemplo. Estos reactivos al ser oxidados dan un
producto coloreado en forma inmediata, indicando la presencia de la enzima.
Reactivo reducido

O2
oxidasa

Reactivo oxidado

H2O
Para la realizacin de la prueba se utilizan discos de papel que contienen el reactivo (la
naturaleza del reactivo vara con los distintos sistemas comerciales pero se trata de
derivados de la p-fenilendiamina).
Se prepara una suspensin densa del microorganismo en 0,2 ml de agua (destilada o
corriente).

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Colocar el disco en contacto con la suspensin, la aparicin de color rosado en menos de


1 minuto indica Oxidasa Positivo.
Prueba de reduccin de Nitratos
Las bacterias pueden utilizar nitratos por asimilacin (reduccin del nitrato a amonaco
que se utiliza como fuente de nitrgeno), desasimilacin (cuando se utiliza como
aceptor final en ausencia de oxgeno, reducindose a nitrito) y desnitrificacin (cuando
se convierte en productos finales gaseosos, como nitrgeno, xido nitroso u xido de
nitrgeno).
La reduccin de los nitratos ocurre generalmente en condiciones de baja tensin de
oxgeno.
Para poner en evidencia la capacidad de reducir el nitrato se emplea el siguiente medio:
Caldo Nitrato
(Composicin (g/l))

Extracto de carne
Peptona
5
NO3K

3
1

Se envasa en tubos y se coloca una campanita de Durham. Se siembra con un inculo


denso y se incuba 24hs. Luego se determina la presencia de N2 , NH3 y NO2- .
Revelado e interpretacin:
Presencia de N2: se verifica la presencia de gas en la campanita.
Presencia de NH3: Agregar a una porcin del cultivo unas gotas del reactivo de Nessler
(iodomercuriato de potasio). Este reactivo, en presencia de iones amonio se descompone
con formacin de ioduro de dimercuriamonio que permite una determinacin
colorimtrica de iones amonio. Si se observa un precipitado color ladrillo rpidamente,
indica un resultado positivo.
Presencia de NO2-: Agregar a una porcin del cultivo 2 gotas del reactivo Nit-1
(solucin actica de cido sulfanlico) y luego 2 gotas del reactivo Nit-2 (solucin actica
de alfa dimetilnaftilamina).
NO3-

NO2- + c. Sulfanlico

Sal de diazonio + dimetilnaftilamina


(color rojo)

Sal de diazonio
p sulfurobenceno azo naftilamina

La aparicin de un color rojo en la superficie indica reaccin positiva.


En caso de que esta reaccin sea negativa, se puede verificar la presencia del nitrato
propio del medio agregando una pizca de Zn. Dado que el Zn reduce el nitrato a nitrito,
si el nitrato del medio no fue reducido debera aparecer el color rojo confirmando una
reaccin negativa. En el caso de que el medio permanezca incoloro, la reaccin es
positiva habindose metabolizado el nitrato hacia otros productos no detectados con las
reacciones anteriores.
Prueba de licuefaccin de la gelatina

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Permite determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas del tipo


proteoltico (gelatinasas).
Para poder ingresar a la clula bacteriana las protenas deben ser primero catabolizadas
a compuestos ms pequeos. Las enzimas exocelulares de tipo proteoltico, gelatinasas,
son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar las protenas. El catabolismo puede
ser considerado en dos etapas:
Proteinasas

Protena + H2O

polipptidos
Peptidasas

Polipptidos + H2O

aminocidos

Medio de cultivo: Gelatina nutritiva


Composicin g/l

Extracto de carne
Peptona
Gelatina

3
5
12

Se envasa y esteriliza por Tyndallizacin. Se siembra por puncin. Luego se incuba a


37C durante 24hs a 48 hs. Antes de la lectura se debe enfriar los tubos. Observar la
presencia de desarrollo y licuefaccin comparando con un tubo control.
Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es capaz de activar especficamente la cascada de coagulacin por
activacin conformacional (no proteoltica) de la protrombina.
Este proceso
desencadena la conversin de fibringeno en fibrina lo cual da lugar a la coagulacin
an en presencia de anticoagulantes como el citrato o el oxalato. El resultado es la
formacin de cogulos o grumos cuando se mezcla una suspensin bacteriana con
plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del gnero
Staphylococcus:
(+) Staphylococcus aureus
(- ) Staphylococcus epidermis
Procedimiento e interpretacin:
-Prueba rpida en portaobjetos: se prepara una suspensin bien homognea del
microorganismo sobre el portaobjetos y se agrega una gota de plasma de conejo. Se
mezclar suavemente con el ansa y despus por rotacin. La prueba se considera positiva
si hay aglutinacin microscpica.
-Prueba en tubo: en un tubo mezclar 0.5 ml de plasma de conejo y una ansada
cargada de la bacteria a ensayar. Rotar suavemente el tubo sin sacudir. Incubar a 35C
2-4 horas y observar cada 30 minutos.
PRECAUCIN: no sacudir el tubo durante la observacin, inclnelo suavemente para ver
el cogulo. Si este no es visible al final de las 3 horas, djelo en la estufa por 24 hs.
La lectura a las 4 horas es fundamental porque puede suceder que las fibrinolisinas de S.
aureus lisen el cogulo luego de 18 horas de incubacin y de esta manera se produzca
un test falso negativo.

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Prueba positiva: Cogulo completo o cogulo parcial (el cogulo no abarca


completamente la columna del fluido)
Prueba negativa: No hay formacin de cogulo, la suspensin permanece homognea
Presencia de la enzima catalasa
Esta enzima se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias
facultativas.
Es una hemo-protena. Uno de sus sustratos es el H 2O2 que se forma durante la
degradacin de los azcares. Este compuesto es txico si se acumula en la clula. Su
descomposicin puede producirse a travs de dos enzimas, catalasa y peroxidasa.
La prueba se realiza a partir de un cultivo del microorganismo en caldo nutritivo,
agregando unas gotas de agua oxigenada y observando la formacin de burbujas.
Es importante partir de cultivos libres de sangre ya que los glbulos rojos contienen la
enzima.
Utilizacin del citrato como nica fuente de carbono
Esta prueba se realiza para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el
citrato como nica fuente de C y energa.
El citrato puede ser metabolizado mediante la enzima citrato oxalacetato liasa que lo
desdobla en acetato y oxalacetato (Ciclo reductivo de Krebs). Este ltimo es convertido
luego en piruvato, que proporciona as materias primas para la biosntesis.
Para evaluar la utilizacin del citrato se utiliza el medio de Simmons que contiene azul de
Bromotimol como indicador de pH, citrato y sales de amonio. Si la bacteria crece, eleva
el pH y hace virar el indicador de verde (pH 6.6) a azul (pH 7.7).
Las bacterias que utilizan el citrato como fuente de C utilizarn el amonio presente en el
medio de cultivo, como fuente de nitrgeno.
Medio de Simmons
(Composicin en g/l)

MgSO4
(NH4)H2PO4
K2HPO4
1
Citrato de Na
NaCl
Agar
Azul de Br timol

0,2
0,1
2
5
15
0,08

Se envasa, esteriliza y deja solidificar en posicin inclinada. Se siembra por estras con
ansa recta. Se incuba durante 24 hs.
La aparicin de desarrollo con intenso color azul indica un resultado positivo.
Hidrlisis del DNA
Esta prueba permite demostrar la presencia de la enzima DNAsa producida por los
microorganismos, mediante la hidrlisis del DNA contenido en el medio de cultivo.
Medio de cultivo

Extracto de carne
Peptona de casena
Peptona de carne
NaCl
DNA
Agar

5
10
5
5
2
15

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(Composicin g/l)

A partir de un cultivo de 24 hs se siembra en la superficie del medio de cultivo contenido


en placa de Petri, con ansa en anillo en forma puntual (spot) sobre la placa. Se pueden
sembrar varios cultivos en una placa. Incubar durante 24 hs a 37C.
Revelado e interpretacin:
Se revela cubriendo la placa con una solucin de HCl 1N. El HCl provocar la
precipitacin del DNA intacto.
Ensayo positivo: se observa una zona clara alrededor del spot que contrasta con la
turbidez del medio (el cultivo produce DNAsa).
Ensayo negativo: ausencia de dicha zona clara.
El medio se puede modificar agregando azul de toluidina o verde de metilo en
concentracin de 0.05 gr/lt. El mtodo tiene una ventaja que permite detectar la
actividad de DNasa mediante la transparencia del colorante alrededor de las colonias
productoras de DNasa. NO se agrega cido y las colonias se pueden recoger
directamente de la placa para estudios posteriores.
Hidrlisis del almidn
Esta prueba pone en evidencia la capacidad del microorganismo del hidrolizar el almidn
presente en el medio de cultivo.
Medio de cultivo
(Composicin g/l)

Infusin de carne
hidrolizado de casena
almidn
Agar

2
17.5
1.5
13

Se siembra el microorganismo en la superficie del medio contenido en placa de Petri,


mediante una estra realizada con ansa en anillo. Se lleva a incubar 24 hs a 37C.
Revelado e interpretacin:
Se revela baando el desarrollo con una solucin I2-Iodurada (Lugol al 5%).
El medio conteniendo almidn se teir de azul, contrastando con el halo incoloro que se
observa alrededor de la estra del cultivo capaz de hidrolizar el almidn.
Prueba de la Ureasa
Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
El medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de
nutrientes y alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la nica fuente de
carbono, nitrgeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el
desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol
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es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa. Aquellas bacterias que


poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrgeno proveniente de la urea, la
hidrolizan, liberando 2 molculas de amonaco y dixido de carbono. Estos productos
metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al
rojo. Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros gneros. Para
organismos que hidrolizan la urea lentamente, es recomendable usar el medio de
Christensen.
Urea

Medio
cultivo
Fosfatode
monopotsico
Fosfato disdicog/l)
(Composicin
Extracto de levadura
Rojo fenol
pH final: 6.8 0.2

20
9.1
9.5
0.1
0.01

Incubacin
A 35-37 C, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12, 24 y 48 horas de
incubacin. Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar
hasta 72 horas. -La gran capacidad buffer de este medio de cultivo, puede enmascarar la
actividad uresica en bacterias que hidrolizan lentamente la urea.
No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone
fcilmente.
Produccin de pigmentos
Agar F:
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de
especies de Pseudomonas spp. en base a la produccin de fluorescena. Conocido
tambin como medio King B. En el medio de cultivo, la triptena y la peptona de carne
aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la
produccin de pigmentos, la concentracin de fosfatos estimula la produccin de
fluorescena e inhibe la produccin de piocianina y piorrubina.

agar F
(composicin en g/l)
Triptena
Peptona de carne
Fosfato dipotsico
Sulfato de magnesio
Agar
pH final: 7.2 0.2

10
10
1.5
1.5
15

Al medio, luego de esterilizado, se le agrega 10 ml de glicerina estril.


A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de
Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Incubar durante
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18-24 horas a 35-37C, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30C,


o dejar a 22 C y observar diariamente hasta 7 das.
Interpretacin de resultados
Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260 nm. Se considera un resultado positivo
la observacin de fluorescena, que es un pigmento de color amarillo, amarillo-verdoso
fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido
a fenmenos de difusin.
Limitaciones
Algunas cepas de P. fluorescens y P. putida solo producen fluorescena a temperatura
ambiente, y se pueden obtener resultados falsos negativos si el medio se incuba a 3035C, por eso, ante la ausencia de crecimiento luego de incubacin a 35-37C, se
recomienda dejar los tubos conteniendo el medio de cultivo a temperatura ambiente.
Agar P: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de
especies de Pseudomonas spp. en base a la produccin de piocianina. Conocido tambin
como medio King A. En el medio de cultivo, la peptona de gelatina aporta los nutrientes
necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de
pigmentos, las sales de magnesio y potasio estimulan la produccin de piocianina y
piorrubina e inhiben la produccin de fluorescena.

agar P
(composicin
g/l)
Peptona deen
gelatina

Sulfato de potasio
Cloruro de magnesio
Agar
pH final: 7.0 0.2

20
10
1.4
15

Al medio, luego de esterilizado, se le agrega 10 ml de glicerina estril.


A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de
Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Se incuba
durante 18-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, re-incubar
a 25-30 C, o dejar a 22 C y observar diariamente hasta 7 das.

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Interpretacin de resultados
Un resultado positivo se verifica por observacin de los pigmentos piocianina y/o
piorrubina. La produccin de piocianina se observa como una zona color azul, azulverdoso que rodea la colonia, o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la
difusin del pigmento. La produccin de piorrubina se observa como una zona de color
rojo oscuro-pardo alrededor de la colonia o que se extiende en todo el medio de cultivo
debido a la difusin del pigmento.
Limitaciones
- La ausencia de piocianina no descarta que el microorganismo aislado sea
P.
aeruginosa. - Bajas cantidades de piocianina pueden no ser evidenciadas, por eso, ante
la sospecha de su presencia, se recomienda agregar al medio de cultivo unas gotas de
cloroformo, para exaltar la visualizacin del pigmento.
- La presencia concomitante de piorrubina y/o piomelanina, puede afectar la
visualizacin del color caracterstico de la piocianina.
- La produccin de pigmento, puede aumentarse dejando los tubos conteniendo medio
de cultivo a 22 C luego de haberlos incubado previamente toda la noche a 35-37 C.
Medio SIM
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de
sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la
familia Enterobacteriaceae.
Fundamento: El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y
particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para
formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.
El indol producido se combina con el aldehdo del reactivo de Kovacs o de Erlich,
para originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en
este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra,
mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la
formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre
que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Frmula (en gramos por litro)


Triptena
20.0
Peptona
6.1
Sulfato de hierro y 0.2
amonio

Instrucciones
Suspender 30 g del polvo por
litro de agua destilada.
Mezclar
hasta
disolver;
calentar agitando y hervir

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Tiosulfato de sodio
Agar

0.2
3.5

durante un minuto. Distribuir


unos 4 ml en tubos de
hemlisis y esterilizar en
autoclave a 121C durante
15 minutos. Solidificar en
posicin vertical.

pH final: 7.3 0.2


Siembra: A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin
profunda con aguja de inoculacin recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el
centro del tubo, y la puncin debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de
cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en lnea recta.
Incubacin:
Durante
24
horas,
a
35-37
C,
en
aerobiosis.
Luego de la incubacin, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich.
Resultados:
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas all de la lnea de
siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el
medio.
Cepas
SH2
negativas:
el
medio
permanece
sin
cambio
de
color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs
o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.
Limitaciones
-En las bacterias aerobias estrictas, que slo crecen en superficie, la movilidad puede
ser difcil de observar.
-Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color
parduzco, que no debe confundirse con el color negro debido a la produccin de cido
sulfhdrico.
Caldo Mac Conkey.
Medio de cultivo selectivo, utilizado para la investigacin presuntiva de
microorganismos coliformes en aguas, alimentos y otros materiales de importancia
sanitaria.
Fundamento: En el medio de cultivo, la peptona es la fuente de aminocidos y de
otros factores de crecimiento, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, la bilis
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de buey estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte de la


flora gram positiva, y el prpura de bromocresol es el indicador de pH.
Los coliformes, son microorganismos que fermentan la lactosa, con produccin de
cido y gas. Al acidificar el medio, se produce un viraje del indicador de pH del color
prpura al amarillo.
Frmula (en gramos por litro)
Bilis de buey
5.0
Peptona
20.0
Lactosa
10.0
Prpura de
0.01
bromocresol

Instrucciones
Suspender 35 g de polvo por
litro de agua destilada.
Disolver y distribuir 10 ml por
tubo con campanita de
Durham.
Esterilizar
en
autoclave a 121C durante
15 minutos.

pH final: 7.3 0.2


Siembra:
Para recuento de coliformes totales, tcnica del Nmero Mas Probable:
Para el anlisis de muestras fluidas como el agua, sembrar por triplicado: 10 ml en
caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentracin.
Nmero
de
tubos
3
3
3

Volumen Volumen
de
de
la medio
muestra
10 ml
10 ml
1 ml
10 ml
0.1 ml
10 ml

Concentracin
del medio
Doble
Simple
Simple

Para muestras slidas (alimentos, cosmticos, frmacos), efectuar diluciones seriadas


10-1, 10-2 y 10-3 y sembrar cada dilucin por triplicado en medio de cultivo simple
concentracin.

Nmero
de
tubos
3
3
3

Dilucin Volumen Volumen Concentracin


de
la de
la de
del medio
muestra muestra medio
10-1
10-2
10-3

1 ml
1 ml
1 ml

10 ml
10 ml
10 ml

Simple
Simple
Simple

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Incubacin
Incubar los tubos 24-48 horas a 35-37 C.
Resultados
Se considera resultado positivo el viraje al amarillo del color del medio y la produccin
de gas
Expresin de resultados: Para muestras de fluidos expresar el NMP por 100 ml de
muestra, y para muestras slidas, expresarlo por gramo de producto.

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