Laboratorio de Microbiologa N1

Marco Terico A
Los laboratorios de microbiologa se clasifican en niveles de bioseguridad, los
cuales corresponden a una combinacin de caractersticas de diseo,
construccin, medios de contencin, equipo, prcticas y procedimientos de
operacin necesarios para trabajar con agentes patgenos de distintos grupos
de riesgo. Se clasifican como sigue: laboratorio bsico nivel de bioseguridad
1; laboratorio bsico nivel de bioseguridad 2; laboratorio de contencin nivel
de bioseguridad 3, y laboratorio de contencin mxima nivel de bioseguridad
4.
En el siguiente cuadro se relacionan, los grupos de riesgo, el riesgo relativo
que entraan los microorganismos infectantes, que se clasifican en: Grupo de
riesgo I, II, III y IV y los laboratorios donde se trabaja con microorganismos se
dividen segn sus caractersticas de diseo, construccin y medios de
contencin en tres tipos de laboratorio: bsico, de contencin y contencin
mxima.
GRUPO DE RIESGO I
Escaso riego individual y comunitario.

Nivel de Bioseguridad 1
Microorganismos con pocas probabilidades de provocar enfermedades
en el ser humano o animales.
Tipo de laboratorio
Bsico: Enseanza bsica, investigacin
Tipo de microorganismos
Bacillus subtilis, Escherichia coli
Equipo de seguridad
Ninguno; Trabajo de mesa de laboratorio al descubierto
GRUPO DE RIESGO II
Riesgo individual moderado y comunitario moderado.

Nivel de Bioseguridad 2
Agente patgeno que puede provocar enfermedades en humanos, el
riego de propagacin es limitado.
Tipo de laboratorio
Bsico: Cmaras de seguridad, dispositivos de proteccin personal.
Tipo de microorganismos
Servicios primarios de salud, laboratorios de diagnstico, de enseanza
universitaria, consultorios mdicos.
Equipo de seguridad
Trabajo de mesa al descubierto y Cmara de Seguridad Biolgica para
posibles aerosoles.

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GRUPO DE RIESGO III

Riesgo individual elevado y riesgo comunitario escaso.

Nivel de Bioseguridad 3
Agentes patgenos que provocan enfermedades graves en humanos,
pero no se propagan de una persona a otra.
Tipo de laboratorio
Contencin. Ejemplo: Laboratorios de diagnstico especializado,
investigacin.
Tipo de microorganismos
Brucella sp, Histoplasma capsulatum
Equipo de seguridad
Cmara de seguridad Biolgica adems de otros medios de contencin
primaria para todas las actividades.
GRUPO DE RIESGO IV
Elevado riesgo individual y comunitario

Tipo de laboratorio
Contencin mxima. Unidades de patgenos peligrosos. Agentes
patgenos que provocan enfermedades graves en personas y que se
pueden propagar.
Tipo de microorganismos
Virus Hanta, Virus fiebre aftosa
Equipo de seguridad
Cmara de seguridad Biolgica de clase III o trajes presurizados junto
con cmara de seguridad biolgica de clase II, autoclave de doble puerta
(a travs de la pared), aire filtrado.

Bioseguridad:
Bioseguridad es un concepto amplio que implica una serie de medidas
orientadas a proteger al personal que labora en instituciones de salud y a los
pacientes, visitantes y al medio ambiente que pueden ser afectados como
resultado de la actividad asistencial. La bioseguridad es el conjunto de medidas
mnimas a ser adoptadas, con el fin de reducir o eliminar los riesgos para el
personal, la comunidad y el medio ambiente, que pueden ser producidos por
agentes infecciosos, fsicos, qumicos y mecnicos. La bioseguridad se realiza
en conjunto, el personal que debe cumplir las normas de bioseguridad, las
autoridades que deben hacerlas cumplir y la administracin que debe dar las
facilidades para que estas se cumplan. Debe existir un responsable de
bioseguridad en cada centro de hemoterapia y banco de sangre, quien deber
controlar la capacitacin y entrenamiento necesarios sobre bioseguridad de

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todas las personas que trabajen o ingresen a los mismos, as como monitorizar
el cumplimiento de lo establecido en las normas vigentes.

Limpieza:
Es el proceso mediante el cual se eliminan materias orgnicas y otros
elementos extraos de los objetos en uso, mediante el lavado con agua, con o
sin detergente, utilizando una accin mecnica o de arrastre. La limpieza debe
preceder a todos los procedimientos de desinfeccin y esterilizacin. Debe ser
efectuada en todas las reas. La limpieza debe ser realizada con paos
hmedos y el barrido con escoba hmeda a fin de evitar la resuspensin de los
grmenes que se encuentran en el suelo. La limpieza deber iniciarse por las
partes ms altas, siguiendo la lnea horizontal, descendiendo por planos.

Desinfeccin:
Proceso que elimina la mayora de los microorganismos patgenos excepto las
esporas de los objetos inanimados. Se efecta mediante procedimientos en los
que se utilizan principalmente agentes qumicos en estado lquido, la
pasteurizacin a 75C y la irradiacin ultravioleta. El grado de desinfeccin
producido depende de varios factores:

Carga orgnica del objeto: si la limpieza fue inadecuada y existe materia

orgnica (sangre) presente, el desinfectante se inactiva.
Calidad y concentracin del agente antimicrobiano.
Naturaleza de la contaminacin de los objetos.
Tiempo de exposicin al agente antimicrobiano.
Configuracin fsica del objeto.
Tiempo y pH del proceso de desinfeccin.

Esto determina distintos niveles de desinfeccin segn los procedimientos y

agentes antimicrobianos empleados. La desinfeccin qumica se clasifica
segn su accin en:

Desinfeccin de alto nivel:

Cuando inactiva al Mycrobacterias, virus y hongos con excepcin de esporas.

Desinfeccin de nivel intermedio:

Cuando inactiva al Mycobacterium tuberculosis, bacterias vegetativas, mayora
de los virus, mayora de los hongos, pero no los esporos bacterianos.

Desinfeccin de bajo nivel:

Puede destruir la mayora de bacterias, algunos virus y algunos hongos. No es
confiable para microorganismos resientes como bacilos de tuberculosis o
esporas bacterianas.

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Descontaminacin:
Tratamiento qumico aplicado a objetos que tuvieron contacto con sangre o
fluido corporales, con el fin de inactivar microorganismos en piel u otros tejidos
corporales.

Esterilizacin:
La esterilizacin es la destruccin de todos los grmenes, incluidos esporos
bacterianos, que pueda contener un material, en tanto que desinfeccin que
tambin destruye a los grmenes, puede respetar los esporos.
A. Esterilizacin por vapor:
Es el mtodo de eleccin para el instrumental mdico re-utilizable. Se
debe mantener por lo menos 20 minutos luego que se hayan alcanzado
los 121C a una presin de dos atmsferas.
B. Esterilizacin por calor seco:
Debe mantenerse por dos horas a partir del momento en que el material
ha llegado a los 170C.
C. Esterilizacin por inmersin en productos qumicos:
Si bien los ensayos de laboratorio han demostrado que numerosos
desinfectantes que se usan en los servicios de salud son eficaces para
destruir al HIV, la inactivacin rpida que suelen sufrir por efecto de la
temperatura o en presencia de material orgnico, no hace fiable su uso
regular (p. ej: Compuestos de amonio cuaternario, Timersal, Iodforos,
etc).
Estas sustancias no deben ser utilizadas para la desinfeccin.

Proteccin Personal:
Se define el equipo de proteccin individual como cualquier equipo destinado a
ser llevado o sujetado por el trabajador para que le proteja de uno o varios
riesgos que puedan amenazar su seguridad o su salud, as como cualquier
complemento o accesorio destinado a tal fin.

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Marco Terico B
Material de Vidrio
Aparte del instrumental y variado equipo que se requiere en todo laboratorio de
Microbiologa, el MATERIAL DE VIDRIO constituye una de las principales
herramientas de esta disciplina.

TUBOS DE PRUEBA:
Condiciones. - que sean de paredes gruesas, bien equilibrados, de
preferencia sin reborde para facilitar el taponamiento. Medidas. - de 16 x
150 mm y 15 x 125 mm para cultivos microbianos puros y para
diluciones de anlisis cuantitativos. Para efectuar estudios de
fermentacin, hemlisis y utilizacin de sustratos se recomienda usar
tubos de 13x 100 mm y para estudios serolgicos de 10 x 75 mm.

CAPSULAS O PLACAS DE PETRI:

Compuestas de dos cristalizadores, de los cuales el ms grande hace de
tapa. Las ms usadas son de 10, 12 20 mm x 100 mm y se emplean
para el cultivo y aislamiento de microorganismos. La tapa puede ser
reemplazada por material de porcelana o metal sin esmalte en la
superficie interna.

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PLACA DE BREWER:
Para el cultivo y aislamiento de microorganismos anaerobios. Son
idnticos a los anteriores, con excepcin de las tapas, que adems de
pesadas tienen una depresin central que impide la acumulacin de aire,
ayudando a mantener la anaerobiosis.

KITASATO :
Es un matraz que adems de la boca tiene una salida lateral corta para
unirla a la bomba de vaco. Se utiliza como parte del equipo de filtracin
(esterilizacin en fro).

MANGOS DE KOHLE:
Vstagos de metal con su cubierta de ebonita aislante del calor y en el
extremo proximal una tuerca para insertar el alambre de platino o nicrom
en el asa de siembra.

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AUTOCLAVE:
Recipiente de presin metlico de paredes gruesas con un cierre
hermtico que permite trabajar a alta presin para realizar la
esterilizacin con vapor de agua. Su construccin permite su resistencia
a presin y temperatura elevada desarrollada en su interior. Las
autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generacin de vapor de
agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presin interna de
1 atmsfera, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de
121 grados Celsius, condiciones tpicas de esterilizacin en tiempo de
15-20 minutos. La presin elevada permite que el agua alcance
temperaturas superiores a los 100 C. La accin conjunta de la
temperatura y el vapor produce la coagulacin de las protenas de los
microorganismos, entre ellas las esenciales para la vida y la
reproduccin de stos, cosa que lleva a su destruccin.

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POTENCIOMETRO:
Requerido para las mediciones del pH de las soluciones buffer y medios de
cultivo. Constituido por un par de electrodos sensibles a concentraciones de
hidrogeniones, conectado a un circuito elctrico que mide las fuerzas
electromagnticas y a un potencimetro que indica las mediciones.
Los potencimetros emplean un electrodo de vidrio, unido a un electrodo de
calomel como standard. El electrodo de vidrio es una delgada membrana de
vidrio especial colocado entre una media celda de Plata-Cloruro de Plata y
la solucin cuyo pH se quiere conocer, el electrodo de calomel est formado
por HgCl slido sobre Mercurio metlico. Dentro de la celda de vidrio que
contiene el electrodo Ag-AgCl, se encuentra HCl 0.1 M lo que establece en
uno de los lados de la membrana de vidrio un pH constante y conocido con
exactitud. La solucin de pH desconocido y la media celda estn unidas por
un puente de KCl. El electrodo de vidrio vara con los cambios de pH de la
solucin problema, este potencial es una funcin lineal de pH.
Debe tenerse extremado cuidado en el manejo de electrodos,
especialmente con la membrana del electrodo de vidrio que es muy
delicada y se rompe al primer contacto con punzo-cortantes. El electrodo de
calomel debe estar siempre lleno con solucin adecuada de sal, usualmente
cloruro potsico saturado.

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Marco Terico 2 A
Los microorganismos de acuerdo a sus requerimientos nutricionales
se clasifican en general en AUTOTROFICOS Y HETEROTROFICOS,
existiendo variaciones nutricionales dentro de estos grupos.

MICROORGANISMOS AUTOTROFICOS:
Son aquellos que obtienen su energa de la oxidacin de
sustancias inorgnicas simples. Dentro de este grupo tenemos a
los microorganismos LITO-AUTOTROFICOS, QUIMIO
AUTOTROFICOS y los AUTOTROFICOS FOTOSINTETICOS, los
cuales extraen su energa de reacciones fotoqumicas o
reacciones qumicas de xido-reduccin y fijan el CO2 como
fuente de carbono. A este grupo de microorganismos se les
puede cultivar en medios de composicin qumica definida que
satisfacen sus exigencias nutricionales.

MICROORGANISMOS HETEROTROFICOS:
Son aquellos que requieren de compuestos orgnicos ms
complejos como fuente de carbono y nitrgeno, requieren del
suministro de protenas, carbohidratos, lpidos, vitaminas, sales
inorgnicas y otros factores de crecimiento para la sntesis de
compuestos estructurales y citoplasmticos en su desarrollo, los
organismos heterotrficos pueden ser: FOTO-ORGANOTROFICOS
Y QUIMIO ORGANOTROFICOS.

Los medios de cultivo

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos
es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en
el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es
el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se
han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de
humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de
acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.

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La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares
en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base
de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a
la que se aadirn otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la
preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la
temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40
grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el
crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que
crecen en l.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho
menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc.
Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes.
Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en
pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como
inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Grampositivas).
Condiciones generales para el cultivo de microorganismos
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve
afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos
casos, son ajenos por completo al propio medio.
1- disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de
contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas.
En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias
inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias

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adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las
reacciones qumicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones
de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la
preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo
provocaba la prdida de los factores nutritivos lbiles.
Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios
es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de
nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen
utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los
aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la
peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade
a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc.
Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales
como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias
promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica.
Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como
indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
2- consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo
productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en
estado semislido o slido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que
muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas
inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la
capacidad de licuarla.
Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y
comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est
ampliamente extendido en el laboratorio.
3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de
oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn

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adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto
intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones
atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida),
mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse
a cualquiera de las citadas condiciones.
4- condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas
en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas
en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de
agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y
evitar as que se deseque el medio.
5- Luz ambiental
La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que
en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los
microorganismos fotosintticos.
6- pH
La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de
los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con
un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No
se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no
impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar
sus procesos metablicos normales.
7- Temperatura
Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre
15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o
incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los
patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos,
alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios.
8- Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la
aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir
el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en
dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el
autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante

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