ACTIVIDAD PRCTICA N 7

Reaccin antgeno anticuerpo: Inmunofluorescencia

Actividad:
Determinacin de Anticuerpos Antinucleares
El trmino anticuerpos antinucleares describe una amplia variedad de autoanticuerpos
que reaccionan con constituyentes del ncleo celular, incluyendo ADN, ARN,
ribonucleoprotenas y otras diferentes protenas. Estos autoanticuerpos se encuentran
con alta frecuencia en pacientes con enfermedades como el lupus eritematoso
sistmico y otras enfermedades reumticas y del tejido conectivo.
El mtodo de referencia (gold standard) para la deteccin de ANA es la
inmunofluorescencia indirecta. En esta tcnica, el sustrato antignico es incubado con
el suero en estudio. El sustrato antignico son clulas, fijadas y permeabilizadas
(pegadas en pocillos de portaobjetos), para dejar el ncleo accesible a los anticuerpos
del suero. Luego de una etapa de incubacin, se eliminan los anticuerpos no unidos
mediante lavado. A continuacin, el sustrato es incubado con un segundo anticuerpo,
anti IgG humana conjugado a un compuesto de fluorescencia verde, isotiocianato de
fluorescencia (FITC). Si en la muestra de suero hay anticuerpos antinucleares, la
reaccin ser positiva y al observar las clulas del sustrato antignico bajo microscopio
de fluorescencia, se apreciar una fluorescencia verde en las reas de la clula o del
ncleo donde se ha unido el anticuerpo.
En esta actividad prctica, los alumnos desarrollarn una tcnica de
inmunofluorescencia indirecta para la deteccin de anticuerpos antinucleares (ANA) en
suero humano, mediante un kit comercial que utiliza clulas HEp-2, una lnea celular
de epitelio humano, como sustrato antignico.
IIFT: HEp-2
INSTRUCCIONES PARA LA PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
(EUROIMMUN)
MATERIALES
Suero o plasma en estudio
Portaobjetos conteniendo 5 BIOCHIPS cubiertos con clulas HEp-2
Suero de cabra anti IgG humana conjugada a FITC, listo para usar. Mantener
protegido de la luz solar ya que FITC es fotosensible
Control positivo: ANA, diluir con PBS/Tween
Control negativo para ANA, diluir con PBS/Tween
Solucin salina tamponada (PBS); - Tween 20
Medio de montaje, listo para usar
Cubreobjetos (62 x 23 mm)
Cubeta de incubacin y lavado; - Micropipeta 10-100 ul
Microscopio de fluorescencia
REACTIVOS Y MUESTRAS
1. Dejar que los reactivos y materiales alcancen la temperatura ambiente.

2. Preparar diluyente de la muestra, agregando 0,2% de Tween 20 al PBS.

3. Diluir los sueros o plasma de pacientes 1:100 con diluyente PBS/Tween 20. Para ello
mida 1,95 ml de PBS en un tubo y agregue 50 ul del suero del paciente.
METODO
1. Los portaobjetos conteniendo sustrato antignico mantenidos en el refrigerador
deben ser dejados un momento a la temperatura ambiente antes de sacarlos de la
bolsa protectora. El agua condensada puede daar las clulas.
3. Colquelos de inmediato en el interior de una cubeta de incubacin. Mrquelo para
su identificacin.
4. Agregue 30 ul de suero control positivo en el pocillo 1.
5. Agregue 30 ul de suero control negativo en el pocillo 2.
6. Agregue 30 ul de cada muestra diluida 1/100 a partir del pocillo 3.
7. Cierre hermticamente la cubeta. Para mantener un ambiente de humedad no
olvide poner unos trozos de papel absorbente hmedos en su interior. Incube a
temperatura ambiente durante 30 min.
8. Retire los portaobjetos de la cmara hmeda, elimine el suero de los pocillos
sacudindolas ligeramente sobre una toalla nova. Seque el portaobjetos por los
costados y por detrs con toalla nova y lave los pocillos agregando un chorrito de
PBS/Tween (con micropipeta de 1000 ul) sin apuntar directamente a los pocillos de
la placa.
9. Sumerja los portaobjetos en una cubeta con PBS/Tween durante 5 minutos. Sacuda
el exceso de PBS de las placas, seque los bordes sin pasar a llevar los pocillos.
10. Coloque nuevamente los portaobjetos en la cmara hmeda y agregue a cada
pocillo 25 ul de conjugado-FITC. No permita que los pocillos se sequen antes de
agregar el conjugado. Incube por 30 min. a temperatura ambiente y en oscuridad.
11. Repita los pasos 8 y 9 (lavado), cuidando de no exponer excesivamente a la luz.
12. Sacuda el exceso de PBS de los portaobjetos. Aplique 10 ul de medio de montaje en
cada pocillo y cubra con un cubreobjetos, evitando la formacin de burbujas.
13. Guardar a 4C protegido de la luz hasta la observacin en microscopio de
epifluorescencia.
14. Para la lectura al microscopio se recomienda usar objetivo 40x, filtro de excitacin
450/490 nm., fuente de luz lmpara de mercurio 100 W.
RESULTADOS
Observe al microscopio de epifluorescencia, primero el pocillo correspondiente al
control negativo, enseguida el correspondiente al control positivo. Luego observe los
pocillos de las muestras en estudio.
Reaccin Negativa: se considera como reaccin negativa a la fluorescencia equivalente
a la presente en el control negativo.
Reaccin Positiva: se considera como reaccin positiva al patrn especfico de tincin
nuclear claramente fluorescente comparado con el control negativo.
INTERPRETACIN DE LOS PATRONES DE REACCIN POSITIVA
Dependiendo de la cantidad y tipo de ANA presentes en el suero, se puede observar
una variedad de patrones de reaccin:

Patrones nucleares
Homogneo: Tincin slida del ncleo. Asociado a LES, LES por drogas, artritis
reumatodea, enfermedad de Sjgren
Perifrico: Tincin slida en la regin externa del ncleo. Podra existir tincin nuclear
pero de menor intensidad. Asociado a LES, LES por drogas, elevada en nefritis lpica
Moteado: Tincin fina granular del ncleo. Asociado a Enfermedades del tejido
conectivo, LES, artritis reumatoidea, esclerodermia
Nucleolar: Grueso grumo de tincin dentro del ncleo, con o sin grumos finos en todo
el ncleo. Asociado a Esclerodermia, miositis, sndrome de Sjgren
Centromrico: Tincin fluorescente de los centrmeros de los cromosomas. Estos
anticuerpos pueden ser detectados en toda la mitosis exceptuando la telofase.
Asociado con sndrome de CREST.
NOTA: La reactividad en las clulas HEp-2 puede presentar patrones citoplasmticos
en caso de existir anticuerpos contra algn componente del citoplasma; sin embargo
igualmente se denominan como anticuerpos antinucleares. Lo correcto sera
denominarlos como anticuerpos anti celulares pero an no se ha logrado un consenso.

Patrones citoplasmticos
Mitocondrial: Fluorescencia en pequeos grupos en la regin perinuclear de la clula.
Ttulos elevados de anticuerpo se asocian a cirrosis biliar primaria.
Filamentoso: Tincin muy fina y uniforme en todo el citoplasma parecido a una
telaraa. Hepatitis autoinmune, hepatitis A, B y C.
Aparato de Golgi: Tincin concentrada solo al lado de la regin perinuclear. LES,
sndrome de Sjgren primario, AR
Lisosomal: Moteado discreto distribuido en el citoplasma en interfase y mitosis.
Ribosomal: Moteado denso pequeo y numeroso. Concentrado alrededor del ncleo.
Inicio temprano de LES
Referencias bibliogrficas
1. Gonzlez, E, Rothfield, N. (1966) Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence
in systemic lupus erythematosus. N Engl J Med 274: 1333-1338.
2. Tan, E. (1982) Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and
medicine. Adv Immunol 33: 167-239.

TRABAJO PREVIO AL LABORATORIO

Tarea 17: Averige qu contiene el medio de montaje y cul es la utilidad de usarlo en
tcnicas de inmunofluorescencia.

Bibliografa:

Registro de resultados:
Pocillo
Muestra
Dilucin
Resultado
Patrn

Tarea 18: Dibuje el patrn positivo que usted observ al microscopio

Informe de Laboratorio
Nombre paciente

: ________________________________________________

Procedencia

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Examen

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Mtodo

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Resultados

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Fecha

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FIRMA T.M.
EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD PRCTICA
Describa los aspectos ms destacables de esta actividad prctica, refirindose a las
dificultades encontradas. Mencione tambin aquellos aspectos positivos que usted
haya encontrado. Puede agregar sugerencias de cmo se puede mejorar este
laboratorio.