UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA
EXTRACCION DE ADN BACTERIANO
KEVIN CASTILLO-PAOLA CERON-CRISTIAN PERAFAN

RESUMEN
En la practica se extrajo ADN a partir de bacterias acido lacticas (BAL).el
procedimiento se baso en la lisis de las BAL con SDS y remocion de proteinas
mediante la digestion con proteinasa k,seguida de la precipitacion de
carbohidratos y proteinas residuales con CTAB,finalmente,el ADN se extrae con
cloroformo y se recupera de la fase acuosa mediante la precipitacion con etanol.

INTRODUCCION
En la actualidad se ha optado por hacer de forma ms practica la extraccin de
ADN bacteriano, para ello se dispone de una serie de tcnicas que permiten la
caracterizacin e identificacin de especies utilizando marcadores moleculares. La
calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms
importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy
purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar
mtodos de extraccin adecuados. Para extraer los cidos nucleicos del material
biolgico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y
separar los cidos nucleicos de los restos de clulas. En La realizacin de esta
prctica de extraccin de ADN bacteriano se utiliz el mtodo CTAB porque
permite obtener ADN de alta calidad eliminando los inhibidores que afectan la
PCR; adems de ser un mtodo econmico y viable de estandarizar. Este mtodo
consiste bsicamente en las etapas: lisis, extraccin y precipitacin.

METODOLOGIA
Se inoculo una colonia en 25 mL de MRS e incubo por 18 h a 35c para promover
la ruptura de membranas,posterior a esto se centrifugo,para aislar las celulas y
descartar al sobrenadante,seguidamente se adiciono 2,4 mL del tampon TE y se
aplico vortex para promover la homogenizacion de la mezcla,despues se adiciono
500 microlitros de lisozima que actua como un destabilizador de la pared
bacteriana, se homogeneizo y se dejo durante 1h en bao termostado para
promover la accion de la lisozima.posterior a esto se adiciono 62,5 microlitros de la
solucion SDS que ayuda en la eliminacion de la membrana, posteriormente se

adiciono 20 mg/ml de la proteinaza k, esta proteasa libera el ADN al medio y

digiere las proteinas.seguidamente se incubaron durante 1h a 37C,luego se
colocaron sobre hielo,depues de adicionaron 300 microlitros de NaCl que
desproteiniza la muestra mediante una deshidratacion y precipitacion de las
proteinas
celulares.previamente
se
hizo
una
homogenizacion
con
vortex.posteriormente se adiciono 188 microlitros de CTAB con su accion
detergente desestabiliza la membrana celular provocando una mayor lisis,ademas,
le da estabilidad al pH de la solucin se aplico vortex,despues se incubaron
durante 20 min a 65C para agilizar la accion del detergente,se dejo enfriar y se le
adicion un volumen igual al de la muestra de cloroformo alcohol isoamilico que
permite la separacion en dos fases ; el ADN queda en la fase acuosa y en la fase
orgnica quedan las protenas y otros contaminantes.seguidamente se llevo a la
centrifuga para hacer mas visible las dos fases, se transfirio el sobrenadante a otro
tubo,para precipitar el ADN se utilizo 0,3 microlitros de isopropanol frio,posterior a
esto se alamacenado a -20C hasta el dia siguiente,despues se hizo una
centrifugacion para descartar el sobrenadante,luego se lavo el pellet con 100
microlitros de etanol y se centrifugo para eliminar el sobrenadante finalmente se
dejo secar y se resuspendio el pellet en TE y se refrigero.
http://www.conganat.org/seap/revista/v30-n2/15.pdf

METODO
CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio)
Lisis de la membrana celular: La primera etapa de la extraccin del ADN es la
rotura de la membrana celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada
se trata primero con el tampn de extraccin, que contiene EDTA, Tris-HCl y
CTAB. Todas las membranas biolgicas presentan la misma estructura general,
integrada por molculas de lpidos y de protenas, unidas por interacciones no
covalentes.

Las molculas lipdicas estn ordenadas en una doble capa continua, en la que las
molculas protenicas estn disueltas. Las molculas lipdicas estn formadas
por extremos hidrfilos, denominados cabezas, y extremos hidrfobos,
denominados colas. En este mtodo, el detergente (CTAB) contenido en el
tampn de extraccin provoca la lisis de la membrana. Dado que la composicin
de los lpidos y del detergente es similar, el componente de CTAB del tampn de
extraccin captura los lpidos que integran la membrana celular y nuclear. A
continuacin se muestra el mecanismo de solubilizacin de los lpidos con un
detergente.

Cmo se libera el ADN genmico cuando el detergente captura los lpidos y las
protenas al entrar en contacto la membrana celular y el tampn de extraccin con
CTAB. Con una concentracin salina (NaCl) determinada, el detergente forma un
complejo insoluble con los cidos nucleicos. El EDTA es un componente quelante,

que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio es un cofactor de la

desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la
desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solucin la
capacidad de amortiguar el pH. Los cidos nucleicos se degradan fcilmente en
esta fase de la purificacin, debe reducirse al mnimo el tiempo transcurrido entre
la homogeneizacin de la muestra y la adicin de la solucin tampn con CTAB.
Una vez que se han roto las membranas de la clula y de los orgnulos (como los
que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el
ADN.

EXTRACCIN - En esta etapa, se separan los complejos formados por los cidos
nucleicos y el CTAB de los polisacridos, los compuestos fenlicos, las protenas y
los dems lisados celulares disueltos en la solucin acuosa. Es especialmente
importante eliminar los polisacridos y los compuestos fenlicos, pues pueden
inhibir numerosas reacciones enzimticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl
< 0,5 M), los contaminantes de los complejos de cidos nucleicos no precipitan y
pueden eliminarse extrayendo la solucin acuosa con cloroformo. El cloroformo
desnaturaliza las protenas y facilita la separacin de las fases acuosa y orgnica.
La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es
densa debido a la concentracin salina (> 0,5 M), formar la fase inferior. Adems,
si el pH de la solucin acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 8,0), los
cidos nucleicos tendern a repartirse en la fase orgnica. Si es preciso, la
extraccin con cloroformo se realizar dos o tres veces, con objeto de eliminar por
completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extraccin de los
cidos nuclicos, puede retroextraerse la fase orgnica con una solucin acuosa,
que se aade a continuacin al extracto anterior. Una vez purificados los
complejos de cidos nucleicos, puede procederse a la precipitacin, ltima etapa
del procedimiento.

PRECIPITACIN - En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del

detergente, para lo cual la solucin acuosa se trata primero con una solucin de
precipitacin compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentracin
elevada (NaCl > 0,8 M). Una alta concentracin salina es necesaria para que se
forme un precipitado de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de
sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampn. En estas condiciones, el
detergente, que es ms soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por
lavado, mientras que los cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con
etanol al 70 % permite una mayor purificacin o elucin de los cidos nucleicos de
la sal residual.
https://monitoreoybioseguridad.files.wordpress.com/2014/02/extraccion-de-adn.pdf
EL MTODO DE PURIFICACIN DE ADN GENMICO FENOL CLOROFORMO
Consta de los siguientes pasos:
1. Aadir un volumen igual al de la muestra de la
fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1) y agitar con vrtex.

mezcla

2. Centrifugar a temperatura ambiente y transferir la parte acuosa que contiene

el cido nucleico a otro tubo
3.

Aadir acetato sdico para facilitar la precipitacin con etanol, y despus

aadir etanol al 100% fro.

4. Dejar precipitar a 20C durante 30 minutos

5. Centrifugar y eliminar el sobrenadante
6. Lavar con etanol al 70%, para re-precipitar
7. Centrifugar y eliminar el sobrenadante de nuevo
8. Resuspender en tampn TE

http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?
p=Aplicacion_AN_Purificacion&opc=tecnicas&idap=34

RESULTADOS
Despues de haber terminado con el proceso de extraccion se procedio a verificar
de forma visual el contenido que se encontraba precipitado en el pellet para
identificar la presencia de ADN bacteriano pero no se observo nada,por lo cual se
procedio a refrigerar la muestra a -20C durante 24 h posterior a esto se
centrifugo y se le hizo un lavado con etanol al 70% luego se centrifugo de nuevo
para eliminar el sobrenante y se dejo secar y luego se resuspendio el pellet en
tampon TE todo esto para lograr una purificacion del ADN.

DISCUSION