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CRESCITA MICROBICA per la PRODUZIONE

INDUSTRIALE
La coltura
- In batch
- Continua
- In fed-batch
- FERMENTATORI
- PROCESSO

Quando il terreno contiene tutti i nutrienti


necessari, in concentrazione non limitanti, e la
temperatura ottimale per il microrganismo si
dice che la crescita bilanciata e il
microrganismo cresce alla sua massima
velocit, indicata come max.,

EFFETTO DELLINOCULO E DEL SUBSTRATO


SULLA FASE DI LATENZA

Produ7vit nel processo batch


Col termine produ.vit si indica la quan5t di biomassa X e di prodo8o P
alla ne del processo
La misura della produ.vit assume forme diverse a seconda dei
parametri presi in considerazione

Produ7vit totale indica la quan5t di P o8enuto alla ne del processo,
senza tener conto del tempo. E espressa in grammi

Produ7vit specica (qP) me8e in relazione velocit di formazione del
prodo8o con la velocit di formazione della biomassa.
E espressa in grammi di prodo8o per grammo di cellule per ora (g P/
g.cells/h) ed quindi indipendente dal volume

Produ7vit volumetrica (Q) indica la quan5t in grammi di prodo8o per
volume unitario e viene espressa in g/L/h

un processo che ha avuto inizio al tempo t4 ed stato interrotto al tempo t5 per il recupero del
prodotto.
La produzione avvenuta secondo una curva che rappresenta la produttivit effettiva.
Linclinazione delle semirette X indica la produttivit media, cio la produttivit effettiva
divisa per il tempo di durata del processo.
NB. Se il processo viene arrestato al tempo t5, la produttivit media sar la pi alta possibile.
Infatti se il processo fosse interrotto prima o dopo, ad esempio al t6, la produttivit media,
indicata dalla semiretta X2 risulterebbe inferiore anche se il prodotto sarebbe superiore in
valore assoluto.
La semiretta X1 tangente la curva di produttivit effettiva in un punto che indica il momento
di produttivit massima Xm (o Pm in caso di P)
I tempi morti t1-t4 corrispondono a quelli di raccolta del ciclo precedente, pulizia, riempimento,
sterilizzazione e inoculo del nuovo ciclo.

Coltura continua

I tempi morti di un processo batch riducono la produttivit del processo e


il continuo cambiamento delle condizioni chimico-fisiche nel reattore
sottopongono i microrganismi a continui adattamenti che rendono difficile il
controllo del processo.
Per questo si tende ad abbandonare la coltura batch a favore di altri
sistemi che permettono la riduzione dei tempi morti e soprattutto un
migliore controllo del processo.
Tali sistemi sono la coltura continua e la coltura fed-batch (semicontinua),
con le loro innumerevoli varianti.

La coltura continua costituita da un sistema aperto con un flusso in


entrata ( F ) che contiene il substrato ( S0 ) e un flusso in uscita ( F ) che
corrisponde al contenuto del reattore

F = F
V = costante
S = limitante

Crescita in condizioni di
substrato limitante

Nella crescita batch la massima


velocit di crescita si raggiunge
solo nella fase logaritmica e solo
se la crescita bilanciata.
Quando un nutriente essenziale
in concentrazione limitante, la
velocit di crescita diminuisce e
assume un valore che
proporzionale alla
concentrazione del nutriente
limitante, non cio una costante.
La relazione fra velocit di
crescita e concentrazione del
nutriente limitante descritta
dallequazione di Monod come una
cinetica di primo ordine uguale a
quella di una cinetica enzimatica

Coltura continua
Il flusso in entrata contiene un nutriente essenziale S0 con concentrazione tale che
una volta diluito nel terreno abbia una concentrazione limitante.
Le cellule nel reattore adattano la loro velocit di crescita alla concentrazione del
substrato limitante secondo lequazione di Monod.
A parit di concentrazione S0 e di V, se si aumenta il flusso (entra pi substrato) le
cellule rispondono aumentando la velocit di crescita e viceversa.
Poich aumentando o diminuendo il flusso aumenta o diminuisce dello stesso valore il
flusso in uscita F, si raggiunge uno stato stazionario (steady state) in cui
allinterno del reattore
X = costante

S = costante

dX/dt = X DX
La variazione di X in ogni istante determinata dalla velocit di crescita meno la
velocit di perdita
Allo stato stazionario dX/dt = 0

da cui

= D

La velocit di crescita uguale alla velocit di diluizione specifica (=D).

Questo equilibrio viene mantenuto per valori di D inferiori alla velocit di crescita
massima. Ad alte D la concentrazione del substrato tende ad essere non limitante e
la velocit di crescita tende a essere quella massima possibile per quel
microrganismo in quelle condizioni

Se la velocit di diluizione specifica supera la velocit di crescita massima la


velocit di perdita delle cellule maggiore della velocit di crescita e si verifica il
Wash out (dilavamento) del reattore.
X tende a 0; S tende a S0

Allaumentare della velocit di diluizione:


-Il tempo di generazione (doubling 5me) diminuisce
-DX (velocit di crescita) aumenta
-Massa cellulare (X) costante

MA- quando la velocit di diluizione supera la velocit di crescita
SI VERIFICA IL DILAVAMENTO
In questo esempio in un punto tra 0.75 e 100 di Dilu5on rate

Vantaggi della coltura continua

Abbattimento dei costi (preparazione del terreno e dellinoculo,


sterilizzazione)
Aumento della produttivit (abbattimento dei tempi morti, uniformit del
prodotto, processi downstream semplificati)
Possibilit di studiare la limitazione di un singolo parametro sul
metabolismo.
Possibilit di studiare il comportamento delle cellule durante il periodo di
transizione da uno steady state ad un altro
ottimizzazione della composizione del terreno
SVANTAGGI
Lo sviluppo e messa a punto un processo molto costoso che richiede grandi
investimenti iniziali.
Tecnologia molto avanzata, operatori altamente specializzati
Problemi di sterilit e mantenimento della stabilit genetica della coltura

Coltura

fed-batch

Nella fase iniziale reattore fed-batch identico a quello batch tranne per il fatto
che viene riempito con un decimo di volume rispetto al volume massimo.
Dopo linoculo si permette alle cellule di iniziare la crescita e, prima dellinizio della
fase stazionaria, si incomincia ad immettere substrato con portata costante F, in
maniera analoga a un continuo, senza che a differenza di questo vi sia un flusso in
uscita, fino al raggiungimento del volume massimo.
Durante il processo, il continuo aumento del volume determina una diminuzione della
diluizione (D). (D = diluizione, diverso da velocit di diluizione nella coltura continua).
Man mano che si riempie il fermentatore, il volume (V ) aumenta e D diminuisce, le
cellule crescono pi lentamente.
Quando il volume vicino al volume massimo lapporto del flusso allaumento del volume
quasi trascurabile e le cellule entrano in uno stato quasi stazionario dinamico in cui
continuano a crescere anche se sempre pi lentamente consumando tutto il substrato.
In questo sistema si ottiene una biomassa maggiore rispetto alla coltura continua e alla
coltura batch.
Nel fed-batch a singolo stadio il reattore viene completamente svuotato alla fine del
processo, mentre nel fed- batch ripetuto nel reattore viene lasciato un volume pari a
quello iniziale e si inizia un nuovo processo.

MATERIE PRIME

Nei processi biotecnologici industriali per ragioni economiche sono di norma


utilizzati substrati complessi di composizione non definita.

La scelta della materia prima deve tener conto di molti parametri diversi che
riguardano:

Efficienza del processo


Crescita del microrganismo. in relazione alla sua composizione elementare e
alle sue esigenze nutrizionali
Resa del prodotto in relazione alleffetto che elevate o basse concentrazioni
di specifici nutrienti hanno sulla sintesi del prodotto
Estrazione-purificazione del prodotto ad esempio co-purificazione di molecole
presenti nel terreno con propriet chimico-fisiche simili al prodotto stesso.
Effetti di processo quali la sterilizzazione, il pH ecc sulla composizione finale
del terreno.

Considerazioni economiche

Costo della materia prima rispetto al valore commerciale del prodotto


La materia prima pu incidere dal 20 a pi del 50% del costo dellintero
processo.
Disponibilit nel tempo, deperibilit e stoccaggi per materie prime che
derivano da prodotti agricoli stagionali
Variazioni della composizione nel tempo che dipendono da variazioni nella
composizione dei prodotti agricoli stessi allinizio o alla fine della raccolta
Costi di trasporto dal luogo di produzione

Fonti di carbonio

Melassi
Sottoprodotto della cristallizzazione del saccarosio da canna e da barbabietola
da zucchero
Contiene oltre a zuccheri (circa il 50% ps) composti azotati, vitamine ed
elementi in tracce

Siero di latte
Sottoprodotto dellindustria casearia. La maggior parte del siero di latte viene
utilizzato per lalimentazione umana o del bestiame
Contiene il 60-70% di lattosio e anche proteine (10%)
I costi son elevati a causa della deperibilit del prodotto che deve essere
trasportato e mantenuto a freddo.

Polimeri di glucosio
Amido (da farine di cereali)
Cellulosa (materiale vegetale di varia natura)

Fonti di azoto
Corn steep liquor.
Sottoprodotto dellestrazione dellamido da mais
Farine.
Sottoprodotti della lavorazione di semi vegetali, di residui di pescato
(farina di pesce)
Sali di ammonio
Urea
Ammoniaca gassosa