ANLISIS DE LAS VITAMINAS

1. Definicin y la importancia
Son compuestos de peso molecular relativamente bajos.
Se necesitan en pequeas cantidades para el metabolismo normal.
Los niveles insuficientes tienen como resultado enfermedades carenciales.
2. Importancia del anlisis
Determina las necesidades nutricionales de los animales y seres humanos.
Para valorar la idoneidad de la dieta y para mejorar la nutricin.
Garantiza la exactitud del etiquetado.
3. Mtodos
3.1. Mtodos de extraccin
Implican la extraccin de una vitamina de su matriz biolgica, con anterioridad al
anlisis.
Tratamientos: el cido, el calor, el lcali, los disolventes y los enzimas.
Los procedimientos de extraccin son especficos para cada vitamina y estn
diseados para estabilizar la vitamina.
Algunos procedimientos tpicos de extraccin son:

cido ascrbico. Extraccin en frio con c. Metafosfrico c. Actico.

Vitaminas B 1 y B2. Ebullicin o extraccin con c. en autoclave, ms un

tratamiento enzimtico.

La niacina. Extraccin en autoclave con cido o lcali.

Vitaminas A, E o D. extraccin con disolventes orgnicos, saponificacin y

reextraccin con disolventes orgnicos.

3.2. Mtodos del bioanlisis

Se utilizan solamente para el anlisis de las vitaminas B12 y D.
Para la vitamina D se analiza con el ensayo line test, basado en la calcificacin de
los huesos.
Procedimiento para el bioanlisis de la vitamina D

Preparacin de la muestra. Las instrucciones lo proporciona la AOAC.

En algunos casos se hace uso de la saponificacin.

Periodo de deplecin. La dieta raquitognica se administra durante 18-25

das.

Periodo de ensayo. Es el intervalo de vida de la rata entre el ltimo da del

periodo de agotamiento y el octavo o undcimo da despus.

Potencia de la muestra. Se determina la vitamina por el ensayo line test.

3.3. Ensayos microbiolgicos

Se compara el crecimiento de un microorganismo determinado en un extracto de
una muestra que contenga la vitamina, con el crecimiento de dicho microorganismo.
Como organismo de ensayo se utilizan: bacterias, levaduras o protozoos.
El crecimiento puede ser medido en trminos de turbidez, produccin de cido,
gravimetra o por respiracin.
3.3.1. La niacina
El crecimiento se mide por la turbidez. Si se hace uso de lactobacilos, se pueden
utilizar igualmente las medidas acidimetrcas.
Procedimiento para el anlisis microbiolgico de la niacina

Preparacin de la muestra. Se pesa una muestra que contenga

aproximadamente 0.1 mg de niacina, aada H 2SO4 1N, se somete al
autoclave 1h. 121C, enfriar. Diluya hasta enrasar.

Preparacin de los tubos del ensayo. Utilice 0, 0.5, 1, 2, 3, 4 y 5ml. de

filtrado de la muestra y se completa la diferencia hasta 5ml agua, adiciona
5ml de caldo Difco Basal Medium for Niacin Assay c/u de los tubos.

Preparacin de patrones. Utilizando 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 y 5ml de

disolucin patrn (0.1 ug niacina/ml) y se trata igual que el paso anterior.

Inoculacin e incubacin. Se aade 1 gota de inculo (utilizando

lactobacillus plantarum) a c/u de los tubos, se los tapa e incuba a 37 C.

3.3.2. El folato
Los folatos son lbiles frente a la oxidacin, la luz, las perdidas trmicas y la
lixiviacin cundo se procesan los alimentos.
Preparacin para el anlisis microbiolgico de los folatos

Preparacin de la muestra. A 1.2 2g de muestra se aade 50ml de

disolucin amortiguadora especificada, homogenice.

Digestin con las tres enzimas. Digiera c/u de las muestras con -amilasa,
proteasa y conjugasa especificadas, desactivarlas hirviendo por 5 min.

Preparacin de la curva de calibrado y los tubos blancos. Utilizando

disolucin de folato para la curva. Prepara un tubo blanco inoculado y no
inoculado para poner en cero el espectrofotmetro, y un blanco de enzima.

Ensayo. Lo preparado anterior se someten al autoclave a 121C, 5min y se

aade 1 gota de inoculo, se incuba los tubos a 37C. 20 24h, se mide la
respuesta de crecimiento mediante % transmitancia a 550nm.

Clculos
Se calculan a mano o a partir de la recta de regresin de la curva de calibrado
de respuestas, obtenidas mediante grficos polinomiales de 4 grado. Los
resultados se expresan como mg/100g o mg/racin.
3.4. Mtodos qumicos
3.4.1. Vitamina A (Retinol)
Se saponifica la muestra, se extrae la vit. A al disolvente orgnico y se concentra y
se determinan los niveles de todo-trans-Retinol y de 13-cis-retinol, mediante
cromatografa HPLC, sobre una columna de slice.
Procedimiento para el anlisis de la vit. A mediante la cromatografa HPLC.

Preparacin de la muestra. 40ml de leche lquida a un matraz de digestin

de 100ml, adiciona 10ml de disolucin etanlica de pirogalol y saponifique
con KOH etanlico por 18h a 70C.

Extraccin del digerido.

Parmetros para la cromatografa.

Clculos
(

AT, AC=rea del pico, todo-transretinol y 13-Cis-retinol de la muestra

respectivamente.
AST, ASC= rea del pico, todo-transretinol y 13-Cis-retinol en el patrn
respectivamente.
WT, Wc= peso de la muestra (mg)
V= volumen de la muestra (ml)
DF= factor de dilucin

3.4.2.Vitamina E (Tocoferoles y tocotrienoles)

Se saponifica la muestra bajo reflujo, se extrae con hexano y se inyecta en una
columna de cromatografa HPLC de fase normal, conectada a un detector de
fluorescencia,
Procedimiento para el anlisis de la vit. E mediante la cromatografa HPLC.

Preparacin de la muestra.

Parmetros para la cromatografa.

Clculo. Se cuantifica a partir del rea de pico, por medio de la regresin lineal.
3.4.3. Vitamina C
3.4.3.1.

Mtodo volumtrico del 2,6-dicloroindofenol

Procedimiento del anlisis de la vit. C

Preparacin de la muestra. Se extracto de la muestra en una disolucin de

ac. metafosfrico-ac. Actico; filtra y diluye hasta 10-100mg c.

ascrbico/100 ml.

Preparacin del patrn. 50mg c. ascrbico/100 ml. c metafosfrico

Valoracin. El patrn y la muestra, con una disolucin de dicloroindofenol

hasta un color rosa persistente, por lo menos 10.

3.4.3.2.

Mtodo microfluorimtrico

Este mtodo mide ambos, el c. ascrbico y el c. dehidroascrbico.

Procedimiento del anlisis de la vit. C

Preparacin de la muestra. Es igual al anterior mtodo, se aade 2g Norit

lavado a los c a 100ml del patrn y la muestra, agite y filtre.

Preparacin de los blancos. Transfiere 5ml de filtrado a matraces aforados

a 100ml, conteniendo una disolucin H3BO3-NaOAc.

Determinacin de la muestra. Transfiera 2ml de disolucin patrn o

muestra a c/u de 2 conjuntos de 3 tubos para la fluorescencia.

Formacin de quinoxalina. Aada 5ml disolucin o-fenilenodiamina.

Determinacin. Mide la fluorescencia a

3.4.4. La tiamina (vitamina B1) por el procedimiento fluorimtrico del tiocromo.

Se basa en la medida de la fluorescencia de la forma oxidada de la tiamina, el
tiocromo.
Procedimiento por tiocromo

Preparacin de la muestra.

Hidrolisis enzimtica

Purificacin del extracto de la muestra

Formacin de tiocromo

3.4.5. La riboflavina (vitamina B2) por el procedimiento fluorimtrico.

Procedimiento por fluorescencia

Preparacin de la muestra.

Oxidacin de los materiales interfirientes

Medida de fluorescencia.