TAREA: Aprovechamiento del suero lcteo, pajilla

de arroz, papa y cascarilla de caf en procesos

fermentativos.
ELABORACIN DE UNA BEBIDA ALCOHLICA DESTILADA (Vodka) A
PARTIR DE TRES VARIEDADES DE PAPA (Solanum tuberosum)
UTILIZANDO DOS TIPOS DE ENZIMAS
1. LA PAPA
El centro de origen de la papa (Solanum sp) se encuentra en Amrica, y
su distribucin es del sur-oeste de Estados Unidos de Norte Amrica
hasta todo el continente. A lo largo de toda la cordillera andina
encontramos una gran variabilidad de especies originales y entre ellas
176 son silvestres y solo siete cultivadas.
La papa es uno de los tubrculos ms consumidos en el Ecuador.
Procede de la planta Solanum tuberosum, que posee un importante
contenido de almidn, que en promedio puede alcanzar el 14%. Su
contenido en protena y grasa es bajo y presenta una gran variedad de
posibilidades para ser industrializada y obtener productos con valor
agregado de gran aceptacin por parte del consumidor en general.
2. Descripcin taxonmica
Segn Egusquiza, B.R (2000) seala: La papa, tiene como nombre
comn patata y segn el Centro Internacional de la Papa con sede en
Per mantiene clasificada de la siguiente manera:
Reino: Vegetal
Clase: Angiospermae
Subclase: dicotyledoneae
Orden: Tubiflorae
Familia: Solanaceae
Gnero: Solanum
Nombre cientfico: (Tuberosum solanum)

3. Descripcin de la planta
3.1 Composicin
Aunque depende de la variedad cultivada, el tubrculo se compone
bsicamente de 72-75% de agua, 16-20% de fcula en forma de almidn,
2,0-2,5% de substancias nitrogenadas, 0,15% lpidos y 1,0-1,8% de fibra
diettica como celulosa. Otro compuesto presente en l es la solanina,
producida en pequeas cantidades (menos de 0,2 mg/g de producto),
pero que se incrementa hasta 1 mg/g o ms en determinadas condiciones
(por exposicin prolongada a la luz o lesiones mecnicas). Aunque a
estas concentraciones la patata es txica, el pelado y el tratamiento
trmico (como la coccin o la fritura) permiten destruir esta sustancia; sin
embargo, permanece su sabor amargo.
3.2 Variedades
Cuadro 1: Composicin qumica de la papa
Composicin qumica de la parte comestible (100 g)

Componente

Papa comn

Papa criolla

Agua

76.7

75.5

Protena

1.9

2.5

Grasas

0.1

0.1

Carbohidratos

19.3

18.7

Fibra

1.0

2.2

Cenizas
1.0
Otros componentes (mg)

1.0

Cuadro 2: Caractersticas de la variedad super chola

Caractersticas
Materia seca %

Promedio
20.92

Gravedad especfica

1.086

Azcares reductores %

0.25

Almidn %

15.02

Protenas

7.94

Tiempo de coccin (min)

26.0
Fuente: Andrade H. INIAP (1998)

Cuadro 3: Caractersticas de la variedad capiro

Caractersticas
Materia seca %

Promedio
23.9

Gravedad especfica

1.103

Azcares reductores %

0.12

Almidn %

18.40

Protenas

8.32

Tiempo de coccin (min.)

23.0
Fuente: Andrade H. INIAP (1998)

Cuadro 4: Caractersticas de la variedad gabriela

Caractersticas
Materia seca %

Promedio
18.92

Gravedad especfica

1.082

Azcares reductores %

0.18

Almidn %

12.02

Protenas

8.28

Tiempo de coccin (min.)

28.0
Fuente: Andrade H. INIAP (1998)

3.3. EL ALMIDON
Segn Owen F. (1982) manifiesta, es un hidrato de carbono
complejo
(C6H10O5)n inodoro e inspido, en forma de grano o polvo. El almidn es
el principal carbohidrato de reserva en la mayora de las plantas.
4. MATERIALES Y MTODOS
4.1 Materias Primas:
Papa variedad super chola
Papa variedad capiro
Papa variedad gabriela
4.1.1 Insumos.
Enzima Termamyl 120 L, Type L
Enzima Fungamyl 800 L
Enzima AMG 300 L
Levadura Saccharomyces cerevisiae
Acido ctrico
4.1.2 Reactivos
Solucin 0,1 N de hidrxido de sodio
Solucin indicador de fenolftalena, solucin alcohlica al 1%
Agua destilada
4.1.3 Factores en estudio
Para la obtencin de vodka se utiliz tres variedades de papa
comercializadas en los mercados de la ciudad de Ibarra:
Factor A
Variedad de papa (Solanum tuberosum)
Sper Chola

(V1)

Capiro

(V2)

Gabriela

(V3)

Factor B
Tipos de enzimas (amilasas comerciales)
Termamyl 120L, Type L

(E1)

Fungamyl 800 L

(E2)

4.1.4 Unidad Experimental

Cada unidad experimental tuvo un peso de 15 kg de
papa pelada.
4.2 VARIABLES EVALUADAS
4.2.1 Materia prima

Rendimiento de almidn

4.2.2 Hidrlisis enzimtica

Prueba de yodo

4.2.3 Durante la fermentacin

Porcentaje de slidos solubles

pH

4.2.4 Producto terminado

Grado alcohlico
Acidez total
Esteres (acetato de etilo)
Aldehdos
Alcoholes superiores (iso amlico)
Metanol
Pruebas organolpticas (aroma, color, sabor, aspecto)
Rendimiento de vodka

5 MANEJO ESPECFICO DEL EXPERIMENTO

Diagrama 1. Proceso de obtencin de almidn de
papa
Papa

Recepcin
Papa deteriorada

Clasificacin

Pesado

Agua

Limpieza y pelado

tierra y
cortezas

Pesado

Rallado

Agua

Lavado

fibra

Sedimentacin
agua 3 horas
Secado
Almidn

45C

Diagrama 2. Proceso de elaboracin de bebida alcohlica

de papa
Almidn

Pesado

Mezclado
Agua destilada
Gelatinizacin

Amilasas
(Termamyl o Fungamyl)

cido ctrico Enzima

AMG

Hidrlisis 1

Reposo 1

1 hora

Hidrlisis 2
Reposo 2

1 hora
Inoculacin
Levadura
(Saccharomyces
cereviseae)

Fermentacin

Trasvase

Mosto

CO2 14 das
Sedimento

1
Destilacin

cabezas y colas

Embotellado

Etiquetado

Almacenamiento
3.5.1 Descripcin del Proceso
Recepcin: La papa, materia prima de nuestra
investigacin fue adquirida en el mercado mayorista de
la ciudad de Ibarra.
Clasificacin: Se clasific la materia prima eliminando
aquellas que se encontraron en mal estado.
Pesado: Se pes la materia prima que estuvo apta
para el procesamiento.
Limpieza y pelado: Se procedi a lavar la materia prima
con abundante agua para eliminar la tierra e impurezas y
luego se procedi a pelar de forma manual.
Pesado: se pes la papa utilizando una balanza tipo reloj
de 15 kg de capacidad.
Rallado: Esta operacin consisti en aumentar la superficie
de contacto de la papa, se realiz de forma manual
utilizando ralladores de metal para facilitar la salida de las
molculas de almidn.

Lavado: Una vez terminado la operacin de rallado, se

lav con agua y agitacin constante, para extraer mayor
porcentaje de almidn.

Sedimentacin y decantado: Se dej en reposo durante 24

horas para que el almidn sedimente y se separe del agua,
luego de lo cual se elimin toda el agua superficial.

 Secado: Para eliminar el agua retenida en el almidn se

procedi a secar durante 3 horas a 45C en horno con
flujo de aire.
Pesado: Una vez que se obtuvo el almidn seco se
procedi a pesar cada unidad experimental para obtener
el rendimiento de cada variedad.
Mezclado: Se mezcl el almidn con agua destilada,
evitando la formacin de grumos (200 g de almidn por 1
litro de agua destilada).
Gelatinizacin: Cuando la mezcla estuvo homognea se
calent

temperatura

de

70C

dando

como

consecuencia la gelatinizacin del almidn.

Adicin de enzima: Luego de la gelatinizacin se
adicion la enzima Termamyl 120 Type L o Fungamyl 800 L,
0.01 g de enzima por 5.26 g de almidn. La enzima por estar
en estado lquido se mezcl con 200 g almidn gelatinizado
para activarlas y luego se adicion a toda la mezcla.
Reposo 1: Adicionada la enzima (Termamyl o Fungamyl)
se dej en reposo durante una hora para que la enzima
hidrolice los enlaces glucosidicos alfa 1,4 de amilasa y
amilopectina y por consiguiente se transforme rpidamente
en dextrinas solubles y oligasacridos.
Adicin de AMG 300 L : Transcurrido el tiempo de
hidrlisis se ajust el pH de 6.5 a 4.5 utilizando cido ctrico
en 0.04% y se adicion 0.01 g de la enzima por cada 5.26 g
de almidn a una temperatura de 50C.
Reposo 2: Luego de haber adicionado la enzima AMG
300 L se dej en reposo durante una hora para que la
enzima hidrolice los enlaces alfa 1-4 y 1-6 de almidn.
Durante la hidrlisis se liberan unidades de glucosa de la
cadena de almidn.

 Inoculacin: Se coloc 100 ml de mosto en un vaso de precipitacin a

35C, se agreg 2% de levadura con respecto al volumen del mosto, se
dej en reposo durante cinco minutos hasta que la levadura se disuelva y
presente espuma sobre la superficie. Esto indic que la levadura esta lista
para inocular el resto del mosto.
Fermentacin: El mosto inoculado se llev a los recipientes de
plstico de 23 litros de capacidad, en donde se realiz la fermentacin
alcohlica, a una temperatura aproximada de 18 la boca de los recipientes
se cubri con lienzo blanco para facilitar la salida del CO2 y se mantuvo
hasta obtener un pH constante
Trasvase: Terminado el proceso de fermentacin (Brix y pH
constantes) se procedi a trasvasar el mosto a otro recipiente con el fin
de eliminar los sedimentos.
Destilacin: El mosto se destil en un equipo de vidrio con columnas
de rectificacin a una temperatura de 78C, obteniendo etanol con
grado alcohlico elevado el mismo que se hizo la dilucin
correspondiente hasta obtener un grado alcohlico de 40GL.
Embotellado: Luego de haber destilado y diluido la bebida alcohlica
se envas en botellas de vidrio de 50 ml.
Etiquetado: Las botellas que contienen el alcohol fueron e
Almacenamiento: Lista la bebida se almacen para las respectivas
pruebas.
5.2. Descripcin de variables evaluadas
En el transcurso de la investigacin se evalu:

Hidrlisis enzimtica

Para detectar la presencia de almidn en el proceso de hidrlisis mediante la

accin hidroltica de las enzimas termamyl 120 L, Type L y fungamyl 800 L se

realizo la prueba de yodo.

El procedimiento del anlisis es el siguiente.

-Preparamos una muestra de 10 ml de la solucin de almidn de papa

-Aadimos cuidadosamente 1ml de solucin de yodo (1gr de yodo + 10 gr de

yoduro potsico + 1 litro de agua).

Evaluacin:

-No cambia el color de la solucin de yodo (color pardo rojizo) ausencia de

almidn

-El color cambia de pardo rojizo a marrn (el almidn no est completamente

degradado).

-Color azul, azul oscuro o negro (presencia de almidn).

Fermentacin alcohlica

En el transcurso de la fermentacin se midi:

-Porcentaje de slidos solubles

Se tom muestras de cada tratamiento durante el proceso fermentativo utilizando

una pipeta de 10 ml, se midi el % de slidos solubles en el refractmetro de

Abbe escala 0-95 Brix, todos los das y a la misma hora (17h00).

-pH

Se midi el pH durante todo el proceso de fermentacin utilizando un

potencimetro digital escala 1-14 se tomo una muestra de cada tratamiento
todos los das y a la misma hora (17h00).

Producto terminado

Una vez realizada la destilacin del mosto sometido a fermentacin, se

realizaron los siguientes controles:

-Grado alcohlico

 Se determin el contenido de etanol en el producto destilado, mediante norma

INEN 340 (Determinacin de grado alcohlico para bebidas alcohlicas). Esta
variable se midi con el fin de determinar que tratamiento presenta el mayor

contenido de alcohol etlico.

Se coloco en una probeta de 500ml la muestra de alcohol y se procedi a medir

el grado alcohlico con el alcoholmetro centesimal de Gay-Lussac.

El grado alcohlico medido se corrigi de acuerdo a las tablas de Determinacin

de Grado Alcohlico de la norma INEN 340.

-Acidez total

Mediante norma INEN 341 Determinacin de la acidez total para bebidas

alcohlicas (por titulacin con fenolftalena) se midi la acidez de la bebida de
papa. Para lo cual se midi 25 ml de muestra, se mezcl con 250 ml de agua
destilad, se aadi 5 gotas de fenolftalena y se titul con hidrxido de sodio 01
N hasta cambio de color ligeramente rosado.
-Contenido de congneres

Se determin el contenido de metanol, steres, alcoholes superiores y aldehdos

en los seis tratamientos, con el objeto de conocer la presencia de estos
productos secundarios de la fermentacin en la bebida alcohlica. Se utiliz la

tcnica que aplica la empresa licorera ILENSA.

Las muestras se analizaron en un cromatgrafo de gases, cuyo fundamento es

separar sustancias de una mezcla basndose en la diferencia que existe en las
fuerzas bipolares de los productos.

-Rendimiento de vodka

Para el desarrollo de esta variable se tom unicamente el cuerpo del destilado,

esta variable estuvo dada por la cantidad de producto que obtuvimos al finalizar
el proceso de destilacin en cada una de las repeticiones. Se tom en cuenta el
volumen de destilado que se realiz a los 78 C y luego diluido hasta obtener una
concentracin de 40GL.

-Pruebas organolpticas

Una vez realizados los anlisis fsico-qumicos al producto, se procedi con la

evaluacin organolptica la cual se realiz en dos fases:

 La primera degustacin se realiz con un panel de 7 degustadores tomando en

cuenta caractersticas como: aspecto, color, olor y sabor para determinar los dos

mejores tratamientos.

Obtenidos dichos tratamientos se realiz una segunda evaluacin organolptica

utilizando dos productos de marcas comerciales ya reconocidas en el mercado,
para determinar si el producto estudiado posee caractersticas organolpticas

similares con un panel de 6 catadores.

A cada catador se le facilit las muestras correspondientes y la hoja de

instrucciones necesarias (Anexo 6).

A cada caracterstica organolptica se le asign una escala de apreciacin y se

valor de la siguiente manera:
Excelente

5 puntos

Muy Bueno

4 puntos

Bueno

3 puntos

Regular

2 puntos

Malo

1 punto

Los resultados obtenidos de los catadores se analizaron bajo la prueba no

paramtrica de Frieedman.

BIOCONVERSIN DE XILOSA A XILITOL POR Candida guilliermondii

EMPLEANDO CASCARILLA DE ARROZ (Oriza sativa).

CASCARLLA DE ARROZ
Tradicionalmente se considera a la cascarilla de arroz como un desecho que
contamina el medio ambiente; sin embargo, este subproducto posee una
composicin aproximada mxima de 43,8% de celulosa, 21,9% de pentosanas y
46,9 % de lignina (Yufera 2002). Aprovechando estas caractersticas se obtiene
por hidrlisis cida un caldo rico en xilosa, el cual aplicando tcnicas de
fermentacin es utilizado para la obtencin de xilitol (Silva et al. 2001a).

XILITOL
El xilitol es un alcohol pentahidroxilado, de gran importancia comercial por su
poder edulcorante, posee propiedades fsico-qumicas que facilitan su uso en la
industria alimenticia, farmacutica y odontolgica (Silva et al. 2001b). Presenta
propiedades anticariognicas por el hecho de no ser utilizado por los
microorganismos de la flora bucal, en particular por la bacteria Streptococcus
mutans, lo que evita la formacin de cidos que atacan el esmalte dental
(Fennema 1993). Tambin se utiliza en la preparacin de alimentos para el
tratamiento de personas con diabetes, desordenes en el metabolismo de lpidos,
lesiones renales y parenterales (Mkinen 2000).

OBTENCION DE XILITOL
Con la obtencin y produccin de xilitol a partir de la cascarilla, mediante el
mtodo biotecnolgico utilizando la levadura Candida guilliermondii, se
contribuye a solucionar problemas tales como la contaminacin y prdidas
econmicas que se estn generando en el pas debido a la poca utilizacin de
este desecho industrial, con lo cual tambin se favorece el desarrollo sostenible
de la regin, racionalidad industrial en el manejo de subproductos y en general
se aporta al conocimiento y la tecnologa, para el bienestar social de todos los
sectores


involucrados en los procesos agrario-alimentarios. La investigacin se realiza
con el propsito de presentar una nueva alternativa a la industria arrocera del
pas para el aprovechamiento de la cascarilla de arroz en obtencin de productos
de valor agregado, mediante la obtencin de xilitol a partir del hidrolizado de
cascarilla de arroz por fermentacin batch con la levadura Candida guilliermondii,
aislada del fruto de corozo chiquito (Bactris guineensis), evalundose los efectos
del tiempo de fermentacin en los niveles de produccin.

MATERIALES Y MTODOS
Acondicionamiento de la cascarilla.
La cscara de arroz fue sometida a un proceso de limpieza, hacindola pasar por
un tamiz de malla numero cuatro, donde retiraron restos de paja, tallo y otras
impurezas. La muestra de cascarilla de arroz fue secada al sol, para reducir su
humedad, se realiz la molienda para obtener fracciones con dimetros de
partculas diferentes, seguidamente se someti a un proceso de tamizado
logrando obtener la mayor cantidad de partculas comprendidas entre los
dimetros de 800 - 1600 m, 800 - 500 m y 500 - 250 m.

Hidrlisis cida de cascarilla de arroz.

Las muestras de diferentes dimetros de partculas de cascarilla seleccionadas y
acondicionadas, se sometieron a una hidrlisis cida para obtener el hidrolizado
hemicelulsico, los experimentos se llevaron acabo en un autoclave modelo 25
x-1, donde se emple cido sulfrico a una concentracin del 1%, 2% y 3% (p/v)
a temperatura de 121 C, presin de 15 PSI, relacin slido-lquido 10:1 (v/w) y
tiempo de 10, 20 y 30 minutos. (Roberto et al. 2003). Luego se determinaron las
concentraciones de azcares reductores (xilosa y glucosa) en los hidrolizados;
asimismo en el hidrolizado previamente seleccionado y concentrado se
determin la concentracin de xilosa por cromatografa lquida de alta resolucin.

Detoxificacin del hidrolizado

Una vez obtenido el hidrolizado se filtr a vaco y se concentr en un
rotaevaporador a 70 4 C hasta retirar un 60% de agua del hidrolizado. Se
realiz una sobretitulacin del hidrolizado en donde se aument el pH a 10, con
hidrxido de sodio (NaOH) slido, posteriormente se disminuy el pH a 5,8,

empleando cido sulfrico (H2SO4) (Parajo et al. 1998a). Durante la

sobretitulacin con hidrxido de sodio y cido sulfrico se realiz filtracin del
precipitado formado en el hidrolizado. Otro procedimiento para detoxificar al
hidrolizado rico en xilosa fue el tratamiento con carbn activado, el cual consisti
en someter la solucin a una clarificacin con 2,5% de carbn activado a 200
rpm y 30 C durante una hora. Luego se filtr y se llev a autoclave a 100 C
durante 15 minutos para la esterilizacin del medio (Mussato 2004).

Adaptacin de la levadura Candida guilliermondii.

Se utiliz la levadura Candida guilliermondii de la coleccin de cepas del
laboratorio de microbiologa y biotecnologa de alimentos de la Universidad de
Crdoba, la cual fue aislada del Corozo Chiquito (Bactris guineensis). La
adaptacin se realiz en un erlenmeyer de 250 ml que contena 100 ml de
hidrolizado, en ste se inocularon dos cajas de Petri con colonias de levaduras
crecidas en agar Sabouroud. Luego se incub a 30 C en un shaker orbital a 120
rpm durante 24 h con la finalidad de adaptar la levadura al medio hidrolizado y a
las condiciones del proceso.

Condiciones de fermentacin.
Se realiz la fermentacin batch en frascos erlenmeyer agitados; en un shaker
orbital. Las condiciones de fermentacin fueron las siguientes: temperatura de 30
C, pH del medio de 5,8, agitacin de 120 rpm, tamao de inoculo de 3 g L-1.
(Silva et al. 2005). Se emple medio de cultivo con concentracin de xilosa de
27,5 g L-1. El hidrolizado detoxificado y esterilizado se enriqueci con 20 g L-1
de extracto de salvado de arroz, 3 g L-1 de sulfato de amonio ((NH4)2SO4) y 0,1
g L-1 de cloruro de clcio dihidratado (CaCl2*2H2O) (Mussato et al. 2004). Estos
compuestos fueron preparados separadamente y esterilizados a 121Cx 20
minutos. Las condiciones de aireacin requeridas para favorecer la produccin
de xilitol se proporcionaron con una relacin volumen de lquido a volumen del
matraz de 0,4 v/v (Silva et al. 2001b). El proceso de fermentacin se realiz
durante 120 h, tomndose muestras cada 12 h cuando se analiz la
concentracin de xilitol y consumo de xilosa, al igual que la concentracin de
biomasa en el tiempo. Una vez finalizados los anlisis se determin la
productividad volumtrica en xilitol y el factor de conversin de xilosa en xilitol
(yP/S).

 OBTENCIN DE BIOMASA A PARTIR DE CSCARA DE CAF

Caracterizacin de la cascarilla del caf

La cascarilla de caf es el principal subproducto del beneficio seco del
caf. La tabla 16 muestra la composicin de la cascarilla en base seca.
Composicin de la Cascarilla de Caf
Compone

ntes

% (peso
seca)

Carbohidr

atos

57.8

Proteinas

9.2

Grasas

Cafena

1.3

Taninos

4.5

Pectinas

12.4

en

base

Tabla 16: Composicin de la cascarila de caf. Fuente: Ashok, Pandey,

Soccol y Nigam, 2000.

Los compuestos presentes en el caf son bsicamente los mismos tanto

en la pulpa como en la cascarilla, sin embargo la composicin de cada
uno de estos subproductos es muy diferente. Adicionalmente la
composicin de la cascarilla puede variar de acuerdo a factores como el
tipo de suelo o la variedad del cultivo. La cafena, uno de los
estimulantes naturales ms poderoso se encuentra presente en la
cascarilla en una concentracin de aproximadamente del 1.3%, mientras
los taninos, que complican el uso del producto para fines como la
alimentacin animal, representan cerca del 4.5%. En cuanto a los
carbohidratos presentes en la cascarilla se trata principalmente de
celulosa y lignina. Estos carbohidratos pueden ser usados directamente
en un proceso de combustin.

MATERIALES Y MTODOS

Preparacin del sustrato

 Como sustrato se emple cscara de caf recolectada de un beneficio

cafetalero ubicado en el municipio de Tamazunchale, S. L. P.
La cscara de caf se tritur empleando una licuadora, para tener un
tamao de partcula de aproximadamente 2 3 mm. La cscara se
hidroliz con H2SO4 al 2 % durante 4 horas, a una temperatura
aproximada de 90-100 C. El hidrolizado cido se centrifug a 3000 rpm
a 0 C por 15 minutos y despus se decant. Debido a la acidez del
hidrolizado, el sobrenadante se ajust a un pH de 4.5 con NaOH al 33
%, y se esteriliz a 15 libras de presin por 15 minutos, con la finalidad
de inhibir el crecimiento de microorganismos no deseados.
Microorganismo
En este trabajo se utiliz una cepa comercial de levadura de Candida
utilis ATCC 9256, se descongel a temperatura ambiente y se revitaliz
en caldo extracto de malta a 25 C por 24 horas, posteriormente se
sembr en cuas de Agar Papa Dextrosa (APD).
Ensayo de preadaptacin y crecimiento
El ensayo de preadaptacin y crecimiento tuvo como objetivo la
adaptacin de la levadura Candida utilis en el extracto cido de la
cascarilla de caf, para lo cual se prepar el pie de cuba.

Preparacin del pie de cuba

Se tom una asada de la cepa de Candida utilis y se inocul en tres
tubos de Agar Papa Dextrosa a 25 C por 24 horas. Posteriormente se
tom una azada de Candida utilis y se coloc en un matraz de 100 ml
con 40 ml de sustrato cido de cascarilla de caf y se incub por 20
horas, 30C a 200 rpm; despus se realiz una resiembra, se tomaron
10 ml y se pasaron a un matraz de 1litro con 180 ml de sustrato, se
incub por 20 horas, 30 C a 200 rpm; finalmente se tomaron del cultivo
anterior 10 ml y se inocularon en un matraz de 1litro con 200 ml de
sustrato y se incub.

Preparacin del medio de cultivo

A 200 ml de sustrato, se le agregaron 0.6 g de Urea, 0.4 g de Fosfato
cido de potasio (KH2PO4) y 0.26 g de extracto de maltaPosteriormente, la mezcla se esteriliz en autoclave a 15 lb de presin
por 15 minutos.

 Fermentacin aerbica
Despus de haber preparado el medio de cultivo y de proporcionar las
condiciones para el crecimiento (nutrientes, pH, y temperatura) se
continu con la fermentacin aerbica. El medio de cultivo preparado se
coloc en una estufa con agitacin mecnica de 200 rpm durante 20
horas a 30 C.

Separacin de la biomasa
La biomasa de Candida utilis se recuper mediante centrifugacin a
3000 rpm por 10 minutos en una centrfuga marca Thermo IEC, Centra
CL3R a temperatura ambiente; el sobrenadante se separ del
precipitado con una pipeta beral. La biomasa se coloc en un vaso de
precipitado y se incub a 45 C durante 24 horas para eliminar la
humedad.

Anlisis bromatolgico
Se llev a cabo el anlisis bromatolgico a la biomasa, el cual incluy la
determinacin de protenas, azcares totales, lpidos y humedad.
Determinacin de protena
La determinacin de protenas, se realiz a la biomasa obtenida al final
de la fermentacin aerbica, utilizando el mtodo Kjeldahl usando
equipo de la marca Buchi (Digestin Unit K424, Scrubber B-414 y
Destillation Unit B-324).

Determinacin de azcares totales

La determinacin de azcares, se hizo al sustrato antes y despus de la
fermentacin, as como a la biomasa producida. Estas determinaciones
se hicieron por triplicado mediante la tcnica de Eynon y Lane.

Determinacin de lpidos
La determinacin de lpidos se le realiz a la biomasa de C. utilis, por
triplicado mediante extraccin con ter de petrleo y calculados como
porcentaje del peso despus de evaporar el solvente.

Determinacin de humedad

 La determinacin de humedad a la biomasa se hizo por el mtodo

gravimtrico, utilizando para el secado de la muestra un horno Lindberg
Blue y para la determinacin de los pesos una balanza analtica
OHAUS Mod. Adventurer.

OBTENCIN DE ACIDO CTRICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE

POR FERMENTACIN EN CULTIVO LQUIDO.

SUERO DE LECHE

El lactosuero suero de leche es el lquido claro de color amarillo verdoso,

color debido al pigmento de la lactoflavina o vitamina B2, que resulta de la
coagulacin de la leche durante la elaboracin del queso. Tiene una densidad un
poco superior a la densidad del agua. Frecuentemente posee todos los
componentes de la leche con excepcin de la casena y un poco menos de grasa,
posee un sabor ligeramente cido, bastante agradable. Se obtiene tras la
separacin de las casenas y de la grasa. Representa alrededor del 90% del peso de
la leche utilizada para la elaboracin del queso. Contiene entre el 6% y el 6,4% de
extracto seco, es decir, la mitad de la materia seca de la leche (3).

Segn el procedimiento utilizado para separar la cuajada del queso

(coagulacin cida o coagulacin enzimtica), se obtiene lactosuero dulce o
lactosuero cido. El empleo de uno u otro procedimiento de separacin de la
cuajada del queso va a determinar tambin una diferente composicin del
lactosuero. El lactosuero industrial, que es otra variedad, se obtiene coagulando las
protenas por la adicin de otros cidos como el cido clorhdrico, sulfrico o actico
(25).

Composicin. La composicin del suero de leche vara dependiendo de las

caractersticas de la leche y de las condiciones de elaboracin del queso de que
proceda, pero en trminos generales se puede decir que el suero contiene 4,9%
de lactosa, 0,9% de protena cruda, 0,6% de cenizas, 0,3% de grasa, 0,2% de cido
lctico y 93,1% de agua. Aproximadamente el 70% del nitrgeno total (protena
cruda), corresponde a protena verdadera, la cual tiene un valor nutritivo superior al
de la casena, y est compuesta por la -lactoglobulina, la -lactoalbmina,
las inmunoglobulinas, la proteosa-peptona y las enzimas nativas; el resto lo forman
aminocidos, urea, creatina, amonaco y cidos nucleicos (15). En la Tabla 6 se
relaciona la composicin de la leche y sus productos.

El contenido de grasa depende del que tuviera la leche empleada. Si el

contenido Si el contenido de grasa del lactosuero es superior al 0.1 %, este se ha de
desnatar. La nata obtenida se transforma en mantequilla de lactosuero o se utiliza para
normalizar el contenido de grasa de los quesos.

Tratamiento del lactosuero.

o

Para tratar el suero de leche se recomienda su enfriamiento a 7 C (o un

poco menos) si se va a trabajar a dos horas de su obtencin o temperaturas de
o
4 C para conservaciones de ms tiempo (mayores de 24 horas), y se aconseja un
desnatado previo cuando se tiene un contenido graso mayor a 0,1%, evitando as su
descomposicin.

Segn E. Spreer tambin se recomienda la adicin de perxido de

hidrgeno (0.2% en peso), como preservativo para tiempos mayores de 10 das.
ste acta como un desinfectante evitando la proliferacin de microorganismos. El
uso de perxido de hidrgeno no est permitido en la mayora de los pases, al
actuar ste como oxidante de los componentes de los alimentos. Por esto se
plantea la adicin de sulfito de sodio o magnesio a un 0,5% (26).

El proceso de filtracin del lactosuero no es necesario, ya que las miscelas

de casena que permanecen en solucin son muy pocas. Sin embargo debido al
contenido de grasa y a los tratamientos en la elaboracin de queso y a elementos
contenido de grasa y a los tratamientos en la elaboracin de queso y a elementos no
deseables para el tratamiento del lacto suero se hace til hacerlo y as evitar una
posible contaminacin.

Extraccin de las protenas del suero. Durante la elaboracin del

queso se hace coagular la leche mediante la adicin de cuajo. Con ello la leche se
descompone en dos partes: una masa semislida compuesta de casena, y un
lquido que es el suero de leche. Este lactosuero contiene 0,8% de protenas
(albminas y globulinas), aproximadamente un 20% de la cantidad total de
protenas de la leche.

La separacin de las protenas del lactosuero puede realizarse por

diferentes procedimientos (fsicos o qumicos) de separacin:

a) Separacin por filtracin: En la filtracin se establece una diferencia de

presin que hace que el fluido fluya a travs de poros pequeos que impiden el
paso, de las partculas slidas las que a su vez, se acumulan sobre un medio filtrante
como torta porosa.

b) Separacin por precipitacin (mtodo trmico): Es una separacin

fsica usando un medio trmico, precipitando

su desnaturalizacin.

las

protenas

debido

c) Separacin por centrifugacin: Es la filtracin que se asemeja a la

filtracin ordinaria, en la que un lecho se acumula y se utiliza la fuerza centrfuga
para provocar una diferencia de presin (22).

Fermentacin Del Lactosuero

El suero de leche es un excelente medio de cultivo ya que se compone
aproximadamente en un 70% de lactosa que es la principal fuente de
carbono, por lo que se utiliza como sustrato para la obtencin de un
buen nmero de productos obtenidos a travs de la fermentacin.
Al ser la lactosa un disacrido se puede limitar su uso a ciertos
microorganismos, pero existe la posibilidad de hidrolizarla en sus
componentes glucosa y galactosa para aumentar las probabilidades de
implementar microorganismos capaces de transformar estos
monosacridos en productos fermentados. Sin embargo, el suero no
contiene mucho nitrgeno inorgnico que puede ser utilizado por los
microorganismos, por lo cual, frecuentemente es necesario aadirle
sales de amonio. Por otra parte, el contenido de protenas es
relativamente alto; debido a ello es un excelente medio para
microorganismos que requieran aminocidos y sean capaces de
hidrolizar las protenas.
El lactosuero puede fermentarse directamente o fraccionarse antes de la
fermentacin. Los posibles sustratos fermentables son:
a)
b)
c)
d)

El lactosuero crudo.
El permeato resultante de la ultrafiltracin.
La melaza resultante de la cristalizacin de la lactosa.
El suero residual resultante del procedimiento Centri Whey. Este
procedimiento ofrece la posibilidad de reintegrar las protenas
desnaturalizadas por el calor al proceso de produccin de queso.

La acidez de estos sustratos debe ajustarse antes de la fermentacin al

valor de pH que sea favorable para el crecimiento de los
microorganismos aadidos. Pocas levaduras, si se excepta a
Saccharomyces fragilis, son capaces de fermentar lactosa.

Acido ctrico:
El acido ctrico es un acido orgnico que abunda en la naturaleza muy
extendido en el reino vegetal y animal, encontrndose en considerable
cantidad en los frutos ctricos. Como acido libre o como sal, se
encuentra en las semillas y los jugos de gran variedad de flores y

plantas. En un componente del vino (0.4g/L), la leche (1 a 4g/L), los

productos lcteos, y los tejidos y lquidos animales.
El acido ctrico se comercializa como acido ctrico monohidratado o
como acido ctrico anhidro. Se emplea en la industria farmacutica (10%
de la utilizacin total), cosmtica y alimenticia (60% de la produccin
total). Su buen sabor y la facilidad con que es asimilado favorecen su
utilizacin como ingrediente acido para mantener el pH o para obtener
un pH conveniente y hacer resaltar el sabor de una extensa variedad de
productos en esas industrias. Recientemente se ha convertido en
materia prima importante para usos industriales de carcter general
como pulimiento y limpieza del hierro y acero, tratamiento y
acondicionamiento de aguas industriales, y en la produccin de resinas
alqudicas, pinturas y lacas, y en el estampado de telas.
Caractersticas: el cido ctrico es el cido 2-hidroxi-1,2,3propanotricarboxilico ,con frmula molecular HOOCCH2C(OH)
(COOH)CH2COOH, con un peso molecular de 192.12. Tiene dos
formad estables: el cido ctrico monohidratado con un 91.42% de acido
ctrico anhidro y 8.58% de agua, y el acido ctrico anhidro.
Se presenta en forma de cristales incoloros, translucidos, o polvo fino o
granular, blanco, inodoro y con sabor acido agradable.
Calentando poco a poco los cristales monohidratados se ablandan a la
temperatura aproximada de 70-75C con prdida de agua y se funden
completamente entre 135 y 152C.
Calentando rpidamente los cristales, se funden a 100C, se solidifican
al convertirse en anhidros y se funden a 153C.
El acido ctrico anhidro cristaliza de soluciones acuosas concentradas y
calientes: la temperatura de transicin media de monohidrato a la forma
anhidra es 36.3 0.15C. La temperatura de fusin es 153C. Es
pticamente inactivo y no manifiesta piezoelectricidad.
El acido ctrico es bastante soluble en agua, medianamente en alcohol y
poco en ter. La forma anhidra es insoluble en cloroformo, benceno,
sulfuro de carbono, tetracloruro de carbono y tolueno.

Obtencin de cido ctrico:

l acido ctrico es fundamentalmente producido por 2 especies de
aspergillus llamadas Aspergillus niger y Aspergillus wentii, aunque
tambin se han utilizado levaduras, como Saccharomycopsis lipolytica,
para la produccin de acido ctrico sobre sustratos no azucarados. Otras
especies empleadas son A. clavatus, Penicillium citrinum, Paecelomyces
divaricatum, Candida guillermondii, Trichodrema viridae, Arthrobacter
paraffineus y Corynebacterium sp.
Los mtodos normales de produccin de acido ctrico emplean bien
fermentacin en superficie o tecnologa de fermentacin sumergida,
siendo las fuentes de carbono preferidas las melazas de remolacha o de
caa y los jarabes de glucosa.

 Cuando se utilizan melazas los niveles de contaminacin por metales

pesados en el medio tienen que ser controlados estrictamente, bien sea
por resinas de intercambio inico o eliminndose mediante un agente
quelante como el ferrocianuro.
La materia prima empleada como fuente de carbono es un carbohidrato,
principalmente el azcar impuro en forma de melazas, utilizndose
tambin la remolacha, la harina de trigo, el agar, la malta de cebada, la
xilosa(azcar de madera), etc. Adems del carbono, el oxigeno y el
hidrogeno suministrados por el carbohidrato, el organismo necesita
como elementos nutritivos nitrgeno, potasio, fosforo, magnesio y
azufre. Otros factores importantes para la conversin de soluciones
azucaradas en acido ctrico por los hongos son las concentracin de la
solucin, las tcnicas de cultivo e inoculacin, la temperatura, el PH y la
aireacin. En gran parte la influencia de cada factor esta determinada
por la cepa de hongo empleada.

MATERIAL BIOLOGICO

Suero de leche

Cepas de Aspergillus Nger

MEDIOS DE CULTIVO

Agar Saboraud Dextrosa

Agar Carbonato de Calcio

Caldo Glucosado

SOLUCIONES Y REACTIVOS

Agua destilada estril

Fenolftalena.

NaOH 0.1N

MATERIAL DE VIDRIO

Botella de 500mL

Botella de 2000mL

Frascos de boca ancha.

Placas de Petri.

Jeringas de 10mL

Viales

EQUIPOS DE LABORATORIO

Birreactor Batch.

Balanza analtica.

PROCEDIMIENTO
ETAPA PRE-FERMENTATIVA
Aislamiento, seleccin y propagacin de Aspergillus niger
i. Muestra

- 100 gramos de suelo agrcola

ii. Procesamiento de la muestra

- Tamizamos la muestra de suelo (tamiz con malla de 1.6 mm), luego
pesar 10 g.
- Pesamos 10 g

- Los 10 g lo llevamos a un frasco con 90 mL se solucin salina

fisiolgica estril (10-1)

Homogenizam
os durante 20
minutos

10 g de suelo tamizado

90 mL de
SSFE (10 -1)

- Realizamos una dilucin 10-2

1mL

9 mL de SSFE

iii. Aislamiento e identificacin de Aspergillus Nger

Incubar en

aerobiosis a

28C durante
24 horas.

Sembramos una asada mediante

la tcnica de agotamiento y estra
sobre Agar Saboraud Dextrosa

PREPARACION DEL MEDIO DE FERMENTACION

Suero de leche estril: el suero tena un pH de 6 y se realiz la

desproteinizacin por 1 hora en el bao Mara. Este suero desproteinizado se
pas por un filtro de gasa y luego se pas por la centrfuga a 3.500rpm por 8
minutos con el fin de separar los residuos de protena que alcanzaron a
decantar durante este proceso. Luego lo llevamos a un pH de 3 para iniciar la
fermentacin, a travs de la hidrlisis acida.
DISEO, CONSTRUCCION Y ESTERILIZACION DEL BIORREACTOR
DE TIPO BATCH
Elaboracin del biorreactor
Biorreactor batch

Configuracin del Biorreactor:

Reactor con agitacin mecnica.

o Reactor con termostato.

Esterilizacin del Biorreactor

Se esteriliz el tanque con vapor de agua por 30 minutos.

PROPAGACIN DEL CULTIVO
Siembra en 20 ml de suero de leche (10 ml en cada tubo de ensayo).


Incubar durante 2 das.

Inoculacin en 180 ml.

En un frasco de vidrio colocar 180 ml de suero de leche.

Inoculacin en el fermentador (biorreactor).

ETAPA FERMENTATIVA O DE PRODUCCION

Acondicionar el biorreactor y el sistema de aireacin o agitacin

Adicionar 1800 mL del medio de fermentacin (suero de leche) al

Biorreactor, aspticamente.


Inocular 200ml Del Inoculo De Aspergillus
Nger Productor de acido ctrico

200ml Del Inoculo

Dejar en fermentacin por un periodo de 10 - 14 das.

Verificar que el pH se encuentre cercano a 3 para favorecer

una buena produccin de acido ctrico.

DETERMINAR EL PRONCENTAJE DE ACIDEZ MEDIANTE EL

METODO DE MANN

Tomamos
2 mL de muestra en
un vaso de precipitacin o

frasco de boca ancha.

Agregamos 2 gotas de
fenolftalina al 0,1% en etanol

Titulamos con el reactivo valorante disolucin de NaOH 0.1N

hasta observar el viraje del indicador y apuntamos el gasto.

Antes

Despus

SEPARACIN DEL CIDO CTRICO

PROCESO
CAL
SULFRICO

Separacin del micelio y otras

impurezas
obtenindose el

Licor madre

Dilucin de cal (15 ml) formada

por dos partes de agua y una de
cal (33% de Ca(OH) 2 )

Agregar la dilucin de cal poco

a poco y lentamente
Citrato clcico separado

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Carrillo (82014) Obtencin de Biomasa a partir de Cscara de Caf.
Disponible en: http://www.eumed.net/rev/tlatemoani/06/icsrb.htm

 Betancout (2003) Obtencin de cido Ctrico a partir de Suero de Leche

por Fermentacin en cultivo Lquido.. Mxico.
Ypez (2009) Elaboracin de una Bebida Alcohlica destilada (Vodka) a
partir de tres variedades de Papa (Solanum Tuberosum) utilizando dos
tipos de enzimas. Ecuador.