FROTIS BACTERIANO, COLORACION DE GRAM Y

USO DE MICROSCOPIO
Barrera, Jhorman, Sanabria, ngela,
Unisangil, Ciencias Naturales e Ingeniera
Ingeniera Ambiental
Yopal, Casanare
jhbarrerav@hotmail.com
Alegna2808@hotmail.com

Resumen En el siguiente informe se

presenta
la
descripcin
de
un
procedimiento en el cual se llev a cabo
la tincin de Gram con el fin de
contrastar las bacterias presentes en una
UFC (unidad formadora de colonia) de
una muestra determinada, para identificar
la presencia de bacterias segn su grupo
taxonmico: Gram positivas y Gram
negativas. En este procedimiento, en un
porta objetos limpio y seco, se agreg
una gota de agua destilada y
posteriormente se coloc una UFC
(unidad formadora de colonia) encima de
esta gota con un asa de siembra
previamente esterilizada; seguidamente
se calent suavemente en la llama de un
mechero para fijar la muestra.
Posteriormente se tio con cristal violeta,
luego se lav con agua destilada,
nuevamente se tio con lugol y
seguidamente se lav con alcohol para
retirar el exceso de colorante, despus se
aplic fucsina bsica para contrastar y
por ltimo se lav con agua corriente y se
dej secar la muestra. Finalmente se
procedi a la identificacin la presencia
de bacterias segn su grupo taxonmico:
Gram positivas o Gram negativas
presentes en la UFC a travs del

microscopio con el objetivo de 100x

obteniendo aparentes bacilos Gram
positivos
Palabras clave Gram positiva, Gram
negativa.
Abstrac: In the following report the
description of the United Nations
procedure in which is an out of the Gram
stain in order to contrast these bacteria in
a CFU (colony forming unit) of a given
sample was carried Presented to identify
the presence of bacteria according to His
Taxon: Gram positive and Gram
negative. In this procedure, a member in
a clean, dry Objects carrier, was added a
drop of distilled water and then placed a
CFU (colony forming unit) drop UN esta
top of the handle scam previously sterile
seed; Then he heated gently in the flame
burner UN fix the sample. Subsequently
stained with crystal violet, then washed
with distilled water, again stained with
lugol and then washed with alcohol to
Unsubscribe excess dye, then applied
basic fuchsin to contrast and finally
washed with tap water and leave dry the
sample. Finally we proceeded to the
presence of bacteria identification
According to his Taxon: Gram positive or

Gram negative Presents UFC Through

the microscope with 100x m getting
apparent aim of Gram Positive
I.

INTRODUCCIN

El Frotis bacteriano y la Coloracin de

Gram son de
gran importancia en
Microbiologa porque permite diferenciar
dos grandes grupos de bacterias (Gram+
y Gram-), segn se comporten ante esta
tincin. El fundamento radica en la
diferente estructura de la pared celular de
ambos grupos: las bacterias Gram+
tienen una gruesa capa de peptidoglicano
en su pared, mientras que las bacterias
Gram- tienen una capa de peptidoglicano
ms fina y una capa lipopolisacardica
externa. Tras la tincin con el primer
colorante (Cristal violeta) se efecta un
lavado con etanol que arrastrar al
colorante slo en las Gram (-), mientras
que en las Gram (+) el colorante queda
retenido y las clulas permanecern
azules. Las clulas Gram (-) se teirn
despus con un colorante de contraste
(safranina) para que puedan observarse.
II.

Cantidad
2
1
1
1
1

MATERIALES
MATERIALES
Descripcin
Portaobjetos
Asa curva
Mechero
Set de Colorantes de
Tincin de Gram
Medio de cultivo con
crecimiento de
colonias bacterianas
Toallas desechables
Marcador
Alcohol antisptico
70%

II.

DESARROLLO DE
CONTENIDOS

A. PREPARACION DEL FROTIS

BACTERIANO
1. Limpie un portaobjetos con alcohol,
papel de filtro y flamearlo.
2. Coloque una gota de agua en el centro
del portaobjetos y con el asa de siembra,
esterilizada a la llama del mechero, tome
una pequea cantidad de colonia
bacteriana, colquela sobre la gota de
agua forme una emulsin y esprzala
sobre el portaobjetos generando un
extendido muy delgado.
3. Fije la muestra con calor pasndola
rpidamente el portaobjetos por la llama
del mechero dos veces.
4. Deje secar la preparacin a
temperatura ambiente.
B. COLORACION DEL FROTISTINCION DE GRAM
1. Coloque el portaobjetos en el lugar
dispuesto para realizar la coloracin que le
indique el auxiliar de laboratorio.
2. Aplique el colorante Cristal violeta sobre
el frotis y deje actuar por 1 minutos (controle
el tiempo).
3. lave con agua de la llave y escurra el
exceso.
4. Cubra el frotis ahora con lugol y deje
actuar por 1 minutos.
5. Lave con agua de la llave y escurra el
exceso.
6. Cubra con solucin decolorante (alcoholacetona) por 30 segundos.
7. Lave con agua de la llave y escurra el
exceso.

8. Cubra ahora con colorante de contraste

(safranina o Fuschina) deje actuar por 45
segundos.
9. Lave con agua de la llave y escurra el
exceso.
10. Permita que la preparacin teida se
seque al aire, dejando la lmina en posicin
inclinada.

Imagen 3: Aplicacin de colorante cristal violeta

IV ANALISIS Y RESULTADOS
1.
Registro fotogrfico y explicacin de
procedimiento de montaje y observacin
del frotis bacteriano teido en el
microscopio.

Fuente: Autores

Imagen 4: Aplicacin de lugol

Imagen 1. Toma de muestra de colonia

bacteriana

Fuente: Autores
Fuente: Autores
Imagen 5: Aplicacin de Safranina
Imagen 2. Fijacin de la muestra con calor

Fuente: Autores

Fuente: Autores

Imagen 5: Observacin en el microscopio

Fuente: Autores

2. Registro
fotogrfico
de
frotis
observado con los diferentes lentes,
describa la observacin realizada con
el objetivo 100X

Fuente: Autores

.Imagen 8: Tincin de Gram con objetivo 40x

.Imagen 6: Tincin de Gram con objetivo 4x

Fuente: Autores

Fuente: Autores
.Imagen 7: Tincin de Gram con objetivo 10x

.Imagen 9: Tincin de Gram con objetivo 100x

Aparentes Bacilos Gram positivos

1. Cul es la utilidad del aceite de

inmersin en la observacin con lente
100x.
La funcin del aceite de inmersin es
restringir el movimiento de la muestra,
adems de evitar el rozamiento entre el
cubre objetos y el objetivo, generalmente
se lo utiliza cuando vamos a observar con
el objetivo 100x. Otra funcin del aceite de
inmersin es evitar que la luz sedes ve;
al contrario lo que se pretende es que
la luz llegue concentrada hacia la muestra.

Fuente: Autores

3. Discuta las observaciones realizadas

con los diferentes objetivos teniendo en
cuenta la resolucin y aumento de los
mismos.
De acuerdo a lo realizado en el laboratorio,
se pudo notar que aunque el medio de
cultivo utilizado fue el mismo, despus
de realizar las coloraciones requeridas y
observar cada muestra, el comportamiento
de estas es distinto debido a las diferentes
capas superficiales o paredes de las
bacterias, ya que al observar en el objetivo
100X con el aceite de inmersin que
permite que la luz se centre en la muestra y
no haya movimiento de la misma se
observ que dos de las muestras tomada
dieron como resultados aparentes bacilos
Gram Positivos y la muestra restante fue
de aparentes bacilos Gram negativo
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

Cuando se usan objetivos de 100 aumentos

(100x) es necesario emplear un lquido
denominado aceite de inmersin entre el
objetivo y la muestra. Esto es debido a que
la refraccin de la luz es alta en el aire y
provoca alteraciones en la imagen que se
ponen de manifiesto con objetivos con esta
capacidad de aumento. El aceite de
inmersin reduce enormemente esta
refraccin permitiendo imgenes mucho
ms ntidas
2. Que otros tipos de microscopios existen
y cules son las diferencias, establezca un
cuadro comparativo.
CUADRO COMPARATIVO MICROSCOPIOS

MICROSC
OPIO

CARACTERISTICA
S

FUNCIONES

Microscopio
Compuesto

Es
utilizado
comnmente, en los
laboratorios,
este
puede ser monocular,
binocular con dos
tubos de observacin
para poder observan
con ambos ojos la
muestra,
posee3
objetivos de 2X, 10X,
40X y mediante un haz
de luz, los ilumina
para
una
mejor

Se utiliza para la
observacin ampliada
de las imgenes de el
objeto de muestra y se
utiliza
para
la
observacin de objetos
transparentes
o
cortados enlaminas tan
finas
que
se
transparentan.

apreciacin
Microscopio
de Campo
Oscuro

Posee un condensador
paraploide que no
permite que la luz
penetre directamente
al objeto sino de una
manera oblicua, utiliza
un haz de luz intensa
en forma de cono
hueco

Se utiliza para la
observacin
demuestras
metalogrficas para la
observacin de los
detalles en superficies
con alta reflactancia.

Microscopio
de
Fluorescenci
a

Los
objetos
son
iluminados por una
determinada longitud
de onda, la imagen es
el resultado de una
radiacin
electromagntica

Se utiliza para detectar

sustancias con auto
fluorescencia como la
vitamina
A,
o
sustancias
marcadas
con fluorescencia

Microscopio
de Barrido

Este
microscopio
utiliza un haz de
electrones, tiene una
gran profundidad de
campo; que permite
que se enfoque a la
vez una gran parte de
la muestra, tambin
posee50000 aumentos,
permite verlo invisible
adherido a diferentes
sustancias

Es
utilizado
en
biologa celular y
tambin en la actividad
pericial
para
dar
eficacia y certeza al
anlisis de indicios de
naturaleza orgnica y
acoplado
a
un
analizador
por
difraccin de energa
de rayos X determina
la
composicin
qumica
demuestras
inorgnicas
como
delos
explosivos,
vidrio,
pintura,
disparos de arma de
fuego, etc.

Microscopio
estereoscopio

Microscopio
Quirrgico

estructuras
microbianas:
capsula,
flagelos, esporas y grnulos. En que
consiste la coloracin y como se
observan al microscopio
Ver Anexo 1.
V CONCLUSIONES

Posee
una
visin
tridimensional para la
observacin
de
objetos, tiene dos
objetivos uno de 2X y
otro de 40X que es el
aumento total.

Se utiliza para la
observacin de objetos
que requieren poco
aumento ptico, es
utilizado en botnica,
mineraloga, y para la
diseccin de animales

Es un instrumento
ptico que consta de
un conjunto de lentes,
de tal manera que
permite trabajar con 6
y aumentos. Viene
dado por un objetivo,
que suele ser de zoom
de distancia focal

Permite
la
visualizacin
de
diferentes estructuras
anatmicas,
proporciona una mayor
iluminacin
y
magnificacin de las
estructuras. Se utiliza
en la realizacin de
intervenciones
quirrgicas del sistema
nervioso y pequeas
estructuras

3. Que tinciones se usan para la

observacin de cada una de las siguientes

1.
La membrana externa de las
bacterias Gram negativas Es soluble
en solventes orgnicos como el alcohol,
La capa de peptidoglicano es demasiado
delgado como para retener el complejo
cristal violeta/yodo que se form, Por lo
que va perdindose el color azulvioleta. Mientras que las Gram
positivas no tienen su capa susceptible a
la accin de solventes orgnicos, se
deshidratan los poros y se cierran
retenindose el complejo cristal
violeta/yodo y por consiguiente el color
azul-violeta
2.
El aceite de inmersin permite
que la luz se centre en la muestra y no
haya movimiento de la misma
3.

Pueden haber variaciones en los

resultados debido a causa como la
concertacin inadecuada de los
reactivos de tincin, tiempo de
tincin incorrecto.

4. La diferencia qumica de cmo est

compuesta la batera y el medio de
cultivo, es lo que permite distinguir a
las bacterias por tincin ya que
generalmente el colorante reacciona
con la clula bacteriana y no con el
medio exterior a esta.
VI BIBLIOGRAFIA

 Introduccin a la microbiologa,
Gerard J. Tortora, Berdell R.
Funke, Christine L Case Ed. Medica
Panamericana, 207, N pg. 959
Ral Romero Cabello, Microbiologa
y
parasitologa
humana
/
Microbiology
and
Human
Parasitology: Bases etiologicas de las
enfermedades
infecciosas
y
parasitarias / Etiological Basis of
Infectious and Parasitic Diseases,
reimpresa, Ed. Mdica Panamericana,
2007, p. 999.
Medigraphic, Revista latinoamericana
de microbiologa, Ene-03 1999, Vol.
41, N. 1, p. 66.
Arturo Elosegui, Conceptos y tcnicas
en ecologa fluvial, Fundacion BBVA,
2009, p. 444.
VII ANEXOS

Anexo 1: Estructuras Microbianas

ESTRUCTURAS MICROBIANAS

Nombre

CAPSULA

FLAGELO
S

ESPORAS

Tincin
Se
denomina
tincin
negativa
utilizando tinta china o nigrosina
porque tie el fondo
de
la
preparacin
y
no
el
microorganismo.
En
el
microscopio
se observa
el
fondo
negro
y
los
microorganismos con capsula sin
color. (TINCIN ESPECIAL)
La tincin de flagelos de Leifson es
una tincin simple que usa un
colorante, la rosanilina y cido
tcnico que engrosa lo flagelos para
que puedan verse. Es impredecible
fijar las clulas con formol y realizar
la tincin muy cuidadosamente para
poder observar los flagelos

La tincin de schaefferfulton se
aplica la tincin primaria se realiza
con Verde de Malaquita en caliente
que tie las clulas de verde. El
calor es necesario para que las
endosporas se tian.
(TINCIN
ESPECIAL)

Vista en el
microscopio