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MTODO DE

MICRONCLEOS
EN PECES
TOXICOLOGIA

AUTORES:

BUJAICO BUSTILLOS CLARISA Z.

ESTEBAN CUTIPA MIJAIL P.

HUAMAN INCA PAUL J.

MEZA CLEMENTE ELIZABET B.

SPINER GUTIERREZ JOSUE R.

UQUICHE AHUI ROMMEL A.

TOXICOLOGA

TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCION ............................................................................................................................................. 3
OBJETIVOS ..................................................................................................................................................... 4
MARCO TERICO .......................................................................................................................................... 4
GENOTOXICIDAD ....................................................................................................................................... 0
ENSAYO DE MICRONUCLEOS .................................................................................................................. 1
PEZ CEBRA (DANIO RERIO) .......................................................................................................................... 3
PRIMERA CARACTERISTICA ................................................................................................................ 3
SEGUNDA CARACTERISTICA ............................................................................................................... 4
TERCERA CARACTERISTICA ............................................................................................................... 5
PROCEDIMIENTO ........................................................................................................................................... 6
CONCLUSIONES ............................................................................................................................................ 7
BIBLIOGRAFA ................................................................................................................................................ 7

TOXICOLOGA

INTRODUCCION
El presente trabajo de Laboratorio analizaremos el pez cebra ya que una gran cantidad de compuestos
txicos, de origen natural y antrpico, llegan a los ecosistemas acuticos, donde son absorbidos,
acumulados, biotransformados por procesos biolgicos y/o qumicos. Estos compuestos disueltos o
dispersos en el agua, ingresan a los organismos acuticos a travs de las branquias, la piel y/o el tracto
digestivo. Una vez dentro del organismo, estas sustancias txicas interactan en diversos procesos
fisiolgicos y rutas metablicas.
Es por ello que los peces son considerados buenos bioindicadores de la calidad del ecosistema acutico ya
que ocupan diferentes niveles de la cadena trfica, bioacumulan sustancias txicas y reaccionan fcilmente
a bajas concentraciones de agentes contaminantes. La eleccin de las especies como bioindicadoras
depender del conocimiento del contaminante del medio acutico (si se deposita en el sedimento o si se
mantiene en la columna de agua), como tambin de la biologa del comportamiento del animal (tipo de
alimentacin, posicin en la columna de agua, movilidad, entre otros).
Las propiedades qumicas de los xenobiticos, as como la capacidad de los peces para absorberlos,
ingerirlos y metabolizarlos determinarn la importancia de las alteraciones o el grado de dao causado
(Buchwalter et aL, 2003; Zavala-Aguirre es al., 2010). En general, la persistencia de un contaminante en el
ambiente determina la peligrosidad del mismo.

TOXICOLOGA

OBJETIVOS
Evaluar el dao gentico del pez cebra despus de haber sido expuesto a contaminantes.

MARCO TERICO

Una gran cantidad de compuestos txicos, de origen natural y antrpico, llegan a los ecosistemas
acuticos, donde son absorbidos, acumulados, biotransformados por procesos biolgicos y/o qumicos.
Estos compuestos disueltos o dispersos en el agua, ingresan a los organismos acuticos a travs de las
branquias, la piel y/o el tracto digestivo. Una vez dentro del organismo, estas sustancias txicas
interactan en diversos procesos fisiolgicos y rutas metablicas (Vanzella et al., 2007).
Se pueden definir dos tipos de contaminacin: i. Contaminacin puntual o localizada, donde los
contaminantes ingresan de forma directa a los cursos acuticos (tpica de efluentes urbanos e
industriales) y ii. Contaminacin difusa o no localizada, donde no existe un punto claro de ingreso al
curso de agua (tpicamente la producida por actividades agrcolas). En el primer caso, las fuentes son
fciles de identificar, monitorear y regular, pero producen un alto impacto sobre el sitio inmediato que
recibe la descarga. En el segundo caso, los contaminantes (pesticidas, fertilizantes y otros qumicos
asociados) generalmente son arrastrados por lixiviado y escorrenta, del medio terrestre al medio
acutico. Los impactos producidos por estos dos tipos de fuentes, van a depender de las caractersticas
propias de los contaminantes, su periodicidad de descarga y el tipo de ambiente donde son vertidos
(FAO, 1997). El ambiente puede ejercer funciones de filtracin, descomposicin, neutralizacin o
almacenamiento de ciertos contaminantes. De esta manera puede reducir en determinado grado, la
disponibilidad del contaminante en el medio, disminuyendo as su efecto nocivo en los organismos. Pero
tambin puede provocar acumulacin de contaminantes como metales pesados unidos a partculas del
sedimento que quedan biodisponibles por cambios en parmetros fsico-qumicos. (Newman &
Clements, 2008).
Los bioindicadores u organismos centinela, permiten estudiar los efectos de los contaminantes en el
ecosistema, a travs de una serie de respuestas moduladas e integrables, las cuales posibilitan evaluar
el bienestar del individuo, de la poblacin y de la comunidad. Por bioindicadores se

TOXICOLOGA

entienden todos aquellos organismos que proporcionan informacin sobre la calidad del
medioambiente o de una parte del mismo, a partir del uso de marcadores especficos (de dao
gentico, celular, inmunolgicos, neurotransmisores, etc.) (Leonzio, 2002; Monserrat et al.,
2007). La informacin que proporcionan los organismos centinela, es el resultado de la
exposicin aguda o acumulativa de los diversos contaminantes en el ambiente. Se puede evaluar
el impacto sobre los organismos a lo largo de un periodo de tiempo. A diferencia de los estudios
fsico-qumicos tradicionales, los cuales brindan una informacin puntual en el tiempo, que
identifica los contaminantes presentes en el ambiente. Ambos estudios pueden ser
complementarios (Butterworth, 1995; Da Silva et al., 2003).

Los peces son considerados buenos bioindicadores de la calidad del ecosistema acutico ya que
ocupan diferentes niveles de la cadena trfica, bioacumulan sustancias txicas y reaccionan
fcilmente a bajas concentraciones de agentes contaminantes (Minissi et al., 1996; Gustavino et
al., 2001). La eleccin de las especies como bioindicadoras depender del conocimiento del
contaminante del medio acutico (si se deposita en el sedimento o si se mantiene en la columna
de agua), como tambin de la biologa del comportamiento del animal (tipo de alimentacin,
posicin en la columna de agua, movilidad, entre otros) (Torres-Bugarin et al., 2007).

Las propiedades qumicas de los xenobiticos, as como la capacidad de los peces para
absorberlos, ingerirlos y metabolizarlos determinarn la importancia de las alteraciones o el
grado de dao causado (Buchwalter et al., 2003; Zavala-Aguirre et al., 2010). Algunas especies de
peces que estn en niveles trficos superiores (por ej. carnvoros) presentan mayores
concentraciones de ciertos contaminantes y estn potencialmente en mayor riesgo que otros de
niveles inferiores (proceso de biomagnificacin) (Porto et al., 2005; Lee & Steinert, 2003). En
general, la persistencia de un contaminante en el ambiente determina la peligrosidad del mismo.
GENOTOXICIDAD
Dentro de los contaminantes que pueden ingresar a los ecosistemas acuticos, se encuentran los
agentes genotxicos. Dicho agentes actan directa o indirectamente sobre el material gentico
TOXICOLOGA

(ADN) y producen efectos detectables a concentraciones subletales (Koppe, 2002). Existen


diversos tipos y fuentes de contaminacin que contienen agentes genotxicos, varios de ellos
relacionados con las actividades productivas del hombre (efluentes industriales, cloacales,
actividades agrcolas, entre otras).
La concentracin de estos agentes en el ambiente, su va de entrada al organismo, as como la
susceptibilidad y la capacidad de reparacin del organismo, determinaran en ltima instancia, el
grado de dao gentico producido (Lee & Steinert, 2003). Dicho dao puede iniciar una cascada
de consecuencias biolgicas en clulas especficas, en tejidos u rganos albo, en el organismo
completo (afectando su sobrevivencia o su capacidad reproductiva) y finalmente en la poblacin
o en la comunidad, dependiendo de si el dao ocurre en clulas somticas o germinales (Zhu et
al., 2005). En una variedad de animales acuticos, las alteraciones genticas, estn asociadas a la
reduccin del crecimiento corporal, desarrollo anormal del mismo, disminucin de la
sobrevivencia en embriones, larvas y adultos (Lee & Steinert, 2003).
ENSAYO DE MICRONUCLEOS
Los microncleos (MN) son indicadores de dao cromosmico que se originan durante la divisin
celular, tanto por fragmentos acntricos o cromosomas que no se incorporan en los ncleos hijos
(ANEXO I). Esto se debe a la ocurrencia de eventos clastognicos (prdida de un fragmento
cromosmico acntrico) o aneugnicos (prdida de cromosomas completos) ocurridos en algn
momento del ciclo celular, provocados por la accin de agentes genotxicos (Mudry & Abrevaya,
2006; Ghisi et al., 2011; Obiakor et al., 2012). Tambin pueden surgir debido a la interaccin de
agentes qumicos, fsicos o biolgicos con estructuras genmicas, que promueven disturbios en la
maquinaria mittica y falla en la segregacin cromosmica, originndose as, uno o varios MN
por clula (Schimid, 1975; Rabello-Gay, 1991; Al-Sabti, 1995; Fenech, 2000; Souza & Fontanelli,
2006).
El ensayo de MN fue desarrollado por Schmid (1975), el cual permite analizar la frecuencia de
MN en sangre perifrica de roedores, luego Hooftman & Raat (1982) adaptaron esta tcnica para
trabajar con peces en laboratorio. Son muchos los estudios posteriores que se han hecho
utilizando el ensayo de MN para detectar los efectos de la exposicin crnica

sustancias

TOXICOLOGA

qumicas mutagnicas y cancergenas en peces (Manna & Sadhukhan, 1986; Majone et al., 1988;
Missini & Lombi, 1997; Campana et al., 1999; Gustavino et al., 2001; Grisolia & Starling, 2001;
Flores-Kehn et al., 2008). Esta tcnica tambin puede ser utilizada directamente en un
ecosistema, como indicador biolgico de contaminacin en peces (Missini et al., 1996; Ateeq et
al., 2002), donde se pueden analizar los efectos mutagnicos de sustancias como mercurio,
nitrito, arsnico y otros agentes clastognicos (Matsumoto & Clus, 2000; Grisolia & Cordeiro,
2000; Lemos et al., 2001; Prieto Garcia et al., 2008; Reis-Henriques et al., 2009).
El aumento en los vertidos de efluentes industriales y domsticos, en ambientes acuticos
(producto del aumento poblacional) provoca la exposicin de los organismos acuticos a una alta
concentracin de compuestos genotxicos. Una amplia variedad de compuestos sintticos se han
incrementado y dispersado en todos los hbitats. Entre ellos, los metales pesados y los poluentes
orgnicos persistentes (COPs) tales como hidrocarburos policclicos aromticos (HPAs) tienen
severos efectos ambientales, dada su gran movilidad ambiental. Varios autores, han reportado el
potencial genotxico de estas sustancias qumicas, como es el caso del cobre que induce estrs
oxidativo, provocando la formacin de MN (Guecheva et al., 2001; Arkhipchuk & Garanko, 2005).
La evaluacin genotxica de ambientes acuticos es un mecanismo clave para transformar el
principio de desarrollo sostenible en medidas concretas. Los agentes genotxicos se asocian a la
ocurrencia de mutaciones gnicas o cromosmicas, proliferacin de clulas cuyos mecanismos
de

control

se

encuentran

daados

(carcinognesis),

desarrollo

de

malformaciones

(teratognesis) y alteraciones en los mecanismos de reparacin del material gentico (Obiakor et


al., 2012).
El ensayo de MN representa una aproximacin apropiada y suficiente ya que permite colectar
varias muestras de diferentes especies y sitios, sin necesidad de sacrificar a los organismos
(Monserrat et al., 2007; Bolognesi & Hayashi, 2011). El ensayo es una tcnica validada por la
Agencia de Proteccin Ambiental de Estados Unidos (EPA o USEPA por sus siglas en ingls),
organismo de referencia para poluentes y agentes contaminantes ambientales. Su importancia
fundamental radica en que es un marcador de efecto de los contaminantes y permite tomar
medidas tempranas de manejo, a niveles subletales de agentes txicos (Obiakor et al., 2012).

TOXICOLOGA

Los MN pueden ser fcilmente detectados en microscopio ptico o de fluorescencia. Para ello, el
ADN es teido con sustancias que permiten diferenciar el material gentico del resto de las
estructuras celulares (Ghisi et al., 2011; Obiakor et al., 2012). La ventaja de esta tcnica es que
provee ndices cuantificables de dao gentico, de manera rpida y relativamente sencilla. Debido
a que el conteo al microscopio de un alto nmero de clulas como requiere el ensayo (>1000)
genera un enorme esfuerzo de observacin (Adams 2002) y precisin, se han desarrollado
programas de anlisis de imgenes, de conteo de MN y se siguen los protocolos estandarizados y
validados a nivel internacional por organismos como la EPA.
El ensayo de MN aplicado al biomonitoreo de contaminantes resulta ser una herramienta de gran
practicidad en los estudios de mutagnesis ambiental (Koppe, 2002). Dado el alto costo de muchos
anlisis fsico-qumicos, los cuales, muchas veces resultan insuficientes para explicar los efectos
macroscpicos individuales, o los cambios en las poblaciones y comunidades, los marcadores
moleculares de dao resultan, en la actualidad, de gran relevancia. En innumerables casos, los
txicos, no pueden ser detectados en las diferentes matrices (suelo, agua, sedimentos), sin
embargo, sus efectos pueden medirse en los organismos (Mudry & Carballo, 2006).

PEZ CEBRA (Danio rerio)

El Pez Cebra, de nombre cientfico Danio Rerio, es un pez tropical de agua dulce, proveniente del
sudeste asitico y muy comn en acuarios de todo el mundo. Pertenece a las familias de los
ciprnidos. Su fisonoma se caracteriza principalmente por ser transparente, tener rayas
horizontales que cruzan su cuerpo hasta la cabeza y no medir ms de 5 centmetros.
Este pez ha sido objeto de mltiples estudios por la comunidad cientfica en los ltimos 20 aos
(incluso ms), debido a sus mltiples propiedades y su parecido gentico con el hombre,, lo que
se vio fomentado a raz de los recientes descubrimientos.
PRIMERA CARACTERISTICA
Este pez ha sido tratado con diversas presiones de oxgeno en su ambiente y se ha detectado que
a partir de los 30 das de vida, puede sobrevivir a bajas presiones de oxgeno (hipoxia) sin

TOXICOLOGA

presentar problemas en su crecimiento, a diferencia de otros peces. Esto se debe a sus


mecanismos anaerbicos y su excelente regulacin con el sistema aerbico. Tambin se concluy
que las cras desarrolladas en este ambiente luego presentan una mejor capacidad de regulacin
entre ambos sistemas (Barrionuevo, 2010).
Hay pocos estudios sobre el sistema de regulacin entre sus metabolismos aerbicos y
anaerbicos, y tambin de cmo estas funcionan. Pero, en cambio, hay otros muchos relativos al
desarrollo del pez en ambientes con distintas presiones de oxgeno, destacndose el Pez Cebra
en ellos con poca presin, dada su gran capacidad de supervivencia y desarrollo gracias a su
sistema anaerbico. Cuando estos animales estn con bajas presiones de oxgenos, su sistema
anaerbico presenta una gran capacidad para sintetizar energa.
La siguiente tabla muestra la supervivencia y desarrollo del Pez Cebra en hipoxia y normoxia a
distintas edades:
APLICACIONES
Entendiendo el funcionamiento de la regulacin entre los sistemas aerbicos y anaerbicos del
pez, podra usarse para saber optimizar el uso de la energa (ATP) del cuerpo humano mediante
el perfeccionamiento de ste. As tambin, como mtodo de supervivencia en casos extremos de
carencia de oxgeno y tambin para usar ms eficientemente el consumo de oxgeno en el cuerpo
y, por lo tanto, el gasto de energa. Adems, usando y perfeccionando este proceso se podra
desarrollar, a largo plazo, una nueva rea de estudio energtico mediante el estudio de la
produccin y regulacin de la energa en sistemas vivos.
SEGUNDA CARACTERISTICA
Estos peces tienen la capacidad de regenerar su corazn a travs de proliferacin slida de
cardiomiocitos localizados en el borde epicrdico del miocardio nuevo. (Ian C. Scott, 2002)
(Kenneth D. Poss*, 2002). Esto se produce por medio de dos etapas coordinadas despus de la
reseccin del pice ventricular. Primero, un blastema es formado compuesto de clulas
progenitoras que expresan marcadores pre-cardacos, se someten a la diferenciacin y proliferan.
En segundo lugar, el tejido epicrdico que rodea ambos compartimientos cardacos induce
marcadores del desarrollo y se expande rpidamente, creando una nueva cubierta epitelial del

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miocardio expuesto. Una subpoblacin de estas clulas epicrdicas sufre una transicin epiteliala-mesenquimal (EMT), invade la herida y ofrece nueva vasculatura para regenerar el msculo.
Durante la regeneracin, el ligando (una molcula que se une a un tomo de metal central para
formar un complejo de coordinacin) fgf17b es inducido en el miocardio, mientras que los
receptores fgfr4 y fgfr2 son inducidos en celdas adyacentes al epicardio derivado. (Alexandra
Lepilina, 2006).
APLICACIONES
Para la regeneracin cardaca del pez es evidente la aplicacin. Siendo algo importantsimo para
la vida del hombre la regeneracin tanto de rganos como de tejidos, aprender el
funcionamiento de la regeneracin animal, adems de la humana, sera un avance extraordinario
para la ciencia dado que sta la complementara y mejorara. As de estos estudios se podra
llegar a regenerar rganos como el corazn u otros y entendiendo el principio activo, sus
hormonas y protenas, aprender a regenerar casi cualquier parte del cuerpo, incluso, producirlos
aisladamente en laboratorios para dejarlos listos para trasplantes. Tambin se podra llegar a la
meta, tan buscada por los cientficos, de aplazar la vejez con un buen estado de salud, mediante
la mejora de regeneracin y renovacin celular de los tejidos, alargando y optimizando su
juventud y la actividad del rgano.
TERCERA CARACTERISTICA
Tiene una protena capaz de intercambiar iones de sodio e hidrgeno con el medio a travs de
sus agallas, con lo que los cientficos creen que se entender el funcionamiento del rin humano
en un futuro prximo.
An se est empezando el estudio, dado que el descubrimiento es muy reciente, pero el grupo de
cientficos que hizo el descubrimiento ya tiene varias respuestas sobre su funcionamiento, que
sern expuestas a continuacin:
Los cientficos descubrieron una protena llamada zNHE3b, altamente abundante en las agallas de
los peces. Esta, permite absorber iones de sodio en contra de la gradiente de concentracin, pero
no est involucrado en su salida. Desde el punto de vista fisiolgico, se ha supuesto que el NHE3

TOXICOLOGA

puede

realizar

un

intercambio

Na+/NH4+,

pero

nunca

se

lo

haba

demostrado

experimentalmente, por lo que todava no se sabe la explicacin termodinmica, pero saben


la ntima relacin con el rin humano, por el parecido del comportamiento de ambos, lo que
ayudar a entender el funcionamiento del nefrn. Para solucionar el problema de que no hayan
estudios suficientes ni se haya medido la actividad de la protena, le pusieron la protena zNHE3b
a unos ovocitos de una rana carnvora africana, llamada Xenopus, y luego estos fueron expuestos
a un medio libre de Na+, observndose que baj el pH intracelular y la actividad del sodio en la
clula. Esto mismos resultados fueron vistos despus cuando estas clulas fueron expuestas a un
medio que contena NH3 y NH4+, pero adems se not un incremento de la actividad del NH4+
en el medio intracelular. Estos y otros estudios parecidos dieron evidencia termodinmica que el
zNHE3b media la absorcin de iones de sodio, en agua con pocas concentraciones de estos, por
su Na+/H+ y Na+/NH4+ actividades de cambio (Yusuke Ito, 2014).

APLICACIONES

Esta peculiar propiedad del pez obtenida principalmente por la actividad de su protena zNHE3b,
podra suponer dos cosas:

Mejorar la filtracin de aguas desarrollando y ampliando las propiedades de las agallas


del pez. De esta manera se puede tanto desalinizar como potabilizar el agua.

Dada la capacidad de este sistema de intercambio, que puede permutar Na+ con H+, se
podra polarizar o neutralizar elctricamente una disolucin o simplemente cambiar sus
concentraciones internas. Adems se podra extender la propiedad a otros tipos de
partculas parecidas

PROCEDIMIENTO
Se seleccionan los peces y se sacrifican realizando un corte en la parte anterior del mismo,
entre el oprculo y las aletas pectorales, con la finalidad de obtener la sangre perifrica.
Se colecta la sangre perifrica colocando una gota de sangre en un extremo de la lmina
porta objeto e inmediatamente se realiza el frotis.
Se deja secar a temperatura ambiente por 15 minutos.
TOXICOLOGA

Se sumergen las muestras en Etanol Absoluto frio por 15 minutos. Luego se procede a
retirarlas y dejarlas secar por 15 minutos a temperatura ambiente.
Las lminas se colorean con GIEMSA al 10% por 8 minutos.
Se lava con agua destilada para retirar el exceso de colorante y dejar seca por 1 hora a
temperatura ambiente.
Finalmente se procede a la observacin microscpica para el conteo final. Se utiliza 400X y
1000X (usamos aceite de inmersin).
CONCLUSIONES
La aplicacin del ensayo de microncleos est siendo utilizada para el monitoreo de la
contaminacin de los ambientes acuticos junto con un biocontrol para la deteccin de la
genotoxicidad, Teniendo como material biolgico a los eritrocitos nucleados (presencia de
ADNnuclear) de la sangre perifrica del pez Cebra (Danio rerio) se detect el dao celular en forma
directa por microscopia permitiendo evaluar rpidamente (24 a 72 horas) los efectos nocivos de un
contaminante acucola de inters que otros ensayos no pueden hacerlo. Es un primer paso para
alertar con el tiempo el padecer mutaciones, alteraciones cromosmicas, desarrollar mal
formacines embrionarias o fetales y causar finalmente la mortalidad en un ambiente acutico
contaminado con metales pesados.

BIBLIOGRAFA

Buchwalter, D.; Jenkins, J. y Curtis, L. 2003. Temperature influences on water permeability


and chlorpyrifos uptake in aquatic insects with differing respiratory strategies.
Environmental Toxicology and Chemistry, 22: 2806-2812.
Gutierres, J. (2013). Micronucleos en peces como indicadores de calidad ambiental en
estuarios de la costa uruguaya. Montevideo . Uruguay
Ziga, G.; Gmez, B. (2006). La prueba de micronucleos.
Barrionuevo, F. R. (2010). Aerobic and anaerobic metabolism for the zebrafish, Daniorerio,.
Ian C. Scott, D. Y. (2002). Fishing Out a New Heart. Science Magazine , 298 (5601), 21412142.J., B. (2010). 70 (2), 425-434
Julie B Schuck, C.-H. L. (2009). Microarray analysis and quantitative real-time PCR
validation of gene expression during auditory hair cell regeneration in zebrafish (Danio
rerio). BMC Bioinformatics .
Kenneth D. Poss*, L. G. (2002). Heart Regeneration in Zebrafish. Science Magazine ,
298(5601), 2188-2190.

TOXICOLOGA

ANEXOS