Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM)

Laboratrio Nacional de Biocincias (LNBio)

Modelagem quantitativa automatizada

de redes biolgicas no cncer para a identificao de
potenciais alvos e drogas

Projeto para pedido de bolsa de iniciao cientfica direto FAPESP

Aluno: Tiago de Lima Ferreira (UNICAMP)

Orientadora: Dra. Gabriela Vaz Meirelles (LNBio/CNPEM)
Co-orientador: MSc. Marcelo Falsarella Carazzolle (IB/UNICAMP)

Campinas
Julho/2013

RESUMO
Na ltima dcada, a pesquisa na rea biolgica ultrapassou a capacidade humana
de analisar o imenso volume de dados acumulados, gerados a partir do desenvolvimento
de tecnologias em larga escala, e das abordagens micas. Assim, o uso de programas
computacionais para o armazenamento, busca, anlise e integrao dos dados de
fundamental importncia. A Biologia de Sistemas uma rea multidisciplinar que visa
integrar os dados relativos a genes e protenas individuais e investigar o comportamento
e relaes entre os diversos elementos de um sistema biolgico para explicar o seu
funcionamento. Neste contexto, o cncer, uma patologia altamente heterognea,
envolvendo a desregulao de mltiplas vias interconectadas que encontram-se
alteradas de uma forma complexa por diversas mutaes gnicas em conjunto com o
contexto ambiental, depende de uma caracterizao quantitativa e de anlises
computacionais para a compreenso preditiva ou mecanicista da patologia. Este projeto
tem como foco, portanto, o desenvolvimento de novos algoritmos para a modelagem de
redes de interao, de forma otimizada e automatizada, dentro de uma perspectiva de
Biologia de Sistemas baseada em redes complexas no cncer. Sero desenvolvidos
modelos dinmicos in silico, com foco em abordagens quantitativas, para a anlise das
redes de interao, em particular o interactoma das Neks (NIMA-related kinases) e o
interactoma de carcinoma e melanoma, visando a identificao de novos alvos
teraputicos e possveis inibidores (drogas) com potencial para utilizao em novas
estratgias teraputicas anti-cncer.

Palavras-chave: biologia de sistemas, cncer, drogas, redes complexas, modelagem

quantitativa.

I.

INTRODUO E JUSTIFICATIVA

1. Biologia de Sistemas: anlise de redes de interao biolgicas e descoberta

de drogas
Na ltima dcada, a pesquisa na rea biolgica ultrapassou a capacidade humana
de analisar o imenso volume de dados acumulados, gerados a partir do desenvolvimento
de tecnologias em larga escala, sendo fundamental o uso de programas computacionais
para o armazenamento, busca, anlise e integrao desses dados. A Biologia de
Sistemas uma rea multidisciplinar que visa integrar os dados relativos a genes e
protenas individuais e investigar o comportamento e relaes entre os diversos
elementos de um sistema biolgico para explicar o seu funcionamento (Kitano, 2002).
A interconexo entre diferentes processos celulares, como metabolismo e regulao da
expresso gnica, reflete a importncia de abordagens holsticas introduzidas pelo
paradigma da Biologia de Sistemas, frente aos tradicionais mtodos reducionistas.
Apesar de grande parte dos componentes celulares serem estudados individualmente, o
comportamento da clula emerge no nvel das redes de interaes e requer uma anlise
integrativa.
A Biologia de Sistemas encontra-se centrada na construo de modelos que
descrevam os sistemas biolgicos. Esses modelos proporcionam uma plataforma para (i)
a interrogao sistemtica e verificao experimental de um dado processo biolgico,
(ii) o gerenciamento da complexidade de centenas de componentes celulares e
interaes, e (iii) a revelao de propriedades emergentes e predio de consequncias a
partir da perturbao de determinados componentes das diferentes vias. Um novo e
importante paradigma da modelagem celular envolve a construo de uma estrutura
ampla de interaes moleculares e a consequente explorao desta estrutura para revelar
a hierarquia das vias de sinalizao, regulatrias e metablicas. Mapas de vias podem
ser extrados desta estrutura utilizando modelos computacionais de alto nvel, os quais
identificam os componentes principais, interaes e influncias requeridas para os
modelos mais detalhados de baixo nvel.
Atualmente, modelos de vias especficas esto sendo suplementados com dados
globais oriundos de screenings em larga escala para identificao de interaes
protena-protena (Ito et al., 2001; von Mering et al., 2002), protena-DNA (Lee et al.,
2002) e genticas (Tong et al., 2001), alm de dados de microarranjo que descrevem
mudanas globais na expresso gnica (DeRisi et al., 1997), e dados de espectrometria

de massa, RMN (ressonncia magntica nuclear) e outras tcnicas para detectar

mudanas globais nos nveis de protena (Gygi et al., 1999), estados de fosforilao
proteica (Zhou et al., 2001) e concentrao de metablitos (Griffin et al., 2001).
Um importante objetivo da modelagem computacional de redes biolgicas a
identificao de potenciais alvos de drogas. A aplicao prtica da Biologia de Sistemas
descoberta de novas drogas reside em trs abordagens principais: a integrao
computacional de dados oriundos de experimentos em larga escala, a modelagem
computacional de vias metablicas, regulatrias e/ou de sinalizao de clulas saudveis
e doentes (cncer etc.) a partir de dados da literatura (para a seleo de alvos e desenhos
de testes clnicos), e o uso dos prprios sistemas de clulas humanas complexos para
interpretar e predizer as atividades biolgicas de drogas e alvos gnicos (abordagem
experimental direta para classificar respostas biolgicas relevantes e validar
alvos/drogas) (Butcher et al., 2004).
Ferramentas computacionais que aumentam a capacidade dos pesquisadores de
avaliar e tirar concluses atravs da complexa dinmica dos processos biolgicos de
interesse so teis quando se tenta acompanhar a funo de centenas de componentes
em uma rede de interaes, ao mesmo tempo em que mtodos automatizados para a
manipulao de modelos de processos biolgicos para a busca de alvos teraputicos
apresentam o potencial de revolucionar o processo de desenvolvimento de drogas
(Nielsen & Schoeberl, 2005).
Os recentes avanos no mapeamento sistemtico de vias/processos biolgicos
sugerem um uso convincente de ferramentas computacionais em uma etapa diferente do
desenvolvimento de drogas: o acesso a efeitos colaterais txicos. Como a estrutura das
interaes moleculares oferece uma viso imparcial de alto nvel em diversas vias, o
estudo desta estrutura pode indicar quais as vias compensatrias so perturbadas por
uma droga alm da sua via-alvo (relacionada a uma determinada doena) pretendida.
Drogas que ativam vias associadas ao estresse e outros efeitos txicos podem, ento, ser
excludas de futuras consideraes. Dado que mais de seis em cada sete candidatos a
drogas que passam por testes clnicos em humanos fracassam (Flanagan et al., 2001),
estes softwares atuariam como um filtro adicional necessrio entre o screening em
larga-escala de candidatos a drogas e o prosseguimento caro e demorado dos testes
clnicos em humanos. Neste sentido, a emergncia de estratgias de modelagem
abrangentes, multi-escala, de alto a baixo nveis, fornecer um impulso considervel
para o desenvolvimento e uso de ferramentas de modelagem computacional tanto na

indstria farmacutica quanto na biologia de modo geral (Ideker & Lauffenburger,

2003; Lounkine et al., 2012).
1.1. Modelagem

dinmica

de

redes

biolgicas:

perspectivas

na

compreenso e tratamento do cncer

O cncer entendido, atualmente, no apenas como uma patologia altamente
heterognea com relao ao tipo celular e tecido de origem, mas tambm como uma
doena envolvendo a desregulao de mltiplas vias interconectadas, abrangendo
processos celulares fundamentais, como proliferao, diferenciao, migrao e morte
(Pawson et al. 2008). Alm disso, essas redes se conectam a componentes externos s
prprias clulas tumorais, incluindo outras clulas e componentes da matriz extracelular
(Kenny et al., 2007; Weinberg, 2008). Assim, as atividades das redes moleculares que
executam processos metablicos ou de organizao do citoesqueleto, ou regulam estes
atravs de transduo de sinal, encontram-se alteradas de uma forma complexa por
diversas mutaes gnicas em conjunto com o contexto ambiental. Portanto, para uma
efetiva compreenso da doena e propostas de novas terapias, torna-se necessria uma
abordagem que avalie o problema nos seus diferentes nveis, a partir da (i) identificao
das vias desreguladas, (ii) elucidao das consequncias de mutaes nas atividades da
rede, (iii) integrao da rede ao comportamento celular, (iv) integrao do
comportamento celular aos processos no nvel dos tecidos, e (v) predio dos efeitos a
partir de intervenes moleculares.
Esta perspectiva leva a, no mnimo, duas consequncias: (i) a caracterizao da
desregulao patolgica dever ser multivariada e quantitativa, e (ii) a compreenso
preditiva ou mecanicista da patologia depender de anlises computacionais. Assim,
uma perspectiva de Biologia de Sistemas baseada em redes complexas no cncer se
apia, fortemente, em abordagens de modelagem computacional (Kreeger &
Lauffenburger, 2009). Devido multidisciplinaridade desta rea, metodologias para
anlises computacionais podem variar consideravelmente, dependendo da pergunta
biolgica e dos dados experimentais disponveis, abrangendo diferentes tipos de
formalismos, desde abordagens preditivas qualitativas (discretas) a quantitativas
(contnuas), incluindo: modelos baseados em lgica (redes Booleanas, lgica fuzzy, etc),
redes Bayesianas, Petri nets, lgebra de processos, modelos baseados em restries,
equaes diferenciais (ODE/PDE), redes neurais artificiais, modelos baseados em
regras, interacting state machines (ISM), autmatos celulares, e modelos baseados em

agentes (ABM) (Feiglin et al., 2012; Ideker & Lauffenburger, 2003; Hardy & Robillard,
2008; Lee & Tzou, 2009; Bosl, 2007; Turner et al., 2004; Wang et al., 2009; Aldridge
et al., 2006; Machado et al., 2011; Kreeger & Lauffenburger, 2010). Esta diversidade
pode levar fragmentao de esforos em modelagem, uma vez que ela dificulta a
integrao de modelos provenientes de diferentes fontes. Portanto, simulaes no nvel
de uma clula inteira ou multi-celular se beneficiariam do desenvolvimento de uma
plataforma para modelagem, anlise e simulao baseada na unificao destes
formalismos, capazes de integrar os diferentes componentes e suas relaes, englobando
todos os tipos de redes biolgicas. Nesse contexto, o desenvolvimento de novos
algoritmos hbridos, combinando os mtodos quantitativos mais eficientes para cada
tipo de rede, proporcionaria uma modelagem automatizada das redes de interao em
um pipeline nico, sendo o objetivo central deste projeto.

2. Resultados prvios do grupo

2.1. NIMA-related kinases (Neks) e cncer
Entre as diversas famlias de cinases descritas, os membros da famlia
relacionados NIMA so os menos estudados e menos caracterizados funcionalmente.
Como prottipo dessa famlia, a cinase NIMA de Aspergillus nidulans contribui para
mltiplos aspectos da progresso da mitose (ORegan et al., 2007). Os mamferos
apresentam uma extensa famlia de 11 Neks estruturalmente homlogas NIMA,
(Quarmby & Mahjoub, 2005) e, de modo geral, os genes que codificam as Neks
humanas encontram-se super-expressos (Capra et al., 2006), ou so alvos de mutaes
em cncer (Greenman et al., 2007). Sendo assim, de fundamental importncia o
conhecimento das vias de sinalizao em que as Neks atuam nas clulas, os mecanismos
moleculares envolvidos e a identificao de potenciais inibidores que possam,
eventualmente, ser utilizados em novas estratgias teraputicas anti-cncer.
Nosso grupo realizou a identificao de parceiros de interao para a hNek1
(Surpili et al., 2003), hNek6 (Meirelles et al., 2010), hNek7 (Souza et al., manuscrito
em preparao), hNek3, hNek4, hNek5, hNek9, hNek10 e hNek11. Alm disso,
realizamos triagens com compostos comerciais utilizando a tcnica de Thermal Shift
Assay para a hNek1, hNek6 e hNek7, alm de anlises de docking e ensaios de
fosforilao in vitro para a confirmao desses compostos como possveis inibidores

(Moraes et al., manuscrito em preparao). Novos inibidores tambm sero testados em

bioensaios, e utilizados nas anlises in silico propostas neste projeto.

2.2. Plataforma IIS

A plataforma IIS (Integrated Interactome System), desenvolvida em colaborao
com o MSc. Marcelo F. Carazzolle, em projeto coordenado pela Dra. Gabriela V.
Meirelles (Carazzolle et al., manuscrito em preparao), apresenta interface web para
anotao, anlise e visualizao de perfis de interao de protenas/genes, metablitos e
drogas de interesse, a partir da criao de um projeto (protegido por senha) para cada
usurio. IIS funciona em 4 mdulos conectados: (i) Mdulo Submisso, que recebe
cromatogramas, derivados de sequenciamento Sanger a partir de diferentes mtodos de
screening (duplo-hbrido, transcritoma, etc.) e realiza o processamento dessas
sequncias; (ii) Mdulo Busca, que possibilita ao usurio fazer buscas pelos reads
processados ou pelas listas de protenas/genes, metablitos e drogas de interesse,
selecion-los e adicion-los ao seu projeto; (iii) Mdulo Anotao, que realiza a
montagem dos reads em contigs e singlets, ou utiliza listas de protenas/genes
carregadas pelo usurio, e os compara contra diversos bancos de dados (Ensembl,
Swiss-Prot, PDB, CDD, Prosite, GO, DisEMBL, MGI, HPA, etc.), gerando tabelas com
anotao automtica que podem ser manualmente curadas; e (iv) Mdulo
Interactoma, que faz o blast dos contigs e singlets ou compara as listas de
protenas/genes, metablitos e drogas contra o nosso banco GPMGDID (Global ProteinMetabolite-Gene-Drug Interaction Database), formado pelo agrupamento de diferentes
bancos de interao, gerando as redes de interao que podem ser visualizadas via web
ou analisadas atravs do software Cytoscape (Shannon et al., 2003).
A plataforma IIS surgiu da necessidade crescente por ferramentas apropriadas a
uma anlise sistemtica e padronizada de interaes fsicas, genticas e qumicogenticas a partir de dados processados ou que necessitam de um processamento
automatizado, e requer agora que novos mdulos sejam implementados no sentido de
ampliar sua funcionalidade, possibilitando a modelagem automatizada destas redes de
interao.

II.

OBJETIVOS
1.

Reviso bibliogrfica e avaliao dos algoritmos mais promissores.

2.

Desenvolvimento de novos algoritmos hbridos para a simulao de redes

de interao com foco em abordagens quantitativas, aplicadas na
compreenso de mecanismos moleculares envolvidos no cncer e
predio de comportamentos celulares a partir de perturbaes na rede
(mutaes gnicas, inibidores, etc).

III.

METODOLOGIA

1. Reviso bibliogrfica e avaliao dos principais algoritmos

Ser realizado um levantamento bibliogrfico dos principais mtodos/algoritmos
utilizados para a simulao de redes biolgicas, com foco nas abordagens quantitativas,
incluindo: Petri nets (Breitling et al., 2008; Chaouyia et al., 2008; Hardy & Robillard,
2007), modelos baseados em restries (Lee et al., 2008; Jamshidi & Palsson, 2010),
equaes diferenciais (ODE/PDE) (Chen et al., 2009), redes neurais artificiais
(Vohradsky, 2001), modelos baseados em regras (Blinov et al., 2004) e modelos
baseados em agentes (ABM) (Pogson et al., 2008; Zhang et al., 2007; Wang et al.,
2009). Esta reviso j encontra-se em andamento e, atravs dela, ser realizada uma
anlise e seleo dos algoritmos descritos de melhor performance para cada um dos
nveis de complexidade: (i) nvel molecular, abrangendo redes de sinalizao, redes
regulatrias e redes metablicas, e (ii) nvel celular, abrangendo redes multi-celulares
(por exemplo, interaes entre clulas tumorais e seu microambiente).

2. Desenvolvimento, implementao e teste de novos algoritmos promissores

Sero desenvolvidos novos pipelines, buscando combinar os mtodos mais
eficientes para cada caso. Estes novos pipelines sero implementados e sua eficcia
avaliada atravs da comparao com os algoritmos selecionados no item III.1. Ser
realizada a modelagem de redes construdas a partir de experimentos in house, em
particular o interactoma das Neks (cinases inseridas em modelos de vias especficas,

como a via de sinalizao do NF-B, em conjunto com dados de fosforilao e inibio

in vitro), em colaborao com o grupo do Prof. Dr. Jrg Kobarg, e o
proteoma/secretoma de carcinoma e melanoma (Kawahara et al., manuscrito em
preparao), em colaborao com o grupo da Profa. Dra. Adriana F. Paes Leme. A
implementao destes novos pipelines ter como objetivo a simulao automtica e
otimizada de redes biolgicas de interesse, possibilitando inserir perturbaes na rede
(mutaes gnicas, inibidores, etc.) e predizer comportamentos celulares e mecanismos
moleculares emergentes em cada condio/tempo de estudo. Isso facilitar novas
descobertas biolgicas, bem como poder ser aplicado ao diagnstico e tratamento de
doenas.
Como perspectivas deste projeto, ser realizada, posteriormente, a validao
experimental dos novos resultados obtidos pelas simulaes das diferentes redes em
colaborao com o grupo do Prof. Dr. Jrg Kobarg e da Profa. Dra. Adriana F. Paes
Leme. Os resultados obtidos a partir deste trabalho tambm serviro de base para o
posterior desenvolvimento do mdulo Modelagem Dinmica Quantitativa de Redes
Complexas na plataforma IIS.

IV.

CRONOGRAMA

Etapas
Levantamento bibliogrfico e avaliao dos principais algoritmos
Desenvolvimento, implementao e teste de novos algoritmos
promissores
Elaborao de relatrios cientficos e artigos

O = etapa em andamento; X = etapa a ser realizada

2 sem/2013

1 sem/2014

O
X

X
X

V.

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