Experimentacin

SEC: cromatografa de exclusin por tamao

El anlisis de biomolculas de metal se realiz usando cromatografa
de exclusin por tamao acoplada inductivamente a espectrometra
de masas de plasma (ICP-MS).
En este trabajo se usaron dos sistemas ICP-MS independientes.
Dos columnas de SEC de diferente rango de masa molecular.
Un espectrmetro ultravioleta-visible (UV/VIS) para deteccin de
protenas fue usado con la columna de cromatografa de
exclusin por tamao para molculas de alta masa molecular
(HMM-SEC column).
Una centrifuga para la separacin del sobrenadante (fraccin
soluble) despus de la extraccin de biomolculas a partir de
los tejidos.
Un liofilizador se utiliz para secar las muestras antes del
anlisis total del elemento.
Para la determinacin total de Hg y Selenio se utiliz muestras
de tejidos, los extractos (Fraccin soluble) y residuo (fraccin
insoluble) se digirieron utilizando un sistema de microondas
equipado con control de temperatura y presin.
El anlisis total se realiz con espectrometra de masas de
plasma usando el modo de celda de colisin con H2, siendo el
H2 el gas de colisin.
Collision/reaction cell: Una celda de colisin / reaccin es un
dispositivo usado en la espectrometra de masas de plasma acoplado
inductivamente para la eliminacin de iones de interferencia o iones
poliatmicos en el plasma que pasa.
La celda de reaccin de colisin conocido como celda de reaccin
dinmica. La clula de reaccin dinmica es una cmara colocada
antes de la cmara de espectrometra de masas de plasma.
Estos iones se eliminan mediante la inyeccin de un gas de colisin
(He), o un gas reactivo (H2), o una mezcla de los dos, directamente
en el plasma a medida que fluye a travs del cono de muestra.
REACTIVOS
Todos los reactivos fueron de grado analtico.
Protenas utilizadas para la calibracin de masa de las columnas
de la SEC fueron ferritina, amilasa, alcohol deshidrogenasa,
albmina de suero bovino, anhidrasa carbnica, citocromo c y
vitamina B12.
Tris compuesto orgnico conocido como tris (hidroximetil)
aminometano y cido clorhdrico.
Solucin patrn de 1000 g ml-1 de Hg, Se, Rodio y titanio.

 H2O2 (35%) and HNO3 (65%) se utilizaron para digerir las

muestras de tejido, los extractos (fraccin soluble) y la fraccin
insoluble residual.
Se obtuvo agua ultrapura fue obtenido de un sistema de
purificacin de agua.
Muestreo y almacenamiento
o Ciervo rojo y jabal (subadultos, > 2-3 aos de edad) fueron
cazados en " monteras " (grandes cazas), que suelen durar 3
horas, momento en el final de la cual fueron asesinados los
animales.
o Las muestras de hgado y rin fueron tomadas de los animales
en el lugar, en porciones colocadas en bolsas de plstico zip-lok
y almacenados en un refrigerador porttil a 4C antes de ser
transferido en un congelador a -80C, dentro de 2 h.
Cuantificacin total, extrable y residual de Hg y Se

Para determinar el contenido total de Hg y Se, muestras (hgado

y los riones tanto de ciervo rojo y jabal) se liofilizaron y
homogeneizaron.
Aproximadamente 0,2 g de la muestra
liofilizada se digiri con 8 ml de 69 % HNO3 (cido ntrico) y 2
ml de 35 % H2 O2 (perxido de hidrogeno). La digestin se llev
a cabo a partir de la temperatura ambiente hasta 200 C en 5
min, se mantiene a 200 C durante 5 min, y se eleva a 220 C
en 5 minutos, y se mantuvo a 220 C durante otros 5 min antes
de que se dejara enfriar hasta la temperatura ambiente.
Las muestras digeridas se diluyeron a un volumen final
apropiado con ultra-agua pura. Los extractos se mantuvieron
refrigerados a 4 C hasta su anlisis por ICP- MS.

Anlisis de biomolculas por SEC-UV-vis y SEC-ICP-MS

Para realizar el anlisis de la unin de las molculas con los metales
en los tejidos biolgicos, una etapa de extraccin es necesaria para
liberar las molculas de la matriz.
Este paso es fundamental ya que el objetivo ms importante es
mantener la integridad de la biomlecula de metal, evitando la
ruptura de enlaces metal-biomlecula o el intercambio de metales.
Por lo tanto, es necesario optimizar las variables en la etapa de la
preparacin de muestras, tales como el agente de extraccin
utilizado, la concentracin del agente de extraccin, volumen de
extraccin, tiempo de homogenizacin y pH del medio, para obtener
una eficiencia mxima de extraccin mientras se mantiene la
integridad de la entidad metal-biomlecula.

Aproximadamente 0,2 g de tejido (fresco congelado a -80 C) se

descongel e inmediatamente se homogeneiz con 400L de la
solucin tampn Tris (100 mM Tris HCl, pH 7,4), utilizando un
homogeneizador para facilitar la ruptura y la extraccion. Esta ruptura
celular se realiz a una temperatura fra (4C), y despus la muestra
se mantuvo en un bao de hielo para la extraccin durante 1 h. Los
componentes solubles fueron separados despus por centrifugacin
durante 1 hora a 15,500g a 4C, para minimizar el riesgo de
degradacin.
El contenido total de Hg y Se en los extractos y los residuos se
analizaron por ICP- MS despus de digestin por microondas.
Resultados y Discusin
Perfiles SEC(HMM)-UV-vis para hgado de ciervo rojo y jabal

El perfil de elucin muestra picos a lo largo de toda la separacin de

rango que indica la presencia de protenas en el extracto.
La mayora de las biomolculas extradas fueron encontradas en la
regin de alto-medio peso molecular (> 300 a 40 kDa). El primer pico
(Pico principal) corresponde a biomolculas de elevado peso
molecular (> 300 kDa). El segundo y tercer pico corresponden a 98 y
45 kDa, respectivamente. Los siguientes picos representan
compuestos con bajo peso molecular (por debajo de 12 kDa).

Evaluacin de biomolculas vinculantes de Hg con LMM y HMM

-SEC - ICP-MS

El anlisis de los extractos de rin de ciervo y el jabal se llev a

cabo utilizando tanto LMM como HMM -SEC - ICP- MS . Los perfiles de
distribucin de tamao molecular de Hg con la columna de HMM -SEC
se muestran en la Fig. 2.

En ambos casos (ciervo y jabal), los perfiles cromatogrficos

obtenidos fueron similares y las fracciones que contienen Hg fueran
detectadas en el intervalo de masa molecular desde 250 a la 20 kDa.
Luego, los extractos de rin fueron analizados utilizando la columna
de la LMM -SEC, las biomolculas que contienen Hg se detectaron en
el intervalo de masa molecular de 70 a 20 kDa (Fig.3).

Los patrones obtenidos para Hg con las dos columnas reflejan la unin
de este elemento a la protena de masa molecular alta-media,
probablemente debido a la alta afinidad de Hg a los grupos sulfhidrilo
de las protenas. Esto corresponde al hallazgo de Chen et al., que
inform que el Hg se redistribuy a las protenas de alto peso
molecular (80 a 100 kDa) en el rin porcino.

Los extractos de hgado de ambos animales se analizaron utilizando la

columna de la LMM-SEC (Fig. 4). El mercurio se detect en un amplio
rango de peso molecular, y una gran parte correspondi a medio peso
molecular (70-40 kDa), seguido de una fraccin con un peso
molecular relativo de 30 kDa y otra fraccin se detect en la regin
molecular inferior a 20 kDa.

Una clara diferencia en los perfiles cromatogrficos y la intensidad

global de la seal de Hg entre los extractos de ambos tejidos
animales, hgado (Fig. 4) y el rin (Fig. 3) puede ser visto.
La intensidad global de la seal de Hg en el rin es de alrededor de
3% de lo que se detect en extractos de hgado, aunque el contenido
global total de Hg es ms alto en los riones que en el hgado.
Esto se puede interpretar de dos maneras: o bien el Hg est ligado
muy estrechamente a las membranas celulares en el rin y por lo
tanto no est disponible para la extraccin muy suave utilizada o el
Hg puede estar unido a una molecula muy pequea que no se eluy
de la columna.
Hay muy poca informacin en la literatura sobre las biomoleculas de
Hg en los tejidos de mamferos terrestres y la comparacin es muy
difcil porque se utilizan diferentes condiciones analticas. De esta
manera, en la investigacin de Chen et al. sobre biomoleculas de Hg
en hgado de porcino de las reas contaminadas y no contaminadas
de Hg se encontr que el Hg estaba ms ligado a las protenas de
peso molecular elevado (> 70 kDa) y la minora con el peso molecular
medio (40-60 kDa) [9]. Por otro lado, Cabanero et al. investigaron los
patrones de unin de muchos elementos traza en el hgado de pollo
suplementado con Hg (II), MeHg y Se. En el estudio, se observ que el
Hg se asoci a las protenas de peso molecular alto y medio (<300 a
45 kDa), junto con especies de pesos moleculares bajas (<10 kDa).
Por lo tanto, los resultados encontrados en el presente trabajo
sugieren que el Hg se une preferencialmente a biomolculas de
elevado peso molecular en el rin y alto-medio en el hgado, que son
similares a los encontrados en la literatura.

Estudio de la unin de biomoleculas de Hg-Se con LMM y HMM

-SEC - ICP-MS

Los perfiles de distribucin de masas moleculares de Se obtenidos de

ciervo rojo y el rin jabal y extractos de hgado utilizando HMM- (Fig.
2) y LMM-SEC-ICP-MS (Fig. 3 y 4) muestran un solo pico
cromatogrfico. Usando SEC (HMM) -ICP-MS, se observ un pico de Se
en los extractos de los riones de ciervo rojo y jabal con masa
molecular cercana a 80 kDa. Sin embargo, con la SEC (LMM) -ICP-MS,
en los extractos de rion e hgado el pico de Se fue cerca de 60 kDa.
De acuerdo con la literatura, el pico de Se podra corresponder a
selenoprotenas.
Por otro lado, SELP se produce principalmente en el corazn, pulmn
e hgado, pero su funcin no se ha confirmado. Una de las funciones
puede ser como transportador de selenocisteina para la sntesis de
selenoproteins. Por otra parte, el SELP podra desempear un papel
importante en la interaccin entre el Hg-Se.

Estudio de otras biomolculas de metal por HMM y LMM-SEC-ICP-MS

El uso de la ICP-MS nos permite la medicin simultnea de diferentes

elementos; Por lo tanto, los elementos fisiolgicamente importantes
Fe, Ni, Cu y Zn se registraron junto con Hg y Se.
Fig. 5 representa los perfiles de la fraccin de masa molecular de Fe,
Ni, Cu y Zn obtenidos utilizando SEC (LMM) -ICP-MS y SEC (HMM) -ICPMS, respectivamente. En general, los perfiles de elucin fueron
similares entre los ciervos y jabales, pero no entre el hgado y el
rin, y exhiben una seal de mayor intensidad en los perfiles de
hgado.
En el rin (Fig. 5a y c) se encontraron fracciones de Fe, Cu y Zn de
peso molecular medio-alto pero no se encontr fracciones de Ni.
Sin embargo, en el hgado (Fig. 5b y 5d) se observa que las muestras
tienen una importante fraccin que contiene Fe en el intervalo de
masa molecular 70 a 50 kDa y otra importante fraccin que contiene
Ni por debajo de 25 kDa coincidiendo con las biomolculas de Hg.
Asi mismo se observaron algunas fracciones de Cu y Zn en el
intervalo de masa molecular 70 a 35 kDa y por debajo de 20 kDa,
donde biomolculas importantes podran eluir, tales como
metalotionenas (~7-6 kDa), rica en cistena.

Se asocian tanto con la desintoxicacin de metales pesados (por

ejemplo, Cd o Hg) y con la homeostasis (por ejemplo, Zn y Cu). Las
metalotionenas son capaces de unirse al Hg y jugar un papel
protector en la toxicidad por Hg en los mamferos.
Elucin: proceso por el cual todos los solutos terminan por abandonar la columna.