LABORATORIO DE EXTRACCIN DE ADN PLASMIDICO POR LISIS ALCALINA

CON SDS

ESPALZA REINEL ASTRID KAROLINA 15171037

LIC. ADRINA GIL

UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO
BUCARAMANGA
2016

EXTRACCIN DE ADN PLASMIDICO POR LISIS ALCALINA CON SDS

1- CAL ES LA IMPORTANCIA DE LA INGENIERIA GENETICA?

La ingeniera gentica es la parte de las ciencias que se encarga de
la manipulacin y transferencia de ADN de un organismo a otro. Nos permite
la creacin de transgnicos, como vimos en la entrada anterior. Sin embargo
existen ms aplicaciones, entre las que se encuentran la correccin de defectos
genticos o la obtencin de frmacos para tratar enfermedades.
Consiste en la manipulacin del cido desoxirribonucleico o ADN. En este proceso
son muy importantes las llamadas enzimas de restriccin producidas por varias
especies bacterianas.

2- DESCRIBA 2 TCNICAS UTILIZADAS PARA LA EXTRACCIN DE ADN

PLASMIDICO?

MTODO DE LISIS ALCALINA DE BIRNBOLM Y DOLY: Este mtodo se

basa en la diferente resistencia a valores de pH elevadas del ADN
plasmdico y cromosmico. Se basa en la desnaturalizacin y
precipitacin selectiva de ADN cromosmico en medios con NaOH y
SDS.

MTODO DE KADO Y LIU: Un mtodo rpido que permite la extraccin

de plsmidos CCC de Gram positivos y Gram negativos con un amplio
rango de peso molecular, es el mtodo de Kado y Liu que combina
tratamiento a elevado pH con una elevada temperatura (55C). Lo cual
tiene el efecto de reducir la obtencin de ADN cromosmico en la
preparada final.

MTODO DE BOLLING O DE HOLMES Y QUIGLEY: La extraccin de

plsmidos por calor se utiliza para extraer ADN plasmdico de un gran
nmero de muestras empleados pequeos volmenes (minipreps). El
ADN suele ser de calidad inferior al obtenido con otros mtodos. Las
bacterias se lisan tras tratamiento con lisozima, tritn y calor. El ADN
cromosmico queda en la pared celular y se elimina por centrifugacin.
El ADN plsmidco queda en el sobrenadante y su precipitacin con
isopropanol.

3- CUALES SON LAS DIFERENCIAS

BACTERIANO Y EL ADN PLASMIDICO?
ADN BACTERIANO
El tamao del ADN es grande
La forma del ADN bacteriano es lineal,
pero circular en algunos casos.
Su organizacin es alrededor de las
histonas.
El ADN bacteriano pertenece a algn
organismo.

FISICAS

ENTRE

EL

ADN

ADN PLASMDICO
El tamao del ADN es pequeo
La forma del ADN plasmdico es
circular.
Su organizacin del ADN plasmdico
es superenrrollada.
El origen del ADN plasmdico
pertenece a plsmidos.

4- QU TIPO DE CLULAS POSEEN LOS PLASMIDOS?

Las clulas procariotas que comprenden bacterias cianobacterias

(antes llamadas algas verdeazuladas, so clulas pequeas entre 1 y 5
um de dimetro y de estructura sencilla. El material gentico (ADN) est
concentrado en una regin; pero no hay ninguna membrana que separe
esta regio del resto de la clula.
Plsmidos: son molculas de ADN en la que la doble hlice se
encuentra formando un crculo cerrado. Es ms pequeo que el ADN
cromosmico bacteriano y de hecho de su presencia le transmite a ese
individuo caracteres que no se presenta en aquello que no lo aportan.

5- QUE CARACTERISTICAS LE PUEDEN CONFERIR UN PLSMIDO A LA

CELULA?
Los plsmidos no son esenciales para el desarrollo o supervivencia de la clula
pero le proveen una ventaja competitiva a las clulas que las poseen, dado a que
los plsmidos poseen genes que le confieren caractersticas selectivas a su
husped. Tales como resistencia a antibiticos, nuevas habilidades metablicas
como degradacin de carbohidratos, factores de virulencia, produccin de toxinas,
resistencia a metales pesados, sensibilidad a mgatenos, sensibilidad/ resistencia
a fagos, produccin de enzimas de restriccin, capacidad de formar relaciones
simbiticas, entre otros.

6- QUE RELACIN TIENEN LOS PLASMIDOS CON LAS ENZIMAS DE

RESTRICCIN?
Los plsmidos son excelentes vectores de clonaje, puede ser cortado con una o
dos enzimas de restriccin puede incorporrsele un fragmento de ADN que ha
sido previamente cortado usando las misma enzimas de restriccin. Los plsmidos
as modificados se los denomina plsmidos recombinados. En este estado, se las
introduce, entonces en una bacteria donde sern replicados.

7- QU FORMA TIENE UN PLASMIDO Y EN QUE PARTE DE LA CELULA DE

UBICA?
Los plsmidos son fragmentos extra cromosmicos de cidos nucleicos (ADN y
ARN) que aparecen en el citoplasma de algunas procariotas. Son de tamao
variable aunque menos que el cromosoma principal. Cada bacteria puede tener
uno o varios a la vez. Los plsmidos suelen existir como molculas circulares de
ADN de doble habr (dsADN) cerradas covalentemente. Las alteraciones por
rotura. De la dsADN dan lugar a las configuraciones plasmidicas abiertas
circulares (formas OC, open circular) o lineal (formas L) segn se afecte una o las
dos hebras.

8- DESCRIBE EL PORQUE DE LOS TRATAMIENTOS CON : NaOH y SDS.

ACETATO POTASICO, ETANOL Y RNASA?
El mtodo se basa en la diferente resistencia a valores de pH elevados del ADN
plasmdico y cromosmico, por esto se realiza la desnaturalizacin y precipitacin
selectivas del ADN cromosmico. En medios con NaOH y SDS, donde las
condiciones alcalinas (pH 12-12,5), desnaturalizan por completo las molculas
lineales de ADN, pero no las molculas lineales) y el plsmido que en relacin es
ms pequeo, se mantendr cerrado. Cuando el extracto celular es neutralizado
(por ejemplo, con cido actico). Bajo condiciones de alta concentracin salina
(acetato de potasio), el ADN cromosomal precipita, obedeciendo a la reasociacin
inespecfica de las largas cadenas de AD simple, que ocurre en mltiples sitios
formando una masa insoluble. Parte del ADN precipita, pero siempre quedan
cantidades detectables de esta molcula, a menos que se utilicen RNAasas
durante el proceso de extraccin. Tambin precipitan algunas protenas debido a
que la reaccin se realiza posteriormente en cloroformo.
Finalmente el ADN purificado se suele concentrar mediante precipitaciones
alcohlicas. Con etanol, el cambio de polaridad del medio genera el agregado de
alcohol la disminucin de la temperatura vuelven insolubles al ADN pudindose
recuperar en un precipitado si es centrifugado a altas velocidades.

9- EN CASO DE TENER LAS FORMAS SUPERENRROLADAS Y RELAJADA

DEL PLASMIDO INDICAR ASI:
TIENEN EL MISMO PESO MOLECULAR?
Las tres formas superenrrolladas, relajada y lineal, tienen la misma longitud y la
misma masa molecular, pero distinta conformacin y, as, distinto volumen
efectivo, distinto tamao tridimensional por ello, avanzan a distintas velocidades
por el gen.

Y LA MISMA LONGUITUD EN PARES DE BASES?

Las formas superenrrolladas, relajada y lineal de longitud completa, corresponden
a la misma molcula y tienen la misma, pero tienen diferentes formas, por lo que
ocupan un volumen efectivo diferentes y avanzan por el gen a distinta velocidad.

COMO SE PODRIA CONVERTIR UNA FORMA EN OTRA?

La topoisomerasa II tiene la propiedad de transformar un ADN circular relajado en
superenrrollado. Este proceso implica pasar de una forma sin almacenamiento de
energa a una forma con alto contenido energtico, y por lo tanto es necesaria la
presencia de adenosinatrifosfato (ATP) como donante energtico por el contrario,
la transformacin de ADN superenrrollado en relajado con subsecuentica
liberacin de energa es catalizada directamente por la topoisomerasa I sin
necesidad de ATP. La ADN girasa es una de las topoisomerasas I.

10-CUAL ES LA APLICACIN DE LOS PLASMIDOS EN BACTERIOLOGIA

Y MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL?

Microbiologa industrial : Existen mecanismos eficientes que asegura

la segregacin de los cromosomas bacterianos a las clulas hijas
cuando se forma el septo transversal , cada mesosoma va a parar a una
clula hija, de modo que las copias de los cromosomas quedan
segregadas, al parecer con algunos plsmidos que ayudan en la
segregacin por este mismo mecanismo.

Bacteriologa: Son herramientas tiles en ingeniera gentica para la

transformacin gentica y la manipulacin gentica de procariotas y
eucariotas, los plsmidos empleados en ingeniera gentica. Se llaman
vectores, son muy tiles para sintetizar en grandes cantidades,
protenas de inters, como la insulina y los antibiticos, mediante un
procedimiento conocido como la transformacin.

BIBLIOGRAFIA.
-

http:/www.argenbio.org/index.php?action=novedades&note=151
http:/www.hiru.eus/biologa.ingenieria-genetica.
http://bacteriologiaclinica.wikispaces.com/file/uiew/practicaNo4extraccion
de ADN plasmidico.pdf.
http://genommol.org/biomolespal.plasmidos-01-html.
http://ibcmung.files.wordpress.com/2010/03-pdf