Mtodos pticos de Anlisis

Tema 2: Espectrometra de
Luminiscencia Molecular. Fluorimetra
Conferencia 1

Sumario:
1. Introduccin
2. Fundamentos tericos
3. Fluorimetra
a)
b)
c)
d)

Espectros caractersticos
Rendimiento cuntico de fluorescencia
Relacin If concentracin
Ventajas y desventajas del mtodo

4. Influencia del entorno molecular

a) Efectos de solutos
b) Efecto de O2 disuelto y de tomos pesados (internos y
externos)

Bibliografa: Skoog (pgs. 381-401), TAI-1, Tomo II (pgs.

5-64)

1. Introduccin
Cul es la base de los mtodos luminiscentes
de anlisis?
Las molculas de analito se excitan para dar
una especie cuyo espectro de emisin
suministra informacin para el anlisis
cualitativo y cuantitativo.
Cul es su relacin con la concentracin?
Los mtodos luminiscentes cuantitativos se
basan en la relacin entre la intensidad de la
radiacin emitida con la concentracin del
analito.

1. Introduccin
Ejemplos de luminiscencia en la vida
cotidiana:
Anuncios lumnicos
Luz fra
Manecillas y nmeros luminiscentes de los relojes
Cocuyos
Light sticks
en CSI

1. Introduccin
Clasificacin segn la forma de producir la
excitacin:
Cuando las molculas son excitadas por interaccin
con fotones o radiacin electromagntica, la forma de
luminiscencia es llamada fotoluminiscencia.
En bioluminiscencia la energa electromagntica es
liberada por organismos.
Si la energa de excitacin es obtenida de una reaccin
qumica, el proceso es quimioluminiscencia.
Radioluminiscencia es el resultado de la liberacin de
energa producida por exposicin a partculas
radiactivas.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
Cules son las caractersticas de los estados
excitados singulete y triplete? (Estados S y T)
Estado Singulete (t=10-8 a 10-5seg.) y Triplete (t=10-4
a varios seg.)

Proceso de absorcin de radiacin (S0

o S2*): (Figura 15-1)

S1*

Proceso muy rpido (10-15 a 10-14 s), no hay t para

movimiento molecular por tanto el medio casi no
afecta.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
Proceso selectivo, cuantizado segn E = hc /
Proceso que depende de la estructura molecular y
de la concentracin del analito.

Desactivacin del estado excitado (S1*

S0):

Hay diferentes vas y la molcula tomar aquella

que minimice su tiempo de vida en el estado
excitado (la va de mayor constante de velocidad),
lo cual depende de la estructura de la molcula y
del medio.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
Vas de desactivacin del estado excitado:
(Figura 15-1)

a) Relajacin Vibracional (RV): proceso no

luminiscente
es un proceso muy eficiente (10-12 seg.) y los
restantes procesos ocurren despus de este.
b) Fluorescencia (F): proceso luminiscente
proceso de emisin espontnea de luz en
diferentes direcciones (incoherente) debido a
transicin singulete excitado a estado base.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
t de vida medio de 10-8-10-5 seg. (el del singulete
excitado), cesa casi inmediatamente despus de
quitar la fuente de luz
Influencia de la estructura (cclicas, rgidas, de alta
conjugacin)
Influencia del medio (bajas c, medios viscoso,
bajas T).
Diferencia en de excitacin y de emisin ( )
se conoce como corrimiento de Stokes.
Por qu de fluorescencia es mayor que la de
absorcin?
Aunque puede ser fluorescencia resonante.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
No todo lo que absorbe radiacin despus
flurese pues el t vida permite que ocurran
movimientos moleculares y otros procesos que
producen la desactivacin del estado excitacin
sin emisin de luz.
c) Conversin Interna (CI): proceso no
luminiscente (Figura 15-1)
Distribucin intramolecular de la E del estado
excitado entre otros estados electrnicos
isoenergticos de igual multiplicidad.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
c) Conversin Interna (CI) (cont.):
Proceso intramolecular mediante el cual la
molcula pasa a un estado electrnico de menor
E sin emitir luz. Proceso muy eficiente cuando la
diferencia de energa entre esos estados
electrnicos es muy pequea (se solapan niveles
vibracionales). Debido a este proceso, la
fluorescencia generalmente ocurre desde el
primer singulete excitado.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
c) Conversin Interna (CI) (cont.):
La conversin interna a travs de los niveles
vibracionales solapados es normalmente ms
probable que la prdida de energa por
fluorescencia desde un estado excitado ms alto.
Ejemplo: La quinina
(Figura 15-2)

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
d) Cruzamiento entre sistema (CES): proceso no
luminiscente (Figura 15-1)
La distribucin intramolecular de la energa
puede ocurrir entre estados isoenergticos de
T1), pero como
diferente multiplicidad (S1
esto conlleva a un cambio en el spin electrnico
es un proceso poco probable. (Sin embargo tiene
una probabilidad mayor que poblar
directamente al T1 desde S0). La probabilidad es
mayor cuando la diferencia de energa entre
esos estados electrnicos es muy pequea (se
solapan niveles vibracionales).

Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
d) Cruzamiento entre sistema (CES) (cont.):
El cruce entre sistemas es ms comn en
molculas que contienen tomos pesados,
como son el yodo y el bromo (efecto de
tomo pesado). Los acoplamientos
spn/orbital se hacen grandes en presencia de
tales tomos y, de ese modo, se favorece un
cambio en el spn. La presencia de especies
paramagnticas en la disolucin, como el
oxgeno molecular, tambin favorece el cruce
entre sistemas.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
e) Fosforescencia (P): Proceso luminiscente
(Figura 15-1)

Proceso de emisin espontnea de luz en

diferentes direcciones (incoherente) debido a
transicin triplete excitado a estado base
(despus de que haya ocurrido CES y RV en el T).
Y finalmente vuelve a ocurrir la RV en el estado
base.
Proceso poco probable debido a que de nuevo
debe haber cambio en spin electrnico.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
e) Fosforescencia (P) (Cont.):
Su duracin es el t vida del T (10-4 a varios seg.),
por tanto la fosforescencia se observa aun un t
despus de que cesa la fuente de excitacin. Su
mayor duracin hace que otros procesos
compiten mucho.
Ocurre a > que la fluorescencia.
Pocas sustancias son fosforescentes, se requiere
rigidez en alguna forma (a T de N2 liq., en medios
muy viscosos, en matrices slidas, o
inmovilizando el compuesto en soportes slidos.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
f) Conversin externa (CE) o amortiguacin colisional:
Proceso no luminiscente que ms compite con F y P.
Se debe fundamentalmente a mecanismos
colisionales con otras molculas, aunque no es la
nica va.
Es proceso de interaccin y transferencia de energa
intermolecular (la excitada y otras)
No se presenta en las condiciones en que se reduce
el movimiento molecular: <T, > viscosidad, > rigidez
molecular (Ejemplo del Fluoreno (F = 1,0) y el
Bifenilo (F = 0,2))
(Fluoreno-Bifenilo)

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
f) Conversin externa (CE) (Cont.):
Condiciones que disminuyen CE aumentan la
luminiscencia.
Tambin se conoce como quenching externo.
g) Reacciones qumicas del estado excitado: Al
ocurrir el proceso de absorcin hay un cambio en
la distribucin de electrones de la molcula y en
algunos casos esto conlleva a cambios en algunas
propiedades y se producen reacciones en el
estado excitado.

2. Principios tericos de los mtodos

fotoluminiscentes
Resumen:
Desactivacin de S*

Transferencia
Radiativa

Luminiscencia
(F, P)

Transferencia
no Radiativa

Conversin Externa
(Mecanismo
Colisional)

Reacciones
Qumicas

Transferencia
Interna (CI, CES)

3. Fluorimetra
a) Espectros caractersticos: (Vitamina E)
Dos s a seleccionar. Qu ventaja tiene esto?
Dos espectros: el de excitacin y el de emisin.
Espectro de excitacin: Similar al de absorcin
pero se miden seales diferentes en equipos que
tienen configuraciones diferentes.
Espectro de emisin (o en este caso particular es
el de fluorescencia): es independiente de la de
excitacin en cuanto a su forma (el valor de la
seal s depende de la exc) y es imagen especular
del de excitacin en la transicin 0,0.

3. Fluorimetra
a) Espectros caractersticos (Cont):
Cmo se obtienen? (Instrumento)
Lo ideal respecto a las s de excitacin y
fluorescencia es que tengan un corrimiento de
Stokes de ~50 nm.
Como seleccionar las s: Hay que considerar varios
aspectos adems de la sensibilidad y la
selectividad a las s de mxima seal.

3. Fluorimetra
b) Rendimiento Cuntico de Fluorescencia (F):

Definicin (en funcin de molculas, en funcin de

fotones): el rendimiento cuntico, o la eficacia
cuntica, de florescencia es simplemente la relacin
entre el nmero de molculas que emiten
fluorescencia respecto al nmero total de molculas
excitadas. Para molculas altamente fluorescentes
como la fluorescena, la eficacia cuntica, bajo
determinadas condiciones, se aproxima a la unidad.
Las especies qumicas que no presentan florescencia
apreciable tienen eficacias que se aproximan a acero.

3. Fluorimetra
b) Rendimiento Cuntico de Fluorescencia (F)
(Cont):

Valores que toma F

Se define en funcin de las constantes de velocidad
de los procesos.
kF est determinada fundamentalmente por la
estructura molecular y las k de los procesos noradiativos (NR) estn determinadas
fundamentalmente por el entorno molecular.

kF
F =
k F + k CES + k CE + k CI +

F ~ 1 si kNR es mucho menor que kF

3. Fluorimetra
c) Relacin IF concentracin:
IF (total) = 2,303 I0Fbc a una dada (lnea recta
que pasa por el origen: curva de calibracin).
IF (medida) = K I0Fbc (esa K depende de las
caracterstica instrumentales).
La expresin se cumple para soluciones diluidas
(~10-4 M y menor, de forma que A~0,05, lo cual
depende tambin de ).

3. Fluorimetra
Relacin IF concentracin (Cont.):

La seal medida depende de I0 y de K.

Aqu tambin se usa un blanco (es importante solo
si es fluorescente y se ajusta la seal a cero).
La IF (medida) no tiene unidades, que a diferencia de
la A son unidades arbitrarias (unidades relativas) y
que por tanto depende del equipo y de lo que se
use de referencia. Por eso generalmente con uno
de los patrones del analito (el ms concentrado)
se ajusta la escala del equipo.

3. Fluorimetra
d) Ventajas y Desventajas del mtodo:

(+) alta sensibilidad ((LD = ppb) los lmites de

deteccin suelen ser de uno a tres rdenes de
magnitud inferiores a los encontrados en la
espectroscopa de absorcin), alta selectividad, e
intervalos grandes de linealidad.
(-) alta dependencia del entorno molecular y
tambin de la estructura molecular. Menor
precisin y exactitud que la de los
procedimientos espectrofotomtricos.

4. Influencia del entorno molecular

(Influencia del medio)
a) Efecto de solutos
b) Efecto del O2 disuelto y de tomos pesados
(internos o externos)
c) Efecto del pH
d) Efectos del solvente (propiedades fsicas,
efecto general y efectos especficos, otros)
e) Efecto de la formacin de enlaces de
hidrgeno
f) Efectos de la temperatura

4. Influencia del entorno molecular

(Influencia del medio)
a) Efecto de Solutos:
1. Del propio analito a altas concentraciones
(autoamortiguacin y autoabsorcin).
Dependencia IF concentracin y linealidad de la
curva de calibracin. (curva de calibracin)
2. De otros solutos (concomitantes) en solucin.

4. Influencia del entorno molecular

(Influencia del medio)
Definicin de Quenching: se define el trmino
quenching de fluorescencia o amortiguacin de
la fluorescencia como la disminucin de la
fluorescencia (o fosforescencia en ese caso) del
analito debido a interacciones bi-moleculares de
este con otras molculas (puede ser con
molculas del propio analito si este est en altas
concentraciones o de otros solutos en solucin).
Estas interacciones ocurren por diferentes
mecanismos siendo el ms comn el mecanismo
colisional.

4. Influencia del entorno molecular

(Influencia del medio)
Tipos de Quenching:
1. Quenching dinmico: proceso mediante el cual se
desactiva el estado excitado de la molcula del
analito (S*) debido a colisiones con otras molculas
en solucin (esa otra molcula sera el quencher (Q)).
Puede ser una simple transferencia de energa lo que
ocurre (S* + Q = S0 + Q + Energa NR), desactivndose
la molcula del analito. En este caso, se altera el
espectro de emisin del analito. Q puede ser otras
molculas del analito o molculas de un
concomitante.

4. Influencia del entorno molecular

(Influencia del medio)
Tipos de Quenching (Cont.):
2. Quenching esttico: proceso de interaccin en el que
no hay afectacin del estado excitado sino que la
interaccin ocurre con el estado base del analito (S0).
En este caso se alteran los dos espectros.

La clasificacin en esttico y dinmico, y como se

definen, depende a veces del autor.
La temperatura influye pues el movimiento
molecular (y por tanto en las colisiones) vara segn
la temperatura.

4. Influencia del entorno molecular

(Influencia del medio)
El proceso de quenching obliga a usar reactivos muy
puros en este mtodo.
Una forma de eliminar el quenching es diluyendo
pero.(lmite de deteccin)
El quenching tiene una ventaja, es posible
determinar cuantitativamente algunas sustancias
que son quenchers a travs del grado en que
amortiguan la seal de fluorescencia de una especie
fluorescente dada. Quenching que aumenta con la
concentracin del quencher.

4. Influencia del entorno molecular

(Influencia del medio)
Esto est definido por la ecuacin de Stern-Volmer.
Ecuacin de Stern-Volmer:

Donde:

0
= 1 +

I0F = seal de fluorescencia de F en ausencia de Q (el

analito)
IF = seal de fluorescencia de F en presencia de Q (el
analito)
K = constante de quenching
CQ = Concentracin del analito (Q)

4. Influencia del entorno molecular

(Influencia del medio)
Como se procede y curva de calibracin.
(Calibracin ecuacin Stern-Volmer)

b) Efecto de O2 disuelto y de tomos pesados:

Tanto el oxgeno disuelto como la presencia de

tomos pesados (como el I, Br, Pb, etc, tanto
internos como parte de la molcula del analito
o externos como parte de la solucin en que
est presente el analito) son fuertes quenchers
de fluorescencia.

4. Influencia del entorno molecular

(Influencia del medio)
b) Efecto de O2 disuelto y de tomos pesados
(Cont.):
El mecanismo es complejo pero se piensa que
favorecen el CES y por tanto disminuye IF.
Se puede usar este fenmeno para determinar
estas especies a travs del quenching que ellos
producen en la fluorescencia de algunos
fluorforos (ecuacin de Stern-Volmer).
En el caso del oxigeno disuelto, puede eliminarse
desoxigenando la solucin.