Laboratorio de Qumica Orgnica Aplicada. Prctica 1.

Cromatografa en Placa Delgada y en Papel

LABORATORIO DE QUMICA ORGNICA APLICADA

PRCTICA # 1

CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA Y EN PAPEL

DETECCIN DE LOS COMPONENTES EN MEZCLAS

OBJETIVOS

Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de:

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Separar adecuadamente los componentes de una mezcla de compuestos poco polares por cromatografa en
capa delgada.
Separar los componentes de una mezcla de compuestos polares por cromatografa en papel.
Identificar los componentes de una mezcla, teniendo muestras de comparacin adecuadas.
Determinar el Rf de los compuestos para unas condiciones dadas.
Utilizar posteriormente estas tcnicas para aplicaciones como: determinar la pureza de un compuesto, el
avance de una reaccin, la identidad o la diferencia de compuestos y de fracciones cromatogrficas.
Explicar los conceptos tericos fundamentales en los que se basan estas tcnicas.

INFORMACIN GENERAL

Mtodos cromatogrficos

Los mtodos cromatogrficos son mtodos de separacin que involucran la transferencia reversible de un
compuesto que est adsorbido en una fase estacionaria (adsorbente) a una fase mvil (disolvente) que fluye a travs
de la fase estacionaria.
La separacin surge de las interacciones mutuas de componentes de una muestra, disolvente y adsorbente. El
adsorbente est presente en un gran exceso, con una gran superficie y con sitios polares capaces de unir
reversiblemente pequeas concentraciones de sustancias por un proceso esencialmente electrosttico. El disolvente
compite con los componentes de la muestra por los sitios de unin. Estos componentes son desplazados reversible
y continuamente en la direccin del flujo del disolvente. El proceso descrito puede escribirse como un equilibrio
competitivo en donde hay una particin de los componentes entre la fase estacionaria y la fase mvil:
componentes-adsorbente

disolvente-adsorbente

componente-disolvente

Entre ms polar sea un compuesto, ms fuertemente se adsorbe en la fase estacionaria, por lo que su migracin a lo
largo de ella es menor, siendo eludo (arrastrado) ms lentamente por la fase mvil, que los compuestos menos
polares. De este modo, la separacin selectiva de los componentes de una muestra, por cromatografa, se debe a las
diferencias en la migracin de los componentes individuales a lo largo de la fase estacionaria.

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En la cromatografa en fase lquida se usa una fase mvil (lquida) y una fase estacionaria (slida), siendo los
adsorbentes ms comunes la slica gel (SiO2.H2O), almina (A2O3) y celulosa.
La distribucin de los componentes entre la fase slida y lquida es determinada, adems de por la polaridad propia
de cada compuesto, por el grado de actividad del adsorbente (el cual depende principalmente del grado de
hidratacin y de la polaridad del disolvente).
El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un cromatograma es la polaridad
del disolvente. Una lista de los disolventes ms usados en los diferentes tipos de cromatografa, en orden de
polaridad creciente, se indica en la Tabla 1. Entre ms polar sea un disolvente, ms rpido es el movimiento de los
compuestos y menos efectiva la separacin.
Menos polar

Ms polar

Hexano
Tolueno
Cloruro de metileno
Cloroformo
ter
Acetato de etilo
Acetona
Propanol
Etanol
Metanol
Agua
cido actico

Tabla 1. Disolventes comunes para cromatografa de lquidos

Aspectos Comunes a la Cromatografa en Placa Delgada y a la Cromatografa en Papel

Las bases tericas de la separacin de mezclas por cromatografa en papel y en capa delgada (o en capa fina,
conocida tambin como TLC por sus siglas en ingls: thin layer chromatography) son las mismas que las de la
cromatografa en columna. As, los compuestos menos polares se unen (adsorben) con menos fuerza al adsorbente
(fase estacionaria) que los ms polares, por lo tanto, se mueven ms rpidamente cuando la mezcla se eluye con
algn disolvente (fase mvil). Los disolventes polares movern los componentes de la mezcla ms rpidamente que
los disolventes menos polares. Si la polaridad de los disolventes es demasiado alta, todos los componentes se
arrastrarn con el disolvente y no habr separacin.
La principal diferencia de las cromatografas en papel y en capa delgada con la cromatografa en columna es que,
en estos mtodos, el adsorbente se usa como una capa delgada sobre un soporte (vidrio, aluminio, plstico, etc. o
papel); como resultado, slo puede separase una cantidad pequesima de mezcla, aunque, por otra parte, la
separacin puede ser ms eficaz, ya que la relacin de cantidad de absorbente/muestra es mucho mayor. Debido a
esto, la cromatografa en columna es preparativa (permite separar cantidades apreciables de los componentes),
mientras que las cromatografas en placa fina y en papel son ms bien mtodos analticos. Otra diferencia
importante es que mientras que la fase mvil desciende por gravedad en la cromatografa en columna, en las de
capa delgada y en papel asciende por capilaridad.
Desde el punto de vista de la tcnica, la cromatografa en placa fina es muy similar a la cromatografa en papel, sin
embargo, desde el punto de vista terico hay una diferencia importante entre ellas. En la cromatografa en papel,
ste es solamente el soporte; el adsorbente realmente es el agua, proveniente del disolvente y de la atmsfera, que
es absorbida en la celulosa y forma una pelcula que adsorbe los compuestos polares, actuando como la fase
estacionaria, mientras que los otros disolventes de la mezcla actan como la fase mvil. Es por esto que la

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cromatografa en papel, desde el punto de vista terico se clasifica como cromatografa lquido-lquido, mientras
que las cromatografas en columna y en placa delgada son clasificadas como cromatografas slido-lquido .
No obstante esta diferencia, que pasa desapercibida en la aplicacin, la tcnica general para correr un
cromatograma en ambos tipos de cromatografa es muy similar. En ambas se aplican, usando micropipetas o tubos
capilares muy finos, cantidades pequesimas de una o varias muestras como manchas en un extremo de la placa ya
preparada o del papel. Cuando el disolvente de dilucin se ha evaporado, la placa o la hoja se colocan
verticalmente en un recipiente cerrado, que contiene el disolvente o la mezcla de disolventes elegidos como fase
mvil (eluyente); la orilla que contiene las aplicaciones se coloca hacia abajo. La fase mvil que est en la parte
inferior de la cmara la satura y asciende por capilaridad por la fase estacionaria, permitiendo a los componentes de
las mezclas moverse, arrastrados por el disolvente, a diferentes alturas dependiendo de sus diferentes polaridades.
Cuando el disolvente ha llegado casi al extremo superior, se saca la hoja o placa, se marca la altura a la que lleg el
disolvente y se deja evaporar ste. Los componentes individuales pueden entonces ser detectados como manchas
separadas a lo largo de la placa o del papel como se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Un cromatograma tpico, ya desarrollado

Slo puede lograrse la separacin exitosa de los componentes de una mezcla si la seleccin del eluyente es la
adecuada. Si el disolvente no es lo suficientemente polar para mover los componentes de la mezcla, habr muy
poca o ninguna separacin. En cambio, si el disolvente es demasiado polar todos los componentes se movern
fcilmente y el resultado nuevamente ser poca o ninguna separacin. Si una mezcla ya ha sido separada antes,
generalmente se indicar un eluyente adecuado. Cuando las mezclas son nuevas, el elegir el disolvente adecuado
generalmente se hace por prueba y error. Para mezclas poco polares se pueden obtener buenos resultados con
mezclas de hexano con diferentes proporciones de tolueno, cloruro de metileno y ter. Los compuestos ms polares
pueden requerir proporciones variables de acetato de etilo, acetona, metanol y hasta agua.
Un modo rpido y efectivo para determinar un buen eluyente, consiste en aplicar la mezcla en varias manchas
pequeas, separadas entre si 1.5 cm. por lo menos, en una placa de TLC o en un trozo de papel filtro (Whatman
No. 1 o equivalente). El disolvente a tratar se absorbe por capilaridad en una micropipeta y se toca una ligera y
rpidamente una de las manchas. Al extenderse el frente del disolvente en un crculo hacia afuera, los componentes
de la mezcla tambin se movern hacia afuera, formando crculos concntricos. Lo adecuado o no del eluyente
podr juzgarse de la apariencia de estos anillos. Este procedimiento se repite en otra mancha con un nuevo
disolvente, hasta que se encuentre el eluyente adecuado. La Figura 2 ilustra lo que se podra encontrar con varios
disolventes.

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Figura 2. Mtodo de anillos concntricos para probar disolventes para cromatografa

Para cada uno de los componentes ya separados de las mezclas puede calcularse un parmetro que es la relacin
frontal o Rf el que se define como la distancia recorrida por un compuesto (a) entre la distancia recorrida por el
disolvente (b), este valor es una constante slo para las mismas condiciones y ofrece cierta utilidad relativa para
establecer comparaciones entre componentes de placas distintas, corridas en las mismas condiciones.
Rf = a / b
As, mientras ms avance un componente con la fase mvil, ms alto ser su valor de Rf que siempre, por su misma
definicin, estar en el rango de 0.0 a 1.0. En la cromatografa en papel, la distancia que ha viajado cada
componente se mide desde la parte superior de la mancha aplicada; en la cromatografa en capa delgada se mide
desde el centro de la mancha. Si los componentes no corren uniformemente, sino que se desplazan formando una
cola, el Rf debe reportarse como un rango de valores.
Algunos Aspectos ms Especficos de la Cromatografa en capa delgada
Para la cromatografa en capa delgada se utiliza una placa de vidrio, aluminio ciertos plsticos u otros materiales
inertes cubierta por un slo lado con una capa delgada del adsorbente, comnmente, slica gel. Las placas pueden
prepararse por inmersin, utilizando pares de portaobjetos de vidrio y una suspensin de slica gel en cloroformo,
la tcnica de preparacin es sencilla pero requiere cierta habilidad para que las placas tengan la calidad necesaria.
Esta tcnica tiene la ventaja de que el cromatograma se corre en muy poco tiempo (2-10 minutos) y emplea
cantidades muy pequeas de material (2-20 g). La principal desventaja es que este tipo de cromatografa no es
muy adecuada para trabajar en una escala mayor. Se pueden preparar placas de 1 m de longitud para realizar
separaciones de hasta 0.5 g de mezcla, aplicando la muestra como una lnea horizontal, no como una mancha, y
despus del desarrollo del cromatograma, puede rasparse la zona de adsorbente donde se encuentra el componente
de inters, extraerlo con algn disolvente adecuado, filtrar y evaporar. Sin embargo, se requiere equipo especial
para que la aplicacin del adsorbente en la placa sea uniforme y de una gran habilidad para la aplicacin adecuada
de la muestra.
Los principales usos de la cromatografa en capa delgada son:
a) Determinar la identidad de dos sustancias. Si dos sustancias aplicadas a la misma placa de TLC dan manchas
idnticas con igual Rf , puede tratarse de la misma sustancia. Si la posicin de las manchas no es igual, puede
afirmarse con certeza que las sustancias no son idnticas. En cambio, es posible que dos sustancias de estructura
muy parecida, pero no idntica, tengan Rf iguales en una placa.

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b) Determinar el nmero de componentes en una mezcla. La TLC permite analizar de forma rpida y fcil mezclas
de reaccin crudas, o extractos de una planta, o algn producto comercial. Conociendo el nmero, la cantidad y la
polaridad relativa de los componentes, se facilita planear los pasos subsecuentes de anlisis y purificacin de estas
sustancias.
c) Seguir el curso de un reaccin qumica. Si se toman muestras de la mezcla de una reaccin de tiempo en tiempo
mientras sta se lleva a cabo, es posible observar la desaparicin de los reactivos y la aparicin de productos. Se
pude encontrar as el tiempo de reaccin ptimo, o el efecto de los cambios en la temperatura, las concentraciones,
los catalizadores o los disolventes, sin necesidad de aislar el o los productos.
d) Determinar la eficacia de una purificacin. La eficiencia de una destilacin, cristalizacin, extraccin y otros
mtodos de separacin y purificacin pueden monitorearse, con la salvedad de que la presencia de una sola mancha
no es garanta total de que la sustancia est pura.
e) Determinar las condiciones ms adecuadas para llevar a cabo una separacin por cromatografa en columna. Ya
que el adsorbente que se usa en ambas tcnicas puede ser el mismo, se puede encontrar el disolvente o mezcla de
disolventes para tener una separacin adecuada de los componentes de una mezcla.
f) Monitorear una cromatografa en columna. Si los compuestos de una mezcla que se separa no son coloridos, las
diversas fracciones colectadas pueden analizarse por TLC para conocer su composicin.
Ya que cantidades muy pequeas de sustancia estn expuestas en una superficie abierta, el uso de la cromatografa
en capa delgada est limitado a compuestos relativamente poco voltiles. La cromatografa en capa delgada no se
usa para determinaciones cuantitativas ya que ni la sensibilidad ni el poder de resolucin son muy altos.
Para visualizar los componentes en una mezcla, generalmente es necesario revelar la placa ya desarrollada.
Usualmente se revela con un reactivo general como vapor de yodo. Casi todos los componentes absorben yodo o
reaccionan con l para formar manchas violeta o caf en la placa. Sin embargo, la intensidad relativa de las
manchas no es una indicacin exacta de las cantidades de los compuestos presentes, ya que el grado de reaccin
vara.
Otro mtodo para visualizar las manchas es la iluminacin de la placa con una lmpara de ultravioleta. Muchas
sustancias, particularmente los compuestos aromticos, mostrarn una fluorescencia brillante, que puede tener un
color caracterstico, sin embargo, los compuestos que no absorben en el ultravioleta cercano no sern revelados.
Una tercera tcnica, mucho mejor, requiere el uso de una capa adsorbente que contiene trazas de un colorante
fluorescente de forma que, cuando la placa se observa con luz UV a 254 nm (onda corta), los compuestos
fluorescentes aparecern como manchas brillantes en un fondo con fluorescencia verde claro. Los otros compuestos
aparecern como manchas obscuras, ya que absorben la luz ultravioleta impidiendo la fluorescencia del colorante.
Para la identificacin de un compuesto especfico en una mezcla, en una misma placa se compara el
comportamiento de la mezcla y el de una muestra autntica del compuesto. Un compuesto dado tendr un
determinado valor de Rf bajo las condiciones dadas (cantidad de muestra, disolvente, temperatura, espesor de la
capa, etc.).
Sin embargo, para trabajo cualitativo, las condiciones no estn rgidamente controladas y la movilidad del
compuesto en las placas corridas a diferentes tiempos es poco reproducible, por lo que la comparacin de las
muestras en la misma placa es esencial. Adems de que el Rf de un compuesto conocido coincida con el de alguno
de los componentes de la mezcla, su color o fluorescencia caracterstica pueden ser de gran ayuda para la
identificacin.
En esta prctica utilizaremos placas de TLC preparadas comercialmente. Estas placas con base de aluminio o de
tereftalato de polietileno estn cubiertas de una capa uniforme de slica gel y cido poliacrlico como aglutinante;
adems la slica gel contiene un indicador fluorescente. La capa de adsorbente de estas placas es muy uniforme y
mide 100 m de grosor, lo que permite resultados muy consistentes. Estas placas miden 20 x 20 cm y pueden

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utilizarse completas o, dado que su costo es elevado, pueden cortarse con tijeras al tamao deseado dependiendo
del tipo de trabajo que se est realizando o del tamao de las cmaras de desarrollo de los que se disponga.
Las muestras para hacer la cromatografa en placa fina consistirn:
a) En una serie de compuestos puros conocidos, especficamente se han seleccionado compuestos aromticos
nitrados, que servirn de referencia para mezclas problema conteniendo estos compuestos y en las que debern de
identificarse los componentes de la mezcla.
b) En tintas permanentes y tintas lavables de plumones con punta de fieltro, para las que se usarn los disolventes
adecuados para correr la cromatografa y poder separar las mezclas de colorantes que los constituyen y comparar
los componentes de los diferentes colores.
Algunos Aspectos ms especficos de la Cromatografa en papel
La cromatografa en papel puede realizarse en una hoja de papel filtro Whatman No. 1 u otro papel similar. Esta
tcnica tambin utiliza cantidades muy pequeas de la muestra pero, al contrario de la cromatografa en placa
delgada, tiene la desventaja de que el cromatograma requiere un tiempo prolongado para correr; dependiendo del
tamao de la cmara. Para frascos de unos 12 cm de dimetro por 15 de alto, el tiempo de desarrollo de la placa
puede ser de 40 min. a una hora.
Este tipo de cromatografa se utiliza para la separacin de sustancias muy polares que requieren el uso de eluyentes
como son mezclas de agua, alcoholes, cido actico, hidrxido de amonio u otros disolventes de polaridad
semejante. Las sustancias que pueden separarse con este mtodo son: cidos carboxlicos, azcares, aminocidos y
otros compuestos bioqumicos. Por esto, este mtodo complementa a la cromatografa en placa fina que no es til
para separar este tipo de compuestos. En forma similar a la TLC, la cromatografa en papel puede utilizarse para
determinar pureza, identificar, seguir el curso de una reaccin, etc. Su aplicacin es mucho menos generalizada por
lo limitado de los tipos de compuestos que permite separar y por el tiempo mucho mayor que requiere.
En esta parte de la prctica se separarn los colorantes contenidos en un producto comercial alimenticio: un polvo
comercial, con bajo contenido de azcar, utilizado para preparar agua de sabores. En el mismo cromatograma se
compararn con colorantes comerciales de alimentos y con la tinta de algunos de los plumones solubles en agua,
etiquetados como no txicos y que, por lo tanto, es lgico suponer que contengan nicamente algunos de los
colorantes permitidos en alimentos.
Colorantes en alimentos
Aunque muchos alimentos naturales tienen color, actualmente una gran parte de lo que comemos es colorido
debido a los colorantes sintticos que los fabricantes les agregan y que pretenden hacer ms atractivo el producto.
Por ejemplo, un consumidor estar ms dispuesto a comprar naranjas si la cscara es naranja y no verde o amarilla,
que es su color ms natural. La margarina no se vendera tan bien si no tuviera el color amarillo que se le aade
para darle ms parecido con la mantequilla. Las personas esperan que una bebida de fresa sea roja, una de uva sea
prpura y una de pia sea amarilla, aunque el sabor de estos productos tambin sea artificial y totalmente
independiente del color.
La prctica de agregar agentes colorantes a los alimentos no es reciente, pero hasta el siglo XIX se utilizaron slo
productos naturales de origen biolgico, ya que por lo general los productos minerales coloridos tienen una
toxicidad muy elevada. Por ejemplo, el verde se obtena de la clorofila, el caf del azcar quemada y de la corteza
de rboles, el azul de la cscara de la uva, el amarillo de la zanahoria, etc.
La era de los colorantes sintticos se inici en 1856 cuando Perkin, accidentalmente, prepar el primer colorante
sinttico, el malva, a partir del alquitrn de hulla. Al darse cuenta del enorme potencial de este descubrimiento,
poco despus se sintetizaron muchos otros colorantes que, poco a poco, se empezaron a incorporar en los
alimentos, sustituyendo a los naturales. La razn fue que los productos artificiales tienen mayor estabilidad, el color
es ms intenso, la variedad de colores que pueden emplearse es mayor, adems de que su costo es mucho menor.

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Actualmente el 90% de los colorantes que se emplean en la industria alimentaria son sintticos y su consumo per
capita est en aumento.
Desafortunadamente, algunos de estos colorantes han resultado txicos y se han retirado del mercado. En los
ltimos aos se han retirado tres: el rojo No. 2, que por mucho tiempo fue el colorante ms utilizado para
alimentos, el rojo No. 4, usado en las cerezas maraschino, y el negro carbn, usado en golosinas. En aos
anteriores se haban prohibido otros colorantes, debido a que eran txicos, causaban defectos en el desarrollo fetal,
enfermedades del corazn o cncer.
Actualmente slo estn aceptados ocho colorantes como aditivos de productos alimenticios y sus estructuras se
muestran en la Tabla 1. El ltimo miembro de este grupo es el rojo No. 40, que tom el lugar de rojo No. 2. Antes
de ser aprobado, este colorante sufri las pruebas ms estrictas que se han aplicado a un aditivo alimenticio y
seguramente cualquier otro colorante que quiera emplearse con este fin deber sujetarse a las mismas pruebas.

Figura 3. Los ocho colorantes de alimentos actualmente aprobados por la FDA

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T CNICA:
a) Preparacin de micropipetas
Se deben preparar varias micropipetas para aplicar las muestras lquidas o soluciones a la placa o al papel. El
nmero necesario es igual al nmero de mezclas y sustancias puras que se van a analizar. Se aplicarn
aproximadamente 40 muestras, si hay seis equipos, cada equipo deber preparar 6-8 microcapilares.
Para prepararlas siga el siguiente procedimiento (ver Fig. 4):
1. Sostenga un tubo capilar horizontalmente en ambos extremos y coloque la porcin media en la flama de un
mechero.
2. Rote el tubo capilar en la flama hasta que la porcin media se suavice.
3. Quite el capilar de la flama e inmediatamente estire, jalando de los dos extremos 4-5 cm hasta que el tubo tenga
un dimetro de un dcimo del original.
4. Marque el tubo en el centro de la zona angosta con una lima y rompa con cuidado para obtener dos micropipetas.
Repita estos pasos para obtener tantas micropipetas como necesite.
Si dispone de pocas micropipetas, stas pueden reutilizarse todos las veces que sea necesario, teniendo cuidado,
antes de cambiar de muestra y para no contaminarla, de enjuagar la micripipeta con un disolvente adecuado (como
acetona para los compuestos nitrados y agua o etanol para colorantes de alimentos) y eliminar por capilaridad todo
el lquido, apoyando la punta en una toalla de papel.

Figura 4. Pasos en la preparacin de micropipetas

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b) Aplicacin de la muestra
Corte la placa de TLC o el papel al tamao adecuado para las celdas de cromatografa de las que se disponga. En
nuestro caso, las celdas son frascos de 8 cm. de alto por 4 cm. de dimetro para las placas, que sern de 3 cm. de
ancho por 7 cm. de alto; para la cromatografa en papel los frascos de boca ancha son de 15 cm. de alto por 10 cm.
de dimetro, por lo que el papel deber cortarse 24 cm. de ancho por 12 cm. de alto. No toque con los dedos la
superficie del adsorvente o el papel. Marque suavemente con lpiz una raya aproximadamente a 1 cm del borde
inferior en las placas, cuidando de no romper el adsorbente, y 1.5 cm en el papel (Figs. 5 y 6).
La muestra a aplicar puede disolverse en cualquier disolvente voltil, como acetona o cloruro de metileno. Ponga
una pequea cantidad de la muestra (aproximadamente 5 mg) en un tubo de ensaye lo ms pequeo posible y aada
unas gotas del disolvente para preparar una solucin concentrada. Sumerja una micropipeta en la solucin y luego
toque muy ligeramente con la punta, sobre la raya marcada, una placa o papel de cromatografa (fig. 6). La
solucin no debe extenderse a un dimetro mayor de 1 mm.
Si la muestra est demasiado diluida es necesario aplicar mayor cantidad de muestra. Para una investigacin
preliminar conviene hacer varias manchas con una, dos o tres aplicaciones para encontrar el volumen adecuado de
solucin a aplicar. Para esto, deje secar completamente la primera aplicacin y despus toque otra vez con el
capilar exactamente en el mismo lugar, las veces que sea necesario, dejando secar cada vez. Es importante no
transferir cristales de la muestra a la placa y no permitir que se formen al aplicar la muestra ya que esto causa
manchas alargadas al correr la placa, impidiendo que haya una buena separacin (Fig. 5). Dos errores comunes al
hacer la aplicacin son el permitir que la mancha se extienda demasiado y el aplicar cantidad excesiva de muestra.
Generalmente se aplican varias manchas en el mismo cromatograma. La separacin entre las manchas no debe ser
menor de 0.7 a 1.0 cm. en TLC y de 1.2 a 1.5 cm. en papel. Esto se debe a que al desarrollar el cromatograma las
manchas se extienden. Cuando se usan placas del tamao de un portaobjetos, se pueden aplicar fcilmente tres
manchas en una sola placa y cuatro manchas es el mximo. En la cromatografa en papel, una vez aplicadas las
muestras, el papel se enrolla en crculo y se engrapa evitando que los extremos se superpongan (ver Fig. 7c).

Figura 5. Placas de TLC con manchas

normales y sobrecargadas

Figura 6. Aplicacin de muestras en un

cromatograma con una micropipeta

c) Seleccin del eluyente para el desarrollo del cromatograma

La eleccin del disolvente es crucial para el desarrollo del cromatograma y depende de la naturaleza de los
compuestos que se van a separar. En nuestro caso se conocen los eluyentes que van a utilizarse en los diferentes

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experimentos. Cuando se desconoce cual es el eluyente adecuado, puede utilizarse el mtodo de anillos
concntricos ya explicado.
Tambin puede empezarse eluyendo con cloroformo o cloruro de metileno, el cual es un disolvente til para una
amplia variedad de compuestos. Si la migracin de las manchas es demasiado lenta, puede aadirse de un 5 a un
10% de acetato de etilo al cloroformo para aumentar la polaridad. Si la migracin es demasiado rpida, habr que
cambiar a un disolvente de polaridad menor. La separacin ptima por cromatografa de compuestos similares
usualmente se logra cuando los valores de Rf son de 0.3 a 0.5, ya que las manchas se vuelven ms difusas entre ms
lejos se mueven.
d) Preparacin de la cmara y desarrollo del cromatograma
Para la cromatografa en placa fina se cubre el interior de la celda (o frasco) con papel filtro, cortado al tamao
adecuado, de tal modo que cubra casi todo el interior, pero quedando abierto por lo menos unos 2 cm. para permitir
observar el frente del disolvente y el desarrollo del cromatograma [ver fig. 7 a) y b)]. El objeto de esto es facilitar
que la cmara se sature con el vapor del disolvente acelerando el desarrollo del cromatograma. Este forro puede
eliminarse de la cromatografa en placa fina si los frascos no son muy grandes y no se requiere para la
cromatografa en papel [ver fig. 7 c)].
Se pone en la celda el disolvente adecuado, en cantidad suficiente para alcanzar una altura de aproximadamente 0.5
cm (ya impregnado el forro de papel filtro, si se usa, para la cromatografa en placa fina). El cromatograma ya
preparado se baja cuidadosamente, con el extremo con la muestra hacia abajo, dentro de la cmara o frasco, el cual
se tapa. El nivel del disolvente no debe alcanzar a las manchas de muestra (Fig. 6). Cuando el disolvente ha
subido por capilaridad hasta aproximadamente medio cm. de la parte superior, se saca la placa o el papel el cual se
desengrapa. Se marca el sitio hasta donde subi el disolvente y se deja secar al aire. Si los valores de Rf son
demasiado bajos, debe repetirse el desarrollo con el disolvente ms polar y, si son demasiado altos con un
disolvente menos polar.

Figura 7. Cmaras de cromatografa: de placa delgada:

a) para portaobjetos b) para placa de 20 x 20 cm c) para cromatografa en papel

e) Cromatografa en papel
La mezclas que se analizarn con esta tcnica son: Polvo para preparar bebidas (Kool-Aid) de diferentes sabores
para determinar la combinacin de colorantes empleada en cada uno de estos productos, colorantes comerciales
para alimentos, tintas de plumones no txicos y algunos de los colorantes puros.
Prepare 1 frasco grande como se indic en el inciso d). La mezcla de disolventes que se utilizar para correr el
cromatograma es 60-70 % de isopropanol y 40-30 % de agua (en volumen).

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Todas las soluciones de colorantes estn ya preparadas. Se prepararon colocando una pequea cantidad de polvo de
Kool-Aid de cada sabor en tubo Eppendorf etiquetado y aadiendo agua caliente a cada tubo, gota a gota,
mezclando hasta que el polvo se disolvi. Los colorantes comerciales se prepararon poniendo una gota de cada
colorante comercial en tubo Eppendorf etiquetado y aadiendo unas gotas de agua. Prepare para cada muestra un
capilar o micropipeta como se indic en el inciso a).
Prepare el cromatograma en la siguiente forma: corte 1 seccin de papel filtro de 12 x 24 cm. o del tamao
adecuado para la cmara donde se har el desarrollo del cromatograma. Asegrese de marcar, con lpiz, la lnea
de aplicacin, el origen de cada mancha y un nmero o letra de identificacin.
Usando una micropipeta para cada muestra, aplique las muestras de Kool-Aid al papel usando el procedimiento
explicado en el inciso b). Las manchas deben estar a 1.5 cm de distancia una de otra y no deben tener ms de 1-2
mm de dimetro. Aplique tambin los colorantes comerciales y marque cada aplicacin. Por ltimo, con algunos de
los plumones no txicos haga algunas otras aplicaciones; tenga cuidado de apoyar muy ligeramente la punta del
plumn para evitar que la mancha se extienda. Marque todas las manchas.
Cuando las manchas estn secas, enrolle y engrape el papel, sin superponer las orillas. Para desarrollar el
cromatograma ponga el papel enrollado en el frasco, sin que toque las paredes, y tpelo.
Cuando el disolvente llegue a la parte superior del papel, saque el cromatograma, marque el frente del disolvente,
desengrape y deje secar. Calcule, midiendo desde la parte superior de la mancha, el Rf de cada una de las manchas
separadas, anote si los productos comerciales contienen una mezcla de compuestos o son puros.
Incluya sus cromatogramas en el reporte.
f) Separacin e identificacin de compuestos aromticos nitrados por cromatografa en placa delgada
Coloque en frascos pequeos, previamente numerados, cantidades muy pequeas (unos 5 mg), de los siguientes
compuestos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

m-nitroanilina
p-nitroanilina
o-nitroanilina
2-metil-5-nitroanilina
o-nitrofenol
m-nitrobenzaldehido
m-dinitrobenceno
2,4-dinitrofenilhidracina
2,4-dinitroclorobenceno
2,4-dinitrofenol

Las soluciones de las muestras ya estn preparadas, se disolvi cada una de las muestras en aproximadamente 0.5
mL de acetona; la totalidad de la muestra debe estar en solucin. Prepare para cada muestra un capilar o
micropipeta como se indic en el inciso a).
Cada alumno recibir una mezcla problema, con dos de estos compuestos disueltos en acetona y etiquetada con una
letra.
Coloque en una placa los compuestos puros (1), (2), (3) y (4); en una segunda placa los compuestos (4), (5), (6) y
(7); en la tercera placa los compuestos (7), (8), (9) y (10); en una cuarta placa los compuestos (10), el problema y
repita los dos anteriores en los que la aplicacin haya sido menos correcta.
Prepare la cmara con un frasco chico, sin forrarlo con papel filtro. Desarrolle las placas con cloruro de metileno,
Si las manchas no se distinguen, son muy grandes o se juntaron, repita las placas las veces que sea necesario.

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Calcule, midiendo desde el centro de la mancha, el Rf de cada uno de los compuestos y antelos; en caso de que
alguno resulte demasiado bajo, repita esa placa desarrollndola con cloroformo o con una mezcla de cloruro de
metileno-acetato de etilol (9:1). Si el Rf es muy alto (cercano a 1.0) repita usando una mezcla de hexano-cloruro de
metileno (8:2).
Dado que estos compuestos son coloridos, deben ser visibles a simple vista, sin embargo, como la concentracin es
muy baja, las manchas se podrn observar mejor revelando la placa, ya seca, con luz ultravioleta de onda corta
(254 nm) o colocndola en un frasco tapado en el que se hayan puesto unos cuantos cristales de yodo. Despus de
un tiempo las manchas se harn claramente distinguibles.
Con base en el Rf de cada componente de su problema y el color de la fluorescencia en UV, prepare y desarrolle
placas el problema y con los compuestos puros de referencia que considere adecuados, hasta estar seguro de la
identidad de los componentes de la mezcla.
Si lo desea puede preparar la mezcla de los compuestos identificados y correrla en una placa junto con el problema.
El comportamiento de ambas mezclas debe ser idntico (en el Rf, no en la relacin cuantitativa de los
componentes).
En las hojas de resultados incluya sus placas, indicando los compuestos de los que se trata.
g) Separacin de tintas permanentes por cromatografa en placa delgada
Este experimento se realiza un placas de cromatografa en placa delgada (TLC), pero por la polaridad de los
eluyentes es similar a la cromatografa en papel de los colorantes de alimentos. Sin embargo, como en las tintas
permanentes, caracterizadas por su baja solubilidad en agua, no hay restricciones de la FDA, la seleccin de
colorantes posibles es mucho ms amplia y por lo tanto sus polaridades.
En varias de las placas de cromatografa cortadas a un tamao de 3 x 8 cm. marque con lpiz, suavemente una lnea
a 1 cm. de la orilla inferior. Seleccione tantos colores como pueda. Antes de aplicar las muestras en la placa, pruebe
los plumones de punta de fieltro en un papel filtro, aplicando ligeramente para que las manchas tengan 1-2 mm. de
dimetro. Aplique varias muestras en una placa, con separaciones entre las manchas de no menos de 0.7 cm. Deje
secar totalmente.
Prepare la cmara de desarrollo, sin forrarla de papel, con etanol de 96 o con ana solucin de etanol absoluto con
5 % de agua. Asegrese de que la altura del disolvente en la cmara sea menor de 0.5 cm. para prevenir que las
manchas se disuelvan en el disolvente e introduzca la placa. Tape la cmara y espere hasta que el disolvente suba
casi hasta la orilla superior. Marque el nivel del disolvente con un lpiz. Deje secar. Calcule los valores de Rf y
registre sus resultados en las hojas de reporte. Compare las complejidades de las diferentes tintas e indique si
algunas tienen los mismos colorantes.
Tambin puede hacerse esta separacin utilizando cromatografa en papel, eluyendo con una mezcla de acetato de
etilo, cido frmico al 90 % y agua en proporciones 7:2:1 en volumen.

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RESULTADOS.
a) Cromatografa en papel. Colorantes de alimentos

COLORANTES
PUROS (85 %)

Rojo Allura No. 40

Rojo Eritrosina No. 3
Azul Cielo No. 1
Amarillo Tartrazina No. 5
Amarillo Sunset No. 6
Rojo Carmoisina No. 5
Rojo Punceau No. 6

SOLUCIONES
(GOTAS)

Colorante comercial azul

Colorante comercial rojo
Colorante comercial amarillo
Colorante comercial verde

POLVO
VEGETAL

Verde Esmeralda
Amarillo Huevo
Azul Claro
Rojo Eggea

COLORANTE
EN PASTA
PARA BETN

Verde Hoja
Rojo Navidad (claro)
Rojo Navidad (obscuro)
Azul Cielo
Violeta
Caf Nuez (Nogal)
Negro

REFRESCOS
EN POLVO
(KOOL-AID)

MUESTRA

Sabor Pia
Sabor Uva
Sabor Fresa
Sabor Cola
Sabor Manzana
Sabor Naranja

PLUMONES
NO TXICOS
en base agua

TIPO

Color
Color
Color
Color
Color
Color
Color

COMPONENTES COLORIDOS SEPARADOS

COLOR y R f
COLOR y R f
COLOR y R f

Conclusiones
1. Se encuentran los colorantes aprobados por la FDA en las muestras separadas?
2. Se encuentran otros colorantes diferentes en los plumones no txicos?
3. Cmo se compararan las mezclas de colorantes en las bebidas comerciales con las de los colores comerciales?

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b) Cromatografa en placa delgada. Identificacin de compuestos aromticos nitrados

1.

Datos experimentales

COMPUESTOS

Rf

FASE MOVIL OPTIMA

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

m-nitroanilina
p-nitroanilina
o-nitroanilina
2-metil-5-nitroanilina
o-nitrofenol
m-nitrobenzaldehido
m-dinitrobenceno
2,4-dinitrofenilhidracina
2-4-dinitroclorobenceno
2,4-dinitrofenol

2.

Composicin del problema (No.

3.

Dibuje las placas corridas, indicando los nmeros o letras correspondientes a las sustancias de referencia o
problemas.

):

c) Cromatografa en placa delgada. Separacin de colorantes en tintas permanentes

Reporte los colores y el Rf de los diferentes componentes separados de las tintas. Compare si en los plumones de
color igual, pero de diferentes marcas, las mezclas de pigmentos son iguales.

PLUMONES
PERMANENTES

TIPO

MUESTRA

COMPONENTES COLORIDOS SEPARADOS

COLOR y R f
COLOR y R f
COLOR y R f

Color
Color
Color
Color
Color
Color
Color
Color

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PREGUNTAS DE PRELABORATORIO
1.

Explique por qu una mezcla puede separase por cromatografa.

2.

Cules son las diferencias fundamentales entre cromatografa en columna, en placa delgada y en papel?

3.

Mencione los principales usos, ventajas y desventajas de cada uno de estos tipos de cromatografa.

4.

Cmo se define, qu utilidad y qu limitaciones tiene la relacin frontal (Rf)?

1.

Observe las estructuras de los colorantes de la Fig. 3 e indique:

a) Qu grupos funcionales inicos hay en estas molculas y cul sera su funcin?
b) Cules son los sistemas conjugados en estas molculas que permiten que stas se exciten con radiacin
electromagntica en la regin del visible?

PREGUNTAS DE POSTLABORATORIO
1.

Si dos manchas tienen el mismo Rf, es esto prueba irrefutable de que se trata del mismo compuesto?

2.

Cul sera el resultado de los siguientes errores comunes al efectuar una cromatografa en capa delgada?
a) aplicacin de demasiada muestra.
b) disolvente de muy alta polaridad
c) disolvente de muy baja polaridad
d) disolvente demasiado alto en la cmara de desarrollo
e) olvidar sacar la placa de la cmara cuando el disolvente ha alcanzado la parte superior
f) placas de espesor disparejo o con cuarteadoras
g) aplicacin de cristales de muestra.

3.

Arregle en orden de polaridad creciente los nitrocompuestos aromticos estudiados. Trate de correlacionar la
polaridad observada con las caractersticas estructurales (ej. indique qu grupos daran mayor polaridad).

4.

Trate de correlacionar las estructuras de la Tabla 1 con los colorantes de alimentos separados. Arregle en orden
de polaridad creciente estos colorante. Trate de correlacionar la polaridad observada con las caractersticas
estructurales (ej., indique qu grupos o qu cromforos daran mayor polaridad).

5.

De acuerdo al color de cada una de las sustancias, ordnalas en orden creciente de la energa de la radiacin
electromagntica necesaria para excitar sus cromforos.

REPORTE
1.

Entregue las cromatoplacas en las que se apoy para la identificacin de los compuestos presentes en su
mezcla problema y las croamatografas en papel.

2.

Entregue la hoja de resultados.

3.

Responda las preguntas de post-laboratorio.

BIBLIOGRAFIA

E. Stall (Editor) Thin Layer Chromatography. A Laboratory Handbook. 2nd. De. Springer Verlag, New
York, 1969.

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Eaton, David C., "Laboratory Investigations in Organic Chemistry", McGraw-Hill, USA, 1989. pp. 127, 139151.

Mayo, Dana W., Pike, R. M. & Trumper Peter K., "Microscale Organic Laboratory with Multistep and
Multiscale Syntheses", 3rd. Ed., John Wiley, USA, 1994, pp. 97-98 y 103-104.

Wilcox, Jr. Charles F. & Wilcox Mary F., "Experimental Organic Chemistry. A Small-Scale Approach", 2
Ed.,Prentice-Hall, New Jersey, USA, 1995, pp. 122-127, 130-132 y 142-147.

Williamson, Kenneth L., "Macroscale and Microscale Organic Experiments", 2 Ed., Heath and Company,
USA, 1994, pp. 157-169.

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