SEQENCIAMENTO DE PEPTDEOS USANDO ESPECTROMETRIA DE MASSAS: UM GUIA PRTICO

Marcelo Delmar Cant e Emanuel Carrilho*

Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo, CP 780, 13560-970 So Carlos SP, Brasil
Nelson Arno Wulff
Fundo de Defesa da Citricultura, Av. Adhemar Pereira de Barros, 201, 14807-040 Araraquara - SP, Brasil
Mario Srgio Palma
Departamento de Biologia, Instituto de Biocincias de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, Av. 24 A, 1515, 13506-900
Rio Claro - SP, Brasil

Nota Tcnica

Quim. Nova, Vol. 31, No. 3, 669-675, 2008

Recebido em 6/10/06; aceito em 17/8/07; publicado na web em 19/3/08

PEPTIDE SEQUENCING USING MASS SPECTROMETRY: A PRACTICAL GUIDE. This paper introduces the basics of peptide
mass spectra interpretation applied to proteomics and is directed to chemists, biochemists and biologists. The manuscript presents
a well detailed protocol aiming to serve as a first choice guide for understanding peptide sequencing. The tutorial was elaborated
based on both a thorough bibliographic revision and the authors experience. In order to prove the applicability of the proposed
guide, spectra obtained on different instruments have been successfully interpreted by applying the presented rational.
Keywords: proteomic analysis; mass spectrometry; peptide sequencing.

INTRODUO
A anlise protemica, definida como sendo o conjunto de
metodologias analticas empregadas para caracterizar (quali e
quantitativamente) um proteoma, trata-se de uma rea interdisciplinar da cincia, a qual agrega principalmente qumica, biologia
e informtica. O sinergismo oriundo de tamanha interdisciplinaridade faz-se necessrio num cenrio onde se pretende estudar a
funo/comportamento dos genes com base nas identificaes das
protenas por eles expressas. Neste contexto, muitas vezes necessrio no somente determinar o conjunto de protenas presentes
em uma amostra, o que por si s algo bastante desafiador, mas
tambm caracterizar as inmeras e comumente presentes isoformas
das protenas, produtos de modificaes ps-traducionais sofridas
pelas mesmas e, por fim, como essas protenas interagem entre
si.1,2 Devidamente dimensionada a complexidade do assunto, a
espectrometria de massas (MS) emerge como uma tecnologia indispensvel para a interpretao da informao codificada pelos
genes, ou seja, o proteoma.
Uma das foras que impulsiona a protemica a habilidade de
usar dados de espectrometria de massas inerentes a peptdeos para
identificar protenas em bancos de dados. Para tal fim, dois tipos de
resultados so usados. O primeiro usa a informao relativa massa molecular dos peptdeos oriundos da digesto enzimtica (Peptide
Mass Fingerprint PMF), enquanto o segundo faz uso de resultados obtidos pela fragmentao de peptdeos individuais previamente
detectados.3
ESPECTROMETRIA DE MASSAS APLICADA ANLISE
PROTEMICA
Em linhas gerais, a MS uma tcnica capaz de determinar a
relao entre massa e carga (m/z) de espcies ionizadas em fase gasosa.2 Um espectrmetro de massas um instrumento constitudo
por uma fonte de ons, um analisador de massas, um detector e um
*e-mail: emanuel@iqsc.usp.br

sistema de aquisio de dados. As fontes de ionizao empregadas

em MS aplicada anlise protemica so Electrospray (ESI)4 e
MALDI (Matrix-Assisted Laser Desporption Ionization),5 tendo a
funo de ionizar (de maneira suave, preservando assim a estrutura
polipetdica) e transferir as espcies a serem analisadas para a fase
gasosa. Os analisadores de massas, como o prprio nome indica,
tm como funo bsica separar os ons formados de acordo com
suas relaes m/z. Diversos analisadores de massas, tais como,
quadrupolos, ion-traps (tridimensionais e lineares), time-of-flight
(TOF), Fourier-transform ion cyclotron resonance (FT-ICR), orbitrap,
entre outros, so comercialmente disponveis e cada um possui aspectos positivos e negativos, de acordo com o experimento planejado e o resultado experimental requerido. Estes analisadores podem
ser usados sozinhos e de maneira independente ou acoplados entre
si, dando origem a equipamentos classificados como hbridos, os
quais fazem uso das vantagens inerentes a cada anali-sador. Tais equipamentos permitem que experimentos em seqncia (tandem) sejam realizados, isto , sendo possvel detectar um determinado on e
posteriormente submet-lo a uma etapa de fragmentao. Uma vez
separados, esses ons so detectados por eletromultiplicadoras que
constituem os detectores mais largamente usados. Uma ilustrao
dos processos mostrada na Figura 1S em material suplementar
De maneira geral, possvel descrever um estudo protemico
empregando MS em seis etapas, descritas a seguir:
i) as protenas a serem analisadas devem ser primeiramente isoladas ou extradas de lisados celulares ou tecidos. Tal procedimento comumente emprega metodologias de extrao ou
fracionamento, definindo o sub-proteoma a ser estudado.
Como exemplo prtico pode-se citar uma rea que tem a cada
dia recebido maior ateno, a busca de biomarcadores para
doenas, fazendo uso da anlise protemica aplicada ao plasma sanguneo. A primeira e mais importante etapa consiste da
eliminao nas protenas mais abundantes do plasma, uma vez
que as 10 protenas mais abundantes no plasma humano
correspondem a aproximadamente 90% do contedo total. Assim, quando biomarcadores para doenas so o alvo do estudo
necessrio reduzir a quantidade das protenas altamente abun-

670

Cant et al.

dantes, que acabam interferindo na anlise.6

ii) Aps a etapa de purificao, o prximo passo converter a(s)
protena(s) isolada(s) em um conjunto de peptdeos. Isso feito
com o uso de enzimas que promovem a clivagem das protenas
em pontos especficos. Quando a anlise protemica realizada por meio da anlise de peptdeos oriundos da digesto
enzimtica de protenas, esse arranjo experimental recebe o nome
genrico de anlise protemica bottom-up.7,8 Mesmo considerando que os espectrmetros de massas podem determinar a
massa molecular de protenas intactas, existem inmeras razes que justificam o uso de peptdeos e no protenas para a
anlise protemica. Dentre essas razes esto: de forma geral,
protenas so difceis de manusear e degradam-se com facilidade, podendo ainda apresentar problemas de solubilidade.
Assim, em muitos casos faz-se necessria a adio de tensoativos que comprovadamente interferem com a anlise por MS,
uma vez que muitos desses componentes ionizam muito bem e
quase sempre esto presentes em excesso na amostra.
A sensibilidade dos espectrmetros de massas para a anlise
de protenas consideravelmente menor que para peptdeos.
Alm disso, se o interesse da anlise a identificao das protenas, informao inerente seqncia necessria, e nesse
sentido os espectrmetros de massas so mais eficientes para
obter informao estrutural de peptdeos que possuem at 20
aminocidos em comparao a protenas intactas. Entretanto
necessrio esclarecer que com o uso de espectrmetros de massas de ltima gerao, tal como o FT-ICR, possvel obter
informaes parciais da seqncia primria de protenas
intactas, que obviamente podem ser usada para fins de identificao ou anlise de modificaes ps-traducionais, num arranjo experimental referido como anlise protemica top down.8,9
iii) Os peptdeos obtidos podem ser separados por meio das tcnicas de cromatografia lquida uni- ou multidimensional, ionizados
e transferidos (ESI ou MALDI) para o analisador de massas.
ESI aplicada anlise de peptdeos produz preferencialmente
espcies duplamente carregadas, enquanto MALDI gera quase
que exclusivamente ons monocarregados.
iv) Nesta etapa o espectro de massas dos peptdeos oriundos da
digesto enzimtica adquirido. Este resultado indica a relao
m/z e, por conseqncia, a massa molecular dos peptdeos. Para
esse resultado d-se o nome de peptide mass fingerprint (PMF).
v) Os peptdeos previamente detectados durante o PMF (chamados de ons precursores) so ento isolados e submetidos fragmentao por coliso com molculas de um gs inerte, tal como
argnio, nitrognio ou hlio. O espectro obtido chamado espectro de fragmentao ou MS/MS.
vi) Ao final do processo, os resultados inerentes a massa molecular
(MM) dos peptdeos, obtida a partir do PMF, bem como a informao relativa a seqncia de aminocidos dos peptdeos,
contida nos espectros de fragmentao (MS/MS), so usados
pelos softwares de busca para localizar as protenas nos bancos de dados. Os softwares mais conhecidos e comumente
empregados so o Sequest10 e o Mascot11 (veja Figura 2S).
FERRAMENTAS PARA IDENTIFICAO DE PROTENAS
EM BANCOS DE DADOS
Como apontado no pargrafo anterior, os programas mais
comumente empregados para a identificao de protenas em bancos de dados a partir de dados de MS so o Sequest e o Mascot.
Ambos os programas correlacionam espectros de massas de fragmentao (no interpretados) de peptdeos com seqncias de
aminocidos de protenas registradas em bancos de dados.12,13 Alm

Quim. Nova

disso, esses softwares tambm tm a capacidade de usar sequncias

de nucleotdeos para fazer tal correlao. Para tal, eles primeiramente simulam as seqncias primria potenciais das protenas
correspondentes quelas seqncias de nucleotdeos encontradas nos
bancos de genes, utilizando-se do cdigo gentico universal; posteriormente, simulam a fragmentao destas seqncias primrias.
De forma geral, estes programas tm como objetivo encontrar a
seqncia de aminocidos, em um determinado banco de dados,
que melhor descreve os ons fragmentos encontrados em um espectro. As seqncias candidatas so procuradas nos bancos de
dados de acordo com a massa do peptdeo intacto (informao adquirida na etapa do PMF) e com o espectro de fragmentao obtido
para cada peptdeo.
No Sequest, uma tcnica de processamento do sinal chamada
autocorrelao usada a fim de determinar matematicamente a
sobreposio entre o espectro terico, derivado de cada seqncia
obtida no banco de dados em questo, e o espectro experimentalmente obtido. O resultado de tal sobreposio expresso quantitativamente em termos de um score para cada peptdeo (Xcorr). O
Xcorr um parmetro que depende de diversos fatores, tais como
o estado de carga do peptdeo bem como do tamanho do banco de
dados que est sendo usado para a busca. Assim, a avaliao de um
segundo score, classificado como Cn faz-se necessria para que a
confiabilidade do resultado obtido seja aumentada. Esse parmetro
definido como sendo a diferena entre os valores de Xcorr obtidos para a seqncia de aminocidos que obteve o maior Xcorr e a
seqncia subseqente. Na literatura, diferentes critrios so usados para classificar uma determinao como satisfatria ou no.
De forma geral, estes valores so: Xcorr > 3,75 para peptdeos com
carga +3; Xcorr > 2,2 para peptdeos com carga +2 e Xcorr > 1,9
para peptdeos com carga +1. Em todos os casos descritos, Cn>0,10
exigido para que a determinao seja considerada suficientemente confivel.3,14 O Sequest tem se mostrado uma ferramenta bastante robusta, inclusive quando espectros com baixa relao sinal rudo so submetidos anlise.3,10
O Mascot tambm envolve o clculo de fragmentos teoricamente preditos para todos os peptdeos de um banco de dados de acordo
com a massa do on precursor, previamente determinada. Os valores de m/z dos fragmentos preditos so comparados com os fragmentos experimentais sendo que, neste caso, a comparao se inicia com base nos ons -b e -y mais intensos. A probabilidade de o
valor de m/z de um fragmento teoricamente obtido coincidir, de
maneira randmica, com o valor de m/z de um fragmento obtido
experimentalmente calculada e expressa como sendo o negativo
do logaritmo desse nmero (score). Assim, quanto maior for o valor obtido, menor a probabilidade de que este resultado seja fruto
de uma coincidncia. Esse software fornece para cada busca submetida um valor limite (dependendo das condies usadas para a
busca) a partir do qual o valor obtido indica que a determinao
possui probabilidade inferior a 5% de ser um evento randmico.11
Uma vez entendida a sistemtica aplicada pelos softwares para
a identificao de protenas em bancos de dados usando dados de
espectrometria de massas, faz-se extremamente necessrio e de
suma importncia o completo entendimento de como ocorre a fragmentao dos peptdeos. Alm disso, a interpretao manual de
espectros de MS/MS recomendada em todos os casos e indispensvel em algumas situaes. Por fim, existem situaes nas quais o
genoma de uma determinada espcie ainda no est completamente seqenciado ou disponvel e, neste cenrio, necessrio derivar
a seqncia primria de aminocidos de um determinado peptdeo
baseado nica e exclusivamente nos dados obtidos por espectrometria de massas, isto , sem recorrer a banco de dados
(seqenciamento de novo).15

Vol. 31, No. 3

Seqenciamento de peptdeos usando espectrometria de massas: um guia prtico

FRAGMENTAO E SEQENCIAMENTO DE PEPTDEOS

A fragmentao de peptdeos por espectrometria de massas
para a posterior anlise de sua seqncia de aminocidos
comumente realizada por meio do processo de dissociao
induzida por coliso (collision induced dissociation CID),16 tambm referida por alguns autores como dissociao ativada por
coliso (collision activation dissociation CAD). Apesar de outras metodologias para a fragmentao de peptdeos, tais como
Electron Capture Dissociation (ECD); Electron Transfer
Dissociation (ETD)17 terem sido desenvolvidas, CID sem dvida o mais largamente empregado, alm de ser o mtodo mais
freqentemente aplicado nos espectrmetros de massas comercialmente disponveis. Neste processo, os peptdeos so inicialmente
introduzidos em uma regio de vcuo do espectrmetro de massas por meio dos processos de electrospray ou MALDI. Usando
uma descrio simplista e abrangente, cabvel para a maior parte
dos equipamentos comercialmente disponveis, os peptdeos
ionizados so acelerados para uma regio do espectrmetro preenchida com um gs inerte (hlio, argnio ou nitrognio) proporcionando, assim, a coliso entre os peptdeos ionizados e as molculas do gs inerte. Como resultado, a energia translacional
transferida em cada coliso convertida em energia interna. O
modelo da mobilidade do prton18 descreve como a energia interna adquirida induz a transferncia intramo-lecular dos prtons
em cada peptdeo, culminando na desestabili-zao das ligaes
do esqueleto polipeptdico e, por conseqncia, induzindo a formao de dois on-fragmentos,19 que so classificados como ons
que retm a carga residual (prton) no lado N-terminal (gerando
fragmentos -a, -b e -c, dependendo da ligao que fragmentada); ons que retm a carga residual (prton) na regio C-terminal (gerando os fragmentos -x, -y -z, dependendo da ligao que
fragmentada), segundo a nomenclatura proposta por Roepstorff
FohlmannBiemann.20 importante enfatizar que os pares de ons
a/x, b/y e c/z sero sempre ons correspondentes aos fragmentos
opostos e complementares entre si. Considerando-se que as ligaes peptdicas so aquelas menos energticas, espera-se que a
formao do par de fragmentos -b/-y seja mais freqente que os
demais pares de fragmentos, facilitando muito a interpretao
dos espectros.
Apesar de diversos estudos no sentido de definitivamente compreender o mecanismo de fragmentao de peptdeos usando CID
terem sido realizados, o mecanismo ainda no completamente
entendido.16,21,22
Como resultado da fragmentao das ligaes peptdicas mencionada acima, uma srie de ons -b e -y complementares obtida,
de modo que a diferena de valores de m/z entre dois ons consecutivos do mesmo tipo pode revelar a identidade do resduo de
aminocido em questo. Enquanto as sries -b e -y resultam diretamente da clivagem das ligaes peptdicas, os ons -a so formados pela perda neutra de monxido de carbono dos ons -b (diferena de 27.9949 u relativo ao on -b correspondente).16,18 Considerando todos os ons que teoricamente podem ser produzidos em
condies de CID, os ons -b e -y correspondem a grande maioria
dos ons observados, enquanto os ons -a so menos comuns. Vale
ainda dizer que para as situaes mais comumente enfrentadas em
um estudo protemico, ou seja, a anlise de peptdeos oriundos de
digesto trptica (R ou K na posio C-terminal) a formao da
srie de ons -y favorecida (em relao srie -b) devido elevada basicidade desses resduos de aminocidos. 16 A energia
comumente usada para induzir a fragmentao dos peptdeos em
CID geralmente insuficiente para romper as ligaes entre o carbono- e o carbono da carbonila, bem como entre o nitrognio e o

671

carbono- adjacente, de modo que os ons -c, -x e -z so tipicamente no observados no espectro.16

Quando a fragmentao ocorre simultaneamente nas posies
amino e carboxi-terminal do mesmo resduo de aminocido, ons
imnio so produzidos (Tabela 1). Esses ons servem como ons
diagnstico, podendo indicar a presena ou ausncia de determinados aminocidos na seqncia em estudo. Em certos resduos de
aminocidos, perdas neutras de molculas de H 2O e NH 3 so
freqentemente verificadas. Por exemplo, S, T e E so aminocidos
que quando presentes em peptdeos submetidos fragmentao
por CID apresentaro perda neutra de H2O bastante pronunciada.
Por outro lado, R, K, Q e N so exemplos de aminocidos que
apresentam pronunciada perda neutra de NH3. Alm disso, determinadas modificaes ps-traducionais ocorridas nas cadeias laterais de certos aminocidos, tais como fosforilao de S e T;
glicosilao e/ou oxidao de M tornam tais grupos laterais lbeis,
de modo que a perda neutra destes ons pode ser observada. Como
exemplo, pode-se verificar se a S constituinte de um determinado
peptdeo apresenta ou no uma fosforilao; para isso, deve-se verificar se h um pico com massa 98 u inferior ao on correspondente (-b ou -y) sendo que para esse on d-se o nome de on satlite15
(veja Figura 3S).
No entanto, apesar da determinao da seqncia de
aminocidos em um peptdeo ser possvel por meio do simples
clculo da diferena de massa entre picos vizinhos em uma srie
de ons, tal trabalho bastante difcil devido a uma sries de fatores, dentre os quais pode-se citar o conjunto de ons fragmento
esperado pode no estar presente na ntegra, ou em outras palavras, pode haver a ausncia de alguns ons das sries -b e -y; alguns
fragmentos podem sofrer rearranjos internos e subseqente fragmentao; os ons podem estar presente com diferentes estados de
carga, dificultando a correta atribuio dos ons (tal dificuldade
aplica-se na interpretao de espectros que no so de-convoludos);
alguns fragmentos podem sofrer rearranjo neutro de hidrognios
durante a fragmentao. Assim, o somatrio destes fatores pode
induzir a atribuio errada das sries de ons, tornando a interpretao do espectro bastante desafiadora.
Desta forma, uma srie de regras bsicas, compiladas a partir
de informaes adquiridas na literatura15,23 bem como fazendo uso
da experincia prpria adquirida durante o trabalho realizado nessa rea do conhecimento, foi elaborada apresentada a seguir, com
o objetivo de estabelecer um guia geral para a interpretao/confirmao de seqncias de aminocidos obtidos pela fragmentao
de peptdeos por espectrometria de massas. Tais informaes so
apresentadas de maneira bastante abrangente, de modo que podem
ser aplicadas para a interpretao de espectros obtidos por diferentes instrumentos, tais como Q-TOF, TOF-TOF, triplo quadrupolos
e ion-traps. A Tabela 1 apresenta informaes inerentes massa
molecular dos resduos de aminocidos e ons imnio enquanto a
Tabela 2 traz a massa de dipeptdeos, uma informao bastante til
para a atribuio de ons -b2.
DETALHAMENTO DO PROCEDIMENTO SUGERIDO
PARA O SEQENCIAMENTO DE NOVO DE PEPTDEOS
Composio de aminocidos diagnstico dos aminocidos
constituintes do peptdeo
Verificar a presena dos ons imnio (Tabela 1) na regio de baixas massas do espectro. Tais ons podem fornecer informaes inerentes composio de aminocidos de um peptdeo. No entanto,
importante ter em mente que se o on imnio para um determinado
aminocido no estiver presente, isso no significa que o aminocido

672

Cant et al.

Quim. Nova

Tabela 1. Lista dos 20 resduos de aminocidos mais comuns26

Aminocido
Glicina
Alanina
Serina
Prolina
Valina
Treonina
Cistena
Leucina
Isoleucina
Asparagina
cido asprtico
Glutamina
Lisina
cido glutmico
Metionina
Histidina
Fenilalanina
Arginina
Tirosina
Triptofano

Gly
Ala
Ser
Pro
Val
Thr
Cys
Leu
Ile
Asn
Asp
Gln
Lys
Glu
Met
His
Phe
Arg
Tyr
Trp

G
A
S
P
V
T
C
L
I
N
D
Q
K
E
M
H
F
R
Y
W

Massa mdia

Massa monoisotpica

on imnio

57,052
71,079
87,078
97,117
99,133
101,105
103,145
113,160
113,160
114,104
115,089
128,131
128,174
129,116
131,199
137,141
147,177
156,188
163,176
186,213

57,02146
71,03711
87,03203
97,05276
99,06841
101,04768
103,00919
113,08406
113,08406
114,04293
115,02694
128,05858
128,09496
129,04259
131,04048
137,05891
147,06841
156,10111
163,06333
186,07931

30
44
60
70
72
74
76
86
86
87
88
101
101
102
104
110
120
129
136
159

on relacionados

72
72
70
84, 129
70, 84, 112, 129
61
82, 121, 123, 138, 166
91
59, 70, 73, 87, 100, 112
91, 107
117, 130, 170, 171

Tabela 2. Lista das massas de dipeptdeos, teis para a determinao de ons -b2. Os valores correspondem soma das massas dos resduos
dos aminocidos acrescidos de uma unidade23

G
A
S
P
V
T
C
I/L
N
D
Q/K
E
M
H
F/M*
R
C**
Y
W

57
71
87
97
99
101
103
113
114
115
128
129
131
137
147
156
161
163
186

G
57

A
71

S
87

P
97

V
99

T
101

C
103

I/L
113

N
114

D
115

Q/K
128

E
129

M
131

H F/M* R
137 147 156

C**
161

Y
163

W
186

114
129
145
155
157
159
161
171
172
173
186
187
189
195
205
214
219
221
244

143
159
169
171
173
175
185
186
187
200
201
203
209
219
228
233
235
258

175
185
187
189
191
201
202
203
216
217
219
225
235
244
249
251
274

195
197
199
201
211
212
213
226
227
229
235
245
254
259
261
284

199
201
203
213
214
215
228
229
231
237
247
256
261
263
286

203
205
215
216
217
230
231
233
239
249
258
263
265
288

207
217
218
219
232
233
235
241
251
260
265
267
290

227
228
229
242
243
245
251
261
270
275
277
300

229
230
243
244
246
252
262
271
276
278
301

231
244
245
247
253
263
272
277
279
302

257
258
260
266
276
285
290
292
315

259
261
267
277
286
291
293
316

263
269
279
288
293
295
318

275
285
294
299
301
324

323
325
348

327
350

361

295
304
309
311
334

313
318
320
343

* Oxidao; ** carbamidometilcistena

est ausente da seqncia. Seguindo a mesma linha de raciocnio, a

presena de um on com massa concordante com algum on imnio
no determina por certo a presena do aminocido, uma vez que tal
on pode corresponder, por exemplo, ao um on-fragmento oriundo
de rearranjo sofrido pelo peptdeo que por coincidncia possui valor
de massa igual de um determinado on imnio.
Obs.: Para instrumentos do tipo ion-traps, tal informao em
muitos casos total ou parcialmente perdida devido limitao que estes equipamentos apresentam para a determinao de ons com valores
de m/z inferiores a 1/3 da relao m/z do on precursor (regra do 1/3].24
No entanto, avanos recentes nessa rea esto sendo realizados de
modo que tal limitao ser contornada num futuro bem prximo.

Determinao do aminocido presente na posio C-terminal

aplicada a peptdeos obtidos por clivagem enzimtica
Se os peptdeos a serem seqenciados so oriundos de digesto
trptica, deve-se verificar a existncia dos ons diagnstico -y1: 147
para K ou 175 para R. Um vez verificada a presena de um destes
ons (-y1), determinar o correspondente on bn-1 (na regio de alta
massa) por meio da seguinte relao: bn-1 = (M+H)1+ - y1 + 1
Verificao/confirmao da presena do on -b2
Para tal, pode-se fazer uso da Tabela 2, a qual traz uma lista

Vol. 31, No. 3

Seqenciamento de peptdeos usando espectrometria de massas: um guia prtico

das massas de dipeptdeos ionizados. Geralmente esses ons podem ser identificados por meio da seguinte razo: on -b2/ on -a2
separados por 28 u (inerente perda neutra de CO por parte de um
on b). Novamente, uma vez encontrada a razo m/z do on -b2, esta
usada para calcular a m/z do correspondente on -ym-2 fazendo uso
da relao: ym-2 = (M+H)1+ - b2 + 1
Em instrumentos do tipo ion-traps tal informao pode, em
alguns casos, no ser medida.
Extenso das seqncias de ons -b e y
Tendo definido os aminocidos posicionados nas extremidades
do peptdeo e usando a massa dos resduos dos aminocidos, iniciar
o seqenciamento analisando a regio de altas massas do espectro.
O menor nmero de picos nessa regio do espectro ir tornar o trabalho mais simples. No entanto, deve-se ter cuidado com a regio
em torno de 60 u abaixo do on precursor, que pode ser confundida
com picos referentes a mltiplas perdas de gua e amnia. Todavia,
no se pode descartar a hiptese que G pode ser o primeiro resduo
de aminocido da seqncia, de modo que o pico inerente a essa
possibilidade pode estar presente.
A partir desse ponto pode-se sistematicamente estender as seqncias de ons -b ou -y. Em outras palavras, a partir de um determinado on (seja ele -b ou -y) basta acrescer ou subtrair (dependendo da massa do on em questo) a massa dos resduos de
aminocidos sucessivamente a partir da G at o W. Uma vez determinada a massa de um on -b ou -y, o correspondente on -y ou -b
pode ser calculado usando as seguintes relaes gerais: ym-n =
(M+H)1+ - bn + 1 e bn-m = (M+H)1+ - ym + 1.
Sempre que um on determinado (por exemplo, um on -b) apresenta o on correspondente (on -y), a determinao ganha muito
em confiabilidade.
Considerando que o on -b1 raramente observado no espectro,
a determinao da ordem dos dois primeiros aminocidos da regio
N-terminal bastante difcil. Uma soluo para tal problema a
determinao do aminocido N-terminal empregando-se a Qumica
Degradativa de Edman, estratgia plausvel desde que a protena
em questo no apresente o aminogrupo N-terminal bloqueado.
INFORMAES PERTINENTES QUE CORROBORAM
PARA A CORRETA DETERMINAO DA SEQNCIA
DE AMINOCIDOS
Perda neutra de amnia (NH3) e gua (H2O)
As informaes apresentadas a seguir so bastante importantes
no tocante confirmao de identificao de certos aminocidos:
ons fragmento -y e -b contendo os resduos de aminocidos R, K,
Q e N podem apresentar perda neutra de amnia (-17 u). O on
inerente a essa perda neutra no raramente mais intenso que os
prprios ons -b ou -y correspondentes e, ons-fragmento -y e -b
contendo os resduos de aminocidos S, T e E podem apresentar
perda neutra de gua (-18 u). No caso do cido glutmico, tal fato
ser mais notrio caso esse aminocido esteja na posio do Nterminal do fragmento. Tais informaes corroboram para que a
certeza inerente a uma determinao seja aumentada.
Intensidades dos picos no espectro
Nos peptdeos gerados a partir de digesto trptica, os ons da
srie -y geralmente sero os de maior intensidade no espectro. Sempre que um peptdeo trptico contiver D em sua seqncia (no
importando a posio) e o nmero de cargas for igual ou menor ao

673

nmero de resduos de R, haver uma fragmentao preferencial

na posio C-terminal do D, de modo que o pico inerente a tal
fragmentao ser o mais intenso do espectro. Quando a clivagem
ocorrer em uma ligao peptdica de modo a posicionar um resduo de P na posio N-terminal do peptdeo, a intensidade do on b (o qual no conter a P) ser bastante reduzida em relao ao on
-y correspondente (o qual ter a P na posio N-terminal). Tal evento
tambm poder ser observado, ainda que em menor extenso, com
os resduos de G, H, K e R.
Clivagens internas podem ocorrer nos resduos P e H. Um fragmento de clivagem interna o fragmento que parece ser um peptdeo
reduzido apresentando P e/ou H em sua posio N-terminal. Por
exemplo, o peptdeo EFGLPGLQNK pode apresentar os ons -b
referentes aos fragmentos de sequncia: PGLQNK, PGLQN,
PGLQ, etc. Esses so resultados de uma dupla clivagem e so normalmente designados como fragmentos internos.
Espcies isobricas
L e I so isbaros e no podem ser diferenciados usando CID como
mecanismo de dissociao. Quando essa diferena de massa for
verificada no espectro, deve-se usar o smbolo X ou Lxx (L/I outra
notao comumente usada), de acordo com a nomenclatura de Hunt.25
K e Q so aminocidos quase isobricos, uma vez que possuem massa 128,09496 e 128,05858, respectivamente. A diferena de
massa 0,03638 u e pode ser usada para diferenciar K e Q se um
espectrmetro for capaz de gerar resultados com alta exatido de
massa e resoluo, tais como Q-TOF, Orbitrap e FT-ICR. Geralmente triplo quadrupolos e ion traps so incapazes de realizar tal
feito.
Existem situaes onde dois resduos de aminocidos iro apresentar massa molecular bastante prxima da de um terceiro aminocido
(Tabela 3), ou mesmo de outros dois aminocidos especficos.
Tabela 3. Combinao de resduos de aminocidos que possuem a
mesma massa de um nico aminocido
Aminocido (s)

Massa (Da)

GG
N
AG
Q
K
GV
R
AD
EG
W
SV

114,04293
114,04293
128,05858
128,05858
128,09496
156,08988
156,10111
186,06406
186,06406
186,07931
186,10044

EXEMPLOS PRTICOS DE INTERPRETAO DE

ESPECTROS DE FRAGMENTAO DE PEPTDEOS
Uma vez apresentadas uma srie de regras bsicas bem como
informaes prticas que objetivam auxiliar na interpretao de
espectros de fragmentao de peptdeos por MS em tandem, dois
exemplos prticos sero apresentados a fim de melhor ilustrar os
procedimentos descritos. Escolheram-se dois espectros inerentes ao
mesmo peptdeo trptico, obtidos por dois instrumentos diferentes.
No primeiro exemplo, o espectro foi adquirido num instrumento do
tipo TOF-TOF (Proteomics 4700 Applied Biosystems), equipado
com uma fonte de ionizao do tipo MALDI (que gera peptdeos

674

Cant et al.

majoritariamente monocarregados). No segundo, um ion-trap

tridimensional (LCQ Deca XP Plus Thermo) foi empregado. Nesse
instrumento uma fonte de ionizao do tipo electrospray foi utilizada. Assim, alm de apresentar a interpretao dos espectros, ser
possvel verificar as diferenas entre os espectros obtidos por esses
dois diferentes instrumentos.
O espectro de fragmentao obtido para o peptdeo trptico em
estudo (on precursor monocarregado na forma [M+H]+, m/z= 1623,7)
usando o instrumento TOF-TOF ilustra bem o perfil dos espectros
usualmente obtidos com esse tipo de instrumento. Em outras palavras, os espectros so pobres em relao ao nmero de picos principalmente nas regies de altas massas, sendo bastante difcil a
verificao de picos inerentes aos ons -a, assim como perdas neutras de H2O e NH3. Por outro lado, os espectros obtidos nesse tipo
de instrumento apresentam as vantagens de serem obtidos com alta
resoluo (da ordem de 3000) e exatido de massa (melhor que 40
ppm). Tais caractersticas permitem que ambigidades em algumas situaes sejam eliminadas. Como exemplo, pode-se citar a
distino entre os resduos de aminocidos Q e K, que possuem
massas bastante prximas e no so distinguidos em equipamentos
com baixa exatido de massa, tais como os ion-traps. Por fim,
necessrio afirmar que o espectro de fragmentao obtido no instrumento TOF-TOF em uso submetido a uma etapa de ps-tratamento, onde sofre um processo de desconvoluo, que exclui possveis picos inerentes a espcies multicarregadas (se presentes),
bem como elimina o padro isotpico.
O mesmo espectro de fragmentao com um zoom na regio de
baixas massas, seguindo o procedimento apresentado, identificou
os ons imnio (Tabela 1) correspondentes aos seguintes resduos
de aminocidos: S (60), P (70), I/L (86), N (87), R (112), Y (136)
e W (159). Dessa forma, possvel ter uma idia acerca da composio de aminocidos do peptdeo. Alm disso, o pico com m/z
101, tambm presente, pode indicar a presena do resduo de
aminocido Q ou K.
Como prximo passo, sabendo que o peptdeo em estudo oriundo de digesto trptica, espera-se que o resduo de aminocido Cterminal seja R ou K. Nesse caso, o aminocido C-terminal facilmente identificado como sendo a R, visto que alm do on imnio
referente a R ter sido verificado, o pico com m/z 175 (-y1) confirma
tal fato. Com essa informao, automaticamente pode se retornar
ao pargrafo anterior e inferir que o on com m/z 101 corresponde
a Q e no a K, a menos que a tripsina tenha falhado em um ponto
de clivagem, o que a priori pode ser descartado. De posse da informao inerente ao on -y1, pode-se calcular a relao m/z do on
-bn-1 correspondente, que nesse caso se trata do on 1449,7, o qual
no pode ser visualizado no espectro (Figura 4SD - Material Suplementar).
tambm possvel verificar o on -b2. Tal on, neste caso o m/z 155,
facilmente identificado devido presena do on a correspondente (m/
z 127). Fazendo uso da Tabela 2, pode-se concluir que o conjunto de
dois resduos de aminocidos que apresentam m/z igual a 155 formado
por PG, sendo obviamente a ordem desconhecida. Nesse aspecto, o
espectro mostra-se bastante simples uma vez que somente uma combinao de resduos possui a relao m/z em questo. No entanto, em
outros exemplos onde mais de um conjunto de aminocidos possui o
valor de m/z correspondente ao on -b2, todas as combinaes devem ser
levadas em considerao. Obviamente, dados inerentes composio
de aminocidos do peptdeo (ons imnio) podem ajudar a indicar a
seqncia que possui a maior probabilidade de ser a verdadeira. Isso
significa que se duas seqncias apresentam a mesma massa relativa ao
on -b2 e, no entanto, em uma delas os ons imnio correspondentes aos
aminocidos constituintes no foram detectados, provvel que essa
no seja a seqncia correta.

Quim. Nova

Conhecendo-se o on -b2, possvel calcular o on -yn-2 correspondente, que nesse caso se trata do on de m/z 1569, o qual tambm no foi observado no espectro. Alm disso, pode-se usar tal
informao para tentar determinar a seqncia dos resduos de
aminocidos da regio N-terminal. Com as informaes obtidas at
esse ponto sabe-se que os dois primeiros resduos da regio N-terminal so P e G. Logo, para determinar a ordem correta basta fazer
a suposio que a P seja o resduo N-terminal. Se isso for verdade,
um on com m/z aproximadamente igual a 98,03 (155.047 57,021)
deveria ser observado, o que no ocorre. Portanto, no h evidncia
que a P seja o aminocido N-terminal. A outra possibilidade que
G esteja na posio N-terminal e nesse caso o on com m/z em torno
de 57,99 deveria ser verificado, o que tambm no ocorre. Assim,
apesar de saber que os dois primeiros resduos de aminocidos da
regio N-terminal do peptdeo so a P e a G, no possvel
determin-los pela interpretao desse espectro de massas.
Uma vez determinados os ons -y1 e -b2, foi possvel estender
as seqncias de aminocidos. A srie -b foi estendida desde o on
-b2 (m/z 155,05) at o on -b7 (m/z 782,42). Por outro lado, a srie -y
pde ser estendida a partir do on -y1 (m/z 175,07) at o on -y7 / -b6
(m/z 1028,70). Assim sendo, o completo seqenciamento do peptdeo foi obtido, fazendo uso da srie -y e/ou da srie -b (Figuras
4SC e 4SD). Neste exemplo, ons complementares (os pares -y7 / -b6
e -y6 / -b7) puderam ser identificados, aumentando a confiabi-lidade
da seqncia proposta (veja Figura 4S).
A seqncia de aminocidos determinada para o peptdeo em
estudo, bem como os ons que foram detectados no espectro, permitiu predizer a seqncia de aminocidos do peptdeo, com exceo dos dois primeiros aminocidos na regio N-terminal, que permanece desconhecida (veja Figura 5S).
O espectro de fragmentao para o mesmo peptdeo em questo foi obtido usando-se o instrumento do tipo ion-trap
tridimensional. Neste caso, o modo de ionizao foi o ESI e o on
precursor era duplamente carregado ([M+2H]2+, m/z = 812,5). Ao
contrrio do espectro obtido no TOF-TOF, esse espectro apresenta
muitos picos, inclusive picos inerentes s perdas neutras de H2O e
NH3, o que facilita o seqenciamento do peptdeo, porm ao mesmo tempo torna maior a chance de que erros sejam cometidos devido a equvocos na assinalao das sries. Tal possibilidade ainda aumentada devido ao fato do espectro oriundo desse tipo de
instrumento no ser desconvoludo, o que significa que ons relativos a espcies multicarregadas podem estar presentes, dificultando a interpretao.
Deve-se lembrar tambm que os espectros obtidos em ion-traps
possuem baixa resoluo e exatido de massas, o que torna impossvel, por exemplo, fazer a correta distino entre os resduos Q ou K.
A limitao inerente regra do 1/324 verificada e por esse motivo
ons com relao m/z inferiores a 270 no so sequer detectados.
Nesse caso, como no se tem acesso regio de baixas massas, fica
impossvel verificar os ons imnio presentes, bem como os ons
diagnstico -y1. Sabendo-se de antemo que o resduo de aminocido
C-terminal se trata de R ou K, deve-se supor que se trata da K (por
exemplo) e calcular o on -bn-1 correspondente, que nesse exemplo
teria m/z igual a 1477,5. Avaliando a Figura 6SC pode-se concluir
que esse on no est presente e, portanto, a suposio de K
corresponde ao resduo de aminocido C-terminal no se mostrou
consistente. Como prxima tentativa deve-se supor que R o resduo C-terminal, situao na qual o on -bn-1 deveria ter m/z igual a
1449,4. A anlise da Figura 6SC mostra que esse on est presente e,
portanto, o aminocido C-terminal trata-se da R.
Uma anlise criteriosa mostra que o on de m/z 268,11 se trata
de um fragmento do tipo -b. Tal fato pde ser concludo uma vez
que o on -a correspondente facilmente identificado (m/z 240,89).

Vol. 31, No. 3

Seqenciamento de peptdeos usando espectrometria de massas: um guia prtico

Alm dessa evidncia, o clculo do on -y correspondente fornece

o on com m/z 1357,45, tambm presente no espectro. Assim, o on
de m/z 268,11 trata-se do primeiro on da srie -b detectado nesse
espectro. Dessa maneira possvel estender as sries -y e -b usando as massas dos resduos dos aminocidos. A srie -b estendida
desde o on -bn-1 (m/z 1449,5) at o ltimo on b detectado (m/z
268,11). Por outro lado, a srie -y pode ser estendida a partir do on
-y1, mesmo apesar do fato desse on no ter sido detectado no espectro. As sries -b e -y estendidas bem como alguns ons -a verificados (-a3 e -a7 ) mostram, alm de inmeros ons inerentes, as
perdas neutras de H2O e NH3. Conforme descrito anteriormente,
uma intensa perda neutra de H2O pode ser verificada em ons fragmento que contm os resduos de aminocidos S, neste caso so
mostrados como exemplo as perdas neutras relativas aos on -b6 e y8. Alm disso, diversas perdas neutras de NH3 so observadas para
os fragmentos que contm os aminocidos N, Q e R. Como exemplo, so mostradas as perdas neutras do ons -b8, -b10, -y10 entre
outras (veja Figura 6S).
A seqncia de aminocidos obtida para o peptdeo em estudo,
bem como todos os ons detectados no espectro, permitiu predizer
a seqncia de aminocidos do peptdeo de maneira inequvoca a
menos da ordem dos dois primeiros aminocidos na regio N-terminal, a qual continuou desconhecida tambm nesse equipamento
(veja Figura 7S).
Conforme esperado, a interpretao dos espectros de fragmentao do peptdeo em estudo, obtidos pelos dois diferentes instrumentos, gerou resultados concordantes. Assim sendo, a seqncia de aminocidos obtida (GPXQXSWNYNYXR ou PGXQXSWNYNYXR)
pode agora ser comparada com a seqncia real do peptdeo, que
GPIQLSWNYNYLR. Deste modo, pode-se concluir que a interpretao dos espectros possibilitou a determinao fidedigna dos
aminocidos constituintes desse peptdeo, a menos da seqncia dos
dois primeiros resduos de aminocidos da regio N-terminal.
CONSIDERAES FINAIS

peptdeos, foi possvel verificar as diferenas espectrais inerentes

aos instrumentos avaliados. Dessa forma, espera-se que esse artigo
sirva como uma fonte de referncia para pesquisadores que fazem
uso de espectrometria de massas para estudar/identificar protenas, peptdeos biologicamente ativos, etc.
MATERIAL SUPLEMENTAR
Est disponvel gratuitamente em http://quimicanova.sbq.org.br,
em forma de arquivo PDF, apresentando as Figuras 1S a 7S.
REFERNCIAS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.

O presente artigo apresenta um guia prtico para a interpretao de espectros de fragmentao de peptdeos obtidos usando
espectrometria de massas em tandem. O conjunto de regras e informaes relatadas foi compilada a partir de uma profunda reviso
bibliogrfica sobre o assunto, bem como usando o conhecimento
prtico adquirido pelos autores. A fim de melhor enfatizar a
aplicabilidade do guia proposto, dois exemplos foram apresentados. Espectros de fragmentao para um mesmo peptdeo foram
obtidos atravs de dois espectrmetros de massas diferentes, sendo eles um TOF-TOF e um ion-trap (tridimensional). Alm de
exemplificar com exemplos prticos e reais o seqenciamento de

675

19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.

Tyers, M.; Mann, M.; Nature 2003, 422, 193.

Aebersold, R.; Mann, M.; Nature 2003, 422, 198.
Sadygov, R. G.; Cociorva, D.; Yates, J. R.; Nature Methods 2004, 1, 195.
Fenn, J. B.; Mann, M.; Meng, C. K.; Wong, S. F.; Whitehouse, C. M.; Science
1989, 246, 64.
Karas, M.; Hillenkamp, F.; Anal. Chem. 1988, 60, 2299.
Ramstrom, M.; Hagman, C.; Mitchell, J. K.; Derrick, P. J.; Hakansson, P.;
Bergquist, J.; J. Proteome Res. 2005, 4, 410.
Kelleher, N. L.; Lin, H. Y.; Valaskovic, G. A.; Aaserud, D. J.; Fridriksson,
E. K.; McLafferty, F. W.; J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 806.
Bogdanov, B.; Smith, R. D.; Mass Spectrom. Rev. 2005, 24, 168.
Nemeth-Cawley, J. F.; Tangarone, B. S.; Rouse, J. C.; J. Proteome Res. 2003,
2, 495.
Eng, J. K.; McCormack, A. L.; Yates, J. R.; J. Am. Soc. Mass. Spectrom.
1994, 5, 976.
Perkins, D. N.; Pappin, D. J.; Creasy, D. M.; Cottrell, J. S.; Electrophoresis
1999, 20, 3551.
Chamrad, D. C.; Korting, G.; Stuhler, K.; Meyer, H. E.; Klose, J.; Bluggel,
M.; Proteomics 2004, 4, 619.
Elias, J. E.; Haas, W.; Faherty, B. K.; Gygi, S. P.; Nature Methods 2005, 2,
667.
Washburn, M. P.; Wolters, D.; Yates, J. R.; Nat. Biotechnol. 2001, 19, 242.
Steen, H.; Mann, M.; Nature Reviews 2004, 5, 699.
Tabb, D. L.; Smith, L. L.; Breci, L. A.; Vysocki, V. H.; Lin, D.; Yates, J.
R.; Anal. Chem. 2003, 75, 1155.
Syka, J. E. P.; Coon, J. J.; Schroeder M. J.; Shabanowitz, J.; Hunt, D. F.;
PNAS 2004, 101, 9528.
Dongre, A. R.; Jones, J. L.; Somogyi, A.; Wysocki, V. H.; J. Am. Chem.
Soc. 1996, 118, 8365.
Mann, M.; Meng, C. K.; Fenn, J. B.; Anal. Chem. 1989, 61, 1702.
Roepstorff, P.; Fohlman, J.; J. Biomed. Mass Spectrom. 1984, 11, 601.
OHair, R. A. J.; J. Mass Spectrom. 2000, 35, 1377.
Wysocki, V. H.; Tsaprailis, G.; Smith, L. L.; Breci, L. A.; J. Mass Spectrom,
2000, 35, 1399.
Kinter, K.; Sherman, N. E.; Protein Sequencing and Identification Using
Tandem Mass Spectrometry, Wiley-Interscience: New York, 2000.
March, R. E.; J. Mass Spectrom. 1997, 32, 351.
Hunt, D. F.; Yates, J. R.; Shabanowitz, J.; Winston, S.; Hauer, C. R.; PNAS
1986, 17, 6233.
Falick, A. M.; Hines, W. M.; Medzihradszky, K. F.; Baldwin, M. A.; Gibson,
B. W.; J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1993, 4, 882.

0DUFHOR'HOPDU&DQW~H(PDQXHO&DUULOKR
,QVWLWXWRGH4XtPLFDGH6mR&DUORV8QLYHUVLGDGHGH6mR3DXOR&36mR&DUORV63%UDVLO
1HOVRQ$UQR:XOII
)XQGRGH'HIHVDGD&LWULFXOWXUD$Y$GKHPDU3HUHLUDGH%DUURV$UDUDTXDUD63%UDVLO
0DULR6pUJLR3DOPD
'HSDUWDPHQWRGH%LRORJLD,QVWLWXWRGH%LRFLrQFLDVGH5LR&ODUR8QLYHUVLGDGH(VWDGXDO3DXOLVWD$Y$
5LR&ODUR63%UDVLO

)LJXUD6(VTXHPDGHWDOKDGRGRVPRGRVGHLRQL]DomRODUJDPHQWHHPSUHJDGRVHP06DSOLFDGDjDQiOLVHSURWH{PLFD$(OHFWURVSUD\%0$/',

HPDLOHPDQXHO#LTVFXVSEU

0DWHULDO6XSOHPHQWDU

4XLP1RYD9RO1R66
6(48(1&,$0(172'(3(37'(2686$1'2(63(&7520(75,$'(0$66$680*8,$357,&2

6

&DQW~HWDO

4XLP1RYD

)LJXUD6(VTXHPDLOXVWUDGRGDVVHLVHWDSDVTXHFRPXPHQWHLQWHJUDPXPHVWXGRSURWH{PLFRTXHHPSUHJDHVSHFWURPHWULDGHPDVVDV

)LJXUD6$(VWUXWXUDTXtPLFDJHUDOGHXPSHSWtGHRDSUHVHQWDQGRDQRPHQFODWXUDSURSRVWDSRU5RHSVWRUII)RKOPDQQ%LHPDQQGRVIUDJPHQWRVIRUPDGRV
GHYLGRjWUDQVIHUrQFLDGHHQHUJLDSDUDRSHSWtGHR%RVtRQVIRUPDGRVVmRHQXPHUDGRVDSDUWLUGRDPLQRiFLGR1WHUPLQDO&DIUDJPHQWDomRGDVSRUo}HV
DPLQRHFDUER[LWHUPLQDOGHXPPHVPRDPLQRiFLGRSURGX]RVtRQVLP{QLR

9RO1R

6HTXHQFLDPHQWRGHSHSWtGHRVXVDQGRHVSHFWURPHWULDGHPDVVDVXPJXLDSUiWLFR

6

)LJXUD6,QWHUSUHWDomRGRHVSHFWURGHPDVVDVUHIHUHQWHDRSHSWtGHRHPHVWXGRREWLGRSHORLQVWUXPHQWR72)72)$(VSHFWURRULJLQDO%]RRPQDUHJLmR

GHEDL[DPDVVDGRHVSHFWUR&H'VHTHQFLDPHQWRGRSHSWtGHRVpULHV\
 HE

6

&DQW~HWDO

4XLP1RYD

)LJXUD6 6HTrQFLDGHDPLQRiFLGRVGHWHUPLQDGDSDUDRSHSWtGHRHPHVWXGREHPFRPRRVtRQVEH\
 HQFRQWUDGRVQRHVSHFWUR$VFDGHLDVODWHUDLVGRV
UHVtGXRVHVWmRUHSUHVHQWDGDVSRUPHLRGRVFyGLJRVGHXPDOHWUDGRVUHVSHFWLYRVDPLQRiFLGRV;UHSUHVHQWD,RX/

)LJXUD6 ,QWHUSUHWDomRGRHVSHFWURGHPDVVDVUHIHUHQWHDRSHSWtGHRHPHVWXGRREWLGRSHORLQVWUXPHQWRtRQWUDS$(VSHFWURRULJLQDO%]RRPQDUHJLmRGH

EDL[DPDVVDGRHVSHFWUR&VHTHQFLDPHQWRGRSHSWtGHRVpULHV\
 HE FRUUHVSRQGHDRtRQSUHFXUVRUGXSODPHQWHFDUUHJDGR

9RO1R

6HTXHQFLDPHQWRGHSHSWtGHRVXVDQGRHVSHFWURPHWULDGHPDVVDVXPJXLDSUiWLFR

6

)LJXUD66HTrQFLDGHDPLQRiFLGRVGHWHUPLQDGDSDUDRSHSWtGHRHPHVWXGREHPFRPRRVtRQVEH\HQFRQWUDGRVQRHVSHFWUR$VFDGHLDVODWHUDLVGRVUHVtGXRV
HVWmRUHSUHVHQWDGDVSRUPHLRGRVFyGLJRVGHXPDOHWUDGRVUHVSHFWLYRVDPLQRiFLGRV;UHSUHVHQWD,RX/