Sistemas de Medida Cualitativa PDF

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS CUALITATIVOS
Itziar Ruisnchez, Esther Trullols y F. Xavier Rius

Grupo de Quimiometra y Cualimetra. Departamento de Qumica Analtica y Qumica
Orgnica. Universitat Rovira i Virgili. Pl. Imperial Trraco, 1, 43005 Tarragona.
Es bi en conocida la necesi dad de vali dar los m todos de anli si s y, e n co ncreto , e n

este art c ulo se aborda la vali daci n de los mtodos de anli si s cualita ti vos . Si bi en el
concepto de vali daci n no depende de que sta sea cua nti tati va o c uali tati va, en la
prcti ca los parmetros de cali dad que caracte ri za n a los m todos cuali tati vos so n
disti ntos. As , adems de descri bi r las caracter sti cas de los mtodos cua li tati vos, se
defi nen los pri nci pales parmetros de calidad como son: falsos posi ti vos y nega ti vos ,
sensi bi li dad, especifi ci dad, regi n de i ncerti dumbre, l mi te de corte, etc. F i nalmente ,
se descri ben muy bre veme nte c uatro vas para estab lecer dic hos parmetros .
Introduccin
los
sistemas
de
medida cualitativos
Estos
En los laboratorios de anlisis es cada
habitualmente sistemas de screening o
vez ms frecuente la introduccin de
de cribado. Desde el punto de vista
sistemas de medida de respuesta rpida
prctico,
que generan respuestas ms de tipo
desarrollo de estos sistemas radica en
cualitativo que cuantitativo. La repuesta
que se utilizan como una etapa previa de
cualitativa suele ser binaria del tipo
cribado de las muestras (figura 1), de
SI/NO y puede responder a distintas
manera que se evita as que todas las
situaciones: presencia/ausencia de un
muestras sean sometidas a todo el
determinado analito en una muestra,
proceso de medida qumico. nicamente
presencia/ausencia por encima de un
seguirn
determinado
cuantitativo
nivel
(normalmente
de
sistemas
el
el
se
principal
inters
proceso
aquellas
denominan
de
en
el
anlisis
muestras
cuya
concentracin) que habitualmente viene
respuesta sea un SI (positivo), aquellas
fijado por la legislacin o el cliente, etc.
en las que se detecte la presencia de un
analito o se detecte que est por encima
realiza en base a los sentidos humanos
del nivel permitido.
como pueden ser la vista, olfato, etc. El
Hay analito por encima de un determinado valor, XSL?
ms utilizado es la vista y la mayora de
>X
SL
< XSL
sistemas se basan en la aparicin o no

MUESTRAS
SISTEMA DE
SCREENING
SI
de un determinado color como resultado
ANLISIS
CUANTITATIVO
de una reaccin qumica, bioqumica o

NO
inmunolgica.
NO SE
ANALIZA
En este tipo de sistemas, la respuesta
Figura 1. Sistemas de cribado (screening).
binaria SI/NO se obtiene de forma

Tipos
de
sistemas
de
directa, sin ningn tratamiento de los
medida
cualitativos.
datos. Generalmente , la presencia de un
Hacer clasificaciones siempre resulta
analito se determina por comparacin
difcil ya que depende de los criterios
respecto a un blanco (muestra sin el
que se utilicen. Si atendemos al tipo de
analito), por ejemplo si se obtiene un
sistema utilizado para la obtencin de la
determinado color hay analito, mientras
respuesta
que si no se obtiene (color del blanco) no
(deteccin)
podemos
lo hay.
diferenciar dos grandes grupos: anlisis

cualitativo clsico o sensorial y anlisis
Dentro de este grupo de sistemas
cualitativo instrumental (Tabla 1).
cualitativos
denominados
se
encuentran
tests
kits.
los
Son
Deteccin sensorial
p
Color: cambio, aparicin, etc.
Olor
ELISA
dispositivos comerciales diseados para

una aplicacin concreta que contienen
todos los reactivos necesarios y en
Deteccin instrumental
instrumental
p
UV-Vis, Fluorescencia, Potenciometra, etc.
Sensores : qumicos, bio- qumicos, etc.
ELISA
algunos casos incluyen un sistema

instrumental sencillo necesario para la
obtencin de la respuesta.
Tabla 1. Tipos de sistemas de utilizados en el

cribado
El otro gran grupo es el que hemos
En el anlisis cualitativo clsico la
denominado
deteccin es de tipo sensorial y se

2
anlisis
cualitativo
instrumental. En este caso, la deteccin
que los test kits, la deteccin puede ser
se realiza en base a una medida
tanto sensorial como instrumental.
instrumental (colorimetra, fluorescencia,

voltamperometra, etc.). La presencia o
Validacin de los sistemas de medida
no de un determinado analito depende
cualitativos
del nivel al que interese detectarlo. Bien
Al igual que los mtodos de medida
puede ser al nivel del lmite de deteccin
cuantitativos, los mtodos cualitativos
o a un nivel superior que generalmente
tambin deben validarse. La validacin
corresponde al fijado por la legislacin.
de un mtodo no depende de que ste

sea cuantitativo o cualitativo, ya que
En este tipo de sistemas de medida, la
validar
respuesta instrumental que se obtiene
documentar su validez, su adecuacin a
debe transformarse en respuesta binaria
unos
del tipo SI/NO y por lo tanto implica un
establecidos. Esta es la idea que queda
tratamiento de datos. Primero hay que
recogida en la definicin proporcionada
establecer la respuesta instrumental, por
por la norma ISO 8402 (ver cuadro 1) y
ejemplo un valor de absorbancia para la
que implica el concepto de adecuacin a
concentracin correspondiente al valor al
la finalidad o propsito perseguido, fit-
que
for-purpose.
se
quiere
concentracin
cribar
establecido
(nivel
de
por
la
consiste
en
requisitos
verificar
previamente
legislacin) y debe compararse con la

Validacin
respuesta instrumental obtenida para
Validacin es la confirmacin mediante la examen
cada muestra. Si es superior, hay analito
y la provisin de una evidencia objetiva de que se

han satisfecho unos requisitos particulares para un
por lo que la respuesta binaria es SI, y si
uso pretendido y especfico.
el valor es inferior la respuesta binaria es

NO.
Cuadro 1, Definicin de validacin segn

la norma ISO 8402
Otro grupo de sistemas cualitativos que

podemos considerar aparte son los que
Por
utilizan el mtodo ELISA. Estn basados
concreto, la validacin implica como
en una reaccin inmunolgica y al igual
paso previo la definicin de los requisitos
lo
tanto,
ante
cada
problema
analticos, o parmetros de calidad (en
segundo es la probabilidad de error
ingls, performance characteristics), que
asociada a la decisin tomada.
se precisan y, una vez definidos, el

siguiente
paso
consiste
Parmetros de calidad
en
determinarlos.
Los sistemas de screening tienen unas

connotaciones especiales que conllevan
La
primera
gran
encontramos
entre
diferencia
el
que
una
cuidadosa
adaptacin
de
los
anlisis
parmetros de calidad que estn bien
cuantitativo y el anlisis cualitativo es la
definidos y estudiados en los procesos
forma de expresar el resultado (figura 2).
de medida con finalidad cuantitativa,
Es bien conocido que la expresin de un
bien sean de tipo fsico como qumico.
resultado cuantitativo se caracteriza por
En la tabla 2 se muestran los parmetros
dos valores numricos, el primero es la
ms relevantes desde el punto de vista
estimacin del valor verdadero y el
matemtico-estadstico,
segundo corresponde a la incertidumbre
cuantitativos como cualitativos. Algunos
que est asociada a la dispersin del
de los parmetros de tipo cualitativo, han
resultado o intervalo dentro del cual
sido definidos recientemente por la
tenemos cierta fiabilidad de que se
AOAC [Feldsine 2000], mientras que en
encuentra el valor verdadero.
otros se est actualmente trabajando en
tanto
su definicin.
A N LISI S
CUA NTI TA TI V O
A N LI SI S
CUA LI TA TIVO /
SCR EE NI NG
Cuantitativo
Cuantitativo
Sensibilidad, Especificidad
VA LOR E STI MA DO
I NCER TI D UMB R E
Selectividad: Interferencias
SI / NO
CO N
P ROBA BIDA D DE
E RO R
Probabilidad de falso
positivo y negativo
Lmite de deteccin
Sensibilidad, Especificidad
Rango y Linealidad
Selectividad: Interferencias
Incertidumbre
Lmite de deteccin
Exactitud: veracidad,
precisin
Robustez
Figura 2, Expresin del resultado analtico.
Binario/Cualitativo
Binario/Cualitativo
Lmite de corte (cut -off )

Incertidumbre o regin de
error
Robustez
.
Tabla 2. Parmetros de calidad.
El resultado de un anlisis cualitativo

tambin se caracteriza por dos valores,
el primero es binario SI/NO, y el
Cabe
resaltar
que
algunos
son
tomamos como referencia la presencia
especficos del anlisis cualitativo, como
de un contaminante, la legislacin fija el
son la proporcin de falsos positivos y
contenido
negativos y el lmite de corte o cut-off.
contenido mximo de Aflatoxina B1 en
Otros, como especificidad, sensibilidad y
fruto seco es de 2 ng/g [EC No
lmite de deteccin, pueden tener un
257/2002].
mximo,
por
ejemplo
el
significado ligeramente diferente aunque

mantienen el mismo nombre que en el
Centrmonos
en
los
cuantitativo. Finalmente, decir que la
cualitativos sensoriales, concretamente
mayora de los parmetros cualitativos,
en los test kit que hoy en da son
al ser de naturaleza binaria SI/NO, se
ampliamente
expresan en trminos probabilsticos.
concreto sera aquel en que cuando la
utilizados.
mtodos
Un
caso
muestra contiene menos de 2 ng/g de

De forma genrica podramos decir que
Aflatoxina B 1 se obtiene una repuesta
la validacin de cualquier mtodo de
negativa (aparece color), mientras que si
anlisis implica el establecimiento de los
la concentracin es superior la respuesta
parmetros de calidad considerados
es positiva (no aparece color) [Aflacard
bsicos:
B1 2002].
trazabilidad,
representatividad,
parmetros
de
etc.
calidad
exactitud,
De
los
propios
En este tipo de test kits lo ideal es que el
caractersticos del anlisis cualitativo
lmite real al que criba el test kit,
podemos destacar aquellos que hacen
denominado lmite de corte o cut-off,
referencia o estn relacionados con
coincida con el lmite legislativo, pero as
niveles de concentracin; as podemos
como el legislativo es un lmite terico, el
distinguir el lmite de deteccin, el lmite
de corte es un lmite experimental (figura
de corte o cut-off y el lmite legislativo.
3).
La situacin habitual que nos solemos
Respuesta
Negativa
encontrar es que la legislacin indica el
Respuesta
Positiva
c= 2ng/g
contenido mximo o mnimo de un
Concentracin
Figura 3, Res puesta terica de un test kit
determinado analito en una muestra. Si
Pero
desde
el
punto
vista
este caso concreto, interesa que la zona
experimental hay que tener en cuenta
2) est por debajo del lmite legislativo
que si representamos la respuesta del kit
para asegurar la ausencia de falsos
en funcin de la concentracin se
negativos y adems que est lo ms
pueden distinguir 3 zonas (figura 4): a)
prximo posible al lmite legislativo, para
zona donde se obtiene siempre una
reducir el nmero de falsos positivos,
respuesta
(figura 5).
negativa
de
(correctos
negativos), b) zona donde para una

misma concentracin se pueden obtener
tanto
respuestas
positivas
Regin de no fiabilidad o error

Zona de
correctos
negativos
como
negativas, corresponde a la zona de

falsos positivos y negativos, y c) zona
Zona de
Zona de
correctos
falsos
positivo
positivos
s
Lmite de corte = c c= 2ng/g
Concentracin
Fig. 5, Lmite de corte en el caso de un

contaminante
donde se obtiene siempre una respuesta

positiva (correctos positivos).
Como queda reflejado en las figuras,

alrededor del lmite de corte se sita una
zona o regin de error o falta de
Regin de no fiabilidad o error

Zona de
correctos
negativos
Zona de
falsos
positivo
s
Zona de
falsos
negativo
s
c= 2ng/g
fiabilidad (que en la literatura inglesa se
Zona de
correctos
positivos
denomina,
Concentracin
unreliability).
corresponde
Figura 4, Respuesta experimental de un test kit
al
Esta
zona
intervalo
de
concentraciones donde se obtienen los

En
el
ejemplo
contaminante
concreto
como
puede
de
un
ser
la
falsos positivos y negativos, por lo que

est definida por un valor superior e
inferior de concentracin de analito en
Aflatoxina B1, est claro que interesa no
muestra. Estos dos tipos de errores son
dar ningn falso negativo (decir que no
dos
hay analito cuando en realidad si lo hay),
caracterizacin
mientras que s podemos aceptar falsos
toda muestra que de una respuesta

analiza
un
en
la
sistema
de
1997]:
implicara un riesgo para la salud ya que

se
de
bsicos
screening y se definen como [Massart
positivos puesto que en ningn caso
positiva
parmetros
Falsos
posteriormente
negativos.
Corresponden
aquellas muestras que contienen uno o
mediante el mtodo confirmatorio. En

6
ms analitos por encima del valor lmite
La sensibilidad se define como la
permitido (lmite legislativo) y que al
capacidad o habilidad del sistema de
aplicar el test de screening dan una
screening de detectar muestras positivas
respuesta negativa. Es decir, como
cuando realmente son positivas. De
resultado del test de screening
se
forma similar, la especificidad se define
concluye que la muestra no contiene
capacidad o habilidad del sistema de
analito por encima del nivel mximo
screening
de
fijado
negativas
cuando
cuando
en
realidad
que
contiene.
Falsos
detectar
muestras
realmente
son
negativas.
positivos.
Corresponden
Finalmente, al igual que en los sistemas
aquellas muestra s que realmente no
de
contienen analito por encima del nivel
comprobarse que el mtodo que se
mximo permitido y que sin embargo el
utiliza para cribar tenga un lmite de
test de screening indica que estn por
deteccin inferior o igual al lmite de
encima de dicho nivel.
corte.
Hay
dos
parmetros
que
medida
cuantitativos,
debe
Mtodos para caracterizar un sistema
estn
relacionados con los lmites inferior y
de screening
superior de concentracin que definen la
Se han desarrollado varios mtodos que
zona
la
permiten caracterizar un sistema de
sensibilidad y la especificidad. Hay que
screening. Cada uno de ellos tiene
resaltar que, como ya se ha comentado
distinto grado de adaptacin a las
anteriormente, ambos se expresan como
diferentes situaciones y problemticas
probabilidades.
que pueden encontrarse, atendiendo al
de
no
fiabilidad
La
que
son
sensibilidad
est
relacionada con el valor superior de la
tipo de medida o resultado obtenido.
regin de no fiabilidad, mientras que la

especificidad lo est con el valor inferior
Dos de ellos se fundamentan en el
de dicha regin.
concepto de probabilidad y en dicho

sentido asocian una probabilidad al
resultado de la medida: las tablas de
contingencia y el teorema de Bayes

[McFall 1999]. Un tercer mtodo se basa
MUESTRA
S
Situacin real (mtodo cuantitativo)
en el establecimiento de las curvas

funcionamiento
[EURACHEM 1999], y finalmente, se

describe
un
mtodo
basado
en
Igual o
superior
Inferior
Total
tp
fp
tp+fp
Negativo
fn
tn
fn+tn
Total
tp+fn
fp+tn
Positivo
screening
de
Resultado
caractersticas
la
aplicacin de los tests de hiptesis

[Pulido 2002]. Este ltimo es similar al
Tabla 3, Tabla de contingencia con 2 categoras.
que se utiliza para el establecimiento de
Fp: falsos positivos, fn: falsos negativos, tp: total
los parmetros de calidad en el anlisis
positivos, tn: total negativos, N: nmero total de

ensayos realizados
cuantitativo.
Una de las ventajas ms importantes es
A continuacin presentamos los rasgos
su fcil aplicacin a mltiples tipos de
generales de cada una de los mtodos
bio-ensayos, campo en el que aparecen
sin pretender desarrollarlos, sino dar una
la mayora de las aplicaciones [Neil
idea general de cuando sera ms
1975, Hawass 1997].
adecuado adoptar cada una de ellos.
Cabe resaltar que estos parmetros dan
Tablas de Contingencia
Las
ms
diferencian
sencillas
las
son
las
que
muestras
en
dos
una medida global de la capacidad del

mtodo de screening. Esto significa que
se supone que la muestra problema a
categoras, positivo/negativo segn el
examinar
mtodo de screening, y establece una

tabla
de
comparacin
respecto
se
comportar
estadsticamente de forma semejante a
al
las ya analizadas, con lo cual no se
resultado obtenido mediante un mtodo
calcula una probabilidad de error para
de referencia o confirmatorio (tabla 3).
cada muestra en particular.
A partir de la tabla, se calculan los cuatro
Otro de los grandes inconvenientes es
parmetros bsicos, definidos en la
que la capacidad de la tabla depende del
seccin anterior: falsos positivos, falsos
nmero de muestras analizadas y el
negativos, sensibilidad y especificidad.
diseo
experimental
utilizado
para
elaborar la tabla, y que para el clculo de
Consiste en representar la probabilidad
los parmetros de calidad mencionados,
de
todas las muestras deben analizarse por
distintos niveles de concentracin. Esta
los dos mtodos, el de cribado y el
representacin
confirmatorio.
posicin y amplitud de la curva es
obtener
resultados
caracterstica
Teorema de Bayes
es
positivos
sigmoidal,
de
cada
a
la
sistema
de
screening (figura 6).
El teorema de Bayes se basa en la

teora de probabilidades por lo que,
desde el punto de vista analtico, la
Regin de Incertidumbre
Sensibilidad=P(X)
=1-FN=100-
100
terminologa utilizada es compleja y
100 -
presenta la dificultad del clculo de las

distintas probabilidades intermedias. En
N(x )
70
probability
probabilidad
90
80
60
P(X)
50
40
30
P(x)
20
10
concreto se calcula la probabilidad de
0
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
AFB1 concentration (ppb)
Especificidad= N(X)
=1-FP=
dar como vlido (positivo o negativo) un
2,2
2,4
Cut -off
Lmite de deteccin
resultado cuando en realidad es vlido,

Figura 6, Curva caracterstica de funcionamiento.
P(a/p). Esta probabilidad se denomina

condicional.
El
principal
inconveniente
de
este
Cabe destacar que una buena estima de
mtodo, al igual que se ha mencionado
la incertidumbre o probabilidad de error
en el mtodo de Bayes, es la elevada
mediante este procedimiento implica un
carga experimental ya que hay que
nmero elevado de muestras. Si se
realizar un nmero elevado de anlisis a
compara con las tablas de contingencia,
distintos niveles de concentracin.
el teorema de Bayes s permite una

estima individual (para cada muestra
Como ventaja, tal y como se refleja en la
analizada) de la incertidumbre asociada
figura 6, resaltar que adems de los
o probabilidad de dar un resultado
cuatro
errneo.
positivos, falsos negativos, sensibilidad y
parmetros
especificidad),
informacin
Curvas caractersticas
se
bsicos
obtiene
adicional
sobre
(falsos
mucha
las
caractersticas del mtodo de screening:
falsos positivos) es mayoritaria-mente
el lmite de corte, lmite de deteccin,
conocida y utilizada en los laboratorios
regin de incertidumbre, etc.
de anlisis, no ocurre lo mismo con la

probabilidad (probabilidad de cometer
Aplicacin de los tests de hiptesis
falsos negativos).
En este caso, se establece el valor de

respuesta
de
Adems, es un mtodo rpido y sencillo,
concentracin al que se quiere cribar
fcilmente automatizable, que permite la
(normalmente con un patrn) y para
asignacin
decidir si una muestra problema es
probabilidad de equivocarnos utilizando
positiva o negativa, se compara el valor
como tcnica de screening una tcnica
de respuesta instrumental de la muestra
instrumental. Como principal desventaja
problema
resaltar que no es directamente aplicable
establecido
instrumental
con
el
(del
valor
al
nivel
previamente
patrn).
de
una
incertidumbre
Esta
cuando la tcnica de screening aplicada
comparacin se realiza mediante tests
es un kit no instrumental o se basa en
de hiptesis [Pulido 2002].
una observacin visual no cuantificable

por parte del analista.
Como
ventajas
cabe
resaltar
la
familiaridad que desde un punto de vista

analtico se tiene de trabajar con los
tests de hiptesis. Si bien la probabilidad
de error (probabilidad de comete r
Referencias bibliogrficas
P. Feldsine, C. Abeyta, W. Andrews. AOAC International Method Committee.
Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Microbiological Official
Methods of Analysis. Draft, November 2000.
URL: http://aoac.org/vmeth/MicrobiologyGuidelines112700.htm
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Community, 12.2.2002, No. L 041, pp12-15.
10
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D.L. Massart, B.G.M. Vandeginste, L.M.C. Buydens, S. de Jong, P.J. Lewi, J.
Smeyers-Verbeke. Handbook of Chemometrics and Qualimetrics: Part A. Elsevier,
Amsterdam, 1997.
R.M. McFall, T.A. Treat. Annual Reviews Psychology; 50 (1999) 215-241.
EURACHEM. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, Draft: EURACHEM
Workshop, 2nd edition, Helsinki, 1999.
A. Pulido, I. Ruisnchez, R. Boqu, F.X. Rius. Analytica Chimica Acta, 455 (2002)
267-275.
B.J. Neil, E. Keeler, S. J. Adelstein. The New England Journal of Medicine, 293 (1975)
211-215.
N. E. Hawass. The British Journal of Radiology, 70 (1997) 360-366.
Los autores agradecen todos los comentarios relacionados con los contenidos de este
artculo. Pueden dirigirse, mediante mensaje electrnico, a la direccin:
quimio@quimica.urv.es. Una versin en soporte electrnico de este artculo e
informacin adicional puede encontrarse en http://www.quimica.urv.es/quimio
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Es bi en conocida la necesi dad de vali dar los m todos de anli si s y, e n co ncreto , e n

En los laboratorios de anlisis es cada

habitualmente sistemas de screening o

vez ms frecuente la introduccin de

de cribado. Desde el punto de vista

sistemas de medida de respuesta rpida

que generan respuestas ms de tipo

desarrollo de estos sistemas radica en

cualitativo que cuantitativo. La repuesta

que se utilizan como una etapa previa de

cualitativa suele ser binaria del tipo

cribado de las muestras (figura 1), de

SI/NO y puede responder a distintas

manera que se evita as que todas las

muestras sean sometidas a todo el

determinado analito en una muestra,

proceso de medida qumico. nicamente

presencia/ausencia por encima de un

concentracin) que habitualmente viene

respuesta sea un SI (positivo), aquellas

fijado por la legislacin o el cliente, etc.

en las que se detecte la presencia de un

analito o se detecte que est por encima

realiza en base a los sentidos humanos

del nivel permitido.

como pueden ser la vista, olfato, etc. El

Hay analito por encima de un determinado valor, XSL?

ms utilizado es la vista y la mayora de

sistemas se basan en la aparicin o no

de un determinado color como resultado

de una reaccin qumica, bioqumica o

En este tipo de sistemas, la respuesta

Figura 1. Sistemas de cribado (screening).

binaria SI/NO se obtiene de forma

directa, sin ningn tratamiento de los

datos. Generalmente , la presencia de un

Hacer clasificaciones siempre resulta

analito se determina por comparacin

difcil ya que depende de los criterios

respecto a un blanco (muestra sin el

que se utilicen. Si atendemos al tipo de

analito), por ejemplo si se obtiene un

sistema utilizado para la obtencin de la

determinado color hay analito, mientras

que si no se obtiene (color del blanco) no

diferenciar dos grandes grupos: anlisis

Dentro de este grupo de sistemas

cualitativo instrumental (Tabla 1).

Color: cambio, aparicin, etc.

dispositivos comerciales diseados para

UV-Vis, Fluorescencia, Potenciometra, etc.

Sensores : qumicos, bio- qumicos, etc.

algunos casos incluyen un sistema

Tabla 1. Tipos de sistemas de utilizados en el

El otro gran grupo es el que hemos

En el anlisis cualitativo clsico la

deteccin es de tipo sensorial y se

instrumental. En este caso, la deteccin

que los test kits, la deteccin puede ser

se realiza en base a una medida