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html#kin
Enzima remanente
activa (%)
100.0
100.0
10
92.2
77.8
20
93.9
56.8
30
88.4
46.3
40
76.2
36.6
60
72.1
20.4
90
60.8
9.1
120
54.6
4.3
Sugerencias:
a)Demuestre que la cintica de inactivacin es de primer orden aparente y calcular la constante de
primer orden y la vida media (no olvide las unidades).
b)Determine si la constante de primer orden vara con la concentracin del reactante CHD y
escriba una expresin para la velocidad que incluya a todos los reactantes.
c) A partir de esta ecuacin identifique que es lo que vara en cada experimento y lo que se
mantiene constante y diga porque la cintica aparece como si fuese de primer orden.
tiempo (min)
Absorbencia
0.00
1.34
0.10
1.28
0.20
1.26
0.30
1.22
0.50
1.16
0.85
1.10
1.50
1.02
2.00
0.99
http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/webprobs/main.html#kin
----------regresar al ndice de la seccin -------------------regresar al ndice general------------
[enz] (l)
Vel
(nmol/min)
1.920
6.307
10
4.059
13.169
15
5.956
19.145
20
7.766
25.694
25
9.479
32.282
30
11.844
37.882
4-Cintica de una enzima. La actividad de la Acetil-CoA carboxilasa, medida con tres diferentes
concentraciones de enzima y a diferentes concentraciones de sustrato fu la siguiente:
[Enz] (g de
protena)
0.1
0.2
[AcetilCoA] (M)
0.5
0.05
0.275
0.546
1.373
0.14
0.482
1.001
2.502
0.23
0.580
1.185
2.891
http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/webprobs/main.html#kin
0.32
0.642
1.385
3.463
0.50
0.755
1.494
3.656
0.59
0.766
1.497
3.810
http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/webprobs/main.html#kin
[OxG] = 0.5 mM
[OxG]
(mM)
Vel
(mol/min)
[Asp]
(mM)
Vel
(mol/min)
[Asp]
(mM)
Vel
(mol/min)
0.002
0.444
0.007
0.411
0.007
0.468
0.018
2.031
0.048
1.268
0.048
2.017
0.037
2.781
0.171
1.722
0.171
3.317
0.063
3.336
0.335
1.850
0.335
3.866
0.094
3.756
0.547
1.983
0.547
4.123
0.493
4.324
1.016
2.031
1.016
4.324
(mol/s)
0.40E-08
0.0410
10
7.74E-09
0.0464
15
1.31E-08
0.0476
20
2.09E-08
0.0497
25
3.52E-08
0.0530
30
5.74E-08
0.0598
http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/webprobs/main.html#kin
0.403
0.307
25
0.375
0.322
30
0.335
0.340
35
0.305
0.362
45
1.500
0.013
9- Efecto del pH sobre la Vmax. Los siguientes valores de velcidad inicial de enzimas fueron
obtenidos para la -Quimotripsina actando sobre un sustrato artificial (ester etlico de acetil-Ltriptofano):
pH Vel (unidades
pH Vel (ui)
internacionales)
5.4 10
6.8 192
5.6 19
7.2 260
5.8 32
7.4 280
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6.4 99
7.8 300
6.5 112
8.0 328
6.6 141
8.4 331
9.0 327
a) Determine los valores de pKa(s) del (los) grupo(s) involucrado(s) en este comportamiento.
b) Diga que residuos de aminocido podran responsables de esta respuesta.
c) Si el experimento se extendiera hacia la regin ms alcalina de la escala de pH que cabra
esperar (explique su respuesta).
a) El tipo de inhibicin.
b) El valor de Km y Vmax.
c) El valor de Ki para el inhibidor.
[Bromolevamisol]
0
8
16
40
(M)
[Sustrato]
[FP](mM)
Velocidades iniciales
-1
(mol min-1 mgProt. )
0.1
0.231
0.210
0.191
0.158
0.3
0.431
0.369
0.309
0.239
0.7
0.607
0.488
0.425
0.277
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1.3
0.751
0.599
0.467
0.304
1.8
0.811
0.657
0.530
0.319
2.6
0.912
0.657
0.546
0.328
4.1
0.957
0.688
0.561
0.351
5.8
0.981
0.741
0.558
0.344
Velocidades
iniciales
0.6
0.59
0.48
0.38
0.24
1.4
1.12
0.91
0.78
0.51
2.9
1.63
1.43
1.19
0.87
5.2
1.94
1.70
1.64
1.19
8.0
2.19
1.94
1.94
1.56
10.3
2.28
2.06
1.99
1.74
16.0
2.32
2.33
2.24
1.89
25.1
2.62
2.53
2.25
2.09
[PEP] (M)
75
Velocidad
[FSM] (M)
200
Velocidad
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0
5
10
25
50
100
(nmol min-1
mgProt-1)
0.73
0.53
0.42
0.26
0.16
0.09
(nmol min-1
mgProt-1)
2.49
2.29
2.15
1.78
1.4
0.98
1. 1.- En este problema se nos pide analizar como progresa la inactivacin de una
enzima en el tiempo. Aqu, la ciclohexanodiona (CHD) es un reactivo que modifica
qumicamente con la enzima y el producto de esta reaccin es una protena que
pierde su actividad enzimtica original. Por tanto, en este experimento, la enzima es
un reactante y su actividad enzimtica es el recurso metodolgico que sirve para
evaluar la concentracin remanente de protena no modificada por la CHD, en cada
uno de los tiempos muestreados.
Se puede determinar si la reaccin qumica es de primer orden, o se encuentra en
condiciones tales que progresa como si lo fuese (aunque estrctamente no lo sea); ello
gracias a que la reacciones con cintica de primer orden (o de pseudoprimer orden)
muestran una relacin lineal entre el logaritmo natural de la concentracin de
reactante remanente y el tiempo transcurrido. De modo que, si obtenemos los
logartmos de los valores de concentracin de la enzima remanente (no importa que
se trate de un porcentaje) resultan las siguientes grficas.
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2.- Para resolver este problema es necesario observar que la absorbencia registrada
representa la desaparicin del NADH, que es el sustrato de la reaccin. En este caso
la estequimetra de la reaccin implica que por cada evento de reaccin, una molcula
de NADH desaparece y, por tanto, lo que necesitamos hacer para calcular la
velocidad es determinar el Cambio de absorbencia del NADH por unidad de tiempo,
para luego convertirlo a cambio de concentracin de NADH mediante la ley de
Lambert-Beer:
A=cl
A = c l
c = A/(e l)
c/t = (A/t)/( l)
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As, con una pendiente inicial de -0.3297 Uabs/min y una longitud para el paso de luz
de la celda del espectrofotmetro de 1 cm (l) se obtiene una velocidad de desaparicin
de NADH de 5.310-5 M min-1, lo que en 3 mL del volumen de cubeta representa
(5.310-5 mol L-1 min-1) (310-3 L) = (1.5910-7 mol min-1).
Las unidades internacionales (UI) de actividad enzimtica son moles de producto
formado o reactante consumido por minuto, de modo que si 1 mol equivale a 106
mol, la velocidad ser (v = 1.5910-1 mol min-1) 0.159 UI.
Finalmente, la actividad especfica es l actividad enzimtica dividida por la
concentracin de protena, es decir a.e. = 0.159 UI/35 ng, pero debido a que la
concentracin de protena suele expresarse en mg: a.e. = 0.159 UI / 3510-6 mg = 4543
UI/mg de protena.
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cantidad de ciertas enzimas presentes en los alimentos, cuya actividad puede ser
indeseable, o bien, puede ser aadida ex professo para modificar las propiedades de
los preparados alimenticios. Todo ello, mediante un ensayo enzimtico, generalmente
sencillo, que tan slo requiere como condicin que la concentracin de sustrato
empleada, as como otras condiciones (pH, temperatura, etc.), sean estandarizadas
adecuadamente.
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Este valor nos dice que una molcula de enzima es capz de convertir 33300
molculas de sustrato a poducto por segundo y es equivalente a la actividad especfica
de una enzima pura (VMAX/[Protena]), excepto por la unidades empleadas. Dado que
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para determinar este ltimo nmero no necesitamos una estimacin exacta del peso
molecular de la enzima, no del nmero de sitios activos por molcula de protena, este
valor es el ms frecuentemente reportado en diversas tablas de parmentros cinticos
y propiedades de enzimas. Sin embargo, cuando la preparacin no es pura el
denominador de este conciente ser mayor, debido a la contribucin de los
contaminantes a la cantidad total de protena, en consecuencia, la actividad especfica
disminuir. De este modo, la actividad especfica es un buen indicador del grado de
pureza de una preparacin enzimtica.
5.- En este problema se nos pide determinar la actividad como fraccin de la VMAX
para la enzima invertasa, la manera ms simple de proceder es reordenar la ecuacin
de Michalis y Menten como sigue:
Lo que nos indica que se alcanza el 33% de la VMAX, como VMAX = kCAT ET , se tiene
vel = 175 min-1 2.5 10-6 mol 0.33 = una actividad de 0.00146 mol min-1. Ahora,
segn lo abtenido arriba, para obtener un 95 % de la VMAX bastar con que S/(KM +
S) = 0.95, de donde al despejar S tendremos S= KM 0.95/(1-0.95) = 19 KM. Lo que
significa que habr que aadir 19 x 0.5 mM = 9.5 mM de sacarosa para que la
actividad alcance este valor.
Este problema sugiere que la cantidad de sustrato es uno de los factores importantes
a considerar cuando se desea emplear una enzima para aplicaciones inductriales. En
otras palabras, si el producto a tratar, que en este caso podra ser un almibar hecho a
base de sacarosa, posee un cancentracin de sustrato muy baja, o sea que nuestro
jarabe est muy diludo, deberemos aadr mucha ms enzima, puesto que sta estara
trabajando muy por debajo de su capacidad mxima. Por otro lado, una alternativa
para ahorrar enzima, sera tratar el jarabe concentrado y luego aadir el agua y los
otros componentes de su almibar, para tener el producto final.
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6.- En este problema se pide calcular KM y VMAX para una enzima que posee dos
sustratos. En este caso, podemos variar la cancentracin de oxoglutarato y mantener
la concentracin de aspartato constante y viceversa. El problema consiste en saber
que concentracin de aspartato debo emplear cuando varo el oxoglutatato y que
concentracin de oxoglutaroto es recomendable mantener, al variar el osoglutarato.
Aqu, existen dos valores para la KM, dado que este valor representa la cocentracin
de sustrato que ocupa 50% de los sitios activos de la enzima en el estado estacionario,
sin embargo, se pueden ocupar estos sitios activos con ambos sustratos y, por tanto,
habr una KM(oxoglutarato ) y otra KM(aspartato).
La figura sigiente muestra la grfica de velocidad contra concentracin de sustrato
(panel izquierdo, para los 3 experimentos) y la de 1/v vs 1/s (panel derecho).
Puede observarse que las curvas y las rectas correspondientes a los experimentos 1 y
3 extrapolan a la misma VMAX, este es el primer diagnstico. La VMAX es la velocidad
de catlisis cuado la enzima se encuentra saturada con sus sustrato, pero dado que
aqu hay dos sustratos, habr que saturar con ambos. Esto significa que cuando
variamos la concentracin de aspartato, la concentracin de oxoglutarato debe estar
saturante desde el primero hasta el ltimo tubo medido y viceversa. Si esto no se
asegura, entonces el resultado ser como el mostrado en el experimento 2, en el que la
VMAX determinada es considerablemente inferior al valor real, decimos que se trata
de un valor aparente. Ahora -cmo sabemos que la concentracin de un sustrato es o
no saturante?- bueno, como se vi en el problema anterior, nosotros nos
aproximamos al 95% de la VMAX cuando la concentracin de sustrato es 19 veces KM.
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7.- En este problema se nos pide calcular la energa de activacin de Arhenius, para
ello, el procedimiento ms sencillo es el obtener una grafca de Log(k) vs. 1/T
(absoluta) y la pendiente de esta grafica ser igual a -Ea/R (siendo R la constante
universal de los gases). En este caso no tenemos el valor de k, sino tan slo el valor de
la velocidad de reaccin. Sin embargo, la pendiente de una grfica de Arhenius es:
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8.- Este es un problema en el que lo que tenemos que hacer es muy semejante a lo que
hicimos en el problema anterior. Aqu sin embargo hay que determinar que datos
debemos usar. Dado que la grfica de Arhenius implica la relacin entre Log(k) vs
1/T absoluta, y k es una constante de velocidad, debemos identificar aqu la constante
de velocidad relacionada con el proceso de catlisis, esta el la kCAT. La KM como
puede verse, tambin puede ser modificada por la temperatura, debido a que su valor
es una relacin de varias constantes de velocidad (vease la definicin de KM en la
deduccin de la ecuacin de Michaelis y Menten), por tanto, al cambiar la
temperatura las constantes de velocidad cambin y esto afecta el valor de KM. Esto es
lgico, ya que la temperatura tambin puede afectar la unin del sustrato a la
protena y este proceso se refleja en el valor de KM.
Ahora, en adicin a lo anterior, se puede identificar en la siguiente figura que a las
temperaturas ms altas se observa un claro efecto de desnaturacin de la protena y
por tanto una caida en la catlisis. Dado que la energa de activacin que deseamos
medir es la del proceso cataltico, debemos considerar slamente los puntos que
reflejan el efecto de la temperatura sobre la reaccin catalizada y no acusan an
efectos sobre la reaccin qumica paralela de desnaturalizacin de la protena:
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9.- En este problema se nos pide determinar el valor del pKa del grupo involucrado
en la respuesta de la enzima frente al pH. As, haciendo una grfica de la actividad
frente al pH, se obtiene la curva siguiente (lnea contnua):
Esta curva es equivalente a una curva de titulacin como las que se ven cuando se
aade base a un cido debil en solucin y se siguen los cambio de pH, slo que aqu,
en lugar de equivalentes de base aadida, lo que estamos modificando el el pH y
observando los equivalentes de enzima activa presentes. Dado que el intervalo de pH
empleado no es muy extremo, es de esperarse que la cada en la actividad hacia el pH
de 6, se reflejo de que la mayora de la enzima no est en su forma inica
catalticamente competente, por lo que no manifiesta su actividad, pero es
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10.- parte a. En este problema, podemos graficar los valores de velocidad frente a la
concentracin de sustrato para las series obtenidas sin y con las distintas
concentraciones del inhibidor. Esto se muestra en la figura que sigue, en el panel
inferior izquierdo. Aunque es posible estimar los valores de Km y Vmax (en ausencia
del inhibidor) y los valores de las constantes aparentes en presencia del inhbibidor en
esta figura, el estimado ser difcil de hacer, debido a que la Vmax es una valor lmite
que debe extrapolarse y el valor de Km debe estimarse una vez que se conoce la
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Vmax, lo que significa que un mal estimado de Vmax dar un mal estimado de Km.
Una manera sencilla de resolver este problema es realizar la grfica que se presenta
en el lado izquierdo de la figura, la representacin de 1/v vs. 1/s propuesta por
Linewaver & Burk permite, unindo los puntos con una recta, determinar los valores
de 1/Vmax a partir de la intercepcin con el eje ordenado y -1/Km a partir de la
intercepcin de la recta extrapolada al eje de las abscisas. Aunque existen otras
formas de graficar estos datos que pueden ser ms convenientes desde el punto de
vista del estimado numrico obtenido, esta es la ms extendida en la literatura.
a) A partir de la representacin mostrada en el panel derecho de la figura, puede
tambin determinarse el tipo de inhibidor que se tiene, que en este caso es
acompetitivo (tambin llamado incompetitivo), dado que las rectas que unen cada
una de las series de puntos son paralelas. Note que aqu de poco sirve emplear un
anlisis de regresin lineal, dado que los errores experimentales provocan que las
rectas obtenidas por regresin no presenten la misma pendiente. En estos casos, una
vez que se ha decidido que los puntos realmente representan rectas paralelas, lo
mejor es tomar una regla y trazar todas las recta paralelas buscando que el conjunto
de lneas realmente describan, tan cercnamente como sea posible, el conjunto de
puntos experimentales.
b) Aqu, el nico valor de Vmax para la enzima es el determinado en ausencia del
inhibidor (). Es decir 1/Vmax = 0.965 (mol-1 min mg prot) Vmax = 1.04 (mol
min-1 mg prot-1). Los valores obtenidos con las otras rectas representan tan slo
parmetros cinticos aparentes cuyo valor refleja las alteraciones impuestas sobre la
actividad enzimtica por la presencia del inhibidor. Km se determina por
consiguiente del valor de la intercepcin con las absisas de esta misma recta i.e. 1/Km = -2.4 mM-1 Km = -1/-2.4 mM = 0.417 mM de p-nitrofenilfosfato. Esto
significa que cuando la concentracin de p-nitrofenilfosfato en el medio de reaccin
(al pH y temperatura empleados en este experimentos) alcanzan 0.417 mM, el 50% de
los sitios activos de la enzima se encontrarn saturados y por tanto la actividad der
igual a la mitad de la mxima que puede observarse en dichas condiciones.
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valores de Ki. Si todas las rectas se cortasen en un punto sobre el eje "X", esto
significara que Kiu y Kic son numricmente idnticos, pero esta coincidencia no es el
caso ms comn.
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