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Avances en la Crioconservacin del Embrin Equino

Dra Aurlie Allard


DVM, Diplomate of the European College of Animal Reproduction

Introduccin
La congelacin del embrin equino es un desafo. Desafo para los investigadores y desafo para los
veterinarios de campo debido a los pobres resultados obtenidos (ndices de preez decepcionantes
despus de la transferencia de embriones congelados), la dificultad de la tcnica y su costo. En 2010, y a
diferencia de otras especies, solamente 2% de los embriones colectados fueron crioconservados en el
mundo (Stout, 2012). Sin embargo, la crioconservacin de embriones permitira liberarse de la
sincronizacin costosa, pesada y poco eficaz entre donantes y receptoras, y aplazar la transferencia de
los embriones a fin de programar los nacimientos en la mejor poca del ao. De manera general, la
crioconservacin de embriones permite salvaguardar especies silvestres amenazadas, creando
criobancos de embriones, y desarrollar el intercambio de material gentico. La primera cra nacida
proveniente de la transferencia de un embrin congelado mediante congelacin lenta fue reportada en
1982 por Yamamoto. Desde entonces, han sido muchas las investigaciones para conseguir una tcnica
rpida, sencilla, fiable y de bajo costo que permitiese obtener unos ndices de preez y de partos
aceptables. Casi 30 aos despus del primero nacimiento fue reportado el nacimiento de una cra
proveniente de la transferencia de un embrin vitrificado por Scherzer en 2011, 17 aos despus de la
primera preez luego de la transferencia de un embrin vitrificado (Hochi et al, 1994). Por qu es tan
complicado lograr la crioconservacin de los embriones equinos? Cules son los daos debidos a la
congelacin y cules son los medios de proteccin? Cules son las tcnicas a la disposicin del
veterinario de campo? Cules son las particularidades del embrin equino que podran explicar la
dificultad de la tcnica y los ltimos avances en investigacin?

Los daos debidos a la crioconservacin


Principalmente, la formacin de cristales de hielo es la ms daina. Los cristales se forman en las
soluciones de mantenimiento y dentro de las clulas del embrin a partir del agua intracelular libre.
Formndose, los cristales de hielo intracelulares aumentan de volumen y daan a los orgnulos y el
citoesqueleto.
Para luchar contra la formacin de cristales de hielo, se usan crioprotectores. Son de dos tipos:
penetrantes o no penetrantes. La finalidad de los crioprotectores en el proceso de congelacin es
proteger al embrin de la formacin de cristales de hielo por medio de un efecto de deshidratacin
celular.
Los crioprotectores penetrantes ms comunes en la congelacin de embriones equinos son el glicerol,
el etilenglicol, el dimetilsulfxido y el propilenglicol.
Estos crioprotectores, al entrar en la clula, se sustituyen al agua intracelular, reduciendo la
cristalizacin. Desafortunadamente, su uso est limitado por su toxicidad: el shock osmtico durante la

exposicin y la deshidratacin celular resultante. La presin osmtica de estas molculas es bastante


superior a la del agua. Entonces, en presencia del crioprotector, el agua intracelular sale por osmosis
ms rpido que el crioprotector que penetra la clula. De la misma manera, cuando un embrin pasa de
un bao de solucin de crioprotector a un bao de solucin sin crioprotector, el agua del medio entra
ms rpido que el crioprotector que sale. Por esta razn, al aadir y retirar los crioprotectores se debe
realizarlo por etapas en baos de soluciones de crioprotectores de concentracin creciente y
decreciente respectivamente, durante un periodo de uno a veinte minutos (dependiendo de la tcnica
utilizada) (Bruyas 2011).
Diferentes concentraciones, y combinaciones de ellos han sido estudiadas y comparadas en busca de la
frmula que permita un proceso de congelacin y descongelacin rpido, sencillo y sobretodo, que no
dae el embrin. Parece que el crioprotector ms permeable en el embrin equino es el etilenglicol
(Pfaff et al, 1993), as como el menos txico. Y en los ltimos aos, conjuntamente con el glicerol, es el
crioprotector que est dando mejores resultados. El empleo de crioprotectores, solos o en combinacin
con otro crioprotector penetrante, as como con los no penetrantes, es cada vez ms frecuente sea cual
fuere la tcnica de congelacin utilizada (Bruyas, 2011).
Los crioprotectores no penetrantes (sucrosa, galactosa, sacarosa) aumentan la presin osmtica del
medio de cultivo sin penetrar en la clula. Son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de
las membranas. Deshidratan, junto con el crioprotector penetrante, las clulas de los embriones
durante la exposicin y limitan los movimientos de agua en las etapas de retiro del crioprotector
intracelular (Bruyas, 2011).

Las tcnicas disponibles: Congelacin lenta y Vitrificacin


La congelacin lenta consiste en la exposicin del embrin a concentraciones crecientes de
crioprotectores a temperatura del ambiente antes de proceder a un enfriamiento lento y contralado:
1. Poner el embrin en un medio de cultivo (EmCareTM Holding mdium, SYNGRO Holding Media,
EquiProTM Holding Medium) antes de empezar las etapas de aadido del crioprotector.
2. Aadido del crioprotector en etapas de concentracin creciente hasta 10% v/v (equivalente a
1,3M etilenglicol o 1,5M glicerol): 2,5%, 5%, 7,5% y 10% v/v. Cada etapa demorando 5 a 10
minutos.
3. Se carga el embrin en una pajuela francesa de 0,25 ml, de la siguiente manera: 90 l de
solucin de mantenimiento, 5-10 l de aire, 50 l de solucin de congelacin con el embrin, 510 l de aire, 90 l de solucin de mantenimiento.
4. Sellar la pajuela con un tapn de PVC en el extremo opuesto al algodn.
Congelacin lenta en el congelador programable:
De la temperatura del ambiente hasta -6/-7C a 3C/min
A -6/-7C, se realiza el seeding, a fin de iniciar la cristalizacin y terminar el fenmeno de
sobrefusin (proceso de enfriar un lquido por debajo de su punto de congelacin sin que este
se haga slido)
A continuacin se desciende la temperatura hasta -30, -33 o -35C a 0,3-0,5C/min.

Introducir la pajuela en nitrgeno lquido a -196C para su almacenamiento.


Para descongelar la pajuela, colocarla en un bao Mara a 35-37C durante 30 a 60 segundos.
Retirar el crioprotector pasando el embrin por baos de concentracin de crioprotector decreciente
(de 10% a 0% v/v). En estas etapas, se aade la sucrosa a 1M (Bruyas, 2011).
En la tcnica de transferencia directa, sin retiro del crioprotector, la solucin de mantenimiento aadida
en la pajuela es un crioprotector no penetrante tipo sucrosa. Sacar la pajuela del bao Mara, secarla y
agitarla suavemente para mezclar los medios (de la misma forma que se agita un termmetro). El
embrin en la pajuela est listo para proceder rpidamente a la transferencia (Hochi et al, 1996).

La vitrificacin es un procedimiento mucho ms rpido y se puede realizar bajo condiciones de campo.


La pajuela conteniendo el embrin est directamente sumergida en el nitrgeno lquido. El descenso de
temperatura es entonces de -2500C/min. Se forma un estado vtreo evitando la formacin de cristales.
Como en la congelacin lenta, este proceso requiere la exposicin secuencial del embrin a soluciones
de concentracin creciente de crioprotector, pero mucho mayor.
1. Exposicin secuencial a temperatura del ambiente. Solucin de vitrificacin 1 (VS1) (1,4M de
glicerol) por 5 minutos. VS2 (1,4M glicerol + 3,6M etilenglicol) por 5 minutos. VS3 (3,4M glicerol
+ 4,6M etilenglicol) por 1 minuto.
2. Durante este minuto en VS3, cargar el embrin en la pajuela.
3. Colocar la pajuela en un gobelet puesto en nitrgeno lquido por 1 minuto y luego sumergir el
gobelet con la pajuela (Carnevale et al, 2004).
La descongelacin se realiza segn el crioprotector empleado y la concentracin de ste como para la
congelacin lenta, por dilucin seriada, exponindolo a concentraciones decrecientes de crioprotector.
Existe tambin una tcnica de transferencia directa. Por eso, durante el minuto en VS3, se aspira de
ambos lados del embrin la solucin de descongelacin conteniendo el crioprotector non penetrante
(Eldridge-Panuska et al, 2005).

Cules son las particularidades del embrin equino que podran explicar la
dificultad de la tcnica?
Calidad del embrin
La calidad del embrin recuperado es importante, ya que slo son aptos para la congelacin los
embriones de grado I (excelente) o grado II (bueno), segn la clasificacin de Mckinnon y Squires (1988).
Afortunadamente, la gran mayora de los embriones recuperados son de buena calidad.
Tamao y edad del embrin
El tamao y el estado de desarrollo del embrin recuperado son factores claves en el xito de la
congelacin de embriones equinos. En efecto, los mejores resultados se obtienen cuando se congelan

mrulas o blastocistos tempranos, con un dimetro medio menos de 300 m comparativamente a los
blastocistos y blastocistos expandidos con un dimetro de ms de 300 m.
A los 5,5-6 das despus de la ovulacin, el embrin equino, en estado de mrula, entra en el tero y
empieza una fase de mitosis intensa (eso supone que las mitocondrias y el citoesqueleto son ms
expuestos a los daos debidos a la congelacin). La mrula evoluciona en blastocisto temprano con el
inicio de la formacin del blastocele. Tambin, al entrar en el tero, una capa glicoproteica se forma
entre el trofoblasto y la zona pelcida adelgazada: la capsula.
Entonces, los embriones recuperados por lavado tero a un medio de 6,5 das despus de la ovulacin
miden menos de 300 m, no tienen desarrollados el blastocele ni la capsula. Al contrario, los
blastocistos recuperados por lavado a los 7-8 das miden ms de 300m, tienen un blastocele grande y
una capsula espesa. Estas caractersticas tienen mucha importancia, ya que los cambios de volumen del
embrin, la cantidad de agua y la permeabilidad a los crioprotectores vara enormemente a medida que
el embrin se va desarrollando. Los embriones ms grandes (blastocisto y blastocisto expandido) no
toleran bien el proceso de congelacin-descongelacin, producto de un mayor ndice de muerte celular
y alteracin de las orgnulos. Estos daos son debidos a la presencia de la capsula glicoproteica que
rodea al embrin a partir del estado de blastocisto, impidiendo la adecuada difusin del crioprotector a
las clulas de la masa interna (Kingma et al, 2011). Los estudios sobre la capsula demuestran que un
tratamiento enzimtico de la capsula permite una mejor penetracin del crioprotector pero una menor
viabilidad in vivo tras transferencia (Legrand et al, 2003). Adems, el desarrollo del blastocele,
condiciona el proceso de deshidratacin, aumentando las probabilidades de formacin de cristales
intracelulares durante la congelacin que posiblemente daen las clulas embrionarias.
El problema es que la recuperacin de embriones de 6,5 das es difcil con ndices de xito de recolecta
bajos. Desafortunadamente, los ndices de preez tras transferencia son de por medio de 55%. Lo ideal
sera de encontrar la maneja de congelar con xito los embriones colectados a 7 o 8 das, cuando los
ndices de xito de colecta son superiores.
Recientes trabajos de Hinrichs y Choi sobre las biopsias de embriones en el fin de realizar una muestra
para el diagnstico gentico preimplantacional (DGP) han demostrado que el colapso del blastocele
inducido por la muestra de trofoblasto no afecta los ndices de preez tras transferencia (Hinrichs y
Choi, 2012). De estos resultados, se intent vitrificar los embriones luego colapso del blastocele con
etilenglicol y sucrosa. Mostraron que mientras ms colapsado est el blastocele, mejores sern los
ndices de preez. El mtodo de aspiracin del lquido es importante. Es preferible aspirar el lquido
desde la periferia (el trofoblasto), que entrar hasta el centro del blastocele. Con esta tcnica, se han
logrado ndices de preez muy buenos (86%) tras la aspiracin del blastocele y posterior vitrificacin,
poniendo de manifiesto la importancia de una disminucin de volumen en el proceso de
crioconservacin (Choi et al, 2011).

Conclusin
Desde hace los ltimos 30 aos, solo la crioconservacin de los embriones de menos de 300m de
dimetro permita ndices de preez del 50% en promedio luego de la transferencia. Comparando la

vitrificacin con la congelacin lenta, las dos tcnicas son aplicables en el campo con ndices de preez
similares. Por su rapidez de ejecucin y el hecho que permite una inversin moderada
comparativamente al costo de la compra de un congelador programable necesario para la congelacin
lenta, la vitrificacin es la ms practicada en el campo con embriones colectados a los 6,5-7 das.
Aunque se necesita el uso de soluciones de crioprotectores a alta concentracin toxica para el embrin
y se requiere experiencia en el manejo de los embriones. En lo que se refiere a los embriones de ms de
300 m de dimetro, son constituidos de un blastocele lleno de lquido y tienen una capsula que los
rodea e impide la penetracin de los crioprotectores. Adems representan un grande volumen. Hasta
hace poco tiempo, estos embriones no sobrevivan a la congelacin. Reciamente, Hinrichs y Choi, al
desarrollar el DGP, encontraron la manera de congelar blastocistos expandidos sacndoles el lquido del
blastocele previamente a la vitrificacin. Desafortunadamente, la tcnica de colapso del blastocele
implica el uso de un micromanipulador, reservado a los laboratorios especializados. El desarrollo de la
congelacin del blastocisto a nivel comercial supondra un gran paso para la industria de la
reproduccin equina y los investigadores han dado un paso muy importante con los ltimos resultados.
Quiz falta poco para estandarizar y adaptar la tcnica al campo !
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