HIBRIDACIN INSITU FLUORESCENTE (FISH)

Fundamento
Es una tcnica molecular que puede ser complementaria al cariotipo y permite localizar un
determinado fragmento de ADN de inters particular, y que no siempre es observable al
microscopio. sta tcnica pone de manifiesto la presencia o ausencia de secuencias
gnicas especficas. Se puede aplicar sobre ncleos interfsicos de extensiones celulares
o cortes de tejido o directamente en cromosomas.

Mtodo

Generacin de cidos nucleicos marcados para una deteccin subsecuente. 2.

Fijacin de tejidos (seccionados), preparacin de cromosomas.

Preparacin del tejido para incrementar el acceso del cido nucleico marcado.

Hibridacin de la sonda marcada en cromosomas o tejidos.

Lavados selectivos que remuevan las sondas que no hibridan.

Deteccin de la sonda marcada, revelando la localizacin celular de los cidos

nucleicos.
Ventajas
Proporciona una resolucin considerablemente superior a la de las tcnicas de bandas de
alta resolucin
Pueden detectar aneuploidias empleando cromosomas en interfase.

Desventajas
Tcnica costosa.
Requiere un espacio amplio.
El tiempo de estandarizacin puede ser prolongado.

MTODO ENZIMTICO (SANGER)

Fundamento
Se emplea anlogos de dNTPs especficos de determinacin de cadena sencilla. Los
anlogos ms utilizados son los ddNTPs. Estos se incorporan en la cadena de ADN en
crecimiento por medio de ADN polimerasa, pero acta como determinadores porque una
vez incorporados a la cadena, y al no contar con OH en el extremo 3, no permite que se
una otro nucletido.

Mtodo

Aislamiento y clonacin del ADN.

Desnaturalizacin del ADN.

Marcaje radioactivo 32P o 32S.

Alineacin del indicador y molde de ADN.

Divisin de 4 parte de la mezcla.

Adicin de ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP (Uno en cada tubo).

Anlisis de secuencia fragmentada por electroforesis en gel de poliacrilamida.

Ventajas
1. Se realiza en poco tiempo.
2. Son ms puras.
3. Fragmento de ADN de todos los tamaos.
Desventajas
1. Empleo de cadena sencilla.
2. Se detecta a partir de 10-20 nucletidos.
3. Dificultad en conseguir los ddNTPs.

PIROSECUENCIACIN
Fundamento
Es un mtodo de secuenciacin de ADN basado en la monitorizacin a tiempo real de la
sntesis de ADN. Es una tecnologa que permite determinar una secuencia de ADN a gran
escala, aplicable a genomas completos, mediante luminiscencia. Se basa en la deteccin
de la liberacin de pirofosfato cuando se incorporan los nucletidos.
Mtodo

Se Fragmenta el ADN a secuenciar mediante nebulizacin.

Mediante una emulsin de aceite se generan microesferas, a las que se
intenta que est atado un nico fragmento de ADN.
En cada microrreactor se encuentran los elementos necesarios para la
reaccin de PCR: oligonucletidos, dNTPs, polimerasa y un nico
fragmento de ADN molde.
Mediante la amplificacin por PCR, se generan muchas copias del mismo
fragmento de ADN original.
Despus se liberan las cuentas de la emulsin y se colocan en placas
donde se procede con la secuenciacin. Para realizar la secuenciacin se
vierte la emulsin sobre una fase slida con celdillas. En cada una de
estas celdas se produce una pirosecuenciacin. La secuenciacin

completa se lleva a cabo aadiendo uno de los cuatro nucletidos y

observando qu celdilla se ilumina.
Despus de cada adicin de nucletidos se lava y se aade el siguiente
nucletido. Este proceso se repite hasta completar la secuencia.

Ventajas

Mtodo rpido y en tiempo real.

Diseo de primer flexible.
Rapidez en preparacin de la muestra.
Costos bajos de reactivos.
Uso de marcadores fluorescentes.

Desventajas
No genera secuencias largas.
Problemas para medir homopolimeros.

SECUENCIACIN SOLID
Fundamento
Es una tcnica de secuenciacin de ltima generacin. Es otro mtodo que emplea una
ADN ligasa en lugar de una polimerasa. Este mtodo utiliza un reservorio de todos los
oligonucletidos posibles de una longitud dada, marcado de acuerdo con la posicin
fragmentada, por su secuencia especifica produce una seal correspondiente a la
secuencia complementaria.
Mtodo

Unin del primer y ligar.

Emitir fluorescencia.
Coronar hebras inextensas.
Extender la cadena y liberacin de OH.
Repetir paso 1-4 hasta extender secuencia.
Reinicio de cebadores.
Repetir los pasos de 1-5 con nuevo primer.
Deteccin por color especifico.

Ventajas
1. Secuencia efectiva.
2. Aumento de capacidad.
3. Bajo costo.
Desventajas
1. Equipo muy sofisticado.
2. Tcnica que usa diferentes colores.

SECUENCIACIN ILLIMINA
Fundamento
Se utilizan nucletidos terminadores marcados con molculas fluorescentes. Adems de
la paralizacin masiva (Millones de secuencias en cada corrida), la diferencia con el
mtodo convencional es la posibilidad de eliminar la fluorescencia una vez obtenida la
imagen, y desbloquear carbono 3 de modo que pueda aceptar una nueva base para
continuar la reaccin de secuenciacin, haciendo que la incorporacin de un nucletido
terminador sea reversible.

Mtodo
Se utilizan nucletidos terminadores marcados con molculas fluorescentes. Adems de
la paralizacin masiva (Millones de secuencias en cada corrida), la diferencia con el
mtodo convencional es la posibilidad de eliminar la fluorescencia una vez obtenida la
imagen, y desbloquear carbono 3 de modo que pueda aceptar una nueva base para
continuar la reaccin de secuenciacin, haciendo que la incorporacin de un nucletido
terminador sea reversible.
Ventajas
1. Baja tasa de error.
2. Arroja muchos datos.
3. Bajo costo por base.
4. Instrumentacin verstil.
Desventajas
1. Corta longitud a leer.
2. Tcnica tardada.

ION TORRENT
Fundamento
Es un mtodo de secuenciacin de ADN basado en la deteccin de protones liberados
durante el proceso de polimerizacin del ADN. Por lo tanto, este mtodo se gua a travs
de la adicin de nucletidos que se llevan a cabo en las cadenas simples de ADN en
estudio. Este tipo de secuenciacin difiere de los dems tipos en que no usan nucletidos
modificados qumicamente y que la deteccin no se realiza por mtodos pticos, sino por
deteccin de pH.

Mtodo

Se asla el ADN y se corta en fragmentos ms pequeos, los cuales se

unen a pequeas bolas denominadas bead. Cada una de ellas, unidas
con millones de fragmentos de ADN, entra en los micropocillos de un
microchip.

Se baa el microchip con una solucin de uno de los nucletidos. Si el

nucletido se incorpora en la cadena de ADN, se libera un protn, el cual
es detectado por la base del pocillo, la cual acta como un mini pH metro.
Gracias a que cada lmina del microchip es semiconductora, se pueden
detectar estos pequeos cambio inicos.

Repetir el bao cada 15 segundos con una nueva solucin de cada

nucletido, por lo que el micropocillo debe lavarse adecuadamente antes
de aadir la siguiente solucin para evitar interferencia que falseen los
resultados.

Anlisis de resultados en el monitor.

Ventajas
1. Velocidad de Secuenciacin.
2. Bajo costo de Operacin.
3. Ocurre a tiempo real.

Desventajas
1. Se deben hacer repeticiones de varias veces iguales en la hebra molde.
2. No se detecta con mucha precisin.
3.

Lentitud de fragmentos no debe pasar de los 400pb.

4. Bajo rendimiento.

NORTHEM BLOT
Fundamento
Es una tcnica de deteccin de molculas de ARN de una secuencia dada dentro de una
mezcla compleja. Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis
en gel a fin de separar los fragmentos de acuerdo con su tamao. Tras esto, se transfiere
el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la que se
efecta la hibridacin de una sonda molecular marcada radiactiva o qumicamente.
Mtodo

Extraccin de ARN total.

Aislamiento de ARNm.

Transferencia a una membrana e inmovilizacin e enlaces covalentes.

Marcaje de la sonda.

Lavado de la membrana.

Hibridacin.

Electroforesis.

Ventajas
1. Detecta hasta pequeos fragmentos.
2. Definir la cadena de ARN.
3. Usar sondas con analoga parcial.
4. Fcil de evaluarla.
5. Reconoce anlisis de mutaciones y alteraciones
Desventajas
1. Probabilidad de degradacin por ribonucleasas.
2. Requiere de mucho ARN.
3. Su resultado depende de la sonda a utilizar.
4. Elevado costo.

SOURTHEN BLOT
Fundamento
Es un mtodo de biologa molecular que permite detectar la presencia de una secuencia
de ADN en una mezcla compleja de este cido nucleico. Para ello, emplea la tcnica de
electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo
a su longitud y, despus, una transferencia a una membrana en la cual se efecta la
hibridacin de la sonda.
Mtodo

Extraccin de ADN.

Digestin del ADN con una endonucleasa de restriccin.

Electroforesis en gel de agarosa.

Preparacin de un ensayo southen blot.

Hibridacin con sonda radioactiva.

Deteccin de los RFLPs mediante autorradiografa.

Reensayar el resultado de southen con sondas adicionales.

Ventajas
1. Tcnica fcil.
2. Bajo costo.
3. Resultados mediante PCR.
4. Analiza fragmentos pequeos y grandes.
Desventajas
No se puede visualizar la secuencia repetitiva en algunas portadoras y en los individuos
afectados.

HIBRIDACIN GENMICA COMPARATIVA (HGC)

Fundamento
La hibridacin genmica comparativa en una tcnica que permite la exploracin de las
anormalidades cromosmicas. Es un mtodo de citogentica molecular para analizar las
variaciones de nmero de copias (CNV) en relacin con el nivel de ploida del ADN de una
muestra ensayo en comparacin con una muestra de referencia, esto sin la necesidad de
realizar un cultivo celular.
Mtodo

Preparacin de diapositivas en Metafase.

Aislamiento de ADN a partir de un tejido de prueba y uno de referencia.

Marcaje del ADN.

Bloqueo.

Hibridacin.

Visualizacin de imgenes de fluorescencia.

Ventajas
1. No se realiza una doble digestin antes del marcaje del ADN.
2. Excelente ratio seal-ruido.
3. Marca entre 0.25 l y 2.5 l ADN sin reamplificacin.
4. Consistencia entre lotes.
Desventajas

1. No detecta translocaciones reciprocas ni Robertsonianas.

2. No detecta inversiones.
3. No detecta mutaciones puntuales.
4. El mosaicismo afecta la deteccin de cambios.

MICROARREGLOS
Fundamento
Se basa en la hibridacin de cidos nucleicos y su deteccin por uorescencia mediante
anlisis de imagen, de tal manera que, como en otras tcnicas, slo se obtendr seal
uorescente en los puntos (genes) donde haya habido hibridacin; la intensidad de
uorescencia ser directamente proporcional al nivel de expresin del gen, es decir,
Permite determinar simultneamente si todos los genes de un organismo se estn
expresando o no en una condicin determinada.
Mtodo

Seleccin de la secuencia de inters y seleccin del tipo de microarreglo.

Obtencin de la muestra.

Purificacin de ADN o ARN.

Obtencin de ADNc (RT-PCR).

Marcaje de la muestra problema.

Hibridacin del microarreglo.

Lavado del microarreglo y captura de datos (deteccin de la seal).

Interpretacin de resultados y Anlisis de expresin o variacin gnica

(base de datos, software).

Ventajas
1. Sencillez en interpretacin.
2. Permite hibridaciones interespecficas.
3. Gran variedad disponible en el mercado.
4. Elevada densidad de sonda.
5. Kit para diagnstico.

Desventajas
1. Radiactivo.

2. Numero de sondas limitado.

3. Cada muestra requiere un array.
4. Costo elevado.
5. Requiere mayor volumen de muestra.

MTODO QUMICO (MAXAM Y GILBERT)

Fundamento
Es un mtodo de secuenciacin que depende de la degradacin qumica especfica del
ADN. Este mtodo puede emplear ADN de doble cadena, pero requiere una separacin
de hebras o fraccionamiento equivalente por cada fragmento de restriccin estudiado. Los
reactivos utilizados para la degradacin son Dimetil sulfato para purinas e Hidroxina para
las piramidicas. Estos reactivos provocan el rompimiento de la desoxirribosa por su
inestabilidad.
Mtodo

Desnaturalizacin del ADN.

Marcaje radioactivo 32P o 32S.

Modificacin de una base.

Eliminacin de la base modificada.

Ruptura de la cadena de ADN en la desoxirribosa.

Anlisis de la secuencia fragmentada por electroforesis en gel de

poliacrilamida.

Ventajas
1. Emplea ADN de doble cadena.
2. Uso de geles de poliacrilamida.
3. Uso de voltajes altos.
Desventajas
1. Mtodo laborioso.
2. Fragmentos cortos de ADN.
3. Acumulacin de las bandas en el gel.