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las digestiones simples con la de la doble. Como los cortes con una enzima
solapan con los cortes de la segunda enzima? Hay detalles claves que ayudan:
- Queda cualquiera de los fragmentos sin cortarse cuando se usa la segunda
enzima.
- Los tamaos de los fragmentos de la digestin doble suman al tamao de
uno de los fragmentos de la digestin simple?
- Algn fragmento se mantiene del mismo tamao aun cuando lo exponga a
la segunda enzima? Revise el siguiente ejemplo (figura 3)
Un plsmido de 1000 pb es digerido y los fragmentos separados en gel de
agarosa.
Marcador de
tamao (pb)
1000
700
500
300
200
Sin cortar
(pb)
1000
Corte con
Enzima A (pb)
Corte con
enzima B (pb)
1000
Corte con
ambas (pb)
700
300
500
300
200
Note que hay dos fragmentos de 1000pb (sin cortar y cortado con la enzima B),
pero corren igual en la gel? No necesariamente! Hay pequeas diferencias en la
migracin de un plsmido si est sin cortar-relajado, lineal, o sin cortarsuperenrrollado. Tambin fragmentos de tamaos parecidos pueden co-migrar
en la agarosa y fragmentos muy pequeos pueden no observarse en la gel por la
sensibilidad de la tincin o porque se salen de la misma.
Como se lee un Mapa de plsmido?
Un mapa de plsmido incluye informacin bsica sobre 1) el tamao, 2) los
genes presentes, 3) el origen de replicacin y 4) los lugares de restriccin para
enzimas. Los plsmidos a utilizarse en este ejercicio salieron del pTZ18U pero
contienen diferentes insertos de DNA. Cualquiera de las enzimas marcadas como
presentes en ellos se podran usar para analizarlos. Como la molcula es circular
hay un 0 arbitrario y todos los lugares de restriccin son indicados con un
3
Procedimiento:
1. Se le suministrarn hojas con secuencias para que identifique lugares de
restriccin para enzimas y simule la actividad de estas.
2. Se le suministrar un mapa de un plasmido para que conteste preguntas
sobre fragmentos, diagrame geles y construya mapas usando bases de
datos de bioinformtica y simuladores.
3. Contestara las preguntas que acompaan cada ejercicio.
4. Virtual
lab
para
electroforesis
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html
5. Virtual
lab
para
mapas
con
enzimas
de
restriccin
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/maps.ht
ml
6. Enzimas
de
restriccin
y
otras
enzimas
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/index.ht
ml
Preguntas sobre lectura de
plsmidos:
1. usando el mapa del plsmido
2, prepare una lista de las
enzimas que podran daar el
gen de la beta-lactamasa y la
secuencia de lambda.
4. Cuales son los tamaos de los fragmentos generados por PvuII en S2?
5. Como se vern en una gel? Dibuja la gel y rotula carriles y los fragmentos con
sus tamaos
6. Ahora simularas una doble digestin con EcoRI y PstI. Determina los
tamaos. Completa la siguiente tabla:
Enzimas
Fragmentos
Ambas
Total
Enzimas
Fragmentos
Ambas
2832
2817
1986
1093
468
164
72
43
Total
Preguntas para el mapa de plsmido
1. Cuan grande es el plasmido S5? Como lo sabes?
3. Compara los datos de la digestin con PstI con los de la digestin con
EcoRI. Cuantos fragmentos hay con PsTI? Cuantos lugares de restriccin
hay para PsTI?
Preparacin de un Mapa
La preparacin de un mapa de restriccin es un ejercicio de pensamiento crtico
y lgica. El plasmido S5 es difcil para formar su mapa por que tiene mucho
lugares para PstI. Con estos datos se hace muy difcil colocar todos los lugares
de restriccin en orden. Es mas fcil un mapa del plsmido S3.
Plsmido S3 (________________pb)
EcoRI
PstI
6504
4507
863
2860
Ambas
3687
2817
820
43
Total
8. De los datos de la digestin simple con EcoRI se desprende que los
tamaos no son iguales. Prepara un posible mapa y rotula los lugares para
Eco R1con sus tamaos.
9. Ahora dibuja un mapa sugerido para los lugares de PstI en S3. Recuerda
rotular lugares y tamaos de los fragmentos.
10.
Dibuja el mapa circular del plsmido S3 digerido con ambas
enzimas. Marca los tamaos de cada fragmento y rotula los lugares de
restriccin con las enzimas correspondientes.
11. Habr algn otro orden posible para los lugares de restriccin en el plsmido
S3 para estas dos enzimas? Como tu resolveras entre estas posibilidades cual
es las mas correcta?
12. Si hubieras corrido una gel con estos fragmentos, faltara alguna banda o
fragmento en la gel? Cual? Porque?
Enlaces de inters.
Biotechnology and Genetic Engineering
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/index.html
Molecular toolkit
http://www.vivo.colostate.edu/molkit/
Restriction Maps
http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Restmap.html
Restriction Digest Maps
http://www.nslc.wustl.edu/courses/bio2960/labs/07dna/restriction/
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