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Biol.

3030 Biologa del Desarrollo


Ejercicio 5 Mapas de restriccin
Introduccin:
Con este ejercicio se pretende demostrar los principios bsicos de mapas de
plsmidos usando enzimas de restriccin mediante simulaciones y prcticas de
bioinformtica.
Enzimas de restriccin:
Las enzimas de restriccin fueron descubiertas por su habilidad de degradar,
digerir o restringir DNA extrao y son exclusivas de procariotas. Ellas pueden
distinguir entre el DNA normalmente presente en la clula de aquel DNA que
aparece por ejemplo por la infeccin de un bacterifago. Ellas defendern a la
clula de la invasin cortando ese DNA extrao en fragmentos y dejndolo no
funcional.
Las
enzimas
mayormente
utilizadas en la investigacin
reconocen
secuencias
palindrmicas de 4-6 pb.
Estas secuencias leen lo
mismo de 53 en ambos
lados de la doble cadena, son
especficas para cada enzima
y son conocidas como lugares
de restriccin (Figura 1). La
enzima hace un corte en el
enlace fosfodiesterico del DNA
en una posicin especfica.
Sus nombres provienen de la
bacteria
Figura 1. Ejemplos de sitios de restriccin para
varias enzimas conocidas. Asegrese de notar el
(genero/especie/cepa) de la
aspecto palindrmico de la secuencia. Que indican
cual se purifican as como el
las flechas?
nmero purificadas de esta.
Bajo condiciones apropiadas, (concentracin de sal, pH y temperatura), enzimas
como EcoRI dejan un fragmento escalonado (mientras AluI dejara uno romo) en
cada punto de la secuencia que se encuentre su lugar de restriccin. El nmero
de fragmentos y los tamao depende de la ubicacin de estos lugares en la
secuencia completa. Estas enzimas nucleasas se clasifican en endonucleasas y
exonucleasas dependiendo si necesitan o no extremos libres en un DNA para
digerir la molcula.
Plsmidos e Ingeniera gentica
Los mapas de plsmidos han revolucionado la biologa molecular y pavimentado
el camino para la industria de la biotecnologa. Con esta tcnica el bilogo
1

molecular puede evaluar rpidamente el xito que podra tener en experimentos


de clonacin, as como identificar fcilmente plsmidos y los rasgos asociados a
estos en los organismos.
Los plsmidos son molculas relativamente pequeas de DNA extra-cromosomal
de arreglo circular que se pueden replicar en la bacteria independientemente del
cromosoma. Por lo general estos contienen genes que codifican para la
resistencia a antibiticos, esto le da a la bacteria que lo tenga una ventaja de
seleccin sobre otras bacterias que compitan por el medio de crecimiento.
Rutinariamente los cientficos sacan ventaja del DNA del plsmido y de la
defensa natural de la bacteria (enzimas de restriccin) como la base de la
biotecnologa (Figura 2). Una vez que el plsmido es cortado en fragmentos por
la enzima, estos pueden ser unidos o ligados a un pedazo de DNA de cualquier
otro
organismo
que
tambin
hayan
sido
cortado con la misma
enzima. El DNA-plsmido
hbrido
resultante
se
puede
introducir
en
bacterias
por
transformacin.
Este
hbrido se replicar por si
mismo como antes, solo
que el DNA insertado
ahora
tambin
es
perpetuado junto a el. El
fragmento de DNA ajeno
al plsmido se le llama
que fue clonado y al
plsmido se le llama
vector.
Mapas de Plsmidos
Figura 2 Plsmido S5. Note sitio Ori, secuencia beta
Los plsmidos se pueden
lactamase y los mltiples lugares de restriccin
describir o representar en
mapas en trminos de la
localizacin de los sitios de restriccin usando experimentos simples y lgica. El
procedimiento en general es digerir el plsmido con dos enzimas por separado
(digestiones simples) y una digestin simultnea con ambas enzimas (digestin
doble). Los tamaos de los productos de digestin se analizan en una
electroforesis y luego se usa la lgica para determinar la posicin relativa de los
sitios de restriccin. Como los plsmidos son circulares, el nmero de
fragmentos representan el nmero de cortes o lugares de restriccin. Como sera
si el DNA fuera lineal? Para visualizar este concepto mejor se puede utilizar una
banda de goma y cortarla con una tijera una vez, dos veces y as sucesivamente
y contar los pedazos luego de cada corte. La parte mas informativa del los
mapas de plsmidos resulta del uso de la lgica para solapar la informacin de

las digestiones simples con la de la doble. Como los cortes con una enzima
solapan con los cortes de la segunda enzima? Hay detalles claves que ayudan:
- Queda cualquiera de los fragmentos sin cortarse cuando se usa la segunda
enzima.
- Los tamaos de los fragmentos de la digestin doble suman al tamao de
uno de los fragmentos de la digestin simple?
- Algn fragmento se mantiene del mismo tamao aun cuando lo exponga a
la segunda enzima? Revise el siguiente ejemplo (figura 3)
Un plsmido de 1000 pb es digerido y los fragmentos separados en gel de
agarosa.
Marcador de
tamao (pb)
1000
700
500
300
200

Sin cortar
(pb)
1000

Corte con
Enzima A (pb)

Corte con
enzima B (pb)
1000

Corte con
ambas (pb)

700
300

500
300
200

Figura 3. Ejemplo de anlisis de datos sobre digestin de plsmidos con enzimas d


restriccin.

Note que hay dos fragmentos de 1000pb (sin cortar y cortado con la enzima B),
pero corren igual en la gel? No necesariamente! Hay pequeas diferencias en la
migracin de un plsmido si est sin cortar-relajado, lineal, o sin cortarsuperenrrollado. Tambin fragmentos de tamaos parecidos pueden co-migrar
en la agarosa y fragmentos muy pequeos pueden no observarse en la gel por la
sensibilidad de la tincin o porque se salen de la misma.
Como se lee un Mapa de plsmido?
Un mapa de plsmido incluye informacin bsica sobre 1) el tamao, 2) los
genes presentes, 3) el origen de replicacin y 4) los lugares de restriccin para
enzimas. Los plsmidos a utilizarse en este ejercicio salieron del pTZ18U pero
contienen diferentes insertos de DNA. Cualquiera de las enzimas marcadas como
presentes en ellos se podran usar para analizarlos. Como la molcula es circular
hay un 0 arbitrario y todos los lugares de restriccin son indicados con un
3

nmero entre 0 y el total de pb en el plsmido. Los tamaos de los fragmentos


se calculan restando o sumando los puntos en el plsmido. El nombre del
plsmido y su tamao aparece en el centro del circulo. El origen de replicacin
aparece marcado como Ori, el gen para beta-lactamasa (enzimas que confiere la
resistencia contra ampicilina) y la localizacin para el DNA de bacterifago
lambda son mostradas (Figuras 2 y 4).

Procedimiento:
1. Se le suministrarn hojas con secuencias para que identifique lugares de
restriccin para enzimas y simule la actividad de estas.
2. Se le suministrar un mapa de un plasmido para que conteste preguntas
sobre fragmentos, diagrame geles y construya mapas usando bases de
datos de bioinformtica y simuladores.
3. Contestara las preguntas que acompaan cada ejercicio.
4. Virtual
lab
para
electroforesis
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html
5. Virtual
lab
para
mapas
con
enzimas
de
restriccin
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/maps.ht
ml
6. Enzimas
de
restriccin
y
otras
enzimas
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/index.ht
ml
Preguntas sobre lectura de
plsmidos:
1. usando el mapa del plsmido
2, prepare una lista de las
enzimas que podran daar el
gen de la beta-lactamasa y la
secuencia de lambda.

2. Cual plasmido es mas grande el 2 el 5? Porque?

3. Usando el plasmido 2, cuantos lugares para PvuII hay. Cual es la localizacin


de cada uno? Si lo usaras para digerir este plasmido, cuantos fragmentos se
obtendran?

4. Cuales son los tamaos de los fragmentos generados por PvuII en S2?

5. Como se vern en una gel? Dibuja la gel y rotula carriles y los fragmentos con
sus tamaos

6. Ahora simularas una doble digestin con EcoRI y PstI. Determina los
tamaos. Completa la siguiente tabla:
Enzimas
Fragmentos

Plsmido S2 (5869 pb)


EcoRI
PstI

Ambas

Total

7. Si el plsmido S2 fuera digerido y analizado en una gel de Agarosa como


se vera la gel? Diagrame la gel con los cortes simples en carriles
separados y con la digestin doble en un tercer carril.

Construccin de un Mapa de Plsmido


1. El primer paso en la construccin de un mapa de restriccin de un
plsmido es determinar cuantas veces se encuentra en el un lugar de
restriccin. Veamos la data para el plsmido S5. Los datos en la siguiente
tabla son de digestiones dobles usando a Eco RI y Pst I. Tambien hay datos
de digestiones simples con las mismas enzimas. Los nmeros en las
columnas representan los tamaos de los fragmentos generados al
digerirlo con cada enzima.

Enzimas
Fragmentos

Plsmido S5(9841 pb)


EcoRI
PstI
9481
2860
2838
1986
1093
468
164
72

Ambas
2832
2817
1986
1093
468
164
72
43

Total
Preguntas para el mapa de plsmido
1. Cuan grande es el plasmido S5? Como lo sabes?

2. Observa los datos de la digestin con EcoRI. Cuantos fragmentos hay?


Cort la enzima el plsmido o este se qued como un circulo? Como
puedes estar seguro?

3. Compara los datos de la digestin con PstI con los de la digestin con
EcoRI. Cuantos fragmentos hay con PsTI? Cuantos lugares de restriccin
hay para PsTI?

4. Cuantos fragmentos hay cuando ambas enzimas se usan simultneamente


para digerir a S5? Contesta esto la pregunta si EcoRI digiere o no al
plsmido? Porque?

5. Algun fragmento de la digestin con PsTI posee tambin un lugar de


reconocimiento para EcoRI? Cual es? Como sabes esto?

6. Dibuja el fragmento de PstI que tambin es reconocido por EcoRI para


documentarlo.

Preparacin de un Mapa
La preparacin de un mapa de restriccin es un ejercicio de pensamiento crtico
y lgica. El plasmido S5 es difcil para formar su mapa por que tiene mucho
lugares para PstI. Con estos datos se hace muy difcil colocar todos los lugares
de restriccin en orden. Es mas fcil un mapa del plsmido S3.

7. En la siguiente tabla estn los datos generados de la digestin del plsmido


S3 con las mismas enzimas. Cuantas veces corta cada enzima? Cuales son los
tamaos de los fragmentos?
Enzimas
Fragmentos

Plsmido S3 (________________pb)
EcoRI
PstI
6504
4507
863
2860

Ambas
3687
2817
820
43

Total
8. De los datos de la digestin simple con EcoRI se desprende que los
tamaos no son iguales. Prepara un posible mapa y rotula los lugares para
Eco R1con sus tamaos.

9. Ahora dibuja un mapa sugerido para los lugares de PstI en S3. Recuerda
rotular lugares y tamaos de los fragmentos.

10.
Dibuja el mapa circular del plsmido S3 digerido con ambas
enzimas. Marca los tamaos de cada fragmento y rotula los lugares de
restriccin con las enzimas correspondientes.

11. Habr algn otro orden posible para los lugares de restriccin en el plsmido
S3 para estas dos enzimas? Como tu resolveras entre estas posibilidades cual
es las mas correcta?

12. Si hubieras corrido una gel con estos fragmentos, faltara alguna banda o
fragmento en la gel? Cual? Porque?

Enlaces de inters.
Biotechnology and Genetic Engineering
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/index.html
Molecular toolkit
http://www.vivo.colostate.edu/molkit/
Restriction Maps
http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Restmap.html
Restriction Digest Maps
http://www.nslc.wustl.edu/courses/bio2960/labs/07dna/restriction/

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