DESENVOLVIMENTO E VALIDAO DE MTODO ESPECTROFOTOMTRICO PARA DETERMINAO DE

CORANTE BASE DE LUTENA ADICIONADO EM IOGURTE DESNATADO

Ana Augusta Odorissi Xavier e Adriana Zerlotti Mercadante*
Departamento de Cincia de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Rua Monteiro
Lobato, 80, 13083-862 Campinas - SP, Brasil
Lgia Dozena Domingos e Walkria Hanada Viotto
Departamento de Tecnologia de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Rua
Monteiro Lobato, 80, 13083-862 Campinas - SP, Brasil

Nota Tcnica

Quim. Nova, Vol. 35, No. 10, 2057-2062, 2012

Recebido em 3/2/12; aceito em 2/7/12; publicado na web em 31/8/12

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A SPECTROPHOTOMETRIC METHOD FOR DETERMINATION OF LUTEIN

COLORANT ADDED TO NONFAT YOGURT. A simple analytical method for extraction and quantification of lutein colorant
added to yogurt was developed and validated. The method allowed complete extraction of carotenoids using tetrahydrofuran in
vortex, followed by centrifugation, partition to diethyl ether/petroleum ether, and drying. The carotenoids dissolved in ethanol were
quantified by UV-Vis spectrophotometry. This method showed linearity in the range tested (1.41-13.42 g g-1), limits of detection and
quantification of 0.42 and 1.28 g g-1, respectively, low relative standard deviation (3.4%) and recovery ranging from 95 to 103%.
The method proved reliable for quantification of lutein added to yogurt.
Keywords: UV-Vis spectroscopy; yogurt; lutein colorant.

INTRODUO
Os carotenoides so pigmentos sintetizados por plantas superiores, microrganismos e alguns animais, com colorao que varia do
amarelo ao vermelho. Sua estrutura terpenoide apresenta um extenso
sistema de ligaes duplas conjugadas, que responsvel tanto por
sua capacidade de absorver luz na regio do visvel quanto por sua
elevada reatividade qumica.1 Os carotenoides so conhecidos por
seu emprego como corantes e tambm por sua atividade biolgica, e
seu consumo tem sido inversamente correlacionado com a ocorrncia
de doenas crnico-degenerativas.2 Dentre estes pigmentos, a lutena
se destaca pela sua associao com a diminuio da ocorrncia e
preveno da catarata e da degenerao macular relacionada idade
(DMRI).3-5 A DMRI caracteriza-se pela degradao da poro central
da retina e a maior causa de cegueira irreversvel em idosos.6
O leite e seus derivados so produtos bastante aceitos pelo mercado consumidor por estarem relacionados a hbitos alimentares ditos
saudveis, j que so fontes de clcio, protenas e vitaminas A e
E.7 Tendo em vista o crescimento do mercado de produtos derivados
do leite e de alimentos funcionais,8 os produtos lcteos se apresentam
como potenciais veculos de adio de substncias benficas sade,
como a lutena, considerando a relao inversa entre o consumo deste
carotenoide e o desenvolvimento de DMRI.
A anlise quantitativa de carotenoides em iogurte e outras
matrizes lcteas envolve vrias etapas, incluindo a extrao com
solventes de baixa polaridade, saponificao e posterior separao
dos compostos por cromatografia lquida de alta eficincia em fase
reversa, geralmente acoplada a um detector de arranjo de diodos
(CLAE-DAD).9-11 Esta tcnica permite a deteco e quantificao
de cada composto separadamente, mas com as desvantagens de
maior tempo de anlise, alto custo do equipamento e a necessidade
de um extrato livre de impurezas. Por outro lado, o mtodo clssico
de quantificao de carotenoides por espectrofotometria na regio
do UV-visvel ainda tem sido empregado em diversas matrizes,
*e-mail: azm@fea.unicamp.br

principalmente naquelas ricas em um carotenoide especfico, onde se

utiliza o comprimento de onda de absoro mxima do carotenoide
majoritrio e seu correspondente coeficiente de absortividade.12 Alm
disso, os parmetros analticos do mtodo devem ser adequados
inteno de uso do mesmo, ou seja, um mtodo para anlise de
compostos presentes em elevadas concentraes, como o corante
lutena adicionado ao iogurte, no requer a mesma sensibilidade de
um mtodo desenvolvido para anlise de traos.13
O corante natural base de lutena adicionado aos iogurtes preparados neste estudo constitui uma matriz bastante complexa pois contm,
alm de carotenoides, amido modificado, cido ascrbico, palmitato
de ascorbila, alfa-tocoferol, benzoato de sdio, leo de girassol e
maltodextrina. Devido presena de leos vegetais, para realizar a
anlise do corante por CLAE necessrio saponificar os extratos com
uma concentrao de lcali maior que a usual (10% KOH), o que pode
levar a perdas e consequente subestimao do teor de carotenoides.14
Alm disso, a lutena extrada das flores de Tagetes erecta L. (famlia
Asteraceae), fonte da lutena presente no corante, encontra-se predominantemente esterificada com cidos graxos, o que corrobora a
necessidade de uma etapa de saponificao dos extratos.15 O aumento
de etapas no procedimento de extrao do corante eleva tanto o custo
quanto o tempo de anlise, inviabilizando a aplicao do mtodo em
estudos de estabilidade da lutena em iogurte. A introduo de novas
etapas tambm implica em provvel aumento do desvio padro relativo, o que indesejvel quando se trata da avaliao de mudanas de
concentrao de um composto durante o perodo de armazenamento.
O objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar um mtodo
simples, de baixo custo e reprodutvel para extrao e quantificao
por espectrofotometria UV-visvel de carotenoides em iogurte adicionado de corante natural base de lutena.
PARTE EXPERIMENTAL
Materiais e equipamentos
O leite em p desnatado Molico (Nestl Araatuba, Brasil)

2058

Xavier et al.

foi adquirido em um supermercado na cidade de Campinas (Brasil),

sendo todo do mesmo lote. A cultura lctea liofilizada, constituda de
Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus (YO-MIX 505
LYO 200), foi fornecida pela Danisco (Cotia, Brasil). O corante natural
base de lutena Vegex Lutein WS foi adquirido da Christian Hansen
(Horsholm, Dinamarca). Esta formulao contm 0,3% de lutena,
possui caractersticas hidroflicas e utilizada para fins alimentcios.
A protease bacteriana Protex 6L (Genencor Int., Rochester, EUA)
foi cedida pela Danisco (Tonder, Dinamarca). Os solventes acetona,
acetato de etila, etanol, ter etlico, ter de petrleo, metanol e tetraidrofurano, todos de grau analtico, foram adquiridos da Synth (Diadema,
Brasil), assim como o sulfato de sdio anidro e hidrxido de potssio
(KOH). Os solventes acetonitrila, metanol e acetato de etila, todos
grau CLAE, foram adquiridos da J. T. Baker (Phillipsburg, EUA). O
padro de lutena com pureza de 99% foi doado pela DSM Nutritional
Products (Basel, Sua). Previamente anlise por CLAE, os extratos
e solventes foram filtrados em membrana de polietileno de 0,22 e 0,45
m, respectivamente, da Millipore (Billerica, EUA).
A fermentao dos iogurtes foi realizada em estufa Marconi modelo MA 415/S (Piracicaba, Brasil). Para extrao dos carotenoides
foram utilizados mesa agitadora orbital Marconi modelo MA140/T
(Piracicaba, Brasil), homogeneizador de bancada Marconi modelo
MA102 (Piracicaba, Brasil), agitador de solues tipo vortex Phoenix
Luferco, modelo AP56 (Araraquara, Brasil), centrfuga Beckman
Coulter, modelo Allegra 64R (Brea, EUA) e evaporador rotatrio
Buchi (Flawil, Sua). A quantificao foi realizada em espectrofotmetro com arranjo de diodos Agilent, modelo 8453 (Palo Alto, EUA).
A anlise dos carotenoides do corante base de lutena adicionado
ao iogurte foi realizada por CLAE, utilizando um equipamento modelo 600E da Waters (Milford, EUA) equipado com detector de arranjo
de diodos (DAD) Waters modelo 996, sistema desgaseificador, sistema
de injeo Rheodyne com ala de amostra de 20 L (Rohnert Park,
EUA) e sistema de aquisio e processamento de dados Millenium.
Mtodos
Anlise por CLAE de carotenoides do corante base de lutena
O corante (0,05 g) foi dissolvido em 1 mL de gua destilada e os
carotenoides foram exaustivamente extrados em vortex, utilizando
ter etlico (2 mL), seguido de acetato de etila (4 mL). Aps cada
extrao, o extrato foi centrifugado para separao de fases e a fase
orgnica foi coletada, seca sob fluxo de nitrognio, redissolvida em
acetato de etila/acetonitrila (1:1, vv-1) e analisada por CLAE. O extrato
remanescente foi seco, redissolvido em ter de petrleo e saponificado com igual volume de soluo metanlica 10% de KOH. 16 Aps
retirada do lcali, o extrato saponificado foi seco e analisado nas
mesmas condies utilizadas para o extrato bruto (no saponificado).
Os carotenoides dos extratos bruto e saponificado foram separados em coluna C18 NovaPak de 300 x 3,9 mm (tamanho de partcula
4 m), usando como fase mvel acetonitrila/metanol (9:1, vv-1) e
acetato de etila, com gradiente linear de acetato de etila de 0 a 100%
em 30 min. O fluxo empregado foi de 1 mL min-1 e a temperatura
da coluna foi mantida a 29 C. Os espectros de absoro UV-visvel
foram adquiridos entre 200 e 600 nm e os cromatogramas foram
processados a 450 nm.17 Os picos foram identificados com base na
ordem de eluio em coluna C18 e nas seguintes caractersticas do
espectro UV-visvel: lmax, estrutura fina espectral calculada como
percentagem das alturas (III/II)% e intensidade do pico cis calculada
como (AB/AII)%, assinaladas na Figura 1,16 comparando com informaes disponveis na literatura.15,17-19
Produo dos iogurtes
O leite em p desnatado foi reconstitudo a 10% de slidos

Quim. Nova

Figura 1. Parmetros utilizados para clculo da estrutura fina e intensidade

do pico cis do espectro UV-visvel de carotenoide

totais e adicionado de 2,5% da cultura previamente ativada. Em

seguida, a formulao de lutena foi adicionada nas concentraes
posteriormente descritas nos ensaios dos parmetros de validao. O
leite foi distribudo em copos plsticos, selados por termo induo, e
incubados em estufa a 45 C, onde permaneceram at atingir pH 4,8
(aproximadamente durante 3 h). Os copos foram ento resfriados em
banho de gelo e armazenados a 5 C para as anlises posteriores. Um
iogurte controle, sem adio do corante base de lutena, tambm
foi produzido e armazenado utilizando o mesmo procedimento de
fabricao e as mesmas condies previamente descritas.
Extrao dos carotenoides
Para extrao dos carotenoides totais, os solventes testados
foram acetona, acetato de etila e tetraidrofurano, combinados aos
seguintes equipamentos para extrao: mesa agitadora, homogeneizador, agitador tipo vortex e almofariz. As combinaes de solvente
e equipamento de extrao foram realizadas de acordo com mtodos
j existentes na literatura para determinao de carotenoides em leite
e produtos lcteos.9-11,20 A necessidade do emprego de uma etapa de
saponificao dos extratos, com 10% de KOH em soluo metanlica,
tambm foi verificada.9,10,20
Aps cada extrao, o solvente foi completamente evaporado e
o extrato seco foi redissolvido em etanol para a quantificao dos
carotenoides totais.
Quantificao dos carotenoides totais
A determinao dos carotenoides totais foi realizada por espectrofotometria no UV-visvel, pela leitura da absorbncia do extrato
etanlico de carotenoides no comprimento de onda de 445 nm, lmax
de absoro da lutena em etanol. A concentrao de carotenoides
totais foi calculada a partir da Lei de Lambert-Beer:

(1)

onde C a concentrao de carotenoides totais (expressa como lutena), A a absorbncia do extrato a 445 nm e E1%
1cm o coeficiente
de absortividade da lutena em etanol, que corresponde a 2550.18
A determinao de carotenoides totais tambm foi realizada no
iogurte controle para verificar se a concentrao de carotenoides
presente neste iogurte interfere na quantificao de carotenoides
totais no iogurte adicionado de corante lutena.

Vol. 35, No. 10

Desenvolvimento e validao de mtodo espectrofotomtrico para determinao de corante

Validao do mtodo de extrao

Aps o teste das diferentes combinaes entre solventes e equipamentos para extrao dos carotenoides, o mtodo que apresentou
os melhores resultados foi validado atravs dos parmetros de seletividade, linearidade, faixa de aplicao, limites de deteco e de
quantificao, preciso e exatido.13,21
A seletividade do mtodo foi avaliada atravs da comparao de
trs espectros de absoro no UV-visvel: do padro de lutena, de
um extrato obtido a partir de um iogurte adicionado de corante base
de lutena e de um extrato preparado a partir do iogurte controle. A
concentrao do padro de lutena utilizada foi 2,47 g mL-1 e a do
extrato de iogurte adicionado de lutena de 1,22 g de lutena mL-1
(que equivale concentrao aproximada de 11,20 g de lutena g-1
de iogurte, quando extrada de 1 g do produto e diluda em 10 mL
de etanol, que so condies fixadas pelo mtodo).
A linearidade do mtodo e a faixa de trabalho foram verificadas
atravs de uma curva analtica construda com extratos de carotenoides obtidos a partir de iogurtes adicionados de diferentes concentraes do corante base de lutena, na faixa de 1,41 a 13,42 g de
lutena g-1 de iogurte. A faixa de concentrao dos testes foi definida
a fim de contemplar um maior nmero de concentraes inferiores
concentrao mdia de lutena no iogurte (aproximadamente 11,20
g g-1), uma vez que o objetivo do mtodo acompanhar os teores
de lutena durante o armazenamento do iogurte e a tendncia que
a concentrao diminua com o decorrer do tempo.
Os limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ) foram determinados a partir dos parmetros da curva analtica construda para
o ensaio de linearidade, e foram expressos em g g-1.13
A preciso foi determinada atravs da concordncia dos resultados no mesmo laboratrio, de um mesmo analista, em dias
diferentes. Foram realizadas trs extraes em 3 dias diferentes
a partir de uma mesma amostra de iogurte adicionado do corante
base de lutena na concentrao de 11,49 g de lutena g-1 de
iogurte, que corresponde concentrao mdia inicial de lutena
adicionada ao iogurte. A preciso foi expressa como desvio padro
relativo (DPR).13
A exatido foi verificada por ensaios de recuperao em iogurtes
adicionados de diferentes concentraes conhecidas de corante
base de lutena. Foram utilizados trs nveis de adio (5,53; 11,49
e 13,45 g de lutena g-1 de iogurte), sendo as extraes realizadas
em triplicata em cada nvel de adio. Essas concentraes foram
utilizadas porque correspondem aproximadamente a 50, 100 e 125%
da concentrao mdia de lutena nos iogurtes.
RESULTADOS E DISCUSSO
Perfil de carotenoides do corante base de lutena por
CLAEDAD
O cromatograma dos carotenoides do extrato no saponificado do
corante demonstrou a presena de pelo menos oito steres de lutena
(Figura 2a), enquanto no extrato saponificado (Figura 2b) foi encontrado apenas o pico da lutena. Este resultado j era esperado, pois a
presena de mais de 90% da lutena na forma esterificada em flores
de Tagetes erecta L. foi previamente relatada.15,17 Os steres presentes
no corante base de lutena foram classificados em mono e di-steres
(Figura 2a), por comparao dos tempos de reteno com dados da
literatura.15,17 Como no h padres de steres de lutena disponveis
comercialmente, o fato de toda a lutena presente no corante estar
esterificada confirma a necessidade de uma etapa de saponificao
dos extratos para a quantificao por CLAE e justifica a escolha de
um mtodo espectrofotomtrico para emprego na quantificao de
lutena adicionada em iogurte.

2059

Figura 2. Cromatograma, obtido por CLAE-DAD, do extrato no saponificado

(a) e do extrato saponificado (b) de carotenoides do corante base de lutena.
As condies cromatogrficas esto descritas no texto

Desenvolvimento do mtodo analtico

A escolha do melhor solvente para extrao depende da composio da matriz e de sua composio de carotenoides. Para extrao
de carotenoides de matrizes com alto teor de umidade, como o
iogurte, mais apropriado o emprego de solventes com polaridade
intermediria e, por isso, foram escolhidos acetato de etila, acetona
e tetraidrofurano.
Acetato de etila
A primeira escolha de solvente foi o acetato de etila, j utilizado anteriormente na extrao de lutena adicionada em iogurte
desnatado.10 Este solvente foi inicialmente testado utilizando uma
mesa agitadora como equipamento para extrao, seguida de centrifugao para separao de fases. Entretanto, este procedimento no
possibilitou a extrao completa dos carotenoides, fato verificado
visualmente, j que ao trmino da extrao, a amostra ainda mantinha
a colorao amarelada.
Um homogeneizador foi ento empregado, visando um maior
contato entre a amostra e o solvente. Como ocorrido no ensaio em
mesa agitadora, a extrao com homogeneizador no foi completa.
Como a formulao de lutena adicionada ao iogurte hidrossolvel e o iogurte apresenta um elevado teor de umidade, possvel
que o fato de o acetato de etila ser um solvente imiscvel com gua
tenha resultado na extrao incompleta. Consequentemente, optou-se pelo emprego de solventes miscveis com a gua, como acetona
e tetraidrofurano.
Acetona
Este solvente j foi utilizado em outro estudo para extrao de
carotenoides em queijo9 e tambm tem sido amplamente empregado
na extrao de outras matrizes, como frutas e vegetais.16,22,23 Para
os testes com acetona, o uso de mesa agitadora foi descartado.
Foram realizadas extraes em homogeneizador e almofariz, ambas resultando em valores de recuperao de carotenoides totais
inferiores a 80%. Em seguida, foi testado o vortex, escolhido pela
praticidade do uso e para tentar minimizar perdas de material.
Entretanto, a combinao acetona e vortex tambm gerou resultados
insatisfatrios, pois produziu um extrato turvo, provavelmente pela
presena de protenas que devem ter sido extradas juntamente com
os carotenoides.

2060

Xavier et al.

Tetraidrofurano
As protenas so capazes de formar complexos com os carotenoides e o nico solvente capaz de romper este complexo o tetraidrofurano.24 Este solvente j foi empregado para extrao de carotenoides
de leite e produtos lcteos.11 Devido praticidade do uso do vortex,
os testes com tetraidrofurano foram realizados neste equipamento.
Os extratos obtidos com tetraidrofurano apresentaram ndices de
recuperao de carotenoides maiores que 90%, razo pela qual foram
utilizados para se verificar a necessidade da etapa de saponificao.
Os extratos foram transferidos para uma mistura de ter etlico e ter
de petrleo (2:1, vv-1) em funil de separao, e lavados com cerca de
5 L de gua destilada. Foi adicionada uma soluo metanlica 10%
de KOH, na proporo 1:1 (vv-1) aos extratos etreos, e estes foram
mantidos sob agitao, por 16 h a 84 rpm temperatura ambiente,
em mesa agitadora. Aps a saponificao, o extrato foi novamente
particionado para ter etlico e ter de petrleo (2:1, vv-1) e lavado
com gua destilada at todo o lcali ser removido (pH da gua de
lavagem prximo de 7). A etapa de saponificao foi responsvel
por perdas de carotenoides que variaram de 22 a 41% e estes resultados corroboram dados existentes na literatura, que relatam perdas
considerveis de carotenoides devido a esta reao.14,24,25 No presente
trabalho, o extrato obtido com tetraidrofurano apresentou-se lmpido
no solvente utilizado para quantificao (etanol). Consequentemente,
no h necessidade da incluso de uma etapa de saponificao no
procedimento de extrao.
O mtodo que permitiu uma completa extrao dos carotenoides
da amostra de iogurte est apresentado na Figura 3. Em funo do
iogurte possuir elevado teor de protena (cerca de 38%, base seca),
o tetraidrofurano mostrou-se um solvente adequado para extrao de
carotenoides nesta matriz, por ser capaz de desnaturar complexos de

Quim. Nova

protenas com carotenoides, facilitando a liberao dos pigmentos e

evitando a formao de emulso durante a extrao.24 A agitao em
vortex proporcionou maior recuperao dos carotenoides, por permitir
que o solvente fosse separado do resduo slido por centrifugao no
mesmo tubo onde a amostra foi extrada, diminuindo a possibilidade
de perda de amostra.
Quando o objetivo da anlise a quantificao, necessria uma
extrao completa e exaustiva da matriz. No mtodo proposto, a remoo completa dos carotenoides foi alcanada aps cinco extraes,
j que a partir da sexta extrao os extratos no apresentaram banda
de absoro no comprimento de onda de 445 nm.
sabido que o extrato de carotenoides obtido por solventes
miscveis com a gua, como o caso do tetraidrofurano, contm
elevados teores de gua, alm de compostos hidrossolveis presentes
na matriz.1 Com o intuito de remover a gua, compostos polares e o
solvente foi realizada a partio do extrato para uma mistura de ter
etlico e ter de petrleo, na proporo 2:1 (vv-1), seguida de lavagem
com gua destilada. Esta proporo foi utilizada devido presena
majoritria da lutena no extrato obtido a partir do iogurte, pois
como este carotenoide possui dois grupos hidroxila em sua estrutura
(Figura4), preferencialmente solvel em ter etlico do que em
ter de petrleo. Posteriormente etapa de partio, foi adicionado
sulfato de sdio anidro para retirada de resduos da gua de lavagem.
Em seguida, o ter foi totalmente evaporado em evaporador rotatrio,
com temperatura do banho inferior a 38 C, uma vez que os carotenoides so suscetveis isomerizao em temperaturas elevadas.26 O
extrato seco foi redissolvido em etanol e, imediatamente, procedeu-se
leitura da absorbncia para quantificao dos carotenoides totais,
seguindo o procedimento descrito anteriormente.

Figura 4. Estrutura qumica da lutena

Validao do mtodo

Figura 3. Fluxograma para extrao e quantificao de carotenoides totais

em iogurte

O teor de carotenoides totais do iogurte controle foi inferior ao

limite de quantificao do mtodo desenvolvido (1,28 g g-1), comprovando que no houve interferncia dos carotenoides provenientes
do leite desnatado na quantificao dos carotenoides totais do iogurte
adicionado de corante lutena.
A seletividade de um mtodo consiste na capacidade de medir
um composto na presena de outros componentes ou substncias
interferentes.21 Os carotenoides possuem espectro de absoro no
UV-visvel bastante caracterstico, apresentando geralmente trs
bandas, cuja posio uma funo do nmero de ligaes duplas conjugadas na molcula.18 A Figura 5 apresenta os espectros de absoro
da soluo de padro de lutena e dos extratos obtidos a partir dos
iogurtes adicionados ou no de corante base de lutena. Foi possvel
observar que o espectro do extrato do iogurte adicionado de corante
apresenta a mesma forma do espectro do padro de lutena, ambos
mostrando comprimentos de onda de absoro mxima a 421, 445
e 473 nm em etanol. Alm disso, o espectro de absoro do extrato
do iogurte controle no interferiu nem se sobreps ao espectro do
extrato do iogurte adicionado de corante na regio espectral prxima
a 445 nm, atestando a seletividade do mtodo de extrao. Caso
o iogurte seja totalmente adulterado com outro corante de menor
custo, como o carotenoide bixina, o mtodo desenvolvido capaz
de detectar esta fraude facilmente, uma vez que a bixina apresenta
caractersticas espectrais na regio do UV-visvel (comprimentos de

Vol. 35, No. 10

Desenvolvimento e validao de mtodo espectrofotomtrico para determinao de corante

onda de absoro mxima de 429, 457 e 484 nm) diferentes das da

lutena. Porm, se a adulterao for parcial, seria necessrio utilizar
um mtodo de espectrofotometria de derivadas para quantificao
como, por exemplo, o desenvolvido para corantes artificiais,27 pois
estes dois carotenoides so extrados juntos e a presena de bixina
pode levar superestimao do teor de lutena no iogurte.

2061

Tabela 1. Resultados da linearidade do mtodo

Parmetros

Resultados

Faixa de linearidade

1,41 13,42 g g-1

Equao: y = ax + b

y = 0,0274x 0,0035

Coeficiente angular D.P.

0,0274 0,0030

Coeficiente linear D.P.

-0,0035 0,0144

Coeficiente de determinao

0,9938

Resultados expressos como mdia desvio padro de trs repeties.

16%.29 Desta forma, o mtodo desenvolvido no presente estudo apresentou um excelente DPR, provavelmente devido ao baixo nmero
de etapas e simplicidade. A exatido do procedimento analtico foi
avaliada por testes de recuperao em trs nveis de adio, e variou
de 95 a 103% (Tabela 2). Considerando que os valores de recuperao
em todos os nveis testados foram prximos a 100%, o mtodo foi
considerado exato.
Tabela 2. Recuperao de lutena nas amostras de iogurte adicionadas de
corante base de lutena

Figura 5. Espectro de absoro no UV-visvel do padro de lutena (2,47 g

mL-1), do extrato obtido a partir do iogurte adicionado de corante base de
lutena e do extrato obtido do iogurte controle

A faixa de linearidade do mtodo foi de 1,41 a 13,42 g g-1, e

os parmetros da curva analtica so apresentados na Tabela 1. Estes
parmetros foram utilizados para a determinao do LD e LQ, que
foram de 0,42 e 1,28 g g-1, respectivamente, indicando boa sensibilidade. Dados da literatura apontam um LD inferior (0,014 g g-1)
ao encontrado no presente trabalho,28 quando realizada a quantificao de lutena em leite e frmulas peditricas por CLAE-DAD,
provavelmente por se tratar de um mtodo analtico mais sensvel
que a quantificao por espectrofotometria. Usualmente, a faixa de
linearidade de um mtodo, assim como seus LD e LQ, determinada
atravs de uma curva analtica obtida pela diluio do padro do
composto que se deseja quantificar em solvente. Entretanto, como
a matriz estudada pode exercer efeito na quantificao do composto
de interesse, necessrio verificar se a faixa de trabalho e os limites
estimados pela curva analtica em solvente so coerentes e correspondem aos resultados prticos. No presente trabalho, uma curva
analtica foi construda a partir de solues etanlicas do corante
lutena, na faixa de 0,10-1,25 g mL-1, correspondente faixa de
concentrao dos extratos do iogurte adicionado do corante lutena.
Os LD e LQ estimados matematicamente pela curva de diluio do
corante foram extremamente baixos, 3,62 x 10-16 e 1,10 x 10-15 g
mL-1, respectivamente, sendo experimentalmente impraticveis para
iogurte, utilizando o mtodo proposto. Por conseguinte, foi empregado o mtodo de superposio de matriz para determinao da faixa
de aplicao e limites, construindo-se a curva analtica com extratos
obtidos a partir de amostras de iogurte adicionadas de diferentes concentraes de corante lutena. Este mtodo de superposio utilizado
para compensar o efeito da matriz ou possveis interferentes e fornece
uma melhor correspondncia com a composio da amostra. Alm
disso, desejvel que a faixa de aplicao e os limites estejam na
mesma unidade dos resultados obtidos pelo mtodo, no caso g g-1.13
O valor do DPR, que expressa a repetibilidade do mtodo, foi
igual a 3,4%. Os mtodos para anlise de compostos presentes em
nveis de concentrao de g g-1 devem apresentar DPR inferior a

Concentrao
adicionada (g g-1)

Concentrao
encontrada (g g-1)1

Recuperao2 (%)

5,53

5,46 0,31

99

11,49

10,96 0,14

95

13,45

13,91 0,05

103

Resultados expressos como mdia desvio padro de trs repeties. 2Calculada a partir da mdia da concentrao de trs repeties.
1

CONCLUSO
O mtodo proposto para extrao e quantificao por espectrofotometria no UV-visvel de carotenoides em iogurte adicionado de
corante base de lutena demonstrou seletividade, linearidade na
faixa estudada, sensibilidade, preciso e exatido adequadas. Este
novo mtodo se apresenta como uma alternativa mais rpida, de fcil
execuo e de baixo custo para quantificao de corante base de
lutena adicionado em iogurte.
REFERNCIAS
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