M.Alfonso - L.Mengozzi - A.

Vecchia
“G.Ciamician”-Bologna 2010

SIMULAZIONE DI UNA DOPPIA CATENA DI DNA: decamero poliA, polyT

INTRODUZIONE:

In questa esperienza abbiamo studiato la dinamica molecolare di una doppia elica di DNA
costituita di sole adenine e timine attraverso stumenti di calcolo computazionale.

Nello studio di una molecola è neccessario considerare tutte le interazioni tra gli atomi che la
compongono:
• le interazioni di legame ossia i legami chimici fra gli atomi
• le interazioni di non legame che si riscontrano a partire dagli atomi in posizione quattro
rispetto all'atomo considerato.
In una molecola molto grande di conseguenza le interazioni di non legame pur essendo molto
meno intense dei legami chimici, sono molto numerose e il loro peso sull'energia complessiva
di una molecola risulta importante.
Poiché il calcolo di tutte le interazioni di non legame della molecola risulta
computazionalmente pesante spesso si sceglie un raggio di cutoff oltre il quale non
consideriamo le interazioni tra gli atomi. In questo modo non consideriamo le interazioni di
non legame oltre tale raggio.
Questa scelta allegerisce I calcoli ma implica approssimazioni non sempre trascurabili.
Prima di effetture lo studio di dinamica molecolare è necessario considerare il raggio di
cutoff da impostare nel file di input del programma e l'eventuale presenza di un solvente.

In primo luogo abbiamo effettuato l'analisi statica della superficie di energia potenziale della
molecola considerata attraverso una procedura di minimizzazione dalla quale otteniamo la
geometria molecolare più stabile.

Tale analisi non è però sufficiente per descrivere la molecola poichè essa vibra a causa
dell'energia termica che possiede.
Attraverso uno studio di dinamica molecolare calcoliamo, a partire dalla geometria ottenuta
attraverso la minimizzazione, le geometrie che la molecola assume nel tempo a causa delle
vibrazioni.
Impostiamo il programma di calcolo così che calcoli una geometria ogni femto secondo per
100000 step.
Il programma utilizzato per i calcoli computazionali è Amber8: tale programma richiede tre file:

1. un file formato .pdb che contiene le coordinate molecolari; tale file viene scaricato dalla
banca dati protein data bank.
2. Un file .imp, ossia il file di input che contiene I parametri di minimizzazione e di calcolo
relativi alla molecola.
3. Il topology file.prmtop che contiene le informazioni relative alla connettività tra gli
atromi, alla forza dei legami, al tipo di atomo e al campo di forza in cui è immersa la
molecola.

Abbiamo utilizzato i programmi vmd per la visualizzazione delle strutture e delle traiettorie
e gnuplot per la realizzazione dei grafici relativi all'energie potenziali, cinetiche e totali.
PARTE SPERIMENTALE:
Caricare il topology file ed il file di coordinate molecolari.

Il topology file ed il file contenente le coordinate della geommetria iniziale sono generati
attraverso il programma leap: il comando per accedervi è tleap.
Il force field, cioè il topology file, utilizzato è Amber99, che viene caricato attraverso il
comando:

source leaprc.ff99

il file pdb utilizzato è nuc_ter.pdb che carichiamo col nome model attraverso il comando:

model = loadpdb “nuc_ter.pdb”

salviamo il file .pdb applicandogli le coordinate molecolari del force field attraverso il
comando:

saveamberparm model polyAT_vac.prmtop polyAT_vac.inpcrd

Usciamo con quit dal programma leap.

Molecola nel vuoto con raggio di cutoff 12.

Caricati i primi due file costruiamo il file di input per studiare la molecola nel vuoto con un
raggio di cutoff pari a 12Å.
Il file di input ha il seguente nome: polyAT_vac_init_min.in
Al suo interno sono definiti:
● il tipo di calcolo: imin=0 (dinamica molecolare), imin=1 (minimizzazione)
● il numero di cicli di minimizzazione: maxcyc= 500
● il numero di cicli steepset descent: ncyc= 250
● la presenza di condizioni periodiche, ntb=0 cioè condizioni periodiche assenti
● se la simulazione è effettuata nel vuoto (igb=0) o nel solvente implicito, acqua, (igb=1)
● il raggio di cutoff: cut=12

Con il file di input e i file polyAT_vac.prmtop e polyAT_vac.inpcrd si effettua la minimizzazione

della doppia elica nel vuoto attraverso il programma sander attraverso con il seguente
comando:

sander -O -i polyAT_vac_init_min.in -o polyAT_vac_init_min.out -c polyAT_vac.inpcrd -p e

polyAT_vac.prmtop -r polyAT_vac_init_min.rst

Il file .out contiene i risultati della minimizzazione: le energie, la temperatura.

Il file polyAT_vac_init_min.rst contiene loa geometria finale del calcolo.

Possiamo verificare il risultato della minimizzazione attraverso il programma grafico vmd.

Per poter vedere il file con vmd è necessario creare il file .pdb della struttura minimizzata dal
file.rst:
ambpdb -p polyAT_vac.prmtop < polyAT_vac_init_min.rst > polyAT_vac_init_min.pdb
Richiamando vmd dal terminal si carica il file.pdb e si visualizza la doppia elica di DNA.
Costruiamo il file di input per la dinamica molecolare con il seguente nome:
polyAT_vac_md1_12Acut.in.
Al suo interno sono contenute le seguenti informazioni:

● imin=0 poichè è una minimizzazione

● ntb=0
● igb=0, ntpr=100, ntwx=100,
● ntt=3, gamma_ln=1.0
● tempi=300.0, temp0=300.0 che sono le temperature iniziali e finali
● il numero di steep: nstlim=100000 e il dt=0.001 picosecondi.
● Cut=12

La simulazione di dinamica molecolare è lanciata con il comando:

sander -O -i polyAT_vac_md1_12Acut.in -o polyAT_vac_md1_12Acut.out -c

polyAT_vac_init_min.rst -p polyAT_vac.prmtop -r polyAT_vac_md1_12Acut.rst -x
polyAT_vac_md1_12Acut.mdcrd

Il file.mdcrd contiente le coordinate della traiettoria della dinamica molecolare.

Per visualizzare tale dinamica carichiamo il file.mdcrd con vmd.

Attraverso il programma gnuplot costruiamo e salviamo I grafici delle energie: cinetica,

potenziale, totale della molecola durante la traiettoria.

Ripetiamo la precedente procedura inserendo il raggio di cutoff 999 per la molecola nel vuoto.
Calcoliamo la traiettoria della dinamica molecolare per la stessa molecola nel solvente
implicito (igb=1) sia con il raggio di cutoff 12 sia con il raggio di cutoff 999.

ELABORAZIONE DATI
il file nuc_ter.pdb nonostante questo file contenga solamente le coordinate spaziali degli
atomi della doppia elica di DNA. visualizza anche i legami tra gli atomi.
La visualizzazione dei legami è effettuata automaticamente dal programma vmd che collega
col simbolo di legame chimico gli atomi ad una distanza inferiore rispetto ad una distanza
critica di default.
Questo non significa che il programma contenga il campo di forza della molecola.
Solamente dopo aver applicato il campo di forza ed aver effettuato la minimizzazione, il file.rst
visualizzato tramite vmd contiene le informazioni relative ai legami. L'aspetto visivo del
filamento del DNA non è cambiato poiche I legami reali corrispondono coi legami che vmd
aveva assegnato in automatico.

Molecola nel vuoto con raggio di cutoff 12

La visualizzazione della traiettoria molecolare mostra le vibrazioni della molecola dovute

all'energia posseduta.
Le analisi dei grafici delle energie delle conformazioni in funzione del tempo mostrano come
la molecola risulti stabile nel vuoto avendo applicato un raggio di cutoff pari a 12.

Energia cinetica totale

Energia potenziale totale

Energia totale

Molecola nel vuoto con raggio di cutoff 999

Al contrario la traiettoria molecolare del filamento di DNA nel vuoto con raggio di cutoff = 999
mostra come la molecola sia instabile ed i due filamenti si separino a partire dal centro in
tempi rapidissimi: dopo 6,3 ps i due filamenti sono visivamente separati e dopo 25 ps
l'energia totale è crollata completamente ed il calcolo di conseguenza si interrompe.
Di seguito le immagini che mostrano il processo:
t=0 femto s

t=15 femto s
t= 45 femto s
t=250 femto s

L'energia cinetica della molecola in funzione del tempo rimane costante essendo dovuta
esclusivamente all'energia termica della molecola.
L'energia potenziale invece crolla nel tempo a causa delle repulsioni fra cariche di segno
uguale presenti sulle doppie eliche di DNA.

Energia cinetica totale

Energia potenziale totale

Energia totale

Tale energia crolla per il contributo dell'energia potenziale evidenziando l'instabilità della
molecola.
Il numero di tali repulsioni è molto elevato ed è la causa della rottura della doppia elica nel
vuoto.
L'instabilità della molecola non era stata evidenziata dalla simulazione con il raggio di cutoff
pari a 12Å perchè considerando le interazioni che ogni atomo ha entro tale raggio vengono
escluse la maggior parte delle repulsioni coulombiane con l'effetto che la doppia elica risulta
stabile nel vuoto.
Al contrario col raggio di cutoff pari a 999 Å includiamo tutte le interazioni che ogni atomo ha
con tutti gli altri.
Concludiamo che l'approssimazione effettuata col raggio di cutoff 12Å non è corretta per lo
studio di una doppia elica di DNA nel vuoto.

Molecola nel solvente implicito con raggio di cutoff 12.

Inserendo il solvente implicito, l'acqua, nella simulazione di dinamica molecolare otteniamo

che la doppia elica di DNA è stabile sia col raggio di cutoff pari a 12 sia col raggio pari a 999.
Ricaviamo tale informazione dai grafici dell'energa totale che mostrano un valore di energia
oscillante attorno a un valore medio che rimane costante nel tempo.

Energia totale: raggio di cutoff 12

Energia totale: raggio di cutoff 999

I grafici delle energie cinetiche e potenziali non mostrano differenze significative in funzione
del raggio di cutoff.

Energia cinetica totale: raggio di cutoff 12

Energia cinetica totale: raggio di cutoff 999

Energia potenziale totale: raggio di cutoff 12

Energia potenziale totale: raggio di cutoff 999

Le traiettorie di dinamica molecolare non presentano differenze significative in base al raggio

di cutoff e mostrano le vibrazioni della molecola stabile nel tempo.

Il solvente dipolare acqua solvata le cariche del filamento di DNA schermandole con l'effetto
di annullarne la repulsione. Perciò approssimare col raggio di cutoff pari a 12 è corretto
perche le interazioni di non legame,numerose a lungo raggio, sono annullate.

L'approssimazione fatta utilizzando il raggio di cutoff pari a 12 risulta corretta per lo studio di
una doppia elica di DNA in un solvente dipolare come l'acqua.

Conclusione.

Il metodo di simulazione di dinamica molecolare con amber fornisce una buona descrizione
del sistema esaminato.
Abbiamo constatato l'importanza del solvente per la stabilità della doppia elica di DNA e
l'importanza della scelta dei parametri di calcolo, in particolare il raggio di cutoff in funzione
del peso delle interazioni che la cariche hanno a diverso raggio nel vuoto e nel solvente, per
simulare correttamente il sistema.