PRACTICA N 2.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

I. OBJETIVOS:
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.

Explica la definicin de medio de cultivo e identifica sus

componentes.
Explica la importancia del medio de cultivo en la tcnica de cultivo
de tejidos vegetales.
Formula y prepara el medio de cultivo de Murashige y Skoog.
Conoce los mtodos de esterilizacin en el cultivo in vitro.

II. MARCO TERICO:

Desde los inicios del cultivo de tejidos ha sido preocupacin de los
investigadores la formulacin de un medio de cultivo que proporcione las
sustancias esenciales para el crecimiento y desarrollo del material
vegetal cultivado. Ello propicio la formulacin de una amplia variedad de
medios de cultivo, dependiendo incluso de la especie cultivada y an de
la clase de explante utilizado, sin embargo consideraron que las rutas
bioqumicas y metablicas bsicas que funcionan en las plantas son
conservadas en las clulas cultivadas in vitro, en tal sentido desde un
comienzo los medios de cultivo incluyeron sales minerales, vitaminas y
carbohidratos y diversos aditivos orgnicos, que si bien es cierto muchos
son biosintetizados por las clulas, lo son de manera lenta y en
cantidades insuficientes, por lo que deben ser adicionados para suplir sus
necesidades metablicas, energticas y estructurales.
El xito que se obtenga en un cultivo de tejidos vegetales depende del
uso del medio nutritivo adecuado, como tambin del empleo de tejidos
viables, incubacin, calidad de reactivos, etc. Usando las sustancias
qumicas necesarias y las combinaciones apropiadas de nutrientes, as
como su forma qumica adecuada, ha sido posible establecer cultivos
para casi todas las partes de una planta en diversas especies vegetales.
Medio de cultivo:
El medio de cultivo es una mezcla de nutrientes que en concentraciones
adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el mantenimiento,
crecimiento y desarrollo normal de rganos, clulas y tejidos luego de
ser aislados de la planta madre. Es un sustrato donde se reproducen las
condiciones necesarias para lograr el desarrollo normal de una planta en
condiciones aspticas.
Los componentes del medio de cultivo pueden agruparse en dos
categoras: componentes inorgnicos, donde se incluye el agua y las
sales minerales, y los componentes orgnicos, donde se incluyen
carbohidratos, vitaminas, reguladores de crecimiento, aminocidos y/ o

amidas, complejos naturales, algunas purinas y pirimidinas, hexitoles y

cidos orgnicos.
Componentes inorgnicos:
Agua:
Es el mayor componente utilizado en la preparacin del medio de cultivo.
Su potabilizacin no elimina las impurezas que a menudo afectan el
normal crecimiento de los cultivos, de all la necesidad de su destilacin y
desionizacin o desmineralizacin.
Sales minerales inorgnicas:
Los minerales constituyen el grupo ms importante de sustancias
nutritivas en el cultivo in vitro.
Las innumerables formulaciones de medio de cultivo que se conocen
llevan el nombre de su autor. Estas formulaciones incluyen un conjunto
de sales minerales llamado medio basal, que incorpora macronutrientes y
micronutrientes.
Los macronutrientes o macroelementos: C, H, O, P, K, N, S, Ca y Mg; son
incluidos en forma de sales inorgnicas cuya concentracin es mayor de
30 ppm.
Los micronutrientes o microelementos: B, Zn, Mn, Cu, Co, I, Mo, Fe y Cl;
son incorporados al medio de cultivo a concentraciones menores de 30
ppm.
La frmula de Murashige y Skoog (1962) ha demostrado ser el medio
adecuado para una gran variedad de especies, as como para diferentes
partes de una planta. Esta frmula contiene grandes cantidades de macro
nutrientes y tambin contiene una alta concentracin de nitrgeno en
forma de NH4NO3 y KNO3.
Componentes orgnicos:
Carbohidratos:
El azcar es un componente muy importante en cualquier medio
nutritivo, y es esencial para el crecimiento y desarrollo in vitro, ya que el
crecimiento tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la
fotosntesis.
La sacarosa es la fuente de carbono ms ampliamente usada, su adicin
es necesaria como fuente exgena de energa metablica y esqueletos
carbnicos, generalmente se usa una concentracin de 1 a 5%, tambin
se utiliza glucosa, fructosa, maltosa, almidn, manitol, sorbitol.
Reguladores de crecimiento:

Las hormonas vegetales (fitohormonas) pueden ser definidas como un

grupo de sustancias orgnicas, sintetizadas por las plantas, que tienen la
capacidad de afectar a los procesos fisiolgicos en bajas concentraciones.
El control de la respuesta hormonal se lleva a cabo a travs de cambios
en la concentracin y la sensibilidad de los tejidos a las hormonas. Hasta
fechas recientes ha existido un acuerdo general en clasificar como
hormonas vegetales a auxinas, citoquininas, giberelinas, etileno y cido
abscsico, que constituyen los cinco grupos hormonales clsicos. En los
ltimos aos, sin embargo, se ha ido aislando una serie de sustancias que
tambin pueden clasificarse como hormonas basndose en sus efectos,
en este nuevo grupo de hormonas vegetales no clsicas se incluyen a los
brasinoesteroides, poliaminas, oligosacarinas, cido jasmnico y cido
saliclico.
Vitaminas:
Las clulas vegetales en cultivo son usualmente autotrficas respecto a
las vitaminas, sin embargo no pueden sintetizarlas hasta que los
explantes crezcan, por lo tanto es necesario incorporarlas al medio de
cultivo. La nica vitamina que ha demostrado tener importancia en
cultivos de clulas y rganos es la tiamina (Vitamina B1); algunas otras se
utilizan debido a que pueden estimular procesos de crecimiento
especficos, tales como la piridoxina (Vitamina B6), el cido nicotnico
(niacina), mioinositol, cido flico (Vitamina B9), la riboflavina (Vitamina
B1), cido pantotnico (Vitamina B5), mioinositol y el acido ascrbico
(Vitamina C).
Aminocidos y amidas:
Los requerimientos de aminocidos y/o amidas se pueden suministrar por
medio de la adicin de un hidrolizado proteico como: casena,
lactoalbmina, peptona y triptona. Sin embargo algunos aminocidos han
demostrado tener efectos benficos al adicionarse en forma individual
como L-arginina, cido L-asprtico, L-glutmico, L- asparragina y Lglutamina.
Purinas y pirimidinas:
Todos estos compuestos pueden ser suministrados a travs de los
extractos y endospermos ya indicados, sin embargo el endospermo
liquido de maz contiene adenina, adenosina, xantina e isoguanina.
Complejos naturales:
Muchas preparaciones de composicin indefinida y variable han sido
empleadas para enriquecer los medios de cultivo; frecuentemente se han
empleado como ltima alternativa despus de que todos los ingredientes
definidos del medio han fallado en el establecimiento de cultivos de
clulas y rganos.

Entre los complejos naturales ms utilizados: Pur de pltano,

endospermo de coco, emulsin de pescado, extracto de malta, extracto
de levadura, zumo de naranja, jugos de tomate, zanahoria, papa, camote,
frejol, uvas, pia, savia de abedul, etc.
Materiales inertes de soporte:
El agar es un polisacrido derivado de algas marinas, que se utiliza como
agente gelificante en los medios nutritivos.
El agar es el material de soporte ms ampliamente usado en el cultivo de
tejidos, pues provee al medio de un excelente gel hmedo que sirve
como soporte al inculo. Sin embargo, fisiolgicamente no es inerte,
puesto que es una fuente de cantidades variables de sustancias
inhibitorias o estimulantes del crecimiento.
La concentracin usual para al agar es 0.6-0.8%, sin embargo se debe
considerar la pureza del agar y la marca comercial.
Se utiliza diferentes formas comerciales como Phytagel, Gibco Phytagar y
Gelrite y Flow agar.
III. MATERIALES:
3.1. Material de vidrio:

Baguetas.

Balones, 500 mL.

Frascos mbar para almacenar soluciones.

Frascos transparentes de cultivo.

Matraces, 250 mL.

Pipetas, 1, 5, 10 mL.

Probetas, 500 mL.

3.2. Reactivos:

Formulacin del medio MS.

Phytagel.

Sacarosa.
3.3. Otros:

Esptula.
Guantes de asbesto.
Ligas.
Papel aluminio.
Picetas.

3.4. Aparatos:

Balanza analtica.

Potencimetro.

Autoclave.

Microondas.
IV. METODOLOGA:

4.1. Lavado de recipientes:

Lavar con un detergente biodegradable la parte interna y
externa de los recipientes de cultivo.
Enjuagar con agua corriente continua y luego con agua
destilada hasta la desaparicin total de burbujas.
Secar y esterilizar el material en la estufa.
4.2. Preparacin del medio de cultivo:
Se conocen tres formas de preparacin de medios
a. Utilizacin de sobres comerciales de medio de cultivo (kits).
b. Utilizacin de soluciones stock
individualizadas de cada
componente de medio.
c. Utilizacin de soluciones stock agrupados de un tipo de
medio.
En la presente prctica emplearemos el segundo mtodo:

Pesar las cantidades necesarias de los componentes del

medio de cultivo, segn la formulacin escogida.
Preparar las soluciones stocks correspondientes segn la
concentracin de la formulacin.
En un matraz mezclar macronutrientes, micronutrientes,
vitaminas, aminocidos y reguladores de crecimiento.
Aadir la sacarosa y agitar hasta que se disuelva
completamente.
Enrasar con agua destilada hasta el volumen deseado.
Ajustar el pH, con soluciones de NaOH 1.0 N y HCl 1.0 N,
entre 5.8 y 6.0.
Disolver el agar con calentamiento y agitacin constante.
Distribucin del medio de cultivo.
Esterilizacin del medio en la autoclave durante 15 minutos
a 121C y 15 lb de presin.
Cuando el medio ha alcanzado entre 30 y 40C, o una
temperatura cercana a la de gelificacin del agar, se le agregan
las soluciones que necesitan ser filtradas por ser termolbiles;
esto debe hacerse en la cmara de flujo laminar.

V. PROCEDIMIENTO DETALLADO:
VI. RESULTADOS Y DISCUSIN:
VII. CONCLUSIONES:

VIII. CALCULOS:

Macro Nutrientes

KNO3 -> PM 101

101g 1000 mM 1000 mL

X=101 ------- 1000 mL
X

------- 100 mL

X= 10.1

CaCl2 -> PM 146.8

146.8 g 1000 mM 1000 mL

X= 14.68 -------- 1000 mL
X

-------- 100 mL

X= 1.468

MgSO4. 7H2O -> PM 246.3

246.3 g 1000mM 1000 mL

X= 24.63 ------- 1000mL
X

------- 100 mL

X= 2.463

KH2PO4 -> PM 135.9

135.9 g 1000 mM 1000mL

X= 13.59 ------- 1000 mL
X
Micro Nutrientes

------- 100 mL

X = 1.359

MnSO4 -> PM 150.9

150.9 g 1000mM 1000 mL
X=1.509 ------ 1000 mL
X

------ 100 mL

X= 0.1509

ZnSO4 -> PM 287.3

287.3 g 1000 mM 1000 mL
X

-- 10

X= 2.873 ------ 1000 mL

X

------ 100 mL

X= 0.2873

H3BO3 -> PM 61.8

61.8 g 1000 mM 1000 mL
X -----1
X= 0.618 ------ 1000 mL
X

------ 100 mL

X= 0.0618

KI -> PM 165.9
165.9 g 1000 mM 1000 mL
X --------1
X= 0.1659 ------ 1000 mL
X

------ 100 mL

Na2MoO4. 2H2O -> PM 241.7

241.7 g 1000 mM 1000 mL

X = 0.01659

X ------1
X= 0.2417 ----- 1000 mL
X

----- 100 mL

X = 0.02417

CaCl2. 6H2O -> PM 237.7

237.7g 1000 mM 1000 mL
X -------0.1
X= 0.02377 ---- 1000 mL
X

---- 100 mL

X = 2. 377 x 10-3

Fe EDTA -> PM 374.04

374.04g 1000 mM 1000 mL
X ------ 10
X= 3.7404 ---- 1000 ml
X

---- 100 mL

X = 0.37404

FeSO4. 7H2O -> PM 277.8

277.8 g 1000 mM 1000 mL
X ----- 10
X=2.778 ----- 1000ml
X

----- 100 ml

X = 0,2778

C6H8O6 -> PM 176

176 g 1000 mM 1000 mL
X ---- 1
X= 0.176 ---- 1000 mL
X

---- 100 mL

X= 0.0176

C2H5NO2 -> PM 75
75 g 1000 mM 1000 mL
X --- 1
X= 0.075 ---- 1000 mL
X

---- 100 mL

X = 7.5 x 10-3

C6H6NO2 -> PM 124

124 g 1000 mM 1000 mL
X ---- 1
X= 0.124 ---- 1000 mL
X

---- 100 mL

X = 0.0124

C8H12ClNO3 -> PM 205.4

205.4 g 1000 mM 1000 mL
X ------- 1
X = 0.2054 ----- 1000 mL
X

---- 100 mL

X = 0.02054

C12H17ClN4OS. HCl -> PM 336.8

336.8 1000 mM 1000 mL
X

--- 1

X = 0.3368 ---- 1000 mL

X

---- 100 mL

C6H12O6 -> PM 180

X= 0.03368

180 1000 mM 1000 mL

X --- 100
X = 18 --- 1000 mL
X ------- 100 mL
X =1.8
Reguladores de Crecimiento
C10H7CH2CO2H -> PM 186
186g 1000 mM 1000 mL
X= 0.186 -------1000mL
X

------ 100mL

X= 0.0186

C12H11N5 -> PM 225

225g 1000 mM 1000 mL
X= 0.225 -------1000 mL
X

------- 0.0225

X= 0.0225

C19H22O6 -> PM 346

346g 1000 mM 1000mL
X= 0.346 ------- 1000 mL
X

------- 1000 mL

X=0.0346

CUESTIONARIO:
Describe la composicin de los medios de cultivo: White y Gamborg (B5)
White (1963)
Es uno de los medios, si no el mas, diluido de que se dispone, y por lo tanto de uso
complementario al MS. Se elabor para cultivo de races de tomate.
Macronutrientes
Ca(NO3)24H2O
0.3 g/l
KNO3
0.08 g/l
MgSO4.7H2O
0.72 g/l
Na2SO4
0.2 g/l

NaH2PO4.H2O
0.019g/l
Micronutrientes
KCl
65 mg/l
KI
0.75 mg/l
H3BO3
1.3 mg/l
MnSO4.7H2O
7 mg/l
ZnSO4.7H20
3 mg/l
Na2MoO4.2H2O
0.25 mg/l
CuSO4.5H2O
0.025 mg/l
CoCl2.6H2O
0.025 mg/l
Na2.EDTA
37.3 mg/l
FeSO4.7H2O
27.8 mg/l

Por qu algunas veces es importante la adicin de carbn activado al

medio nutritivo?
Algunas plantas se caracterizan por liberar un pigmento caf a negro
despus de un corte. Estos pigmentos son compuestos fenlicos y taninas
que se oxidan y posteriormente dificultan el crecimiento y desarrollo del
cultivo
in vitro.
El carbn activado es un compuesto antioxidante ya que contribuye a
absorber esos compuestos fenlicos cuando estn presentes. Cuando se
utilizase agrega a razn de 0.2 - 3% (peso/vol).
Cul es la influencia del pH del medio nutritivo en el cultivo in vitro?
El pH inicial de los medios de cultivo se regula, en general, entre pH 5.5 y
6.0, dado que afecta tanto el crecimiento como la produccin.
Explica los mtodos de esterilizacin por calor seco y por calor hmedo.
Enumera cinco especies vegetales micropropagadas en el medio de
Murashige y Skoog.
IX. BIBLIOGRAFA:
AZCN-BIETO, J. y TALN, M. Fundamentos de Fisiologa vegetal.
2da Edicin. Editorial McGraw-Hill. Espaa. 2008.
HURTADO, D., MERINO, M. Cultivo de tejidos vegetales. Editorial
Trillas. Mxico. 2000.
ROCA, W., MROGINSKI, L. Cultivo de tejidos en la agricultura.
Fundamentos y aplicaciones. Centro internacional de Agricultura Tropical
(CIAT). Colombia. 1993.
AYERBE, L. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones MundiPrensa. Espaa. 1990.

X. ANEXOS:
COMPOSICION QUMICA DEL MEDIO DE CULTIVO DE MURASHIGE & SKOOG (MS)
Solucin
Frmula
Peso
Gr en
nM de
Macronutrientes:
qumica
olecular
Stock
100 mL
MS
mM

Nitrato de amonio
Nitrato de potasio
Cloruro de calcio
Sulfato de magnesio
Fosfato monobsico de potasio
Micronutrientes

Sulfato de manganeso
Sulfato de zinc
Acido brico
Ioduro de potasio
Molibdato de sodio
Sulfato de cobre
Cloruro de cobalto
FeEDTA

Acido etilenediomina
tetraactico
Sulfato ferroso

NH4NO3
KNO3
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
KH2PO4
Frmula
qumica

MnSO4
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Frmula
qumica

Na2EDTA.2H20
FeSO4.7H2O

80.04
101.11
147.00
246.48
136.09
Peso
molecul
ar

151.01
161.46
61.81
166
182.94
249.68
237.93
Peso
molecul
ar

1000
1000
100
100
100

200
200
50
150
20

20.6
18.8
2.99
1.5
1.25

Solucin
Stock
M

Gr en
100 mL

10000 100
10000 50
10000 100
1000 60
1000 100
100 100
100 100

M de
MS

100
29
100
5
1
0.1
0.1

Solucin
Stock
M

Gr en
100 mL

372

10000 0.372

277.8

10000

Volume
n
mL

20.6
18.8
29.9
15
12.5
Volume
n
mL

10
2.9
10
5
1
1
1

M de
MS

Volume
n
mL

100

10

0.277

Solucin
Vitaminas y otros

Acido ascrbico
Glicina
Acido nicotnico
Piridoxina. HCl
Tiamina. HCl
Mio-inositol
Carbohidratos

Frmula
qumica

Stock
M.

C6H8O6
C2H5NO2
C6H6NO2.
C8H12ClNO3
C12H17ClN4OS.HCl
C6H12O6

176.12
75.067
123
205.64
337
180.16

Frmula
qumica

Peso
molecul
ar

Gr en
100 mL

1000 0.0176
1000 0.075
1000 0.0124
1000 0.0205
1000 0.0337
100000 0.0336

M de
MS

10
26.6
4
2.4
0.3
550

Solucin
Stock
M

gr. en
100 mL.

mM de
MS

10
26.6
4
2.4
0.3
5.5
Volume
n
mL.

Sacarosa
Reguladores de crecimiento
ANA
BAP
AG3
KIN

C12H22O11
Frmula
qumica

342.29
Peso
molecul
ar

186.21
225.26
346.37

87.6
Solucin
Stock
M

1000
1000
1000
1000

gr. en
100 mL.

0.0186
0.0775
0.0346

M de
MS

0.5
10
10

87.6
Volume
n
mL.

0.5
10
10