Microbiota de La Cavidad Bucal

Universidad Autnoma de Madrid
Facultad de Biologa
Mster en Microbiologa
CIAL
La Dra. Teresa Requena Rolana del Departamento de Biotecnologa y Microbiologa de los

Alimentos del Instituto de Investigacin en Ciencias de la Alimentacin.
Certifica:
Que Elvira Barroso Merinero ha realizado el trabajo de investigacin titulado: Interacciones de
los polifenoles del vino con la microbiota de la cavidad bucal humana bajo su direccin en el
Instituto de Investigacin en Ciencias de la Alimentacin (CSIC-UAM).
Este trabajo ha sido subvencionado por el Proyecto de Investigacin AGL2009-13361-C02-02
RESUMEN
La cavidad bucal alberga un complejo ecosistema con diferentes microambientes
(mejillas, paladar, lengua, superficie de los dientes, encas y saliva), est compuesto por
cientos de especies de microorganismos diferentes, la mayora de los cuales son
bacterias y solo cerca del 50% de estas especies se pueden cultivar. Algunos estudios
realizados in vitro e in vivo han demostrado que muchos de los componentes naturales
de los alimentos y bebidas provocan modificaciones en esta microbiota. Los polifenoles
de los alimentos pueden modificar el crecimiento de microorganismos susceptibles. El
vino, es una rica fuente de polifenoles y por ello el consumo moderado de esta bebida
puede permitir la modulacin de la microbiota oral e intestinal humana. La composicin
fenlica del vino tinto se caracteriza por la presencia principalmente de flavan-3-oles,
flavonoides, antocianinas, cido hidroxibenzoico, cidos hidroxicinmicos, estilbenos y
alcoholes fenlicos, compuestos que potencialmente pueden producir la modulacin de
la microbiota humana por el consumo de vino
El objetivo de este trabajo se ha centrado en el estudio de los posibles efectos de
los polifenoles del vino sobre la microbiota de la cavidad bucal a travs de un estudio de
intervencin en humanos. A partir del DNA de las muestras de saliva obtenidas de un
grupo de individuos sanos que haban estado consumiendo vino de forma moderada
durante 28 das,
se realizaron anlisis de la poblacin microbiana a travs de la
separacin de los fragmentos amplificados por PCR utilizando la tcnica de

electroforesis en gel de de gradiente desnaturalizante (DGGE), as como la
cuantificacin por PCR cuantitativa en tiempo real (RTi-PCR). Los perfiles de DGGE
obtenidos y los recuentos de microbiota bacteriana total no mostraron diferencias
significativas de diversidad o cantidad bacteriana asociadas al consumo de vino. Sin
embargo, s se han observado diferentes patrones de comunidades bacterianas entre los
distintos individuos sujetos al estudio.
INDICE
1. INTRODUCCIN.........5
1.1. Polifenoles del vino........6
1.2. Microbiota bucal........8
1.3. Interacciones de los polifenoles del vino con la microbiota oral.....11
1.3.1. Metabolismo de los polifenoles del vino por bacterias orales...11
1.3.2. Efecto de los polifenoles del vino y sus metabolitos en la microbiota oral...12
1.4. Mtodos de estudio de la microbiota oral. Tcnicas moleculares.......13
1.4.1. Tcnicas moleculares basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR)...14
1.4.2. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)..14
1.4.3. PCR a tiempo real o cuantitativa (RTi-PCR)....15
1.4.4. Secuenciacin....16
1.4.5. Metagenmica...17
2. OBJETIVO..........18
3. MATERIALES Y MTODOS....19
3.1. Diseo del estudio de intervencin en humanos......19
3.2.Recogida de muestras....20
3.3. Extraccin de DNA ..20
3.4. Incubacin in vitro de sedimentos bacterianos de saliva con polifenoles de uva....21
3.5. Anlisis por PCR-DGGE..21
3.5.1. Amplificacin de DNA y preparacin de geles de gradiente desnaturalizante.21
3.5.2. Revelado de los geles.22
3.6. Recuperacin de bandas y secuenciacin....23
3.7. PCR cuantitativa en tiempo real (RTi-PCR)23
3.7.1. Obtencin de la curva de calibrado y evaluacin de la eficiencia de los cebadores
empleados....23
3.7.2. Reaccin de RTi-PCR....24
3.7.3. Anlisis de los datos obtenidos mediante RTi-PCR...25
4. RESULTADOS Y DISCUSIN...25
4.1. Optimizacin en el tratamiento de muestras y extraccin del DNA.........25
4.2. Modulacin in vitro de la microbiota bucal con extractos fenlicos...27
4.3. Perfiles microbianos de saliva obtenidos por DGGE. Consecuencias del consumo
moderado de vino.29
4.4. Anlisis de la curva de calibrado y eficiencia de los cebadores empleados en la
RTi-PCR...36
4.5 Cuantificacin de bacterias de la saliva por RTi-PCR.....36
5. CONCLUSIONES.38
6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS..........39
1. INTRODUCCIN
En los ltimos aos, la importancia de la salud bucal y su impacto en la salud en
general ha sido destacada por investigadores dentales, mdicos y profesionales afines
(Signoretto y Canepari, 2009). La cavidad oral es un complejo sistema de tejidos y
rganos que se utilizan para la seleccin de los alimentos durante la ingesta, as como
para su transformacin en formas adecuadas para la digestin en el resto del tracto
gastrointestinal (TGI). Una de las principales funciones de la microbiota del TGI es la
transformacin de carbohidratos, protenas y compuestos no nutritivos en molculas
ms absorbibles que sirven como nutrientes para las bacterias hospedadoras y
transentes. Por otra parte, la microbiota intestinal se considera que juega un papel
esencial en el sistema de defensa del husped. En este sentido, es bien conocido que una
microbiota intestinal equilibrada protege contra trastornos intestinales, enfermedades
inflamatorias, cncer, obesidad, etc. (Carroll, Threadgill, y Threadgill, 2009). Todos los
cambios indeseables en la composicin de esta microbiota podran modificar su funcin
protectora. Adems de los aspectos mencionados, la dieta influye en el establecimiento
de las bacterias y su grado de colonizacin intestinal y bucal y, por tanto, en la
composicin y actividad de la microbiota del ser humano. Por lo tanto, es importante
determinar si el consumo de componentes especficos de los alimentos es capaz de
modificar la colonizacin de la microbiota bucal e intestinal.
En los ltimos aos, ha aumentado el inters cientfico por las interacciones
entre los polifenoles de los alimentos y la microbiota intestinal (Selma, Espn, y TomsBarbern, 2009). En este sentido, cada vez hay ms estudios sobre los derivados del
vino y la uva debido a su alto contenido en polifenoles, su diversidad estructural y sus
potenciales beneficios para la salud (Forester y Waterhouse, 2009).
Las principales transformaciones de los polifenoles del vino tienen lugar en el
colon, donde pueden ser transformados en metabolitos ms bioactivos que sus
precursores (Aura, 2008; Selma et al, 2009). Fisiolgicamente, estos cambios estn
asociados con el metabolismo bacteriano de polifenoles, junto con la capacidad de los
polifenoles del vino y sus metabolitos resultantes de inhibir o estimular selectivamente
el crecimiento de las bacterias del intestino, tambin conocido como modulacin de la
microbiota intestinal. En cuanto a la microbiota oral, se ha demostrado recientemente el
papel de los componentes del vino en la salud bucal (Kongstad et al., 2008), y los
esfuerzos se han dirigido a la deteccin y caracterizacin de diferentes compuestos
polifenlicos beneficiosos por mostrar actividad antimicrobiana (Furiga, Lonvaud, y

Badet, 2009). Sin embargo, hay muy poca informacin disponible en la actualidad
relativa a la modulacin bacteriana por parte de los polifenoles del vino en la cavidad
bucal.
1.1. Los polifenoles del vino

El vino es un producto alimenticio en el que el componente principal, despus
del agua, es el etanol, por lo general por encima del 10%. Sin embargo, a pesar de los
posibles efectos txicos del etanol, por lo general se acepta que el consumo moderado
de vino tiene efectos beneficiosos para la salud (Pozo-Bayn et al., 2010). En los
ltimos aos, ha habido un aumento significativo en la investigacin relacionada con la
actividad biolgica de los compuestos del vino y, sobre todo, con su biodisponibilidad
en el organismo humano. La mayora de estos estudios han revelado que los compuestos
fenlicos podran jugar un papel clave en los efectos positivos para la salud derivados
del consumo moderado de vino (Pozo-Bayn et al., 2010), particularmente en relacin
con las enfermedades cardiovasculares, tales como aterosclerosis y enfermedad
coronaria (Dvalos y Lasuncin de 2009, Renaud y De Lorgeril, 1992). En base a esta
evidencia cientfica, se ha producido un aumento en el diseo y comercializacin de
ingredientes o suplementos dietticos enriquecidos en polifenoles de la uva o
subproductos de la vinificacin para el consumo humano y animal (Monagas et al.,
2005).
Los compuestos fenlicos en el vino se pueden clasificar en no flavonoides
(cidos hidroxibenzoicos y hidroxicinmicos, aldehdos hidroxibenzoicos, alcoholes
fenlicos y estilbenos, as como elagitaninos extrados de las barricas de roble) y
flavonoides (antocianos, flavonoles, dihidroflavonoles, flavan-3-oles y sus formas
oligomricas y polimricas, tambin los llamados proantocianidinas o taninos
condensados) (Fig. 1). Las antocianinas son componentes caractersticos de los vinos
tintos, mientras que los principales compuestos fenlicos en los vinos blancos son los
cidos hidroxibenzoicos y steres de cido tartrico de cidos hidroxicinmicos (cidos
coutrico y caftrico). El contenido de polifenoles en el vino vara dependiendo de la
variedad de uva y de las prcticas enolgicas realizadas. En este sentido, basado en
anlisis de cromatografa, el contenido promedio de polifenoles es de 10,38 mg/100 ml
para los vinos blancos, y 107,44 mg/100 ml para los vinos tintos (Neveu et al., 2010).
NO FLAVONOIDES
cido glico (cido hidroxibenzoico)
trans- Resveratrol (etilbeno)
cido cafico (cido hidroxicinmico)
FLAVONOIDES
(+)-Catequin (flavan-3-oles)
Procianidina B2 (flavan-3-ol oligmero)
Tirosol (alcohol fenlico)
Malvidin-3-O-glucosido (antocianina)
Quercetina-3-glucsido (flavonol)
Fig. 1. Compuestos fenlicos representativos de los principales grupos presentes en el

vino.
Con el fin de que el organismo haga uso de las propiedades saludables de los
polifenoles del vino, stos deben ser absorbidos para llegar a los tejidos diana y a los
rganos. Sin embargo, la biodisponibilidad de los polifenoles del vino est limitada por
su reconocimiento como xenobiticos por parte del organismo humano. Por otro lado,
en relacin a la estructura qumica de los compuestos fenlicos del vino, se ha
demostrado que influye directamente en su biodisponibilidad, por ejemplo, limitando el
sitio de la absorcin intestinal ya sea en el intestino delgado o en el colon, que influye
en la farmacocintica de su absorcin, la extensin del metabolismo y, por ltimo, la
cantidad excretada en la orina (Donovan et al., 2006; Manach, et al., 2004).
Algunos compuestos fenlicos no glicosilados presentes en el vino, como
flavan-3-oles y, en menor medida, procianidinas dimricas, se absorben directamente en
el intestino delgado sin modificacin qumica previa. En el caso de polifenoles
glicosilados, como las antocianinas, flavonoides y resveratrol, su transformacin podra
comenzar en la boca con la hidrlisis de la unidad glucosdica por accin de enzimas glucosidasas de las bacterias y/o clulas epiteliales de la cavidad oral, como ha sido
reportado para varios glucsidos de quercetina (Walle et al., 2005). La mayor hidrlisis
de estos compuestos se produce en el intestino delgado por accin de -glucosidasas
intestinales, seguido por la difusin pasiva a travs de los enterocitos, as como por glucosidasas citoslicas (CBG) en las clulas epiteliales (Donovan et al., 2006). Tras
atravesar las vellosidades intestinales, los polifenoles sufren metabolismo heptico,
pasan a la circulacin sistmica y finalmente se eliminan por la bilis o en la orina. Otros
polifenoles del vino, que no son absorbidos en su forma nativa, son metabolizados por
la microbiota del colon, as como con algunos metabolitos de fase II que llegan al colon
por la circulacin entero-heptica, antes de la absorcin. Las bacterias intestinales
capaces de metabolizar los polifenoles podran jugar un papel importante en la
produccin de compuestos fenlicos a partir de otros polifenoles, que podran tener
mejor biodisponibilidad y mayor actividad biolgica que sus compuestos de origen, y
participar en la proteccin del cuerpo humano por accin sistmica y local.
1.2. Microbiota bucal

Ambos extremos del tracto orogastrointestinal de los seres humanos poseen una
microbiota abundante dominada por bacterias anaerobias El nmero de bacterias en la
cavidad bucal ronda las 1011 bacterias/g de placa dental y 108109 bacterias/ml de
saliva, mientras que en las heces las cifras alcanzan las 10111012 bacterias/g. (Carroll et
al, 2009; GuRNAer y Malagelada, 2003). Estudios recientes (Maukonen et al., 2008)
indican que se pueden encontrar los mismos gneros bacterianos en muestras orales y
colnicas. Por ejemplo, en ambas regiones se pueden detectar tanto bifidobacterias
como lactobacilos, aunque su incidencia es diferente; los lactobacilos son un hallazgo
comn en la cavidad bucal mientras que las bifidobacterias se detectan ms
frecuentemente en el colon.
La cavidad bucal contiene diferentes microambientes (mejillas, paladar, lengua,
superficie de los dientes, encas y saliva) cada uno con su propia microbiota. Por lo
tanto, la composicin de la microbiota oral vara en las distintas superficies (por
ejemplo, dientes o mucosa), y en lugares sobre una superficie especfica (por ejemplo,
fisuras o surco gingival), lo que demuestra que las pequeas diferencias en el hbitat
pueden afectar a la capacidad de especies individuales para colonizar y dominar (Marsh
y Percival, 2006). Sin embargo, se ha descrito que las especies comunes a todos los
lugares de la cavidad bucal pertenecen a los gneros Gemella, Granulicatella,
Streptococcus y Veillonella (Aas et al., 2005). En estudios realizados tomando muestras
de varios nichos intraorales de individuos sanos (superficies dentales, mejillas, paladar
duro, lengua y saliva) se encontraron 3600 secuencias nicas, ms de 500 OTUs
(unidades taxonmicas operativas) diferentes o filotipos a nivel de especie y de 88 a 104
taxones. Los taxones predominantes pertenecan a Firmicutes (gnero Streptococcus,
familia Veillonellaceae, gnero Granulicatella), Proteobacteria (gneros Neisseria,
Haemophilus), Actinobacteria (gneros Corynebacterium, Rothia, Actinomyces),
Bacteroidetes (gneros Prevotella, Capnocytophaga, Porphyromonas) y Fusobacteria

(gnero Fusobacterium) (Zaura et al., 2009). La microbiota bucal, por tanto, se
compone de un gran nmero de organismos diversos. Muchos de ellos crecen en
biofilms formando comunidades unidas a las superficies de los dientes y la lengua. Las
mltiples especies que componen estas comunidades constituyen redes clula-clula de
interacciones entre especies.
La saliva que fluye por la boca baa superficies limpias y clulas adheridas, con
una gran variedad de especies en suspensin presentes en la saliva. Los primeros
estudios de van der Hoeven et al. (1984, 1987) sobre la capacidad de las bacterias orales
para crecer en la saliva como la nica fuente de nutrientes muestran que varias especies
de Actinomyces pudieron crecer, pero que tres especies de Streptococcus no crecieron a
base de saliva. Se midi la actividad enzimtica de una amplia variedad de bacterias,
incluyendo glicosidasas, peptidasas y esterasas, llegando a la conclusin de que la unin
especfica de las bacterias orales a las glicoprotenas salivales es un posible mecanismo
para localizar nutrientes en las proximidades de la clula (de Jong y van der Hoeven,
1987). Estas glicoprotenas de alto peso molecular, conocidas como mucina, se
componen de numerosas cadenas laterales de oligosacridos unidas a protenas por
enlaces O-glucsidos y sirven como fuente de nutrientes para el crecimiento
microbiano. Van der Hoeven et al. (1991) estudiaron las actividades enzimticas de
varias especies bacterianas, utilizando la mucina gstrica de cerdo, como sustrato
modelo de saliva humana dada su similitud estructural (Herp et al., 1979), como nica
fuente de hidratos de carbono para el crecimiento microbiano. Estos investigadores
informaron que Streptococcus sanguis Ny 584 alcanz significativamente mayor
densidad celular en cultivos quimiostticos mezclados con Streptococcus oralis Ny 586
que en cultivo puro, apoyando la hiptesis de que las bacterias coordinan sus
actividades enzimticas complementarias para incrementar el uso eficiente de la
mucina. Estos estudios se han ampliado para incluir la influencia del ambiente
anaerobio y el papel de la agregacin entre especies en el establecimiento de una
comunidad microbiana oral estable (Bradshaw et al., 1998). Estos investigadores
demostraron que la co-agregacin entre Fusobacterium nucleatum y otras especies
anaerobias como Porphyromonas gingivalis y Prevotella nigrescens, facilita la
supervivencia de estos anaerobios estrictos en entornos oxigenados. Wickstrom et al.
(2008) exploraron la degradacin proteoltica de una glicoprotena oligomrica de la
mucina humana (MUC5B) como nica fuente de nutrientes para las bacterias orales. La
placa dental y un consorcio de 4 especies lograron degradar MUC5B, por el contrario,

no lo hicieron cada una de las especies de forma individual. Estas investigaciones
demuestran que, cuando las especies bacterianas cooperan dentro de una comunidad,
crecen a partir de saliva y mucina de forma ms rpida y eficiente. Adems, dentro de
los biofilms, las bacterias residentes pueden obtener ventajas significativas tales como la
proteccin ante las defensas del husped y los antibiticos y, por lo tanto, las principales
enfermedades asociadas con la cavidad bucal humana son resultado de la actividad de
las comunidades microbianas, no de microorganismos individuales. (Jenkinson y
Lamont, 2005).
La adhesin a la cavidad oral es el primer paso para el desarrollo de las
comunidades de muchas especies de Streptococcus, Actinomyces, Veillonella y
Neisseria. La retencin de Porphyromonas spp. se ve favorecida por su asociacin con
estreptococos.
Las
condiciones
anaerobias
promueven
la
incorporacin
de
Fusobacterium spp., gnero que a su vez facilita el crecimiento de Treponema spp., que
forma parte del llamado grupo rojo de patgenos periodontales identificado por
Socransky et al. (2004). La adhesin inicial implica invariablemente la unin de las
bacterias a los componentes de la saliva, que son adsorbidos a las superficies de la
cavidad bucal, que sirve como un sustrato para la adhesin de los llamados primeros
colonizadores (Bodet et al., 2008). Las bacterias de la saliva unidas a la pelcula
proliferan en la superficie, y dan lugar a micro-colonias, de las cuales los estreptococos
(Streptococcus mutans, S. sobrinus, S. criceti y S. rattus) se asocian con frecuencia a
caries dental. Posteriormente, nuevas especies de bacterias son capaces de adherirse a
las clulas de las bacterias presentes en el biofilm y proliferar. La capacidad de adhesin
de las bacterias colonizadoras tempranas da lugar a una ventaja selectiva en el inicio de
la formacin de biofilms. Por lo tanto, la ingesta de bacterias no invasivas colonizadoras
puede retrasar o prevenir la colonizacin por bacterias cariognicas o patgenos
periodontales (Kaufman y Lamster, 2000).
La proliferacin bacteriana consecuencia de una dieta rica en azcares, como la
sacarosa, y de la pobre higiene bucal, puede llegar a producir patologas como caries,
gingivitis y periodontitis (Lamont et al., 2006, Marsh y Martin, 1999, Wilson, 2008).
Existen muchas estrategias para reducir la acumulacin de placa, desde la restriccin del
consumo de azcar, hasta la vacunacin contra bacterias odontopatognicas especficas
(S. mutans) o el uso de agentes antimicrobianos en enjuagues bucales o pastas
dentfricas. Otra caracterstica importante de la cavidad oral es que puede ser una fuente
10
importante de bacterias causantes de infecciones respiratorias, tales como Streptococcus

pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus y que pueden causar
infecciones en los pulmones (Paju y Scannapieco, 2007).
Al estudiar la microbiota oral, un aspecto importante a considerar es que las
bacterias en los biofilms son mucho menos sensibles a los antibiticos y los
tratamientos antimicrobianos que las clulas planctnicas. Este aumento de la
resistencia a los antimicrobianos es una de las razones principales para el estudio de las
bacterias en biofilms modelo, para poder predecir con fiabilidad la eficacia in vivo de
los antimicrobianos. Los modelos experimentales para estudios a corto plazo implican la
necesidad de una superficie slida para la adherencia de las bacterias (Guggenheim et
al., 2004). Estudios realizados con un sistema de biofilm in vitro en dientes
experimentales ha llevado a los mismos resultados que con su replica in vivo,
proporcionando as una herramienta fiable e interesante para reducir la experimentacin
animal (Thurnheer et al., 2008).
1.2. Interacciones de los polifenoles del vino con la microbiota oral

1.3.1. Metabolismo de los polifenoles del vino por bacterias orales
A pesar de que la boca juega un papel importante a favor de la liberacin de los
compuestos fenlicos de la matriz del alimento, hace poco que ha recibido especial
atencin la interaccin entre los polifenoles del vino y la microbiota bucal. Las rutas
involucradas en el metabolismo de compuestos fenlicos por la microbiota bucal an no
se conocen. Por medio de estudios in vitro con cultivos celulares, se ha demostrado que
los flavonoles-3-O-glucsidos pueden ser hidrolizados por bacterias de la boca y/o por
las clulas epiteliales que dan lugar a las agliconas correspondientes (Walle et al.,
2005). La hidrlisis de estos compuestos parece estar relacionada con la actividad glucosidasa de algunas cepas de bacterias cido lcticas presentes en la cavidad oral y es
similar a la descrita en la saliva humana. Aunque se ha descrito que una cepa de
Streptococcus milleri aislada de la cavidad oral, es capaz de deglicosilar rutina en
quercetina (Parisis y Pritchard, 1983), prcticamente no hay estudios centrados en los
grupos de microorganismos que poseen esta actividad metablica u otras actividades
que participan en la degradacin de compuestos fenlicos de diferentes estructuras
qumicas. Adems, tambin es importante tener en cuenta el efecto de la saliva por s
misma, ya que esta puede modificar la estructura de los compuestos fenlicos del vino
(Hirota et al, 2001; Yang et al., 1999).
11
1.3.2. Efecto de los polifenoles del vino y sus metabolitos en la microbiota oral
El efecto de los polifenoles de la dieta sobre la microbiota oral es una temtica
de investigacin incipiente, pero que est creciendo muy rpidamente. Estudios llevados
a cabo utilizando diferentes polifenoles del t, sobre todo flavonoides, y extractos de t
e infusiones, han demostrado un poderoso efecto protector de esta bebida contra la
descomposicin dental en animales y humanos (Friedman, 2007). Se ha demostrado
recientemente que las proantocianidinas de tipo A y flavonoles del arndano pueden
interrumpir el desarrollo del biofilm de S. mutans y de su acidogenicidad (Duarte et al.,
2006). Trabajos publicados recientemente demuestran con estudios in vitro e in vivo, en
animales y en humanos, los efectos de los polifenoles del t y del arndano sobre los
patgenos orales (principalmente S. mutans) y las implicaciones de estos productos en
la prevencin de las enfermedades orales/dentales (Wu y Wei, 2009; Bodet et al, 2008).
A pesar de que los mecanismos de accin no estn completamente entendidos, parece
ser que los polifenoles del t y el arndano inhiben el crecimiento y la adhesin de los
microorganismos asociados a la caries dental en la superficie del diente. Son todava
escasos los datos sobre la actividad anticariognica de los polifenoles del vino y la uva.
La actividad antimicrobiana frente a estreptococos orales ha sido demostrada
tanto en vino tinto como en blanco sin grandes diferencias entre ellos (Daglia et al.,
2007). Los compuestos responsables de dichas actividades son los cidos succnico,
mlico, lctico, tartrico, ctrico y actico. Adems de estos componentes del vino, se
tiene conocimiento recientemente de que los extractos fenlicos del vino y la uva
(Furiga et al. 2009), as como extractos fenlicos de la pulpa de diferentes variedades de
uva tinta (Thimote et al., 2007), tambin pueden tener efectos antimicrobianos frente a
diferentes especies de Streptococcus y otras bacterias que participan en infecciones
odontolgicas. Aunque el contenido de antocianinas y flavonoides vara en gran medida
en funcin de la variedad de uva y el tipo de extracto, se ha demostrado que todos los
extractos fenlicos de la uva inducan alrededor del 80% de inhibicin de la actividad
enzimtica de estreptococos involucrada en la caries (Thimothe et al., 2007). Adems, la
produccin de cido de S. mutans fue inhibida por los extractos de uva sin afectar la
viabilidad bacteriana. El efecto de los enjuagues bucales con bebidas con polifenoles
(incluyendo varios tipos de t y vino) en la adhesin inicial de bacterias en la cavidad
oral tambin ha sido investigado. El porcentaje ms bajo de adherencia bacteriana se
encontr con los enjuagues con vino tinto, pudiendo contribuir a la prevencin de la
formacin de biofilms (Hanning et al., 2009). En un estudio reciente, tambin se ha
12
demostrado que extractos de uva pasa, que contienen 5-hidroxi-2-furfural entre otros
componentes, tambin pueden inhibir el crecimiento de patgenos orales (Wu, 2009).
Se ha descrito que extractos de semillas de uva que contienen proantocianidinas,
influan positivamente en el proceso de desmineralizacin y/o remineralizacin in vitro
de lesiones por caries de la raz dental (Wu, 2009). Estudios in vivo tambin han
revelado que las pasas pueden impedir el descenso del pH de la placa dental por debajo
de pH 6 durante un perodo de 30 min en nios de entre 7 y 11 aos, lo que indica el
potencial de la uva y sus productos derivados en la salud oral (Wu, 2009). Finalmente,
un estudio realizado por Signoretto et al. 2006 mostr que las personas que consumen
regularmente alimentos y bebidas que contienen polifenoles, poseen niveles inferiores
de bacterias cultivables en su saliva y placa dental. El estudio se bas en el anlisis por
electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) de muestras de placa dental,
observndose que los individuos que consumen de manera regular caf y vino tenan
menos bandas que los consumidores de agua. Este resultado sugiere que la placa dental
de bebedores de caf y vino es menos rica en especies (Signoretto el at. 2010). Estos
estudios abren la posibilidad de emplear estos polifenoles como agentes naturales para
prevenir la formacin de la placa dental, y enfatizan la necesidad de estudios ms
amplios que consideren los distintos grupos de polifenoles presentes en el vino y
taxones bacterianos que forman parte del ecosistema bucal.
1.4. Mtodos de estudio de la microbiota oral. Tcnicas moleculares

Como se ha descrito en apartados anteriores, la cavidad bucal es un hbitat muy
rico y diverso del cual solo podemos cultivar cerca del 50% de los microorganismo
presentes (Wilson, 2008). Aunque es reconocido como un complejo sistema
microbiano, la mayora de los estudios experimentales de investigacin de la microbiota
bucal y la placa dental se han centrado en una nica especie o un consorcio
seleccionado y no desde una perspectiva de ecologa microbiana. Los mtodos de
identificacin de bacterias basados en anlisis genticos son una herramienta muy til
en el estudio de la microbiota oral humana, ya que estas tcnicas tienen la ventaja de
analizar la composicin microbiana global sin necesidad de aislamientos previos,
permitiendo la deteccin de bacterias no cultivables. Las ventajas de las tcnicas
moleculares frente a los tradicionales medios de cultivo son la rapidez, sensibilidad y
reproducibilidad. Estas tcnicas moleculares estn basadas en el anlisis de secuencias
conservadas de DNA o RNA. La mayora de las tcnicas emplean el gen 16S rRNA ya
13
que es un gen altamente conservado y permite la comparacin filogentica entre

bacterias. La eleccin de una tcnica u otra depende del objetivo que se pretenda. De
este modo, para identificar la microbiota a nivel de especie podran emplearse tcnicas
de clonaje o secuenciacin; para estudiar la diversidad de una poblacin microbiana se
suelen emplear las llamadas tcnicas de huella gentica, tales como DGGE y TGGE; y
para cuantificar especies o grupos taxonmicos encontramos la hibridacin dot-blot,
FISH y PCR a tiempo real o cuantitativa (Mayo et al., 2008).
1.4.1. Tcnicas moleculares basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa

(PCR)
La PCR se basa en la amplificacin de un gen o una parte de un gen a partir de
una pequea cantidad de DNA o RNA (previo paso a cDNA) mediante la repeticin de
ciclos alternos de temperaturas para la desnaturalizacin, unin de cebadores y
extensin de la cadena mediante una enzima Taq polimerasa. El proceso permite la
amplificacin exponencial de una secuencia de cidos nucleicos flanqueada por
secuencias homlogas a cebadores sintticos previamente diseados. La Nested PCR es
una variante de la PCR convencional que aumenta la especificidad de los productos de
la reaccin. Comprende dos rondas de amplificacin con distintos pares de cebadores en
cada una. Primero se realiza una reaccin con los cebadores externos para amplificar
una regin de DNA ms extensa, que contiene el segmento diana. Despus, con este
producto de amplificacin, se ejecuta una segunda PCR con los cebadores internos para
amplificar la regin especfica. Es posible combinar la PCR con otras tcnicas, las
cuales se comentarn a continuacin.
1.4.2. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)

La tcnica DGGE fue desarrollada por primera vez en 1983 por Fischer y
Lerman para la identificacin de mutaciones en genes humanos. Ms adelante se ha
venido empleando para el anlisis de poblaciones microbianas basadas en secuencias
especficas del gen 16S rRNA. El fundamento de la tcnica se basa en la separacin
electrofortica de molculas de DNA que tienen la misma longitud pero diferente
secuencia nucleotdica (Lerman et al., 1984).
La separacin en los geles de poliacrilamida se produce por un agente
desnaturalizante (urea y formamida en DGGE y temperatura en TGGE) que desdobla
las hebras de DNA. Para prevenir la completa disociacin de las hebras se aade un
14
anclaje de 30 a 50 bases nucleotdicas de guaninas (G) y citosinas (C) unidas al extremo

5 de uno de los cebadores. Ya que la migracin de la molcula depende de su
desnaturalizacin y a su vez de la secuencia nucleotdica, la tcnica DGGE/TGGE es
capaz de distinguir especies que difieran en tan slo una base nucleotdica. Para
visualizar las bandas en el perfil DGGE se puede llevar a cabo una tincin con bromuro
de etidio, Sybr Green o plata. La tincin con plata es el mtodo de deteccin ms
sensible aunque tiene el inconveniente de teir molculas de DNA tanto de una como de
doble cadena que existan en la muestra (Muyzer y Smalla, 1998). La intensidad de las
bandas obtenidas aporta informacin semi-cuantitativa de la abundancia relativa de esa
poblacin en concreto. Las bandas en un gel de DGGE pueden identificarse
directamente por comparacin de la migracin y perfil de las bandas contra un marcador
de DGGE de amplicones obtenidos con cepas bacterianas conocidas, o mediante
purificacin de la banda de DNA obtenida, reamplificacin, secuenciacin y
comparacin con las bases de datos existentes (Genbank).
La tcnica PCR-DGGE ha sido utilizada para estudiar la diversidad y evolucin
de poblaciones microbianas en muestras de la cavidad bucal (Maukonen et al., 2008),
donde se observ que el grupo Clostridium coccoidesEubacterium rectale y las
bifidobacterias son estables en el tiempo y sus perfiles difieren entre la saliva y las
heces humanas. Sin embargo, los perfiles de Lactobacillus son inestables en el tiempo,
pero similares entre saliva y heces dentro de un mismo individuo. Tambin se ha
utilizado para detectar cambios en la comunidad microbiana asociados con el consumo
de caf y vino (Signoretto et al., 2010), como herramienta de diagnstico periodontal
(Zijnge et al., 2006) o para el desarrollo de nuevos medios de cultivo para comunidades
microbianas orales (Tian et al., 2010). Gracias al perfil microbiano obtenido con esta
tcnica, estos autores consiguieron demostrar que el medio que desarrollaron para el
cultivo de la microbiota de la saliva, utilizando proteosa peptona, peptona tripticasa y
extracto de levadura como componentes bsicos, completado con mucina, hemina,
vitamina K, urea y arginina (SHI), es capaz de soportar el crecimiento de una amplia
variedad de especies bacterianas de la cavidad bucal.
1.4.3. PCR a tiempo real o cuantitativa (RTi-PCR)

En la RTi-PCR, los procesos de amplificacin y deteccin se producen de
manera simultnea, sin necesidad de ninguna accin posterior. La cantidad de DNA
sintetizado en cada ciclo se mide mediante deteccin por fluorescencia, ya que la
15
emisin de fluorescencia producida en la reaccin es proporcional a la cantidad del

DNA diana presente en la reaccin. Los agentes fluorforos pueden ser de dos tipos
principalmente: agentes inespecficos como SYBR Green y sondas especficas marcadas
con fluorocromos como las balizas moleculares (molecular beacons) y las sondas de
hibridacin (sistema TaqMan). Los agentes inespecficos son fluorocromos que
aumentan notablemente la emisin de fluorescencia cuando se unen a DNA de doble
cadena. El ms empleado en RTi-PCR es el SYBR Green. La optimizacin de las
condiciones de la reaccin es fcil y adems es ms barato que las sondas especficas. El
principal inconveniente de los agentes inespecficos, como su nombre indica, es su baja
especificidad, debido a que se unen de manera indistinta a productos generados
inespecficamente o a dmeros de cebadores, muy frecuentes en la PCR, introduciendo
errores en el posterior anlisis de los resultados. Para mejorar la especificidad del
proceso, se deben emplear condiciones de reaccin ptimas y una seleccin cuidadosa
de los cebadores para disminuir el riesgo de formacin de dmeros. Adems, la mayora
de los equipos para RTi-PCR tienen la posibilidad de determinar la temperatura de
fusin de los fragmentos amplificados (Tm = temperatura a la que el 50% del DNA de
la molcula est desnaturalizado). Cada fragmento amplificado tiene una Tm
caracterstica, que depende sobre todo de su longitud y de la composicin de sus bases.
Esta aplicacin permite comprobar, aunque no siempre con absoluta garanta, la
especificidad de los fragmentos detectados en la PCR. Entre las aplicaciones de la RTiPCR sobre micobiota oral se encuentran estudios de diagnstico de enfermedades
periodontales (Maeda et al., 2003), relaciones entre microbiota oral y periodontitis
crnica (Braga et al., 2010) o de modulacin de las poblaciones bacterianas de la placa
dental por la administracin oral de probiticos (Mayanagi et al., 2009).
1.4.4. Secuenciacin
El mtodo ms empleado para la identificacin taxonmica es la secuenciacin
del gen 16S rRNA. Los genes ribosomales estn ms conservados que la mayora de los
genmicos y, por lo tanto, ofrecen una mayor informacin taxonmica que las
hibridaciones DNA-DNA. El hecho de que el gen 16S rRNA contenga a su vez regiones
muy conservadas y regiones muy variables permite distinguir organismos a diferentes
niveles filogenticos. Empleando cebadores universales de regiones conservadas a
ambos lados del gen, se puede amplificar mediante PCR el gen 16S rRNA de las bandas
recortadas de un gel de DGGE o directamente de colonias crecidas en placa. El
16
producto amplificado se secuencia y se compara con otras secuencias recogidas en las

bases de datos, permitiendo as una caracterizacin de estirpes desconocidas. Las bases
de datos donde se introducen las secuencias analizadas para su identificacin incluyen
actualmente
ms
de
millones
de
secuencias
del
gen
16S
rRNA
(www.ncbi.nlm.nih.gov).
El anlisis de la secuencia del gen 16S rRNA se emplea habitualmente para
identificar la diversidad de la microbiota bucal y establecer las relaciones filogenticas.
Esta tcnica ha servido para demostrar que la microbiota bucal est compuesta
mayoritariamente por los taxones Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria,
Bacteroidetes y Fusobacteria (Zaura et al., 2009) y para identificar bacterias asociadas a
ciertas enfermedad a partir de muestras de placa dental (Kumar et al., 2005). Sin
embargo, la gran similitud en la secuencia del gen 16S rRNA entre especies del mismo
gnero, como por ejemplo ocurre con muchas especies de Lactobacillus, hace que este
mtodo no siempre sea preciso para la identificacin de especies muy relacionadas entre
s (Botina et al., 2006). Por eso tambin se emplea la secuenciacin de la regin
intergnica entre los genes del 16S y el 23S rRNA ya que contiene un gran nmero de
genes tRNA variables (Gurtler y Stanisich, 1996; Tannock et al., 1999).
1.4.5. Metagenmica
La revolucin genmica actual se entiende como el desarrollo de las tecnologas
de secuenciacin de genomas completos, lo cual ha dado un nuevo sentido al anlisis de
poblaciones bacterianas, ya que el conocimiento del total de los genes contenidos dentro
del genoma de una especie permite estudiar caractersticas fisiolgicas y ecolgicas
desconocidas hasta ahora. La metagenmica representa una aproximacin totalmente
nueva al estudio de las poblaciones microbianas, definida como el anlisis funcional y
de secuencias de los genomas microbianos colectivos contenidos en una muestra
ambiental, basndose ya sea en expresin o secuenciacin (Handelsman, 2004). La
propiedad ms valiosa de la metagenmica es la de proporcionar la capacidad de
caracterizar de forma global la diversidad gentica presente en dichas muestras,
obviando las dificultades encontradas en el cultivo en laboratorio de determinados
microorganismos. El anlisis de genomas completos se hace construyendo libreras de
clones. Esto conlleva la amplificacin por PCR de la casi totalidad de los genes y
posterior secuenciacin. A continuacin, mediante programas informticos, las
secuencias se alinean y se genera un rbol filogentico en el que las secuencias quedan
17
agrupadas en OTUs (unidades taxonmicas operativas). La comparacin de

microbiomas entre poblaciones diferentes se realiza, por tanto, comparando los datos de
las libreras de clones (Li et al., 2008). En un estudio reciente a partir del DNA de
muestras de saliva de 120 personas sanas de 12 localizaciones geogrficas a lo largo de
todo el mundo, se obtuvieron y secuenciaron 14.115 secuencias parciales del 16S
rRNA. Estas secuencias fueron asignadas a 101 gneros bacterianos conocidos, de los
cuales 39 no se saba de su presencia en la cavidad oral humana, mientras que el anlisis
filogentico sugiere que estn presentes otros 64 gneros desconocidos. Los resultados
han indicado que existe una gran diversidad en el microbioma de la saliva humana y un
alto nivel de variacin interindividual. La investigacin de algunas variables
ambientales revel una asociacin significativa entre las distancias genticas entre los
individuos y la distancia de sus lugares de procedencia con el ecuador terrestre (Nasidze
et al. 2009). Las principales ventajas de estos mtodos sobre las tcnicas tradicionales
de amplificacin gentica son: un menor sesgo taxonmico en la secuenciacin y la
capacidad de analizar simultneamente la taxonoma y funcionalidad de una misma
comunidad. Una de las limitaciones ms obvias de la metagenmica se refiere a la
ausencia de estandarizacin en las metodologas de obtencin de datos, causando una
enorme heterogeneidad en la informacin contenida en los anlisis metagenmicos
(Raes et al., 2007). Debido al uso de diferentes protocolos de extraccin de DNA, de
diferentes volmenes de muestra, y por lo tanto del nmero de clulas por muestra y
cantidad de DNA total utilizada en la secuenciacin, la comparacin entre metagenomas
resulta actualmente muy difcil. Otro problema es la complejidad en el proceso de
ensamblado del genoma o metagenoma, as como el alto coste del proceso.
2. OBJETIVO
Este trabajo persigue estudiar los potenciales efectos de los polifenoles del vino
en la microbiota oral humana. Los estudios sobre los beneficios para la salud humana
del consumo moderado de vino se han dirigido especialmente hacia la proteccin
cardiovascular, por lo que se trata de un objetivo novedoso. La mayora de los
antecedentes en la bibliografa se refieren a estudios realizados en el ecosistema del
colon, donde los compuestos fenlicos son extensamente metabolizados. No obstante,
los polifenoles podran modular la microbiota bacteriana de la boca de forma
beneficiosa. Por lo tanto, y como una primera aproximacin a los efectos del consumo
18
de vino en la microbiota humana, se ha evaluado mediante un estudio de intervencin

en humanos, la posible modificacin de la microbiota de la cavidad bucal tras el
consumo de vino.
Partiendo de muestras de saliva de los individuos incluidos en el estudio, el
procedimiento desarrollado se ha basado en el anlisis de los perfiles de huella gentica
obtenidos por la amplificacin por PCR de secuencias del 16S rRNA especficas de
gnero de bacterias presentes en la cavidad bucal humana, y separadas por electroforesis
en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). A partir de estos perfiles se procedi a la
secuenciacin de las bandas de inters separadas en estos geles. Tambin se ha llevado a
cabo la cuantificacin de la poblacin microbiana bucal mediante PCR cuantitativa en
tiempo real (RTi-PCR), utilizando SYBR Green como emisor de fluorescencia y
oligonucletidos cebadores universales para bacterias totales diseados a partir del gen
16S rRNA de E. coli.
3. MATERIAL Y MTODOS
3.1. Diseo del estudio de intervencin con vino en humanos

Para la realizacin del estudio de intervencin en humanos mediante consumo
moderado de vino, se seleccion una poblacin sana y de edad homognea. Los
voluntarios fueron reclutados en el Servicio de Salud Laboral del Hospital Ramn y
Cajal. Los resultados obtenidos en la analtica sangunea realizada como revisin anual
de los voluntarios sirvieron para descartar la existencia de enfermedades graves de base.
Como criterios de inclusin en el estudio, se determin que los participantes
pertenecieran a ambos sexos, tuvieran una edad comprendida entre 25 y 45 aos, fueran
no fumadores, no hubieran recibido antibiticos u otro tratamiento mdico por lo menos
durante 6 meses antes del estudio y no padecieran de enfermedades o trastornos
intestinales. Adicionalmente, no deberan haber usado antispticos orales durante los 30
das previos al estudio, ni padecer de ninguna enfermedad sistmica que pudiera alterar
la cantidad y composicin de la placa dental o saliva.
El estudio de intervencin se estructur en dos partes, periodo de lavado y
periodo de intervencin con vino tinto. Durante el perodo de lavado (primeros 15 das),
los voluntarios (consumidores y controles) no ingirieron ninguna bebida alcohlica ni
alimentos de alto contenido en polifenoles (caf, t, cacao, frutos rojos, etc.). Despus
de esos 15 das, se recogi una muestra de saliva. Durante las siguientes 4 semanas, los
19
voluntarios consumidores ingirieron una cantidad de 250 ml/da del vino tinto joven con
elevado contenido fenlico (polifenoles totales 3500 mg cido glico/L), elaborado en
la bodega Miguel Torres S.A, y evitaron el consumo de otros alimentos de contenido
elevado en polifenoles. Una vez concludas las 4 semanas de ingesta de vino, se recogi
una nueva muestra de saliva. Los sujetos controles siguieron las mismas pautas que los
voluntarios, con la excepcin de no ingerir vino durante el tiempo del estudio.
3.2. Recogida de muestras

El procedimiento de recojida y tratamiento de las muestras de saliva consisti en
la realizacin de un enjuague bucal profundo con una pequea cantidad de agua, por la
maana y antes de ingerir alimentos. Esta saliva fue recogida en recipientes
proporcionados por el Hospital Ramn y Cajal para esos fines. A partir de 15 ml del
volumen total homogeneizado recogido por individuo, se procedi a su centrifugacin a
10.000 rpm durante 15 min, con el fin de obtener un sedimento celular concentrado, con
el que realizar los diversos anlisis propuestos para este estudio. Cada uno de los
sedimentos obtenidos fue dividido en alcuotas de entre 20 y 25 l y conservado a una
temperatura de -80C en presencia de un fluido crioprotector (glicerol al 40%).
3.3 Extraccin de DNA

Para la extraccin de DNA, las alcuotas del sedimento celular de saliva se
mezclaron con 100 mg de bolas de vidrio (dimetro de 150-212 m) y 100 l de tampn
fosfato sdico 50 mM. Las clulas se sometieron a rotura mecnica utilizando el equipo
FastPrep (Bio 101; Savant Instruments, Holbrook, NY, USA), en tres ciclos de 45 s de
agitacin a una velocidad de 5,5 m/s. A continuacin, se centrifug la mezcla a 14.000
rpm, 10 min, para desechar las bolas de vidrio y restos celulares. El DNA genmico
total y posibles restos celulares presentes en el sobrenadante se incubaron a 70 C en
presencia de buffer de lisis comercial (Nucleo Spin) y se purific empleando el sistema
NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel Dren, Germany), siguiendo las instrucciones del
fabricante. El DNA fue eluido en un volumen de 50 l de la solucin tampn
proporcionada en el kit.
20
3.4. Incubacin in vitro de sedimentos bacterianos de saliva con polifenoles

de uva.
Con el objetivo de simular el efecto que genera la ingesta de polifenoles en la
microbiota bucal humana, se realiz un ensayo de crecimiento in vitro de sedimentos
bacterianos de saliva en presencia de Vitaflavan, un extracto comercial de pepitas de
uva con alto contenido en polifenoles, en particular en flaval-3-oles, aportado por el Dr.
Piriou (Les Drives Resiniques & Terpniques, S.A., Francia). Las muestras de 20 l de
sedimento celular de saliva se inocularon en 5 ml de ZMB1, un medio de cultivo
qumicamente definido (Zhang et al., 2009) con glucosa al 0,4% como fuente de
carbono, a los que se aadieron 0,5 mg/ml de Vitaflavan. Los cultivos se incubaron en
condiciones aerobias y anaerbicas (en una cmara de anaerobiosis) a 37 C durante 24
horas. Tras la incubacin, las bacterias se recogieron por centrifugacin a 10.000 rpm
durante 10 min y el DNA genmico total fue extrado como se indica en el apartado 3.3
para su posterior anlisis por PCR-DGGE.
3.5. Anlisis por PCR-DGGE

3.5.1. Amplificacin de DNA y preparacin de geles de gradiente
desnaturalizante.
La calidad y cantidad de DNA genmico total extrado de las muestras de saliva
fue medida con un espectrofotmetro UV a 260 nm y 280 nm. (BIORAD Smart Spec
Plus Spectrophotometer). Se llev a cabo la amplificacin de regiones variables del gen
16S del RNA ribosomal bacteriano mediante PCR con cebadores universales para la
evaluacin de la microbiota total y mediante PCR especfica de gnero. Los cebadores
especficos se muestran en la Tabla 1 y corresponden a los gneros Lactobacillus,
Bifidobacterium,
Streptococcus,
Veillonella,
Neisseria
al
grupo
Prevotella/Porfiromonas/Bacteroides. A uno de los cebadores de cada pareja de PCR se

le adicion una cola de GC de 40 pb (5 CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC
CCG CCG CCC CCG CCC C-3), con el fin de que los productos de amplificacin
pudieran ser separados por electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE).
La reaccin de PCR para un volumen de 50 l, se llev a cabo empleando 100 ng del
DNA genmico, 0,2 mol de cada primer, 0,2 mM de una mezcla de oligonucletidos
(dNTP), 3 mM de MgCl2, buffer Taq al 1, y 2,5 U de enzima DNA-Polimerasa Taq
(Invitrogen). El programa de amplificacin fue el siguiente: 95 C durante 2 min, entre
35 y 45 ciclos de 30 s a la temperatura de anillamiento adecuada para cada pareja de
21
cebadores (Tabla 1), 40 s a 56 C y 20 s a 72 C, seguido de una extensin final de 72 C

durante 5 min. Para Lactobacillus y Bifidobacterium se llevo a cabo una Nested PCR,
que aumenta la especificidad de los productos de la reaccin. Los productos de
amplificacin (5 l) se separaron en un gel de agarosa al 0,8% y se analizaron por
DGGE.
La DGGE se llev a cabo con un equipo DCode system (Bio-Rad Lab., USA),
empleando un gel de poliacrilamida al 9% y un gradiente especfico para la correcta
separacin de bandas de cada gnero (Tabla 1). El gradiente va aumentando en el
sentido del avance de la electroforesis, donde el 100% desnaturalizante corresponde a 7
M de urea y 40% (v/v) de formamida. Para la electroforesis, se emple tampn 0,5
TAE (20 mM Tris, 10 mM cido actico y 0,5 mM EDTA), a 70 V y 60 C durante 16
horas.
Tabla 1. Lista de cebadores para DGGE utilizados en este estudio.
Microorganimos
Secuencia 5'-3'
Temp anillamiento(C) Gradiente (%)
F:AACGCGAAGAACCTTAC+GC
Total bacteria
R:CGGTGTGTACAAGACCC
F:GGAAACAGGTGCTAATACCG
R:ATCGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC+GC
Lactobacillus
F:GTTTGATCCTGGCTCAG
R:CACCGCTACACATGGAG
F:GGGTGGTAATGCCGGATG
R:GCCACCGTTACACCGGGAA+GC
Bifidobacterium
F:CGGGTGCTICCCACTTTCATG
R:GATTCTGGCTCAGGATGAACG
F:AGATGGACCTGCGTTGT+GC
Streptococcus
R:GTGAACTTTCCACTCTCACAC
F:A(C/T)CAACCTGCCCTTCAGA
Veillonella
R:CGTCCCGATTAACAGAGCTT+GC
F:CTGGCGCGGTATGGTCGGTT
Neisseria
R:GCCGACGTTGGAAGTGGTAAAG+GC
Prevotella,Porphiromonas, F:GAACGCTAGCTACAGGCTT+GC
R:CCAATGTGGGGACC
Bacterioides
Referencia
56
30-60
Nubel et al. (1996)
56
30-50
66
nested
62
40-55
57
nested
55
25-50
Van den Borget et al (2011)
62
40-70
Rinttil et al. (2004)
55
30-70
Lansac el al. (2000)
58
40-58
Noor et al.(2010)
Heilig et al. (2002)
Satokari et al. (2000)
Cola de GC: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC

C/T = Y
A/T = W
3.5.2. Revelado de los geles

Tras la electroforesis, los geles se tieron con AgNO3 segn describen
Sanguinetti, et al. (1994). Para ello, las muestras se fijaron con una solucin de cido
actico glacial 0,5% (v/v) y etanol 10% (v/v) durante 3 min antes de teir los geles de
poliacrilamida con una solucin de nitrato de plata al 0,2% (p/v) durante
aproximadamente 10 min. A continuacin, se lavaron los geles con agua destilada.
22
Posteriormente, se incub el gel en solucin de revelado (hidrxido sdico 1,5%,

formaldehdo 0,3% y una punta de esptula de borohidruro de sodio) hasta la
visualizacin de las bandas. Despus de la tincin, los geles se incubaron en solucin
fijadora durante 5 min, lavados con agua destilada 2 min e incubados en solucin
preservadora 7 min con el fin de mantener un registro permanente del experimento.
Finalmente, los geles se colocaron en una placa de cristal cubiertos con papel
transparente y se dejaron secar al menos durante 24 horas. Los geles se fotografiaron
con una cmara COHU High Performance CCD Camera (Gelprinter).
3.6. Recuperacin de bandas de PCR-.DGGE y secuenciacin
Para la recuperacin de los amplicones de inters de los geles de poliacrilamida,

las bandas obtenidas mediante PCR-DGGE se seleccionaron y se escindieron del gel de
poliacrilamida con la ayuda de una lmina de bistur quirrgico esterilizada. Estas
bandas se incubaron en 100 l de una solucin de Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2
1,5 mM y Triton X-100 0,1%, pH 9, a 95 C durante 20 min. Despus de centrifugar
las muestras durante 1 min a 13000 rpm, se reamplific 1 l del DNA eludo de cada
banda de DGGE siguiendo las condiciones ya descritas en el apartado 3.5. Se utilizaron
los cebadores apropiados (Tabla 1) sin la secuencia rica en GC en el extremo 5,
necesaria slo para separar los fragmentos amplificados en DGGE. Los fragmentos
amplificados por PCR se resolvieron por electroforesis en geles horizontales de agarosa
al 1,5%. Finalmente, se purificaron los productos amplificados utilizando el Kit
Qiaquick
PCR
Purification
(QIAGEN,
Hilden,
Germany),
siguiendo
las
recomendaciones del fabricante y se secuenciaron en el Servicio de Secuenciacin de

DNA de la Unidad de Genmica del Parque Cientfico de Madrid. Posteriormente se
analizaron las secuencias empleando un programa adecuado (DNAStar Inc., USA) y
fueron identificadas por BLAST mediante el uso de bases de datos de nucletidos
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
3.7. PCR cuantitativa en tiempo real (RTi-PCR)

3.7.1. Obtencin de la curva de calibrado y evaluacin de la eficiencia de los
cebadores empleados
Para la cuantificacin por RTi-PCR de bacterias totales en la saliva de los
sujetos sometidos al estudio, antes y despus del consumo de vino, se utiliz una curva
de calibrado con diluciones decimales de DNA obtenido a partir de una cantidad
23
conocida de clulas de un cultivo puro de Escherichia coli DH5. Para ello, se creci a
esta cepa en caldo Luria Bertani (LB) a 37 C, en condiciones de aerobiosis y con
agitacin constante (200 rpm). Cuando el cultivo alcanz la fase estacionaria de
crecimiento (15 h), se tomaron muestras para llevar a cabo el recuento en placa y la
extraccin de DNA. Para los recuentos en placa, se tom 1 ml de cultivo, se diluy en
solucin salina (0,85 %) y se plaque sobre agar LB (caldo LB al que se le aadi agar
bacteriolgico al 1,5 %), extendiendo la incubacin a 37 C durante 24 h. Para la
extraccin del DNA, se emple el procedimiento descrito en el apartado 3.3. Tras la
obtencin del DNA purificado, se prepararon las diluciones decimales empleadas en la
curva de calibrado, correspondindose con una concentracin de 107, 106, 105 y 104
unidades formadoras de colonia (ufc) por ml de cultivo puro, respectivamente.
Los oligonucletidos cebadores utilizados, 968-GC-Forward (5- AAC GCG
AAG AAC CTT AC- 3) y Uni-1401-Reverse (5- CGG TGT GTA CAA GAC CC -3),
fueron descritos por Nbel et al. (1996), y se disearon a partir del gen 16S rRNA de E.
coli. Para determinar la capacidad de los cebadores para cuantificar el DNA bacteriano
total por RTi-PCR, se calcul la eficiencia de la reaccin, basada en la capacidad de los
cebadores para duplicar el nmero de amplicones obtenidos en cada ciclo de
amplificacin. Adems, se verific mediante el anlisis de la curva de fusin (melting)
que los cebadores no formaban dmeros entre s, aspecto especialmente relevante
cuando el agente intercalante de DNA empleado es SYBR Green.
3.7.2. Reaccin de RTi-PCR

Para la reaccin de RTi-PCR se utilizaron 2 l del DNA, 0,4 l de cada uno de
los cebadores especficos (10 M) y 10 l de la mezcla maestra KAPA SYBR FAST
Master Mix (KAPA Biosystems), completando el volumen de reaccin hasta 20 l con
agua milliQ estril. La reaccin se llev a cabo en un equipo iQTM5 Multicolor RealTime PCR detection system Cycler (BIO-RAD). El protocolo de PCR fue:
desnaturalizacin previa de DNA a 94 C (2 min), seguida de 35 ciclos de
desnaturalizacin a 94 C (30 s) y de hibridacin y elongacin a 56 C (40 s). Las
medidas de fluorescencia se realizaron en cada ciclo en el paso de hibridacin y
elongacin. Para detectar posibles productos inespecficos y/o la aparicin de dmeros
de cebadores se program al final de cada reaccin de RTi-PCR una curva de melting
entre 56 y 95 C (0,5 C/s).
24
3.7.3. Anlisis de los datos obtenidos mediante RTi-PCR

Cada reaccin de RTi-PCR va asociada a un ciclo umbral (CT), definido como el
ciclo en el que se empieza a detectar un aumento de fluorescencia significativo con
respecto a la seal de base. En este estudio, la seal de base que se estableci como
ptima fue la generada automticamente por el software del equipo de RTi-PCR. Los
valores CT de las muestras problema obtenidos por RTi-PCR, sirvieron para cuantificar
el nmero de bacterias (ufc/ml) presentes en la saliva de los individuos por
extrapolacin a partir de la curva de calibrado obtenida con E.coli DH5 con cantidad
conocida de clulas. La pendiente de la curva de calibrado fue usada para calcular la
eficiencia (E) de reaccin de RTi-PCR, usando la siguiente ecuacin (Klein et al., 1999)
E = 10
(-1/pendiente)
-1. Todas las reacciones de RTi-PCR fueron llevadas a cabo por
triplicado para la curva patrn y por duplicado para cada muestra, y las diferencias se
compararon en un nivel de significancia de 0,05 mediante la prueba de comparacin t de
Student utilizando el programa Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE.UU.).
4. RESULTADOS Y DISCUSIN
4.1. Optimizacin en el tratamiento de muestras de saliva y extraccin del

DNA
Para el desarrollo del objetivo de este estudio, hubo que seleccionar un mtodo
ptimo para la extraccin de DNA de los sedimentos celulares de saliva procedente de
los individuos incluidos en el estudio de intervencin con vino. Se compararon varios
procedimientos que permitieran la obtencin del mximo de cantidad de DNA con la
mayor diversidad bacteriana posible. El punto crtico a valorar en la puesta a punto de la
tcnica fue el diferente comportamiento bacteriano a la lisis celular. Teniendo en cuenta
la complejidad de las muestras y la posible presencia de material gentico de origen
eucariota, tras la extraccin de DNA se realiz una PCR-DGGE utilizando cebadores
universales para bacterias totales (Tabla 1), con el fin de evaluar el mtodo que
proporcionaba mejor rendimiento en DNA y mayor diversidad bacteriana.
Se ensay la utilizacin del tampn de lisis descrito por Zijnge et al. (2006) que
contiene
dodecilsulfato
sdico
(SDS)
proteinasa
K.
El
SDS
es
un
compuesto tensoactivo inico que ayuda a solubilizar los constituyentes membranosos

celulares y destruir la envoltura celular rompiendo los enlaces no covalentes y
desnaturalizando las protenas. La proteinasa K, activa a 58 C, degrada las protenas y
25
enzimas que pueden potencialmente agregarse al DNA y ayuda a limpiar la muestra.

Para potenciar la lisis celular se aplicaron tres ciclos de choque trmico (15 min a -80C
seguido de 5 min a 80C). La extraccin de DNA se complet mediante extraccin con
fenol-cloroformo y precipitacin con etanol en el primer mtodo ensayado. En el
segundo mtodo, la extraccin de DNA se realiz utilizando una columna del kit
comercial Nucleo Spin Tissue en lugar de fenol-cloroformo. La concentracin de DNA
obtenida en los dos casos fue entre 32 y 40 ng/l. Por lo tanto, no se observaron
diferencias entre los dos mtodos de recuperacin del DNA.
Con el fin de obtener mayor concentracin de DNA, se prob, en tercer lugar, el
uso de un tampn de lisis ms agresivo, que contena EDTA, Triton X-100, lisozima y
proteinasa K, y los tres ciclos de choque trmico mencionados anteriormente. El DNA
tambin se recuper con la columna del kit Ncleo Spin Tissue, debido al menor
requerimiento de tiempo con respecto a la recuperacin de DNA con fenol-cloroformo,
ya que no se haban encontrado diferencias entre los dos mtodos de purificacin del
DNA. La concentracin de DNA obtenida fue de 93 ng/l. Cuando se supriman los 3
ciclos de choque trmico en el procedimiento de lisis, se obtenan cantidades muy bajas
de DNA (0,97 ng/l).
El mtodo de lisis bacteriana denominado Repeated Bead Beating, caracterizado
por el uso de esferas de vidrio de pequeo dimetro para conseguir una friccin que
destruya las envolturas celulares, ha sido aplicado para la extraccin del DNA de
muestras fecales bovinas (Yu y Morrison 2004) y humanas (Salonen et al 2010),
obtenindose buenos resultados en cantidad y diversidad de DNA de las poblaciones
bacterianas obtenidas. Se aplic este mtodo de lisis a las muestras de saliva y la
obtencin de DNA se realiz siguiendo el procedimiento de extraccin con el kit
Nucleo Spin Tissue. Con este procedimiento se obtuvieron las mayores concentraciones
de DNA (126 ng/l).
En relacin a la diversidad bacteriana recuperada con los diferentes
procedimientos de extraccin de DNA, el perfil de bandas obtenido por PCR con
cebadores de bacterias universales y separadas por DGGE del DNA procedente de cada
uno de los mtodos de lisis y extraccin de DNA ensayados mostr mayor diversidad e
intensidad de bandas en las muestras procedentes de la lisis por el mtodo de friccin
con bolas de vidrio (Repeated Bead Beating). Estos resultados nos permitieron escoger
este mtodo de extraccin como el ms adecuado para el estudio de diversidad
bacteriana de las muestras de saliva humana.
26
4.2. Modulacin in vitro de la microbiota bucal con extractos fenlicos

Con el objeto de evaluar el potencial modulador de los polifenoles presentes en
el vino sobre la microbiota bucal humana, se hizo un estudio previo de incubacin de
sedimentos celulares procedentes de saliva humana con un extracto rico en polifenoles
procedente de pepitas de uva (Vitaflavan). Para las incubaciones se utiliz un medio de
cultivo qumicamente definido (ZMB1), que permite el crecimiento de un gran nmero
de especies bacterianas (Marcobal et al., 2010; Tabasco et al., 2011). La respuesta de
crecimiento bacteriano a la presencia del extracto de polifenoles fue evaluada por PCRDGGE. En la Tabla 2 se muestran los compuestos fenlicos que constituyen el extracto
utilizado. El contenido total es de 337 mg/g y los principales componentes son cido
glico, flavan-3-oles monomricos [(+)-catequina y (-)-epicatequina], procianidinas
dimricas (B1, B2, B3 y B4) y trimricas (C1 y T2), (-)-epicatequina-3-O-galato y
procianidin-galatos (B1-3-O-galato, B2-3-O-galato, y B2-3-O-galato). La Fig. 2
muestra los perfiles de bandas amplificadas con los cebadores universales para bacterias
totales y separadas mediante DGGE en geles de gradiente de desnaturalizacin 40-60%
y 30-60%. Se muestran los resultados de los perfiles de bandas amplificadas
procedentes del sedimento celular de saliva de partida y despus de la incubacin a 37
C en aerobiosis y anaerobiosis en presencia o no de Vitaflavan. Los resultados indican
la presencia de tres bandas mayoritarias, que varan en intensidad segn la presencia o
ausencia del extracto fenlico en las incubaciones. Estas bandas fueron secuenciadas y
los resultados de homologa de las secuencias nucleotdicas obtenidas indicaron que se
corresponden con Streptococcus salivarius (banda 1), Neisseria flavenscens (banda 2) y
Haemophilus parainfluenziae (banda 3). Tanto Streptococcus, Neisseria como
Haemophilus pertenecen a tres de los gneros bacterianos mayoritarios en la microbiota
oral (Zaura et al., 2009; Tian et al., 2010). Un estudio de la microbiota de la lengua en
individuos con halitosis ha demostrado que S. salivarius (ausente en la halitosis), es uno
de los organismos de mayor prevalencia en el dorso de la lengua (Kazor et al, 2003). N.
flavescens es un miembro generalmente no patgeno del grupo de Neisseria, es
normalmente un saprofito de la boca, nasofaringe y del tracto respiratorio superior
asociado con un estado bucal libre de caries (Crielaard et al., 2011).
27
Tabla 2. Concentracin en compuestos fenlicos del extracto Vitaflavan

Compuestos fenlicos
mg/g ( SD)
cido galico
Procianidina B3
Procianidina B1
(+)-Catequina
Procianidina T2
Procianidina B4
Procianidina B2
B1-3-O-galato
(-)-Epicatequina
B2-3-O-galato
Procianidina C1
B2-3-O-galato
(-)-Epicatequina-3-O-galato
9,11 0,10
20,39 0,33
60,99 1,42
74,57 0,09
6,81 0,06
15,04 0,13
45,13 0,95
0,32 0,04
67,68 0,75
1,80 0,06
7,07 0,08
1,61 0,00
26,21 0,41
Banda 1
Banda 2
Banda 3
Fig. 2. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gel superior:

gradiente 40-60%; gel inferior: gradiente 30-60%) de los productos obtenidos por PCR,
empleando los cebadores universales de bacterias totales, del DNA de la saliva
procedente de: (A) cultivo en aerobiosis sin vitaflavan; (B) sedimento celular de partida;
(C) cultivo en aerobiosis con vitaflavan; (D) cultivo en anaerobiosis sin vitaflavan; (E)
cultivo en anaerobiosis con vitaflavan. Las bandas sealadas corresponden a
Streptococcus salivarius (banda 1), Neisseria flavenscens (banda 2) y Haemophilus
parainfluenziae (banda 3).
28
La presencia mayoritaria en los geles de PCR-DGGE de la banda

correspondiente a S. salivarius tras las incubaciones de los sedimentos celulares de
saliva en ausencia de Vitaflavan, que indica el mayor crecimiento de esta especie en el
cultivo in vitro, puede asociarse al hecho de que el medio ZMB1 fue desarrollado para
lactococos, estreptococos y enterococos (Zhang et al., 2009). Es llamativo el hecho de
que la presencia de Vitaflavan en las incubaciones favorece el mantenimiento de una
mayor diversidad de bandas, ya que el perfil bacteriano observado en los cultivos con
Vitaflavan es ms similar al del sedimento celular sin incubar que al de las incubaciones
sin Vitaflavan. Este resultado podra explicarse por la mayor sensibilidad de los
estreptococos a los polifenoles presentes en el Vitaflavan, mientras que la poblacin de
Neisseria y Haemophilus se vera menos afectada. El efecto inhibidor sobre S.
salivarius y S. thermophilus de los flavan-3-oles presentes en Vitaflavan ha sido
descrito previamente en el grupo de investigacin (Tabasco et al., 2011). En este
estudio, tambin se observ que las especies de Lactobacillus y Bifidobacterium se
vieron menos afectadas por la presencia de estos compuestos que los estreptococos. De
igual manera, las bacterias Gram negativas parecen verse menos inhibidas por estos
compuestos que las Gram positivas (Cueva et al., 2010). Esto explicara que Neisseria
(Gram negativa) y Haemophilus (Gram negativa) no se vieran aparentemente afectados
por la incubacin de la saliva con Vitaflavan.
4.3.
Perfiles
microbianos
de
saliva
obtenidos
por
PCR-DGGE.
Consecuencias del consumo moderado de vino

Un total de diecisis individuos participaron en el estudio de intervencin en
humanos, de los cuales diez consumieron vino de forma moderada durante cuatro
semanas y los otros seis se mantuvieron como controles negativos. A partir de las
muestras de saliva recogidas de todos los individuos al final del periodo de lavado y al
final del ensayo, se analizaron los perfiles de PCR-DGGE obtenidos con cebadores
universales de bacterias totales y especficos de Lactobacillus, Bifidobacterium,
Streptococcus, Veillonella, Neisseria y el grupo Prevotella/Porfiromonas/Bacteroides
(Tabla 1). Para la separacin de bandas procedentes de bacterias totales, se realizaron
geles con distintos gradientes de urea-formamida (30-60%, 20-70% y 40-70%) a fin de
obtener las condiciones que proporcionaran la mejor separacin posible de bandas y
visualizacin de los perfiles bacterianos. En la Fig. 3 se muestran los perfiles de bandas
29
obtenidas con los cebadores de bacterias totales separadas con un gradiente 20-70%. Se
muestran los resultados obtenidos de 8 de los individuos al final del periodo de lavado
(a) y despus (d) del periodo de consumo de vino. Los resultados muestran unos perfiles
similares en todos los casos, sin aparentes diferencias en las poblaciones bacterianas
atribuibles al consumo de vino. La Fig. 4 muestra los perfiles obtenidos con el gradiente
30-60% para el mismo grupo de individuos. En estas condiciones, los resultados
mostraron una mayor diversidad de bandas, pero tampoco se encontraron variaciones
evidentes de los grupos bacterianos debidas al consumo de vino. En general, la
variabilidad de bandas observadas entre individuos fue mayor que la asociada al
consumo de vino. Como se ha descrito anteriormente, la cavidad bucal es un hbitat
repleto de microorganismos. No todas las especies que residen en la saliva se han
identificado, y se prev la existencia de alrededor de 750 especies diferentes (Jenkinson
y Lamont, 2005; Paster et al, 2006). La dificultad de identificacin reside en que
muchas no son cultivables y adems presentan similitudes genmicas. Por ello, muchas
investigaciones estn dirigidas a la identificacin de genomas completos de
microorganismos representativos de la comunidad bucal: Streptococcus, Actinomyces,
Veillonella, Fusobacterium,
Porphromonas,
Prevotella,
Treponema,
Neisseria,
Haemophilus, Lactobacterium, Eubacteria, Capnocytophaga, Eikenella, Leptotrichia,

Peptostreptococcus, Staphylococcus y Propionibacterium (Jenkinson y Lamont, 2005;
Wilson, 2005).
1
a
2
d
3
d
4
d
5
d
6
d
7
d
8
d
Fig. 3. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 20-70%)

de los productos obtenidos por PCR de la saliva de ocho individuos antes (a) y despus
(d) del periodo de consumo moderado de vino empleando los cebadores universales de
bacterias totales.
30
1
a
2
d
3
d
4
d
5
d
6
d
7
d
8
d

(d) del periodo de consumo moderado de vino (carriles 1, 2, 3 y 8) empleando los
cebadores para bacterias totales. Carriles 4, 5, 6 y 7: controles negativos.
Con el objeto de evaluar el efecto del consumo de vino en grupos bacterianos
concretos, se llev a cabo el estudio de PCR-DGGE empleando cebadores especficos
para los grupos bacterianos mayoritarios de la saliva. Adems se realiz el estudio del
efecto sobre Bifidobacterium y Lactobacillus por su potencial papel probitico. La Fig.5
muestra los perfiles de bandas amplificadas con los cebadores especficos para el gnero
Bifidobacterium y separadas mediante DGGE (gradiente 40-55%). Se muestran los
resultados procedentes de muestras de saliva de 8 individuos al final del periodo de
lavado (a) y despus del consumo de vino durante 4 semanas (d). Los resultados indican
la presencia de tres bandas predominantes en la mayora de individuos, aunque no
parece existir una aparente relacin entre el consumo de vino y los perfiles de bandas
observadas. Las diferencias encontradas indican, por tanto, mayor variabilidad entre
individuos que la que podra asociarse al consumo de vino. Las tres bandas fueron
secuenciadas y los resultados de homologa de las secuencias nucleotdicas obtenidas
indicaron que se corresponden con Bifidobacterium dentium (banda 2) y con clones de
Bifidobacterium no cultivados (banda 3). La banda 1 se identific como Alloscardovia
omnicolens. Esta especie ha sido descrita recientemente por Huys et al. (2007) y
pertenece a la familia Bifidobacteriaceae. Dentro de esta familia, A. omnicolens, B.
dentium, Bifidobacterium longum, Scardovia inopinata y Parascardovia denticolens
son las especies habitualmente asociadas a la saliva humana (Beighton et al., 2008).
31
1
a
2
d
3
d
4
d
5
d
6
d
7
a
8
d
Banda 1
Banda 2
Banda 3

(d) del periodo de consumo moderado de vino empleando los cebadores especficos para
el gnero Bifidobacterium. Las bandas sealadas corresponden a Alloscardovia
omnicolens (banda 1), Bifidobacterium dentium (banda 2) y clones de Bifidobacterium
no cultivados (banda 3).
Los perfiles de bandas especficas del gnero Lactobacillus obtenidas por PCRDGGE se muestran en la Fig. 6. Los resultados indican una elevada homogeneidad de
especies presentes en saliva entre los individuos analizados, con la aparicin de 4
bandas mayoritarias, sin que se observen cambios aparentes relacionados con el
consumo de vino. El nmero de especies de lactobacilos encontradas en saliva humana
vara habitualmente entre cuatro y ocho especies diferentes, siendo L. vaginalis, L. oris,
L. gasseri, L. salivarius, L. fermentum, L. rhamnosus y L. casei las principales especies
identificadas en saliva (Yang et al., 2010). La presencia de lactobacilos en la saliva
humana se ha relacionado tradicionalmente con la aparicin de caries dental, debido a
su capacidad fermentativa de azcares (Caufield et al., 2007).
1
a
2
d
3
d
4
a d
5
a
6
d
7
d
8
d

de los productos obtenidos por PCR de la saliva de nueve individuos antes (a) y despus
el gnero Lactobacillus.
32
La Fig. 7 muestra los perfiles de bandas amplificadas con los cebadores

especficos del gnero Streptococcus. Los resultados indican una gran abundancia de
especies de este gnero en las muestras de saliva. No es de extraar este resultado,
debido a que Streptococcus se corresponde con uno de los gneros predominantes de la
microbiota bucal (Aas et al., 2005: Ciric et al., 2010; Tian et al., 2010). Sin embargo, los
perfiles de bandas obtenidos entre los individuos reflejan cierta uniformidad de las
especies presentes y poca variacin atribuible al consumo de vino. La banda mayoritaria
y presente en todos los individuos se identific como perteneciente al grupo S. mitis-S.
oralis, que se corresponde con estreptococos del grupo viridans. Dentro de este grupo se
encuentran varias especies predominantes en la cavidad bucal. S. sanguis y S. mitis
biovar 1, estn presentes en la mucosa bucal y junto con S. oralis estn asociadas a la
formacin inicial de la placa dental. Dentro de este grupo tambin se engloba S.
gordonii, que anteriormente formaba parte de S. sanguis, y que habitualmente se
encuentra en pequeas cantidades en la mucosa orofarngea y en la placa supragingival
madura. En el dorso de la lengua prevalecen S. mitis biovar 2 y S. salivarius, esta ltima
especie predomina tambin en la mucosa farngea, mientras que S. anginosus es ms
habitual en la placa subgingival (Frandsen et al., 1991).
1
a
2
d a
3
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4
d a
5
d
6
d a
7
d a
8
a d
Fig. 7. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 25-50 %)

el gnero Streptococcus. La banda mayoritaria (S) pertenece al grupo S. mitis-S. oralis.
33
Los perfiles de bandas especficas del gnero Veillonella obtenidas por PCRDGGE se muestran en la Fig. 8. Los resultados muestran una gran abundancia de
bandas, correspondientes a distintas especies de este gnero, que coincide con el hecho
de que Veillonella sea uno de los grupos mayoritarios presentes a lo largo de toda la
cavidad bucal (Aas et al., 2005). En general, se observa una banda de gran intensidad
coincidente en todos los sujetos y una mayor variabilidad interindividual que la asociada
al consumo de vino.
1
a d
2
a d
3
a d
4
a d
5
a
6
d a
7
d
8
d a
Fig. 8. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 40-70 %)

el gnero Veillonella.
El estudio de Neisseria en los individuos incluidos en el estudio de intervencin
en humanos tambin refleja gran abundancia de especies correspondientes a este gnero.
En la Fig.9 se muestran los perfiles de bandas amplificadas con los cebadores
especficos para el gnero Neisseria. Los resultados procedentes de muestras de saliva
de 8 individuos al final del periodo de lavado (a) y despus del consumo de vino durante
4 semanas (d) muestran ciertas diferencias en la intensidad de la bandas, pero no es
destacable la variacin de bandas asociadas al consumo de vino. Nuevamente
observamos mayor variabilidad entre individuos que antes y despus del periodo de
consumo de vino. Un estudio sobre la estructura de la comunidad bacteriana en la
saliva, sita a Neisseria como uno de los organismos asociados al estado de salud oral
34
en humanos (Ciric et al., 2010). Al mismo tiempo, Tian et al. (2010) atribuyen a este
gnero el 15% de la presencia bacteriana en la saliva humana.
La Fig.10 muestra los perfiles de bandas amplificadas con los cebadores
especficos para el grupo Prevotella, Porphiromonas y Bacterioides. Los cebadores
empleados amplifican los tres gneros debido a la similitud en su secuencia del 16S r
RNA, razn por la cual, en el pasado, algunas especies actualmente agrupadas en
diferentes gneros se consideraban dentro del mismo gnero (Shah y Collins, 1990). El
perfil de bandas obtenido muestra mayor variabilidad entre individuos que la atribuible
al consumo de vino. Segn relata un estudio realizado por Zaura et al. (2009), el taxn
Bacteriodetes, al cual pertenecen los gneros Prevotella, Porphiromonas y
Bacterioides, representa uno de los taxones mayoritarios del microbioma oral de
individuos sanos. Tian et al. (2010) atribuyen a Prevotella en torno al 30-40% del total
de las poblaciones de la microbiota de la saliva, mientras que Porphiromonas representa
un 2-4%.
1
2
3
4
a d a d a d a d
5
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8
a

el gnero Neisseria.
35
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2
d
3
d

de los productos obtenidos por PCR de la saliva de tres individuos antes (a) y despus
el grupo de Prevotella, Porphiromonas y Bacterioides.
4.4. Anlisis de la curva de calibrado y eficiencia de los cebadores

empleados en la RTi-PCR
Con el fin de cuantificar la microbiota de la saliva de los individuos incluidos en
el estudio de intervencin con vino, se realiz una PCR a tiempo real (RTi-PCR) con las
muestras de saliva utilizando cebadores universales de bacterias totales. El objetivo fue
evaluar las posibles diferencias en cantidad de poblacin bacteriana de la saliva
asociadas al consumo moderado de vino, dado que no se han encontrado cambios
evidentes a nivel cualitativo. Para ello, se elabor una curva de calibrado a partir de una
cepa pura de E. coli, con la que poder comparar los resultados obtenidos con las
muestras de DNA de saliva. El anlisis por RTi-PCR de las diluciones decimales del
DNA procedente de cantidades conocidas de clulas a partir de un cultivo puro de E.
coli DH5, gener una recta de calibrado con un valor de R2 de 0,992 y una eficiencia
de 0,84 (slope = -3,75). Estos valores fueron proporcionados por el software del equipo
RTi-PCR utilizado (BIO-RAD) (Fig. 11). El anlisis de las curvas de melting obtenidas
para cada reaccin no revel la formacin de ningn fragmento inespecfico que
interfiriera durante la lectura de fluorescencia.
36
CT
E= 81,5%
R2 = 0,999
Slope= -3,865
Log nmero de genomas
Fig. 11. Curva de calibrado de Escherichia coli para el clculo por extrapolacin del
nmero de bacterias presente en la saliva. La eficiencia de los primers (E), el coeficiente
de regresin lineal (R2) y la pendiente (Slope) estn representados en la figura.
4.5 Cuantificacin de bacterias de la saliva por RTi-PCR

Los valores CT de las muestras procedentes de 10 individuos antes y despus del
periodo de consumo de vino obtenidos por RTi-PCR, sirvieron para cuantificar el
nmero de bacterias totales (nmero de copias de genomas/ml) en la saliva por
extrapolacin a partir de la recta de calibrado obtenida para E. coli DH5 (Tabla 3.).
Los resultados mostraron que tanto antes como despus del periodo de cuatro semanas
de consumo de vino, el nmero de copias de genomas bacterianos por ml de saliva
analizado fue de media 108. Este dato concuerda con el hecho de que en la saliva se
haya estimado la presencia de 108109 bacterias/ml de saliva (Carroll et al, 2009;
GuRNAer y Malagelada, 2003).
37
Tabla 3. Recuentos (Log10 del nmero de copias del genoma/ml) de bacterias totales en
la saliva de los individuos sometidos al estudio de intervencin, antes y despus del
consumo de vino, analizados por RTi-PCR.
Copias del genoma de bacterias por ml de saliva
Individuos
Antes del consumo
Despus del consumo
8,46 0,03
8,86 0,04
8,19 0,01
7,92 0,07
7,81 0,08
7,59 0,01
7,79 0,05
7,07 0,06
8,05 0,01
8,03 0,06
7,04 0,02
7,61 0,01
7,84 0,02
8,32 0,16
8
9
8,15 0,01
8,23 0,03
7,58 0,01
8,08 0,03
10
8,82 0,01
8,99 0,01
Expresado en Log10 Desviacin estandar
El valor resultante del anlisis estadstico de los resultados de RTi-PCR

obtenidos de los recuentos de saliva procedentes de los individuos antes y despus de la
ingesta de vino, mediante la prueba t de Student, n-1 grados de libertad y 95% de nivel
de confianza, fue inferior al valor tabulado de t, lo que indica que no hubo diferencias
significativas entre el nmero de bacterias totales obtenido antes y despus del consumo
moderado de vino. Esto hace pensar que no existe una relacin directa entre el consumo
moderado de vino y la cantidad de bacterias totales en la saliva. Sin embargo, dadas las
diferencias de intensidad de algunas bandas de los perfiles microbianos obtenidos por
DGGE, se podra pensar en la existencia de diferencias cuantitativas entre gneros
bacterianos asociadas al consumo de vino. Como se ha descrito anteriormente, existe un
efecto inhibidor de los compuestos fenlicos sobre S. salivarius y S. thermophilus
(Tabasco et al., 2011) y las bacterias Gram negativas parecen comportarse de manera
distinta a las Gram positivas ante la presencia de este tipo de compuestos (Cueva et al.,
2010). Teniendo en cuenta el efecto modulador sobre las poblaciones de S. salivarius,
N. flavenscens y H. parainfluenziae obtenidos en nuestro estudio in vitro (Fig. 2), sera
interesante llevar a cabo estudios de PCR cuantitativa sobre los gneros ms abundantes
de la microbiota oral.
38
5. CONCLUSIONES
El presente trabajo muestra los efectos del consumo moderado de vino sobre la
microbiota de la saliva humana. Se han utilizando las tcnicas de PCR-DGGE y RTiPCR para la evaluacin de los posibles cambios en los perfiles microbianos de huella
gentica de la poblacin bacteriana mayoritaria en la saliva humana y en la
cuantificacin de la poblacin total bacteriana. A partir de los resultados encontrados se
han obtenido las siguientes conclusiones.
- A travs de un estudio de incubacin in vitro, se ha demostrado que el extracto
fenlico de pepita de uva (Vitaflavan) puede potencialmente modular la microbiota oral
humana. Se observa un efecto inhibitorio en Streptococcus salivarius, y ningn efecto
aparente sobre Neisseria flavenscens y Haemophilus parainfluenziae.
- Se ha demostrado a travs de los perfiles de bandas obtenidas por PCR-DGGE,
la existencia de diferentes patrones de comunidades bacterianas entre diferentes
individuos que se mantiene estable y que aparentemente es independiente del consumo
moderado de vino. La secuenciacin de bandas de los perfiles de PCR-DGGE ha
permitido completar la caracterizacin de poblaciones bacterianas presentes en la saliva
humana.
- La cuantificacin de la poblacin total bacteriana de la saliva mediante RTiPCR muestra la presencia media de 108 bacterias por ml de saliva en individuos sanos,
independientemente del consumo moderado de vino.
39
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Microbiota de La Cavidad Bucal

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Universidad Autnoma de Madrid

La Dra. Teresa Requena Rolana del Departamento de Biotecnologa y Microbiologa de los

Este trabajo ha sido subvencionado por el Proyecto de Investigacin AGL2009-13361-C02-02

se realizaron anlisis de la poblacin microbiana a travs de la

separacin de los fragmentos amplificados por PCR utilizando la tcnica de

polifenlicos beneficiosos por mostrar actividad antimicrobiana (Furiga, Lonvaud, y

1.1. Los polifenoles del vino

cido glico (cido hidroxibenzoico)

trans- Resveratrol (etilbeno)

cido cafico (cido hidroxicinmico)

Procianidina B2 (flavan-3-ol oligmero)

Tirosol (alcohol fenlico)

Fig. 1. Compuestos fenlicos representativos de los principales grupos presentes en el

1.2. Microbiota bucal

Bacteroidetes (gneros Prevotella, Capnocytophaga, Porphyromonas) y Fusobacteria

placa dental y un consorcio de 4 especies lograron degradar MUC5B, por el contrario,

importante de bacterias causantes de infecciones respiratorias, tales como Streptococcus

1.2. Interacciones de los polifenoles del vino con la microbiota oral

1.4. Mtodos de estudio de la microbiota oral. Tcnicas moleculares

que es un gen altamente conservado y permite la comparacin filogentica entre

1.4.1. Tcnicas moleculares basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa

1.4.2. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)

anclaje de 30 a 50 bases nucleotdicas de guaninas (G) y citosinas (C) unidas al extremo

1.4.3. PCR a tiempo real o cuantitativa (RTi-PCR)

emisin de fluorescencia producida en la reaccin es proporcional a la cantidad del

producto amplificado se secuencia y se compara con otras secuencias recogidas en las

agrupadas en OTUs (unidades taxonmicas operativas). La comparacin de

de vino en la microbiota humana, se ha evaluado mediante un estudio de intervencin

3.1. Diseo del estudio de intervencin con vino en humanos

3.2. Recogida de muestras

3.3 Extraccin de DNA

3.4. Incubacin in vitro de sedimentos bacterianos de saliva con polifenoles

3.5. Anlisis por PCR-DGGE

Prevotella/Porfiromonas/Bacteroides. A uno de los cebadores de cada pareja de PCR se

cebadores (Tabla 1), 40 s a 56 C y 20 s a 72 C, seguido de una extensin final de 72 C

Temp anillamiento(C) Gradiente (%)

Nubel et al. (1996)

Van den Borget et al (2011)

Rinttil et al. (2004)

Lansac el al. (2000)

Heilig et al. (2002)

Satokari et al. (2000)

Cola de GC: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC

3.5.2. Revelado de los geles

Posteriormente, se incub el gel en solucin de revelado (hidrxido sdico 1,5%,

3.6. Recuperacin de bandas de PCR-.DGGE y secuenciacin

Para la recuperacin de los amplicones de inters de los geles de poliacrilamida,

recomendaciones del fabricante y se secuenciaron en el Servicio de Secuenciacin de

3.7. PCR cuantitativa en tiempo real (RTi-PCR)

3.7.2. Reaccin de RTi-PCR

3.7.3. Anlisis de los datos obtenidos mediante RTi-PCR

-1. Todas las reacciones de RTi-PCR fueron llevadas a cabo por

4.1. Optimizacin en el tratamiento de muestras de saliva y extraccin del

compuesto tensoactivo inico que ayuda a solubilizar los constituyentes membranosos

enzimas que pueden potencialmente agregarse al DNA y ayuda a limpiar la muestra.

4.2. Modulacin in vitro de la microbiota bucal con extractos fenlicos

Tabla 2. Concentracin en compuestos fenlicos del extracto Vitaflavan

Fig. 2. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gel superior:

La presencia mayoritaria en los geles de PCR-DGGE de la banda

Consecuencias del consumo moderado de vino

Haemophilus, Lactobacterium, Eubacteria, Capnocytophaga, Eikenella, Leptotrichia,

Fig. 3. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 20-70%)

Fig. 4. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 30-60%)

Fig. 5. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (gradiente 40-55%)