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AUTOMATIZACION EN

HEMATOLOGICA
LIC. TM. NOE OLAYA NIO
BLGA. SANDRA CRUZ GUERRERO

INTRODUCCION

Los mtodos manuales tradicionales han sido


sustituidos por contadores electrnicos que
conllevan mejores condiciones en rentabilidad,
fiabilidad y condiciones de trabajo.

Estos contadores permiten realizar el hemograma


analizando en pocos segundos miles de clulas.

HISTORIA

1934: Andrew Moldavan, recuento fotoelctrico de clulas en


suspensin que pasan a travs de un capilar montado a un
microscopio (detectara cambios de luz producidos por GR).

1956: Hermanos Coulter, Wallace y Joseph, patentan su equipo


basado en el mtodo de la impedancia elctrica, nicamente
para contar leucocitos y eritrocitos.

AUTOMATIZACION VENTAJAS

RAPIDEZ

EFICIENCIA

PRECISIN

EXACTITUD

NUEVOS NDICES

REPRODUCIBILIDAD (CV)
MANUAL

AUTOMATIZADO

Eritrocitos

11%

1%

Leucocitos

16%

2%

Plaquetas

22%

4%

VCM

9.5%

1%

HCM

10%

1.5%

Delta Check

Delta Check - el proceso


de revisar los resultados
de pacientes actuales y
compararlos con
resultados previos en
busca de diferencias
significativas.

Generacin segn avance tecnolgico


1ra. G: Hemograma manual.
2da. G: Hemograma semiautomatizado:
3ra. G: Hemograma automatizado:
Histogramas de GR, Plaquetas y
recuento diferencial de GB en 3 estirpes.

4ta. G: Hemograma automatizado


Con perforacin de tapa, histograma,
dispersograma para GB, diferencial GB
de 5 estirpes.

Parmetros hematolgicos Directos (determinados)


Recuento de eritrocitos
Volumen de eritrocitos

Recuento de Plaquetas
Volumen de plaquetas
Hemoglobina
Recuento de leucocitos,

Volumen de leucocitos
Formula leucocitaria

Parmetros hematolgicos Indirectos (calculados)


Hematocrito
ndices eritrocitarios: VCM, HCM, CHCM
ADE (RDW)
VPM, Plaquetocrito.
Histograma leucocitario, eritrocitario, plaquetario

Diagrama funcional simplificado de un sistema


multiparamtrico de recuentos celulares

Equipos automatizados
TECNICAS DE RECUENTO CELULAR:
Existen tres tipos de equipos automatizados
segn su funcionamiento:

Por impedancia
Radiofrecuencia y Corriente directa.
Por dispersin de luz

IMPEDANCIA ELECTRICA
PRINCIPIO
Se basa en la resistencia
que ofrecen las clulas al
paso
de
la
corriente
elctrica, cuando atraviesan
un orifico de apertura que
separa dos medios con
diferente potencias (uno
positivo y otro negativo)

IMPEDANCIA ELECTRICA

Sistema de medicin no ptico,


con un rango de medicin que
excede
las
6000
clulas
individuales por segundo.
El numero de clulas contadas
por muestra es aproximadamente
100 veces mayor que los
recuentos
microscpicos,
reduciendo el error estadstico
aproximadamente 10 veces.

IMPEDANCIA ELECTRICA
Eritrocitos y Plaquetas:
Las clulas de una muestra de
sangre total es diluida en una
solucin electroltica.
Se hacen pasar, una detrs de
la otra, a travs de una abertura
de determinado dimetro, por la
que circula una corriente
elctrica de cierta intensidad
inducida por 2 electrodos
dispuestos a ambos lados de la
abertura u orificio.

IMPEDANCIA ELECTRICA
Cada que una clula atraviesa el orificio de apertura
obstaculiza la corriente (se produce un cambio de
resistencia elctrica), que genera un cambio en la diferencia
de potencial: Pulso

IMPEDANCIA ELECTRICA
Se producen pulsos que son clasificados por tamaos, varias
miles de clulas por segundo, haciendo que los resultados sean
ms fiables que los obtenidos por mtodos manuales
La amplitud de los pulsos es directamente proporcional al
tamao de la partcula (Volumen celular).

AP : 100 um : GB >= 35 fl
AP : 50 um : GR >= 36 fl Pq >= 2 20 fl

Flujo
CC
PULSO
Tamao
Volumen

N Cantidad

PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

IMPEDANCIA ELECTRICA:

SUSPENSIN CELULAR EN MEDIO ELECTROLTICO.

PASO DE CLULAS POR APERTURA PEQUEA.


GR y Plaquetas: 50 x 60 micras
Leucocitos: 100 x 70 micras

FLUJO ELCTRICO POR EL PORO.

ELABORACIN DE GRFICAS:
Eritrocitos: 30 a 350 fL
Plaquetas: 2 a 20 fL
Leucocitos: 35 a 430 fL

Impedancia Electrica
Grficas

ENFOQUE HIDRODINAMICO

Para conseguir una trayectoria


uniforme de las clulas por el
centro de la regin sensible del
orificio de apertura (en hilera).
Con esto se evita que las clulas
pasen por el borde del orificio de
apertura o que, una vez
atravesado este, retrocedan e
interfieran en la lectura de las
otras clulas que le siguen.

ENFOQUE HIDRODINAMICO

La sensibilidad y exactitud de la
lectura dependen de que las
clulas en suspensin fluyan por
un ncleo central sin mezclarse
con el liquido de arrastre (flujo en
hilera)
Mejora
la
exactitud
y
reproducibilidad del conteo de
clulas sanguneas.
Previene la generacin de pulsos
anormales.

IMPEDANCIA ELECTRICA
Eritrocitos y plaquetas:
Son contados en un canal exclusivo.
Discriminadores automticos separan las dos
poblaciones celulares.
GR y Plaquetas se cuentan juntos y se separan por
la altura de los pulsos.

IMPEDANCIA ELECTRICA
Impedancia de Leucocitos:

El conteo es posible gracias a la adicin del lisante, que


ocasiona salida de agua del citoplasma, ocasionando que la
membrana se adhiera al ncleo de la clula.
Las clulas lisadas pasan por la apertura de 70 u, lo que
genera impulsos elctricos de alta variabilidad, generndose 3
poblaciones:
Linfocitos
Regin media: (monocitos,
eosinfilos y basfilos.
Granulocitos: Neutrfilos.

IMPEDANCIA ELECTRICA

En la actualidad, este principio se


aplica
como
mtodo
de
referencia para el recuento
celular hemtico y la medicin de
los volmenes (tamao) de cada
poblacin celular.

Es utilizado por la mayora de los


contadores
hematolgicos
debido
a
su
marcada
reproducibilidad,
rapidez
y
disminucin del error estadstico.

RADIOFRECUENCIA Y CORRIENTE DIRECTA


PRINCIPIO:
El tamao de las clulas es detectado por
medio de cambios en la resistencia a la
corriente elctrica y
La densidad del interior de las clulas
(tamao del ncleo y otras informaciones)
se detecta por medio de cambios en la
resistencia a la frecuencia de radio.

DISPERSION LUMINICA (mtodo ptico)


PRINCIPIO

Tcnica de anlisis
celular multiparamtrico.
Analiza el efecto que
sobre un haz de luz
monocromtica de alta
densidad (Lser) ejercen
las clulas de la sangre al
cruzarse, una a una en
su trayectoria.

DISPERSION LUMINICA

Una suspensin de clulas


diluidas fluye a travs de una
abertura.
Las clulas pasan alineadas una
detrs de otra, a travs de una
pequea zona sobre la que incide
perpendicularmente un haz de luz
halgena o lser, lo que provoca
la interrupcin y dispersin
lumnica de la energa radiante en
diversos ngulos.

DISPERSION LUMINICA

Es mas complejo que la impedancia:


Adems del tamao y la concentracin de
las clulas permite analizar la complejidad
de la estructura celular (Granularidad,
caractersticas
del
ncleo)
y
as
diferenciarlas.
Por ello es el procedimiento de eleccin
para la automatizacin de la frmula
leucocitaria.

METODOS ADICIONALES
Los mtodos pueden incluir tambin:

Actividad de enzimas celulares como la


peroxidasa. (Citoqumica)

Fluorescencia

Anlisis digital de la imagen.

CITOQUIMICA CELULAR

Citoqumica: Son aquellas reacciones qumicas


que se dan en la clula para evidenciar las
estructuras que la componen.

Proporcionan la formula leucocitaria, de


acuerdo con el tamao de los leucocitos y su
tincin con determinados colorantes.
Ventaja: En cada espcimen se cuentan
muchas clulas (unas 10,000), lo que hace
que aumente su precisin.

CITOQUIMICA
Actividad de enzimas celulares: Peroxidasa

Para aumentar la fiabilidad del recuento


diferencial combinan Citometra de flujo con la
Citoqumica
Miden con un colorante la actividad peroxidasa:
Alta en eosinfilos,
Menor positividad en neutrfilos,
Monocitos tienen muy poca actividad y
Linfocitos no tienen actividad peroxidasa.

RECUENTO DIFERENCIAL
AUTOMATIZADO

La mayora de contadores diferenciales


automatizados utilizan la citometra de flujo
incorporada a un contador de sangre total.
Proporcionan recuento diferencial de 3, 5 a 7
componentes.
Los recuentos se realizan en sangre completa
diluida en la que los eritrocitos se han lisado o
se han vuelto transparentes.

RECUENTO DIFERENCIAL
AUTOMATIZADO
Recuento diferencial de 5 componentes:
Neutrfilos
Eosinfilos
Basfilos
Linfocitos
Monocitos
Recuento extendido:
Grandes clulas inmaduras (Blastos y granulocitos
inmaduros)
Linfocitos atpicos (incluye blastos pequeos)

ANALISIS DIGITAL DE LA IMAGEN


PRINCIPIO:
Se
basa en el reconocimiento de los
leucocitos
por
medio
del
anlisis
computarizado de las imgenes que
proporciona un microscopio, a partir de
extensiones sanguneas teidas.
Estas
se
comparan
con
imgenes
programadas en el ordenador.

ANALISIS DIGITAL DE LA IMAGEN


La extensin teida se coloca en un
microscopio, que se mueve controlada por el
ordenador.
Se inicia el sistema de rastreo semejante al
manual.
Cuando se localiza un leucocito, se digitaliza la
imagen con una cmara de video.
Se
compara
con
las
caractersticas
morfolgicas programadas en la memoria del
equipo para los distintos tipos de leucocitos

ANALISIS DIGITAL DE LA IMAGEN


REPORTE:
Polinucleares neutrfilos: segmentados y no
segmentados.
Eosinfilos
Basfilos
Monocitos
Linfocitos.
Algunos identifican; Mielocitos,
metamielocitos, linfocitos atpicos y blastos.

Recuentos de Reticulocitos

Mtodo de Referencia: Azul de Metileno


Altos coeficientes de variacin, laboriosos

Mtodos automatizados

Fluorescentes: naranja de tiazol, auramina O.


Absorvancia: oxazina 750 , azul de metileno.
Colorantes que interaccionan con el ARN de
reticulocitos.

Canal reticulocitos - Fluorescente


RETSEARCH II (Diluyente + Colorante)

WBC

RET

Tincin:
Polimetino: ARN
Oxazina: ADN
Fl muy alta

Fl alta

RBC
Fl baja

Recuentos de Reticulocitos
Actualmente, diversos autoanalizadores tienen la
capacidad de contar los reticulocitos de sangre
perifrica, ofrecen:
Parmetros:
N porcentual y absoluto,

Volumen reticulocitario
Concentracin en
hemoglobina.

DETERMINACIN DE LA
CONCENTRACIN DE HEMOGLOBINA

El sistema utiliza la dilucin de LEU lisados para


calcular la hemoglobina.
La absorbancia de luz de un foco incandescente se
determina en 525 nm a travs de la longitud ptica
del bao.
Un haz de luz del foco pasa a travs de la muestra,
con un filtro de 525, y se determina mediante un
fotodiodo.
La seal se amplifica y el voltaje se calcula y se
compara con la lectura del blanco de referencia.

Tecnologas de Hemoglobinometra

Con Cianuro

Cianmetahemoglobina

Sin Cianuro

Hidroxilamina
Lauril Sulfato de Sodio
Formulado a partir de concentracin de
Hemoglobina y Rcto. De GR

Hemoglobina
Lauril sulfato sdico:
Reactivo libre de cianuro
No causa dao al medio ambiente
Menor interferencia en muestras:
Lipmicas
Ictricas
Conteos altos de leucocitos
Proteinas anormales

Determinacin de Hb
Instrumento
BeckmanCoulter
Sysmex

Mtodo de
Mtodo de
identificacin deteccin:
HiCN
Absorcin a 525 nm
LSS-meta-Hb

Absorcin a 555 nm
Absorcin a 546 nm

Abbott

HiCN con Hb
celular directa
HiCN

ABX

HiCN

Absorcin a 540 nm

Bayer

Absorcin a 546 nm

Hematocrito
No se mide directamente con los citmetros de
flujo y se calcula a partir del VCM y en nmero
de GR. Tiene menor precisin.

Calculado:
VCM x Nmero de GR

Indices Hematimtricos

VCM
HCM
CHCM
RDW-CV
RDW-SD
Plaquetocrito
VMP

CONTROL DE CALIDAD
Control de Calidad
Mtodos estadsticos y
cuantitativos usados en
el
laboratorio
para
asegurar la validez de
los resultados de tests.

LIMITACIONES DE LA
AUTOMATIZACIN

No se detectan inclusiones intraeritrocitarias


No puede distinguir exactamente los leucocitos
patolgicos
Existen
interferencias
que
afectan
las
determinaciones
Pseudo trombocitopenia por EDTA
Policromatofilia,
Eliptocitos,
Esferocitos,
Acantocitos, Hemates fragmentados, GR en
lgrima, Macroovalocitos, Punteado Basfilo, Anillos
de Cabot, Corpsculos de Howell-Jolly, Rouleaux,
Parsitos hemticos, etc.

AUTOMATIZACIN: ASPECTOS ORGANIZATIVOS


LA AUTOMATIZACIN NO PUEDE LLEVAR A QUE EL
LABORATORIO SE CONVIERTA EN UN EXPEDIDOR DE
CIFRAS AISLADAMENTE.
ES NECESARIO AUMENTAR LA EFICIENCIA Y CALIDAD
DE LOS RESULTADOS Y UNA CONTINUA SUPERACIN
DE TODO EL PERSONAL QUE LABORA EN ESTE.

Gracias por su atencin