Practica de laboratorio:

ESTERILIZACION DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

MICROBIOLOGA
INTEGRANTES:

PROFA:

CRUZ RAMIREZ JUANA GLADYS

LUCAS GARCIA DIEGO
MARTIEZ SANTIAGO ADALBERTO
CRUZ OSORIO SAMUEL
LOPEZ SILVA GUSTAVO

GRADO: 3

MORA GUZMAN ZOILA

GRUPO: D

ING. EN AGRONOMIA

INTRODUCCIN
En la presente prctica de laboratorio se dar a conocer el tema de esterilizacin
de materiales y medios de cultivo que nos dice que la esterilizacin se define
como la destruccin completa de todos los microorganismos presentes incluyendo
las formas vegetativas y las esporas. Para lograr la destruccin de las bacterias,
existen diferentes medios como son: la accin de los agentes qumicos y
antibiticos.
Un medio de cultivo est constituido por una mezcla de agua y sustancias que en
conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el desarrollo de los
microorganismos. La composicin de los medios de cultivo vara en funcin del
grupo microbiano que se pretende estudiar, y la preparacin del medio depende
de la complejidad qumica, el estado fsico y otras condiciones requeridas.
Existen medios de cultivo comerciales empleados para el desarrollo de los
microorganismos ms comunes, sin embargo en muchas ocasiones se requiere
preparar el mismo mediante la mezcla de sus componentes.
Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas
con material y medios de cultivo estriles. Existen diversos mtodos de
esterilizacin, entre ellos: calor (seco o hmedo), filtracin (para sustancias
termolbiles y aire), radiaciones y aplicacin de gas de xido de etileno (para
jeringas y cajas de plstico).

OBJETIVOS
I.

Conocer los principios generales de la preparacin y tcnicas de

esterilizacin de diversos materiales y medios de cultivo de uso comn en

II.

la microbiologa.
Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la
contaminacin microbiana en el laboratorio.

MARCO TEORICO
La historia de la asepsia se desarroll en torno a la fiebre puerperal. En 1864 Luis
Pasteur, niega la teora vigente de la generacin espontnea. Durante el siglo XIX,
se descubrieron algunas de las bacterias que con mayor frecuencia causaban
enfermedad a la humanidad. En la poca moderna comienza a influir los
conceptos de asepsia y antisepsia.
A pesar de todos los adelantos, persista el problema de las bacterias adheridas a
las manos del operador. Uso de guantes. Durante el siglo XX se desarrollaron las
autoclaves, la desinfeccin y desinfectantes. En el siglo XVII, Kirsten observo a
travs de un microscopio primitivo que la sangre de las personas enfermas
contenan unos "animaculos".
Las precauciones fueron desapareciendo con el tiempo.
Este verbo refiere a la accin de destruir los grmenes patgenos o de hacer
estril e infecundo algo que antes no lo era. Por ejemplo: Por favor, encrgate de
la esterilizacin de estos instrumentos, La infeccin se produjo por una falla en la
esterilizacin del material mdico; en este caso en el campo como por ejemplo el
suelo; empleado en la intervencin.
Es un procedimiento que engloba un trmino absoluto que significa la total
destruccin o remocin de toda forma de vida.
Para medios de cultivo se usan altas temperaturas, vapor saturado a presin,
algunos agentes qumicos (muy pocos) y ciertos filtros y radiaciones U.V.

Por su minsculo tamao, los microorganismos no pueden estudiarse como

individuos, sino que es necesario manejarlos como poblaciones.

Para ello es necesario cultivarlos, es decir, favorecer su multiplicacin in vitro, en

ambientes especiales que proporcionen las condiciones semejantes a las de sus
hbitats naturales. En estos ambientes se debe eliminar a todos aquello
microorganismos que interfieren en el estudio del microorganismo de inters, al
que adems de proporcionar los nutrientes necesarios para su crecimiento
multiplicacin
Entonces decimos que la esterilizacin al proceso por el cual se obtiene un
producto libre de microorganismos viables. El proceso de esterilizacin debe ser
diseado, validado y llevado a cabo para asegurar que es capaz de eliminar la
carga microbiana del producto o un microorganismo ms resistente.
Dado que la esterilidad no puede demostrarse de manera absoluta sin causar la
destruccin completa de todas las unidades del lote de producto terminado, se
define la esterilidad en trminos probabilsticos, en donde la probabilidad de que
una unidad de producto est contaminada es aceptablemente remota.
Se considera que un producto crtico es estril cuando la probabilidad de que un
microorganismo est presente en forma activa o latente es igual o menor de 1 en
1.000.000.
Los agentes que matan microbios son denominados microbicidas (cida= matar) o
ms comnmente denominados germicidas. Si el agente especficamente
destruye bacterias, es llamado bactericida; si mata hongos es denominado
fungicida.
Tras una exposicin del objeto esterilizado al aire o a sus alrededores, ste se
habr contaminado de nuevo con microorganismos.
Los mtodos trmicos de esterilizacin son comnmente los ms utilizados para
eliminar los microorganismos, incluyendo las formas ms resistentes como lo son
las endoesporas.
En este caso en el suelo natural casi siempre tiene en su interior elementos
indeseables para su uso como sustrato de macetas. Principalmente semillas de
malas yerbas y organismos patgenos vivos o sus medios de reproduccin que
5

son perjudiciales al desarrollo de la futura planta en la maceta. Para eliminar este

inconveniente, la tierra se somete a un proceso que produce la muerte de estos
agregados indeseables; este proceso se le llama esterilizacin.
Durante la esterilizacin tambin mueren los organismos beneficiosos que son
necesarios en el suelo, por lo que a la tierra esterilizada, deben agregarse luego
estos microorganismos a travs del uso de compost.
Aunque la esterilizacin se puede hacer por mtodos qumicos, lo ms ecolgico
es usar mtodos ms "naturales", los dos ms comunes son; con el uso del calor
directo y por medio de la solarizacin.
Esterilizacin por calor directo.
Este proceso consiste en el mantenimiento de la tierra a unos 80-82C por lo
menos 30 minutos. A estas temperaturas se produce la muerte de los seres vivos
que hay en la tierra, sin producir cambios sustanciales en otros componentes del
suelo, pero si la temperatura sobrepasa este lmite seguro, pueden producirse
ciertos procesos que generan sustancias txicas para las plantas.
Esterilizacin por solarizacin.
Para este tipo de esterilizacin se utiliza el calor generado en el suelo debido a la
incidencia de los rayos del sol. Este mtodo resulta efectivo en el verano en los
climas templados, cuando el sol brilla con fuerza, pero puede ser utilizado todo el
ao en las regiones tropicales.

Tiene la ventaja de que puede utilizarse directamente en el terreno para eliminar

patgenos de tierras infectadas, pero la desventaja de que necesita largos
perodos de tiempo para ser efectiva.
La clave de una buena solarizacin radica en la obtencin de la mayor
temperatura posible en el sustrato por un tiempo prolongado. Se acepta que una
buena solarizacin debe alcanzar por lo menos los 50C despus del medioda,
por un total de 45 das.
6

Si la solarizacin es buena, todas las semillas de las malas yerbas habrn

germinado y/o muerto, as como la gran mayora (si no todos) de los patgenos
principales del suelo, en principio muchos organismos resisten temperaturas
mayores que las alcanzadas durante la solarizacin por perodos breves de
tiempo, pero no por por largos perodos repetitivos, por eso para lograr una buena
desinfeccin se recomienda una permanencia mnima del sustrato de 30 das en el
solarizador. Durante la solarizacin ocurren otros procesos diferentes al simple
calentamiento, que parecen intervenir en la muerte de los patgenos.
Otra ventaja de la solarizacin es que no se producen de ninguna forma
componentes txicos en el suelo.

MTODOS DE ESTERILIZACIN
Flameado: Tiene por objetivo hacer pasar el material por la llama de un
mechero de tipo Bunset hasta lograr su incandescencia.
Incineracin: Forma de destruir la carga microbiana por combustin. Se
utiliza para la eliminacin de residuos biopeligrosos mediante su
combustin en hornos crematorios.
Horno Patear o estufa Poupinel: Se basa en el calentamiento del interior de
un aparato de acero inoxidable, en el que se eleva la temperatura, por
energa elctrica, que controla un termostato. El objetivo es que el aire
caliente destruya por oxidacin las protenas microbianas.
Autoclave de vapor: Es un medio en el que se emplea vapor saturado para
producir la hidratacin, coagulacin e hidrlisis de las albminas y las
protenas en las clulas microbianas.
Miniclaves: Son autoclaves de pequeas dimensiones y capacidad
reducida, de uso cada vez ms frecuentes en centros de salud. Posibilitan
la esterilizacin de instrumental de pequeo volumen de forma rpida y
eficaz.
Radiaciones ionizantes: las radiaciones tienen una gran capacidad
germicida. Su efecto letal se debe a la formacin de radicales entre los
7

componentes celulares de gran reactividad. Su accin mutagnica se

produce el inhibir la divisin celular incidiendo directamente sobre los
cidos nucleicos.
Filtros microporosos: su accin esterilizante se produce por filtracin. Se
utilizan para esterilizar fluidos, lquidos y gases.

xido de etileno: se presenta como gas o liquido incoloro. Penetra con

facilidad en los materiales de goma y plstico. Es un medio de esterilizacin
a bajas temperaturas con un tiempo de exposicin de 3 a 8 horas. Los
parmetros que maneja son:
cido peractico: Mayor actividad antimicrobiana que el perxido de
hidrgeno. Puede emplearse como lquido y en estado plasma, es muy
corrosivo para los instrumentos, a la vez es desinfectante de alto nivel y
esterilizante.
Formaldehdo: Es un gas incoloro, de olor fuerte, con propiedades
germicidas. Se utiliza en cmaras de formalizacin, controlando los
parmetros de presin, temperatura, concentracin y humedad. El agente
es cancergeno potencial.

AGAR NUTRITIVO
El medio contiene extracto de carne, peptona y agar, siendo una formulacin
suficiente para el desarrollo de los microorganismos. El extracto de carne
proporciona a la media fuente de carbohidratos, de nitrgeno y vitaminas. El
empleo de este medio es de acuerdo al tipo de estudio por realizar.
PREPARACION: Rehidratar 23 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar
10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin
durante 1 minuto para disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a 121C
(15 lbs de presin) durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45C. Vaciar
en cajas de Petri estriles. Conservar en refrigeracin de 2 a 8C.

MAC CONKEY AGAR.

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil
desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que
utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
AGAR DEXTROSA Y PAPA
Medio de cultivo Agar de Dextrosa y Papa es de la marca DIBICO, y es conocido
como PDA por sus siglas en ingles, tiene la infusin de papa como fuente de
almidones y la dextrosa son la base para el crecimiento de hongos y levaduras. El
bajo pH (3.5) evita el crecimiento de las bacterias. Cuando se va a usar para el
recuento de hongos y levaduras, agregar al medio de cultivo una vez esterilizado y
enfriado aproximadamente a 45C, 14 ml de una solucin estril de cido tartrico
al 10% para obtener un pH aproximado de 3.5. Sembrar el medio de cultivo por
estra en la superficie o adicionar la muestra para la tcnica de vaciado en placa.
Incubar hasta 7 das a temperatura ambiente.

MTODO PRCTICO
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Materiales
Agua destilada 300ml por equipo
Agar dextrosa y papa
Agua saboraud
Agar nutritivo
Agar bacteorologico
Microscopio
5 cubre objetos
5 porta objetos
4 matraces Erlenmeyer de 250ml.
Alcohol etlico
Cloro al 3%
Algodn
Gasa
10 Caja Petri
Papel estraza
Klean pack
Guantes
Cubre bocas

Peso de los agares

Lo primero que se realiz fu el clculo que debe contener cada caja preti, as que
pesamos en la bscula analtica para 4 matraces, en el cual nos sali como lo muestra la
tabla 1
Tabla 1. Muestras de agares
Matraz
Tipo agar
1
Dextrosa y papa
2
saboraud
3
Nutritivo
4
Mac conkey

Cantidad
3 cajas Petri
3 cajas Petri
2 cajas Petri
2 cajas Petri

Agua destilada
40ml
40ml
30ml
30ml

10

Total de agar por cada caja petri

1.56 g.
2.6 g.
0.69 g.
1.5 g.

Ilustracin 1 Integrando agua destilada a los

matraces.
Ilustracin 2 Tapn de matraz.
Una
junto
a
tal

vez pesado integramos los agares en cada matraz,

con el agua destilada. Posteriormente se hizo una
especie de tapn para tapar el matraz e introducirlo
autoclave, Con una gasa y una bolita de algodn de
manera que entrara y saliera en la boca del matraz.,
despus le construimos una especie de gorro hecho
papel de estraza.

la

con

Ilustracin 3 Agar despus de la autoclave.

Ilustracin 4 Introduccin de agar en caja petri.

Se introdujeron los matraces en la autoclave por 15 minutos. Mientras estos estaban en la

autoclave en la mesa de trabajo preparamos el mechero y limpiamos todo con alcohol
(incluso la bolsa de donde estaban las cajas petri, para que una vez que salieran los
matraces se colocaran en cada uno de las cajas petri. Una vez que salieron de la
autoclave se movi cada matraz para que no se cuajara el agar. Se destapo la bolsa de
las cajas petri de manera ordenada, abriendo de manera correcta, se pas una caja petri
sobre el mechero, se introdujo el agar y Posteriormente la dinmica se hizo con todos los
agares.
Cada caja petri se sell por las orillas con kleen pack, y se meti en la misma bolsa de las
cajas petri. Una vez concluido esto se metieron en el refrigerador.

RESULTADOS
3. TABLA DE AGAR EN 10 CAJAS PETRI
Matraz
1
2
3
4

Tipo agar
Dextrosa y papa
saboraud
Nutritivo
Mac conkey

Cantidad
3 cajas Petri
3 cajas Petri
2 cajas Petri
2 cajas Petri

Agua destilada
40ml
40ml
30ml
30ml
11

Total de agar por cada caja petri

1.56 g.
2.6 g.
0.69 g.
1.5 g.

Obtuvimos 10 cajas con 3 agar Dextrosa, 3 con agar Saboraud, 2 con agar Nutritivo y 2
con Mac conkey.

DISCUSIN DE RESULTADOS

Viendo los tipos de agar nos dimos cuenta que era un medio de cultivo slido y que tiende
a convertirse en un cultivo de hongos, puesto que tiene los suficientes nutrientes para que
una colonia de hongos se desarrollen rpido y a una cierta temperatura. El buen manejo
de esterilizacin es muy importante porque un mal uso puede generar otro tipo de
bacterias sobre el medio de cultivo. Es imprtate saber que cada agar tienen sus
funciones que lo hace distinguir y el saber que es un medio de cultivo para hongos.

CONCLUSIN
Un medio de cultivo consta de un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes
necesarios para permitir, en condiciones favorables del crecimiento de organismos, una
forma muy til de poder aislar, identificar y conservar los microorganismos es mediante el
uso de medios de cultivo. En base los reactivos pudimos identificar que el cultivo fue
creado por medio de cultivo slido, pues ocupamos agares de cual son utilizados solo
para medios de cultivos solidos o semislidos.

ANEXOS

12

Imagen 1 AGAR DEXTROSA

Imagen 3 AGAR NUTRITIVO

Imagen 2AGAR SABORAUD

Imagen 4 AGAR MAC CONKEY

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Imagen 5 PESANDO EL AGAR

Imagen 7 AUTOCLAVE

Imagen 6 AGREGANDO AGUA

DESTILADA

Imagen 8 INTRODUCCION DE AGAR

EN CAJA PETRI

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