UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS

MANUAL DE PRCTICAS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
DRA. EVANGELINA OLIVAS ENRQUEZ

PROGRAMA DE CIRUJANO DENTISTA

ACADEMIA DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA

CD. JUREZ, CHIH.

2015
1

MANUAL DE PRCTICAS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Dr. Daniel Constandse Cortez

Director del Instituto de Ciencias Biomdicas
Dr.
Director del Departamento de Estomatologa
Dr.
Coordinador del Programa de Estomatologa
Dr. Alejandro Martnez Martnez
Departamento de Ciencias Qumico Biolgicas
M. en C. Bertha Alicia Borrego Ponce
Coordinadora Academia de Microbiologa

AGRADECIMIENTOS:
A TODOS LOS PROFESORES DE LA ACADEMIA DE MICROBIOLOGA Y
PARASITOLOGA,

POR

SUS

VALIOSAS

SUGERENCIAS

EN

LA

ELABORACIN DE ESTE MANUAL.

TABLA DE CONTENIDO

Reglamento del laboratorio y NOM 087.

Prctica 1. Microscopa
Prctica 2. Tcnicas bacterianas de cultivo
Prctica 3. Estudio microscpico de las bacterias
Prctica 4. Control de los microorganismos
Prctica 5. Microflora de la placa dental
Prctica 6. Cocos gram-positivo.
Prctica 7. Estreptococos orales
Prctica 8. Cocos pigenos Gram-negativo orales
Prctica 9. Bacterias entricas
Prctica 10. Bacterias anaerobias orales
Prctica 11. Actynomycetos orales
Prctica 12. Hongos de la cavidad oral
Prctica 13. Virus orales.
Prctica 14. Problema de una infeccin oral.
Bibliografa

Pg.
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10
15
20
27
31
35
39
42
45
48
52
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62

REGLAMENTO DEL LABORATORIO Y NOM. 087

INTRODUCCIN
Este reglamento regir la actitud, el comportamiento y el desempeo del
estudiante dentro de los laboratorios de Microbiologa y tiene como finalidad evitar
riesgos al personal y estudiantes que laboran en l, ya que el laboratorio es un
rea donde se manejan microorganismos patgenos, parsitos y algunos
compuestos qumicos peligrosos. Asimismo, se debe cuidar el equipo valioso
como son los microscopios y el material delicado como la cristalera.
REGLAS
1. Todos los alumnos debern asistir con bata blanca larga y el cabello
recogido.
2. La entrada al laboratorio quedar restringida exclusivamente a los alumnos
inscritos
3. se prohbe introducir al laboratorio cualquier alimento o bebida, para evitar
el riesgo de contaminacin con microorganismos patgenos.
4. Est estrictamente prohibido fumar dentro del laboratorio.
5. Queda prohibido introducir mochilas, cajas de herramienta, etc., debindose
colocar estas en los lockers de la entrada de
6. Cualquier accidente en el laboratorio o derrame de microorganismos, se
deber comunicar inmediatamente al profesor, para evitar el riesgo de
contaminacin con los microorganismos patgenos o parsitos manejados
en las prcticas.
7. Se nombrar un jefe de mesa quien ser el responsable del cuidado del
material y equipo y de que la mesa quede aseada y desinfectada. Tambin

vigilar que todos los integrantes de la mesa se laven las manos con
antisptico antes de retirarse. El jefe de mesa recibir del profesor los
microscopios y otros materiales y aparatos necesarios para el desarrollo de
las prcticas, y posteriormente los devolver en las mismas condiciones
que los recibi, a excepcin de los materiales especiales indicados por el
profesor. (ejemplo cultivos). En caso de algn dao al material o aparatos,
los alumnos integrantes del equipo estarn obligados a reparar dicho dao
en forma que indique el profesor.
8. Para tener derecho a la evaluacin final en la teora, el alumno deber tener
el 80 % de asistencia.
9. Se tendr derecho a la asistencia slo con 10 minutos de retardo
10. La calificacin final de la materia de Microbiologa quedar constituda por
la puntacin obtenida en la prctica y en la teora, cuya suma se efectuar
en la forma siguiente:
a) La calificacin final obtenida en el laboratorio tendr un valor del 30 % de la
calificacin final total.
b) La calificacin total de la teora corresponder al 70 % de la calificacin
final.
c) La suma de ambas calificaciones (teora y prctica) ser igual al 100 %.
d) El alumno no podr acreditar la materia si obtiene calificacin reprobatoria
en el laboratorio o en la teora. Debe aprobar ambas para promediarse.
CONOCIMIENTO DE LA NORMA OFICIAL MEXICANA - 087
El alumno deber capacitarse con la NOM-087 sobre la Separacin, Tratamiento y
Destino de los Residuos Biolgico- Infecciosos.
La NOM-087 se refiere a la Separacin, Tratamiento y Destino de los Residuos
Biolgico- Infecciosos, manejados en los laboratorios. Esta Norma tiene por objeto
establecer los requisitos mnimos de infraestructura y de equipamiento para los
hospitales y consultorios que presten atencin mdica especializada. En esta
norma se presentan los requisitos mnimos de infraestructura y equipamiento para
hospitales y consultorios de atencin mdica especializada, incluyendo la
6

infraestructura y el equipamiento para ejercer actividades directivas y de formacin

de personal de salud, establecido como obligatorio por la Ley General de Salud y
su Reglamento en materia de prestacin de Servicios de Atencin Mdica.

INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA.
La microbiologa es la rama de la biologa encargada del estudio de los
microorganismos, tambin conocidos como microbios, seres vivos pequeos, del
griego mikros "pequeo", bios, "vida" y loga, tratado, estudio, ciencia. Los
microorganismos tienen una gran sencillez en su estructura y organizacin, los
hay sin estructura celular, como los virus, pero la mayora de ellos son
unicelulares, aunque algunos son pluricelulares formados por varias clulas, las
cuales apenas tienen diversidad funcional. A pesar de su sencillez aparente, su
importancia es tanta, que ha dado origen a una rama de la Biologa dedicada a su
estudio, la Microbiologa.
De acuerdo al rbol de la Vida de Woese, microbilogo creador de la nueva
taxonoma molecular basada en la comparacin entre especies de la fraccin 16s
del ARN ribosomal, se proponen 3 dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, en los
que se incluye a todos los seres vivos. El autor dividi el antiguo grupo
denominado Procariota, en dos grupos, Archaea y Bacteria, debido a que ninguno
de los dos es el ancestro de alguno de ellos y por otro lado, ambos comparten
muy pocas caractersticas en comn.
DOMINIO BACTERIA (antes denominado Eubacteria):
Son clulas procariotas. Presentan una pared celular conteniendo peptidoglicano,
son sensibles a los antibiticos antibacterianos tradicionales, y tienen regiones del
RNAr y del RNAt claramente diferentes de las Archaea y Eukarya. Hay tantas
variedades de Bacteria que es casi imposible determinar cuantas especies existen
en el planeta.

DOMINIO ARCHAEA:
Este Dominio comprende a organismos unicelulares, los cuales son procariotes
semejantes a las bacterias. El material gentico de los procariotas, o
ADN, no est encerrado en un compartimento celular central llamada
ncleo. Las Bacteria y las Archaea son los nicos procariotas. Al
contrario de Bacteria y Eukarya, tienen membranas compuestas de
cadenas de carbono ramificadas unidas a glicerol por uniones de ster y
tienen una pared celular que no contiene peptidoglicano. Mientras que no
son sensibles a los antibiticos que afectan a los Bacteria, son sensibles a
los antibiticos que afectan a los Eukarya. Viven a menudo en ambientes
extremos ambientales.
DOMINIO EUKARIA:
Incluye los protistas (algas y protozoarios), los fungi (hongos), el reino Plantae
(plantas) y el reino animalia (animales), es decir los organismos cuyas
clulas son eucariticas, con membrana similar a las de Bacteria. No todos
los Eukarya presentan pared celular y cuando la tienen no contiene
peptidoglicano. Las clulas estn organizadas en tejidos, tanto en Plantae
como en Animalia, pero la presencia de pared solo se restringe a Plantae.
Al tratar la microbiologa sobre todo los microorganismos patgenos para
humanos, se relaciona con categoras de la medicina como Patologa,
Inmunologa y Epidemiologa.

Bacterias: Las bacterias (grupo conocido anteriormente como eubacterias) son

clulas procariota. Una clula bacteriana tpica es de aproximadamente 1
micrmetro de dimetro, mientras que la mayora de las clulas eucariticas miden
de 10 a 100 micrmetros de dimetro. Los Procariota se encuentran en todos los
hbitats donde viven los eucariotas.
Las clulas bacterianas muestran tres regiones arquitectnicas: apndices en
forma de flagelos y pili (protenas unidas a la superficie celular); una envoltura
celular que consiste de una la membrana plasmtica, pared celular y cpsula; y
una regin citoplsmica que contiene el genoma de la clula (ADN) y ribosomas y
varios tipos de inclusiones. Una clula procariota tpica es aproximadamente del
tamao de una mitocondria de eucariota.

Estructura bacteriana

La clasificacin de las bacterias se basa en el estudio de sus caractersticas

mediante tcnicas que comprenden desde las ms sencillas tinciones, hasta los
ms complejos estudios moleculares. Una tcnica til y de bajo costo consiste en
la tincin de Gram y posterior observacin de la muestra mediante el microscopio
de luz para estudiar su forma, tipo de agrupacin y color, de acuerdo a la
composicin de su pared celular. Algunas propiedades genticas y fisiolgicas
constituyen herramientas utilizadas para definir algunas caractersticas de las
cepas, como los serotipos y biotipos, la determinacin de especies en algunos
grupos de bacterias y la produccin de toxinas. Los mtodos ms sensibles se
basan en el anlisis del material gentico, se emplean en la identificacin de
subgrupos de genes esenciales para el crecimiento, colonizacin, adhesin e
invasin bacterianos, tal es el ejemplo de mtodos para seleccionar los genes
activos nicamente durante la infeccin.
9

PRCTICA 1
MICROSCOPA

OBJETIVO DE LA PRCTICA.
Que el alumno se familiarice con las partes del microscopio de luz, con su manejo
y sus cuidados y que conozca el fundamento de las diferentes clases de
microscopios.
INTRODUCCIN.
El microscopio es el instrumento ms frecuentemente utilizado y el ms til en el
laboratorio de microbiologa, debido a que proporciona la amplificacin o
agrandamientoaparente que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a
simple vista, con una amplificacin desde cien a cientos de miles de veces. Las
dos categoras de microscopios disponibles son los microscopios pticos (de luz) y
los microscopios electrnicos.
I. MICROSCOPIO PTICO (DE LUZ):
Utiliza un sistema de lentes pticos que va amplificando la imagen sucesivamente
y comprende: microscopio de campo claro -microscopio de campo obscuro,
microscopio de fluorescencia, microscopio de contraste de fases.
10

1. Microscopio de Campo Claro:

Es el instrumento ms ampliamente utilizado para microscopa de rutina. Aqu el
rea observada est brillantemente iluminada y los objetos en estudio aparecen
ms obscuros. Generalmente producen un aumento til de unos l000 dimetros.
La amplificacin se logra mediante el uso de sistemas de lentes diseadas y
acomodadas para proporcionar la amplificacin en forma ptima. Presenta lentes
en el condensador, en los objetivos y en los oculares. La lente del condensador
enfoca un cono de luz sobre el campo donde se coloca la muestra. Algunos de los
rayos de luz de este cono pasan directamente a la lente del objetivo para formar el
fondo de luz o campo claro. Los rayos de luz que chocan con los objetos
(microorganismos) que hay en la muestra y se "curvan", son conducidos a la lente
del objetivo para formar una imagen del objeto. La imagen es amplificada por la
lente ocular. Comnmente los microscopios estn equipados con tres objetivos
montados en una plataforma llamada revlver, que al hacerse girar pone a uno de
ellos en la lnea del condensador. y cada uno proporciona distinto grado de
aumento El poder de resolucin de un microscopio est determinado por la
longitud de onda de la luz y por una propiedad del objetivo y de la lente del
condensador.
Sistema mecnico: Base, brazo, cuerpo del tubo, tubo intercambiable del
microscopio, platina, revlver, objetivos de de 10, 40 y 100 X, tornillo
macromtrico, tornillo micromtrico, condensador y diafragma.
2. Microscopio de Campo Oscuro:
Es similar al de campo claro, excepto que va equipado con un condensador de
campo oscuro y una abertura numrica baja. Esta clase de condensador dirige los
rayos de luz dentro del campo de la muestra, formando un angulo tal, que solo los
rayos que chocan contra el objeto que hay en el campo de la muestra son
refractados (curvados) y penetran en el objetivo. As, el objeto queda
brillantemente iluminado y destaca sobre el fondo oscuro (campo oscuro)
3. Microscopio de Fluorescencia: Est equipado con una fuente de luz ultravioleta,
varios filtros y un condensador de campo obscuro. Se usa para examinar muestras
teidas con colorantes de fluorocromo, denominados fluorescentes, los cuales
11

absorben energa de longitudes de ondas cortas invisibles, pero emiten ondas de

longitudes de onda mayores visibles y el fenmeno es denominado fluorescencia.
Esta tcnica permite la identificacin rpida de algunos microorgnismos
4. Microscopio de contraste de fases:
Es un tipo de microscopio ptico que permite un mayor contraste entre
substancias de diferente grosor o diferente ndice de refraccin, mediante el uso
de un condensador y un objetivo especiales que controlan la iluminacin del
objeto, de manera que acenta las ligeras diferencias en el espesor o en los
ndices de refraccin de las estructuras celulares. Las diferencias se revelan en
forma de distintos grados de brillo o de oscuridad (un mejor contraste), pudiendo
localizarse estructuras dentro de la clula sin teir, que no son visibles en la
microscopa de campo claro.
II. MICROSCOPIO ELECTRNICO
Emplea haces de electrones en lugar de ondas de luz, para producir una imagen
amplificada. Un campo magntico substituye a las lentes. Es posible lograr
amplificaciones de un milln de veces, las que posteriormente se logran ampliar
ms en la imagen fotografiada. Esto hace posible la observacin de
microorganismos tan pequeos, que no se ven con el microscopio ptico, como
los virus.
1. Microscopio electrnico de transmisin: Un haz de electrones finamente
enfocados, pasa a travs de un corte ultradelgado del especimen. Los
electrones son enfocados a una pequea rea de la muestra y la iluminan,
apareciendo con reas claras y obscuras. La resolucin de es de 2.5 nm y la
amplificacin es de 10,000 X a 100,000 X.
2. Microscopio electrnico de Barrido: Resuelve el problema de seccionar los
especmenes, permitiendo observar clulas completas. Unos electrones son
dirigidos a la superficie de la muestra y otros colectados para formar la imagen
tridimensional.
MATERIALES Y MTODOS:

12

EJERCICIO PARA EL TRANSPORTE Y MANEJO DEL MICROSCOPIO:

1. El transporte del microscopio de un lugar a otro debe ser muy cuidadoso. Con
una mano se debe sujetar del brazo, mientras se coloca la otra mano bajo la base
para sostenerlo, mantenindolo en posicin vertical. Esto evita el desprendimiento
de algunas de las partes que no son fijas.
2. Nunca deposite el microscopio en la orilla de la mesa, sino a unos cm de
distancia del borde.
3. No toque las lentes con los dedos.
4. No juegue con los componentes del instrumento. Si no funciona en forma
adecuada, notifquelo al profesor y no intente arreglarlo usted mismo.
5. No permita que ningn reactivo qumico entre en contacto con alguna parte del
microscopio, a excepcin del aceite de inmersin usado en la lente de l00 X.
6. Limpie las lentes slamente con papel especial para lentes (papel seda) sobre
todo al terminar de usarlo, para que no queden restos de aceite de inmersin.
EJERCICIO DE ENFOQUE
1. En base a las indicaciones del profesor vaya identificando las diferentes partes
que constituyen el microscopio.
2. El profesor le proporcionar una preparacin fija de bacterias en un portaobjetos
para el

ejercicio.

3. Encienda el microscopio.
4. Mueva cuidadosamente el revlver y coloque el objetivo de 10 X sobre la
platina.
5. Coloque en la platina un portaobjetos con un especimen y ajstelo en el carro.
Haga coincidir el haz de luz del condensador con el especimen.
6. Mueva el tornillo macromtrico para acercar el objetivo de 10 X a la platina,
totalmente hasta el tope.
7. Posteriormente, sin dejar de observar a travs del ocular, mueva lentamente el
tornillo macromtrico para ir alejando el objetivo de 10 X, hasta detectar una
imagen o un color en la preparacin; enseguida mueva lentamente el carro en la
platina. Si la imagen se mueve, indicar que est enfocando la preparacin.
13

Mueva el tornillo micromtrico y afine el enfoque. Una vez logrado el enfoque, ya

no suba ni baje el tornillo macromtrico, solo use el micromtrico. Si se desenfoca,
vuelva a repetir el proceso.
8. A continuacin mueva el diafragma y determine la cantidad de luz ms efectiva
para la observacin.
9. Mueva el revlver lentamente para retirar el objetivo de 10X y cambie al objetivo
de 40 X. Ajuste el enfoque con el tornillo micromtrico. Con el diafragma determine
la cantidad de luz adecuada .
10. Mueva el revlver lentamente para retirar el objetivo de 40X, coloque una gota
de aceite de inmersin sobre la preparacin. A continuacin mueva de nuevo el
revlver con cuidado, dejando que la lente del objetivo de 100 X quede en
contacto con el aceite. Ajuste el enfoque con el micromtrico. Si no lo logra,
regrese directamente al objetivo de 10 X, sin pasar por el de 40 X para no
ensuciarlo con el aceite y vuelva a enfocar. El aceite aumenta la cantidad de luz
que pasa a la lente del objetivo.
11. Al terminar, mueva el revlver antes de sacar la preparacin y enseguida
limpie el aceite de la lente, con papel seda. Puede usar un pauelo desechable
por el lado que no suelta pelusa. No utilice algodn ni otros materiales.
12. Nunca olvide retirar la preparacin de la platina al terminar, ni limpiar el aceite
del lente 100X .
13. Apague el microscopio y enrolle el cable.
Haga dibujos de las observaciones a diferentes amplificaciones. Explique con un
esquema la formacin de la imagen que se observa
Comente su experiencia obtenida al hacer las observaciones y las dificultades
encontradas, as como las ventajas y desventajas que not en la tcnica.

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

Cuestionario.
1

Cmo se forma la imagen del microscopio?

14

Por qu se usa el aceite de inmersin con el objetivo de 100 X slamente.

Consulte la literatura y describa otras clases de microscopio no

mencionadas.

PRCTICA 2
TCNICAS BACTERIANAS DE CULTIVO
OBJETIVO DE LA PRCTICA.
Que los alumnos conozcan algunos medios de cultivo comunes para bacterias y
adquieran el criterio para seleccionarlos segn sus necesidades. Que desarrollen
las tcnicas de siembra comunes de aislamiento de bacterias.
INTRODUCCIN.
El crecimiento de los microorganismos no se puede estudiar individualmente debido
a su tamao tan pequeo, por lo que es necesario recurrir a medios nutritivos
artificiales, por lo que slo pueden ser estudiados en poblaciones. Para ello es
necesario cultivarlos en medios artificiales, donde se puedan desarrollar
rpidamente. En estas condiciones se pueden manipular y efectuar las
investigaciones deseadas.
- Medios de cultivo: los materiales nutritivos donde se desarrollan y multiplican los
microorganismos contienen los nutrientes necesarios para su crecimiento, y se
denominan medios de cultivo, cuyos componentes son muy variados. La eleccin
del medio se basa en el propsito del estudio.
Medios de cultivo sintticos: los medios de cultivo pueden ser sintticos, es decir de
composicin qumica conocida, o pueden ser complejos, en los cuales por lo menos
hay un componente de composicin desconocida.
15

- Medios slidos o lquidos: los medios lquidos se pueden transformar en slidos,

mediante la adicin de agar. Esto significa que conservan la misma frmula nutritiva.
- Medios enriquecidos: en general, los medios son ricos en protenas no especficas,
con el fin de estimular el crecimiento de los microorganismos que se desean aislar.
La mayor parte de los microorganismos requieren un medio enriquecido o
suplementado por susbstancias como sangre, suero, vitaminas, etc.
- Medios selectivos: los medios de cultivo adems de nutrientes y agua pueden
contener sustancias inhibidoras de ciertos grupos microbianos, sin interferir con
otros, conviertindose en medios selectivos. Cuando la muestra procede de una
parte del cuerpo que contiene microorganismos de la flora normal, el desarrollo de
stos es inconveniente y puede inhibir a los microorganismos patgenos, por lo que
el especimen debe sembrarse en un medio que los inhiba y permita el desarrollo del
patgeno. Estos medios son complejos y altamente selectivos para ciertos
organismos. Por ej: el de Shigella-Salmonella agar (SS), el citrato-desoxicolato-agar
y el sulfito de bismuto-agar, inhiben el crecimiento de la mayora de los coliformes y
permite el desarrollo de patgenos entricos. El agar-sangre-alcohol feniletil, es
selectivo para el aislamiento de cocos grampositivos positivos a partir de
especmenes contaminados con organismos gramnegativos, los cuales crecen en
colonias muy pequeitas. Los medios con telurito de potasio y con suero o sangre
favorecen el aislamiento de Corynebacterium, mientras que inhiben todos los cocos
grampositivos comunes en las muestras. En sal-manitol-agar las colonias de
Staphylococcus patgenos crecen con un halo amarillo.
- Medios diferenciales: adems de la frmula nutritiva, la adicin de algunas
sustancias indicadoras al medio, los convierte en medios diferenciales, debido a que
permiten el desarrollo de las bacterias con una apariencia colonial distintiva, segn la
especie. En virtud de la composicin qumica de estos medios, se pueden
caracterizar ciertos gneros bacterianos por la apariencia colonial distintiva en el
medio, por ejemplo, el medio Agar-eosina-azul de metileno (EMB) y el agarMacConkey contienen lactosa y un colorante o un indicador de pH. Las colonias
fermentadoras de lactosa y productoras de aldehdo, producen colonias de un color
especial.
16

- Medios para identificacin de las bacterias: contienen sustratos especficos de

prueba, para diferenciar unas especies de otras, en base a su capacidad enzimtica.
Cada especie se presenta un equipo enzimtico caracterstico de su especie.
- Medios con antibiticos: son inhibitorios para unos organismos, permitiendo aislar a
otros, a partir de una poblacin mixta. Por ejemplo, agar-Sabouraud con
cicloheximida y cloranfenicol, permite el crecimiento de hongos dermatofitos y de la
mayora de hongos patgenos, e inhibe a los hongos saprfitos y a las bacterias.
- Medios de mantenimiento: contienen los requerimientos necesarios para conservar
las cepas bacterianas puras en el laboratorio, haciendo resiembras peridicas.
- Otros medios especiales: son utilizados para permitir el crecimiento de grupos poco
comunes de bacterias, como los anaerobios, Mycobacterium, Mycoplasma, etc.
- Bacterias no-cultivables: existe una pequea cantidad de bacterias de diferentes
grupos que no se pueden cultivar en ninguno de los medios conocidos hasta
ahora, como los gneros Rickettsia, Chlamydia, Mycobacterium leprae, y
Treponema palidum.
- Inculo: El material bacteriano que se inocula en el medio de cultivo se denomina
inculo.
- Cultivo: Una vez que los microorganismos se desarrollan en el medio, el resultado
es un cultivo.
- Medio en placa: es un medio solidificado adicionado de agar, contenido en una caja
de Petri.
- Aislamiento de bacterias en placa, estra en placa (rayado ): Cuando se inocula un
medio solidificado adicionado de agar, contenido en una caja de Petri (en placa), las
bacterias pueden esparcirse en la superficie, mediante una tcnica de rayado
(estriado) con el asa, en tal forma que las clulas queden separadas individualmente,
lejos unas de otras. Durante la incubacin, cada clula bacteriana se reproduce tan
rpidamente, que en 18 a 24 hs se producen masas bacterianas visibles a simple
vista, denominadas colonias.
- Colonia bacteriana: Cada colonia presumiblemente procede de una bacteria
progenitora, cuyos individuos son de una sola especie.

17

- Cultivo puro: Una colonia que se desarroll separada de las otras, al ser transferida
a un medio de cultivo nuevo, dar lugar a un cultivo puro, es decir con individuos de
una sola especie.
MATERIALES Y MTODOS.
I. TCNICA PARA QUEMAR EL ASA BACTERIOLGICA, EN LA FLAMA.
1. Antes de iniciar la siembra de bacterias, se debe aprender a quemar el asa
bacteriolgica con el fin de no contaminarse con las bacterias. El asa
bacteriolgica es la herramienta para transferir los microorganismos de un
recipiente a otro.
2. Para ello, introduzca el anillo del asa en el centro de la flama del mechero,
donde hay el mnimo calor, manteniendo el mango inclinado, para que se
caliente el anillo pero sin quemarse, mientras que se pone al rojo vivo solo el
resto del alambre; enseguida lentamente retire el anillo hacia la superficie de la
flama, y queme, esperando que se ponga al rojo vivo. En ese momento retire el
anillo fuera de la flama, pero manteniendo el asa dentro del crculo de
esterilidad, creado durante la combustin del aire; sienta el aire caliente con la
mano, dentro de la zona estril. No agite el asa para no romper el rea de
esterilidad y espere un minuto para que se enfre el alambre.
3. Entre cada siembra de los diferentes medios, y las diferentes bacterias se debe
quemar el asa en la misma forma que se describi anteriormente, para prevenir
el chisporroteo a la cara, de las bacterias que an quedaron en el asa, de la
siembra anterior. Esta tcnica para quemar el asa, servir de proteccin para
evitar contaminarse y debe hacerse un hbito antes y despus de cada siembra.
4. Los recipientes que contienen las bacterias, solo deben abrirse dentro del rea
de esterilidad, para evitar que se contaminen con las bacterias del ambiente
II. AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR LA TCNICA DE ESTRA CRUZADA
1. Siembre placas por separado de medio tripticasa-agar-soya o de agar-nutritivo,
con cultivos puros de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Streptococcus
18

pyogenes. Para lograrlo, desarrolle el mtodo de siembra de la estra cruzada en

placa, girando la caja al ir rayando hasta formar un pentgono, siguiendo las
indicaciones del profesor, con el fin de ir diluyendo el inculo. Al final de la
siembra las bacterias quedarn bien separadas unas de otras.
2. Siembre una mezcla de todas las bacterias en una placa del mismo medio y con
la misma tcnica e invierta todas las placas, es decir con la tapa hacia abajo
para evitar que el vapor acumulado en la tapa escurra convertido en agua. Incube
a 37C, durante 24 hs.
3. Saque las placas de la incubadora y observe el crecimiento bacteriano.
Determine y anote los errores efectuados en la siembra, cuando no se obtuvo la
separacin de las colonias.
4. Note las diferencias entre las colonias, segn la especie bacteriana. Haga una
tabla de caractersticas morfolgicas con los datos observados, para cada
bacteria, tomando en cuenta dimetro aproximado, color, transparencia, brillo,
elevacin pigmentos difusibles en el medio, etc.

Estra cruzada

III. CULTIVO EN MEDIO LQUIDO.

19

1.

Siembre las mismas bacterias, en tubos con caldo-tripticasa-soya inoculando

una asada de la bacteria. Deje un tubo testigo sin inocular.

2. Incube todos los tubos sembrados a 37 C por 24 hs.

3. Saque de la incubadora sin agitar los tubos. Note una turbidez, un sedimento,
una pelcula superficial, o combinados.
4. Deduzca la causa por la que no se forman colonias en medio lquido y por qu
no se aislan las bacterias. Anote detalladamente sus resultados en todos los
experimentos. Compare sus resultados personales con los de los otros equipos.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.
Anote detalladamente todos los resultados observados y discuta para saber si se
logr el objetivo de cada experimento desarrollado.
Cuestionario.
1. Cul es la importancia de las caractersticas coloniales bacterianas.

PRCTICA 3
ESTUDIO MICROSCPICO DE LAS BACTERIAS
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Desarrollar las tcnicas microscpicas comunes para observar, teir y medir a las
bacterias y sus estructuras.
INTRODUCCIN
El tamao tan pequeo de las bacterias no permite observarlas a simple vista, ya
que su promedio oscila entre 0.5 a 2.0 micrmetros (m) de dimetro. En cuanto
a su forma, las bacterias se agrupan en tres tipos principales: bacilos, cocos,
curvos o helicoidales. Los extremos de los bacilos pueden ser redondos,
angulares o agudos y pueden ser mviles o inmviles. Las bacterias esfricas
(cocos) pueden presentarse solas, en pares, en tetradas, en cadenas o

en

racimos. Los bacilos tambin pueden agruparse en dos o en cadenas.

20

Las caractersticas morfolgicas de las bacterias se pueden apreciar mediante

tcnicas microscpicas, ya sea en su estado vivo o muerto. Las ventajas del
estudio directo al microscopio de clulas vivas en referencia a su forma,
disposicin y tamaos naturales, han sido antagonizadas por el hecho de que, el
ndice de refraccin del protoplasma de los microbios se acerca al del agua y por
ello, las clulas y sus estructuras no pueden diferenciarse en forma neta entre s,
ni del lquido en que estn includas. El estudio microscpico de las bacterias se
facilita notablemente al tratarlas con colorantes o tintes, aprecindose su forma y
tamao.
- Preparacin en fresco: Permite observar en los microorganismos la movilidad, el
color, el tamao, la forma

y la agrupacin en su forma natural viva y sin

alteraciones. Sin embargo, la observacin es difcil debido al escaso contraste,

por la poca diferencia

entre el ndice de refraccin del medio y de los

microorganismos. Este problema se resuelve utilizando el microscopio de campo

oscuro y el de contraste de fases.
Una forma de preparacin en fresco es la Preparacin en portaobjetos normal con
cubreobjetos. Otra forma es la Preparacin en gota suspendida. Se utiliza un
portaobjetos excavado y un cubreobjetos.
- Tincin de bacterias: Las clulas microbianas se pueden teir, mediante la
utilizacin de un solo colorante, o la combinacin de dos o ms. Algunas de estas
tcnicas permiten la demostracin de estructuras especficas como cpsula,
flagelos, esporas, etc. Otras tien selectivamente bacterias de un grupo
especfico.
- Tincin simple o directa: Tien homogneamente la clula y solo utilizan un
colorante, que puede ser azul de metileno, safranina, cristal violeta, etc.
- Tincin compuesta o diferencial: Requiere combinaciones de dos o ms
colorantes, como en la tcnica de Gram, la de Ziehl Neelsen, tincin de esporas,
otras.
- Tinciones negativas: En realidad no colorean los microorganismos, se limitan a
depositarse en el campo del rededor, delimitando las clulas.

21

MATERIALES Y MTODOS
I. PREPARACIN EN FRESCO.
1. En este tipo de preparacin se perdern varios detalles de las bacterias.
2. Para el montaje en gota suspendida, extienda un poco de vaselina con un
palillo, alrededor de la concavidad de un portaobjetos excavados. Se puede
improvisar la excavacin en el portaobjetos, adhiriendo un crculo de plstico
grueso de aproximadamente 1 cm de dim, tambin con vaselina en el borde.
3. A continuacin, coloque en el centro de un cubreobjetos una gota de solucin
salina fisiolgica y suspenda en ella un poco de placa dental, obtenida con un
palillo. No extienda la gota y sobre ella acomode cuidadosamente la excavacin
del portaobjetos, de tal forma que permita la adhesin entre porta y cubre.
4. Invierta el portaobjetos con el cubreobjetos encima y observe al microscopio a
10 X y posteriormente a 40 X.
5. Haga dibujos de lo observado. Detalle la forma, agrupacin, color, movilidad,
etc.
6. Al terminar, haga una preparacin en fresco en un portaobjetos normal,
colocando una gota de solucin salina fisiolgica y suspenda en ella un poco de
placa dental, monte con un cubreobjetos y observe al microscopio a 10 y a 40 X.
7. Comprare las observaciones en ambos casos y anote los detalles de las
clulas, sobre todo la movilidad. Diga si pudo observar la forma de las clulas y su
agrupacin. Haga dibujos.
II. ELABORACIN DE FROTIS BACTERIANOS (ANTES DE LA TINCIN).
Utilice adems de la placa dental, algunos cultivos puros de bacterias como
Staphylococcus aureus, Escherichia coli

Bacillus subtilis de 24 horas, para

esta tcnica.
1. Una gota de suspensin de placa dental extindala en en el centro de un
portaobjetos y djela secar a temperatura ambiente. Haga lo mismo con las
cepas puras.
2. Queme el asa al rojo vivo en la flama del mechero y djela enfriar en el rea de
esterilidad.
22

3. Coloque una gotita de agua destilada con el asa, en el centro de un

portaobjetos. Queme el asa y djela enfriar.
4. A continuacin abra junto al mechero un tubo con cultivo bacteriano en medio
slido y tome una poca de la masa bacteriana de la superficie, para hacer una
suspensin de bacterias en la gotita del porta.
5. Enseguida extienda la gota con el asa para hacer un frote. Queme el asa.
6. Deje secar el frote al aire libre.
7. Fije todas las preparaciones con calor, pasndolas tres veces sobre la flama del
mechero en forma rpida.
III. TINCION DE GRAM (tincin diferencial)
Esta tincin separa las bacterias en dos grandes grupos, las gram-positivo que
retienen el primer colorante usado (cristal violeta) y las gram-negativo que se
tien con el segundo colorante (safranina). Estas diferencias estn basadas en la
estructura y composicin qumica de la pared celular. Las gram positivas tienen
una pared gruesa de pptidoglicano y adems, muchas de estas especies
presentan cidos teicoicos en la pared.
Las gram negativas contienen menos pptidoglicano y su capa es mucho ms
delgada, pero que est rodeada de una bicapa ms externa de lpidos, llamada
membrana externa.
Los mejores resultados se obtienen utilizando cultivos jvenes de bacterias, no
mayores de 24-48 hs, pues de lo contrario los resultados son ambiguos. La pared
celular es daada en las clulas viejas.
1. Tia los frotes previamente preparados y fijados en el punto II.
2. Cbralos con cristal violeta durante un minuto y enjuague con agua.
3. Cubra con lugol durante un minuto y lave con agua.
4. Decolore con alcohol-acetona unos segundos y lave con agua.
5. Cubra con safranina medio minuto y lave con agua.
6. Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 X y despus a100 X con
aceite de inmersin.

23

7. Las bacterias teidas de rojo se consideran gram-negativo; las de morado,

gram-positivo.
8. Note las diferencias en la observacin de las diferentes bacterias teidas.

pared gram-negativo

pared gram-positivo

IV. TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN (CIDO-ALCOHOL-RESISTENTE)

Por este procedimiento se distinguen los gneros Mycobacterium y Nocardia de
cualquier otra bacteria, debido a retienen el primer colorante (rojo de la fuchsina),
por lo que son llamadas bacterias cido-alcohol-resistentes. Las bacterias nocido- alcohol-resistentes se tien de azul. Esto es debido a que Mycobacterium y
Nocardia usualmente presentan un alto contenido de lpidos, hasta 60 % del peso
de la pared, lo que hace difcil la tincin, debido a que los iones del colorante no
penetran rpido a travs de las capas de lpidos. Para facilitar la entrada del
colorante se calienta; una vez teidas, es difcil su decoloracin.
1. Haga un frote con Nocardia sp. y otro con Mycobacterium sp. y djelos secar al
aire libre y fjelo con calor.
2. Coloque encima un pequeo rectngulo de papel filtro (2 x 3 cm).
3. Aplique unas gotas de carbol-fucsina sobre el papel, para humedecerlo bien y
deje actuar 5 min, calentando la preparacin por el reverso cuidadosamente hasta

24

emisin de

vapores, sin permitir la ebullicin. No deje secar el colorante,

aplicando ms, si lo requiere.

4. Retire el papel con una pinza y enjuague con agua y escurra.
5. Decolore con alcohol cido, uno a dos min. y lave con agua.
6. Cubra con azul de metileno por 1-2 min y lave con agua corriente.
7. Deje secar y observe al microscopio a 10 X y despu a 100 X.
8. Las bacterias teidas de rojo se consideran bacterias cido-alcohol-resistentes
(BAAR).
9. Las azules son no-cido-alcohol-resistentes.
V. TINCIN NEGATIVA DE CPSULA
La cpsula es una capa gruesa de polisacrido (ocasionalmente de polipptido),
ms externa a la pared celular, que rodea a la bacteria y est adherida a ella. Sus
dos funciones principales son favorecer su adhesin a las superficies y protegerla
de los predadores. Por ejemplo Streptococcus mutans, productor de una gran
cpsula, es uno de los iniciadores de la caries dental, debido a su capacidad para
adherirse a los dientes y sus cidos que degradan el esmalte dental. La bacteria
Streptococcus pneumoniae

ataca el pulmn, causando pneumona cuando es

capsulado, pero no causa enfermedad cuando pierde la cpsula, debido a que es

fcilmente fagocitado por los macrfagos. La cpsula es difcil de teir con los
colorantes, por lo que se recurre a tinciones negativas. El campo del rededor se
tie con un colorante cido, mientras que la clula se tie con un colorante bsico
de otro color. En estas condiciones se observa un rea brillante translcida sin
colorante, alrededor de la clula.
1. En el extremo de un portaobjetos coloque una gota de suspensin bacteriana
en agua de

Streptococcus mutans y en otro coloque

Klebsiella pneumoniae

(cultivos de 24-48 hs).

2. Adicione a la gota de bacterias una gota de tinta china y mezcle con el asa.
3. Con otro portaobjetos extienda la preparacin a partir de la gota, formando una
pelcula a lo largo del portaobjetos. Deje secar al aire libre. No se requiere fijar
con calor.
25

4. Cubra la preparacin con safranina por un minuto y lave con agua rpidamente
y con mucho cuidado, para no despegar la preparacin.
5. Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 X y despus a 100 X
VI. TINCIN DE ENDOSPORAS BACTERIANAS.
Ciertos gneros de bacterias como Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum,
Sporolactobacillus, Thermoactinomyces y Sporosarcina,

producen endosporas,

estructuras no reproductivas, resistentes a las condiciones ambientales adversas,

as como al calor y a los compuestos qumicos. Cada clula da una espora y cada
espora da una clula.
En condiciones favorables las bacterias se reproducen normalmente por fisin
binaria, y al volverse desfavorables, esporulan. Se tien pobremente, aunque
pueden teirse mejor usando colorantes calientes para que penetren.
1. Prepare un frote con Bacillus sp. (Utilice un cultivo de Bacillus sp. de 48 hs,
con el fin de que haya esporulado). Deje secar al aire libre y fjelo con calor.
3. Cubra la preparacin con verde de malaquita en solucin acuosa de fenol.
4. Caliente a emisin de vapores durante 5 min. No permita que ebulla. Si
empieza a secar adicione ms colorante.
5. Deje enfriar y lave. Tia con safranina 60 seg. y lave con agua. Deje secar.
Observe a 10X y despus a 100X.
6. Haga dibujos detallados en cada una de las observaciones microscpicas, con
detalles de la forma, color, nombres de las estructuras, etc. En cada caso
anote el nombre completo de la bacteria observada y la interpretacin de la
tcnica utilizada. Discuta sus resultados en base a los datos de la literatura.

26

T. endosporas

T. cpsula

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

Anote detalladamente todos los resultados observados y discuta para concluir si
se cumpli el objetivo en todos los experimentos.

Cuestionario.
1. Explique el mecanismo qumico de la tincin de Gram, refiriendo la reaccin
entre los reactivos y los componentes de la pared celular.
2. Explique el mecanismo qumico de la reaccin de Ziehl-Neelsen.
3. Cmo funciona la tincin en el experimento de la cpsula

PRCTICA 4
CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS
OBJETIVO DE LA PRCTICA.
Desarrollo de tcnicas de laboratorio para comprender la diferencia entre
esterilizacin y desinfeccin y determinar el efecto de diferentes agentes fsicos y
qumicos, sobre los microorganismos.
INTRODUCCIN
Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por agentes
fsicos, procesos fsicos o agentes qumicos.
- Esterilizacin: En los mtodos de esterilizacin queda implcita la destruccin total
de todas las formas de vida. La esterilizacin y la incineracin los conducen a la
muerte.

27

- Desinfeccin: Con estos mtodos no se logra la destruccin total de los

organismos.
- Agente fsico: Es una condicin fsica o propiedad fsica que causa un cambio. La
temperatura, la presin y la radiacin son ejemplos de agentes fsicos que actan
sobre los microorganismos. Mediante los procesos fsicos se causan cambios en los
microorganismos,
- Filtracin: Los filtros retienen y separan los microorganismos del lquido filtrado.
- Higienizacin: por ejemplo el lavado, desprende las clulas de los materiales.
- Agente qumico: Es una sustancia (slido, lquido o gas) que se caracteriza por
una composicin molecular definida y que causa una reaccin en los
microorganismos, por ejemplo los compuestos fenlicos, los alcoholes, el cloro, el
yodo y el xido de etileno. Dependiendo de la concentracin y del tiempo de
exposicin, los daa o los mata.

MATERIALES Y MTODOS.
I. FACTORES FSICOS.
- EFECTO DEL CALOR SOBRE LA VIABILIDAD BACTERIANA
1. Para iniciar el experimento se contar con un cultivo lquido de E. coli y uno de
Bacillus subtilis. Enseguida siembre con una de las bacterias la mitad de una placa
de agar nutritivo por estra contnua cerrada. En otra caja siembre la mitad con la
segunda bacteria.
2. A continuacin coloque los frascos de los cultivos lquidos en un bao Mara a 70
o

C por 10 min y despus squelos.

3. Enseguida, con cada uno de los cultivos calentados siembre la otra mitad de
cada placa.
4. Incube las placas sembradas a 37 oC por 24 hs. Compare la abundancia del
crecimiento en las cajas sembradas, antes y despus de calentar.
28

- ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO COMBINADO CON PRESIN.

En este mtodo se utiliza un autoclave. Para preparar un medio de cultivo pese la
cantidad adecuada, siguiendo las instrucciones de la etiqueta del proveedor, para
100 mL.
1.

Deposite el medio en el fondo de un matraz de 250 mL y adicione 100 mL de

agua destilada. Tapone con algodn y coloque encima un gorro de papel.

2. Esterilice en el autoclave a 121 C y 15 libras de presin, durante 15 min,

siguiendo las indicaciones del profesor. Deje un medio control sin esterilizar.
Posteriormente, mantenga los 2 matraces a temperatura ambiente. Compare
los resultados despus de 24 hs y explique lo sucedido. Analice los resultados
de la esterilizacin y saque conclusiones.
- EFECTIVIDAD DEL LAVADO DE MANOS CON DETERGENTE.
1. Un primer estudiante se vaca unas gotas de suspensin de suelo (1 gr de suelo
fresco en 9 ml de agua estril), en la palma de la mano derecha y hace que se
extiendan en toda la superficie de la palma Un segundo estudiante le saluda de
mano al 1er estudiante. Un tercer estudiante le saluda al segundo y un cuarto al
tercero (todos los estudiantes usan la mano derecha).
2. Con un hisopo estril humedecido en s.s.f. estril, se frota la mitad de la palma
de la mano y se descarga el inculo en la mitad de una placa de Tripticasa agar
soya. Se repite la operacin con el segundo estudiante y se siembra en la mitad
de otra placa nueva de tripticasa soya agar y as sucesivamente con los otros
estudiantes.
3. Que todos los estudiantes se laven la mano con detergente y se enjuaguen con
agua estril. Enseguida se repite el muestreo de la misma mano con un hisopo
esteril (ahora no se requiere humedecerlo), y se siembra la mitad de la placa
que qued sin sembrar,
4. Incube todas las placas a temperatura ambiente por 48 hs. Compare los
resultados de las siembras de manos sin lavar y manos lavadas. Note si hubo
diferencias en la cantidad de bacterias desarrolladas en cada caso.
29

5. Otros estudiantes pueden modificar el experimento usando jabn bactericida o

jabn antisptico, etc.
II. FACTORES QUMICOS.
-

ACTIVIDAD

BACTERIOSTTICA

BACTERICIDA

DE

ALGUNOS

COMPUESTOS:
1. Siembre la superficie de una placa totalmente por medio de un hisopo
impregnado de una suspensin bacteriana de S.aureus. Haga lo mismo en otra
caja con E. coli.
2. Distribuya varios crculos de papel

( 5 crculos por caja) impregnados con

antispticos, limpiadores comerciales y domsticos, colorantes, desinfectantes,

jabones, antibiticos, etc. Deben ser los mismos para las dos bacterias.
3. Incube a 37 oC por 24 hs y mida el radio de inhibicin alrededor de cada crculo
de papel para cada compuesto y compare entre las dos bacterias probadas.
Determine si hay diferencias en el efecto del mismo compuesto para las dos
bacterias.
4. En una placa sembrada con una bacteria coloque algunas monedas de plata y
de cobre. Determine la inhibicin alrededor de las monedas.
5. Forme una tabla con los datos del halo de inhibicin medido en mm para hacer
las comparaciones.
6. Anote detalladamente los resultados en cada experimento e interprete los
resultados.

Halos de inhibicin del crecimiento bacteriano.

30

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

PRCTICA 5
MICROFLORA DE LA PLACA DENTAL
OBJETIVO DE LA PRCTICA.
Conocer la microflora de la placa dental humana y comprobar su presencia en los
dientes.
INTRODUCCIN.
La placa dental es un depsito de material suave que se acumula en los dientes y
puede definirse como una comunidad microbiana compleja con ms de

10 16

bacterias por mg, pudiendo encontrarse hasta 400 especies bacterianas

diferentes. Adicionalmente a las bacterias, la placa contiene un pequeo nmero
de clulas epiteliales, leucocitos y macrfagos. Las clulas estn contenidas
dentro de una matriz extracelular formada a partir de productos bacterianos y
31

saliva. La matriz extracelular contiene protenas, polisacridos y lpidos; tambin

contiene componentes inorgnicos, mismos que se incrementan con el desarrollo
de clculos al calcificarse la placa dental, los cuales se observan como material
duro, dando aspecto de una superficie rugosa en la corona y raz del diente, son
fcilmente colonizados por la placa.
La placa dental pude ser supragingival o subgingival, basada en su relacin con el
margen gingival. La placa ha sido clasificada de acuerdo a su asociacin con
estado de enfermedad, o no-asociada con enfermedad, es decir, segn haya
enfermedad o no, con diferencias en su composicin microbiana.
La superficie limpia de los dientes (despus de la profilaxis) es colonizada
primeramente por bacterias gram-positivas, como

Streptococcus sanguis,

Streptococcus

Molculas

mutans,

Actinomyces

viscosus.

superficiales

bacterianas (como la fimbria) interactan con los componentes de la pelcula

dental y permiten a la bacteria adherirse a la superficie del diente. Despus de la
colonizacin inicial de la superficie dental la placa

se incrementa por dos

mecanismos diferentes, ya sea por multiplicacin de las bacterias adheridas a la

superficie dental o por adhesin subsecuente y multiplicacin de nuevas especies
bacterianas a la masa de la placa. Los colonizadores secundarios incluyen
especies gram-negativas como Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia y
Capnocytophaga, observndose tres dias despus)

Estas especies presentan

gran habilidad para adherirse a especies de los gram positivos ya presentes en la

masa de la placa. Los organismos pueden observarse bien uno a tres das
despus de su acumulacin. Despus de una semana de acumulacin otras
especies gram-negativas se presentan, siendo consideradas como terciarias e
incluyen a Porphyromonas gingivalis, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens,
Actinobacillus actinomycetemcomitans y espiroquetas orales como (Treponema
sp.).
Estudios de la placa a partir de individuos sanos o enfermos y examinados
microscpicamente o por cultivo, han demostrado varias diferencias de las
poblaciones

microbianas de los sanos con respecto a los enfermos. Se han

32

observado diferentes tipos morfolgicos (morfotipos) de bacterias. Por ejemplo, en

un Gram de placa madura subgingival se pueden ver diferentes morfotipos de
de bacterias de cocos,bacilos, filamentos y espiroquetas, revelando un incremento
de bacilos mviles y espiroquetas en gingivitis y periodontitis, en comparacin con
los de individuos sin gingivitis. La principal limitacin para este tipo de estudios
referentes a los morfotipos bacterianos es que muchos de los microorganismos
presentes asociados con enfermedad son indistinguibles de los no-asociados
con enfermedad, tal es el caso de Streptococcus sp. y Porphyromonas gingivalis.
Sin embargo, el porcentaje de bacilos y cocos gram-positivos en la placa asociada
con gingivitis, es mayor, en comparacin con el de placa no-asociada-con
enfermedad. Similarmente, el porcentaje de bacterias gram-negativas anaerobias
se incrementa grandemente en la gingivitis y en la periodontitis

PRINCIPALES ESPECIES BACTERIANAS DE LA PLACA DENTAL

Gram-Positivas

Facultativas
Streptococcus mutans

Gram-negativas

Streptococcus sanguis

Anaerobias

Actinomyces viscosus
Actinobacillus
Espiroquetas

actinomycetemcomitans
Capnocytophypa sp
Eikenella corrodens

Porphyromonas gingivalis
Fusobacterium nucleatum
Prevotella intermedia
Bacteroides forsythus
Campylobacter rectus
Treponema denticola
(Otros Treponemas)

Microorganismos Periodontales: A partir de los 70s hubo muchos refinamientos

taxonmicos en esta microbiologa periodontal. La siguiente tabla puede servir
como gua en estos aspectos.
33

Reclasificacin de las bacterias periodontales

Clasificacin antigua
Bacteroides gingivalis
Bacteroides endodontalis
Bacteroides intermedius
Bacteroides melaninogenicus
Bacteroides denticola
Bacteroides loescheii
Wolinella recta
Wolinella curva

Nueva Clasificacin
Porphyromonas gingivalis
Porphyromonas endodontalis
Prevotella intermedia
Prevotella melaninogenica
Prevotella denticola
Prevotella loescheii
Campylobacter rectus
Camplyobacter curvus

MATERIALES Y MTODOS
I. AISLAMIENTO DE BACTERIAS DE LA FLORA DE PLACA DENTAL.
Cada equipo de alumnos debe trabajar con dos muestras de placa dental:
a) Muestra de placa dental de un paciente que no se ha aseado la boca en tres
semanas
b) Muestra de placa dental de un paciente con profilaxis unas horas antes.
1. Siembre las dos muestras de la placa dental en suspensin, individualmente en
dos placas de agar tripticasa soya, por estra cruzada.
2. Siembre otras dos placas de agar-sangre de cada muestra en la misma forma.
3. Incube una placa de cada medio en aerobiosis y las otras en anaerobiosis, a
35 oC durante 24 hs a 48 hs.
4. Describa las diferentes clases de colonias desarrolladas, tanto en aerobiosis
como en anaerobiosis, determinando la forma, agrupacin y respuesta al Gram,
trate de ubicar a cada bacteria en un posible gnero bacteriano de los reportados
en la placa dental.
II. TINCIN DE GRAM.

34

1. Haga un Gram de cada muestra de placa dental. Observe a 100 X. Haga

dibujos.
2. Note la presencia de una gran variedad de formas bacterianas, cocos, bacilos,
filamentos, as como clulas eucariticas del husped.
3. Haga comparaciones de lo observado, y concluya.

RESULTADOS DISCUSIN Y CONCLUSIONES

PRCTICA 6
COCOS GRAM-POSITIVO
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Aprender a aislar e identificar los cocos grampositivos.
INTRODUCCIN
El tracto respiratorio superior es rico en microorganismos de la flora normal,
incluyendo estreptococos, estafilococos, neiserias, difteroides, levaduras y bacilos
entricos Gramnegativos. Los cocos grampositivos patgenos se aislan en agar
enriquecido y suplementado con sangre de carnero. Algunas especies presentan
capacidad hemoltica, parcial (alfa hemlisis) o total (beta hemlisis)
El gnero Staphylococcus se separa de otros cocos grampositivos por sus
propiedades microscpicas, morfolgicas coloniales y bioqumicas. S. aureus es
causante de un gran nmero de enfermedades, incluyendo infecciones de heridas.
Es el nico coagulasa positivo y forma grandes colonias cremosas y frecuentemente
con pigmentacin amarilla si se incuba a temperatura ambiente y es beta
35

hemoltico. Es muy resistente a la accin del calor, luz, desecacin, temperaturas

extremas, agentes qumicos, sobrevive semanas o meses en el polvo, pus o esputo.
Es altamente tolerante a altas concentraciones de sales, sobreviviendo en alimentos
preservados. En sal-manitol desarrolla colonias amarillas de 3mm y vira el indicador
del pH a amarillo. Es resistente a la penicilina. Antignicamente, los estreptococos
presentan 13 grupos (clasificacin de Lancefield) en base al carbohidrato C de la
pared celular y son denomminados de la A a la O.
Los estreptococos del grupo A, tambin denominados Streptococcus pyogenes
forman colonias de 1-2 mm, sin color, muy transparentes, beta hemolticas y son los
ms virulentos. La protena M es el principal antgeno en las cepas virulentas. Son
sensibles a la Bacitracina. Causan infecciones faringeas y de heridas. Sobreviven
semanas en esputo u otras excretas y meses en sangre o pus. Streptococcus
mutans est asociado con caries dental.
Los estreptococos del grupo B incluyen a S. agalatiae y dan la prueba de CAMP
positiva: una hemlisis marcada en forma de punta de flecha en el punto de unin
de su crecimiento con S. aureus.
Streptococcus

pneumoniae

(Diplococcus

pneumoniae)

es

conocido

como

neumococo y causa pneumona. Desarrolla colonias de 1-3 mm, apigmentadas,

alfa hemolticas en condiciones aerobias y beta hemolticas en anaerobiosis. Las
cepas virulentas dan colonias mucoides debido a que presentan una gran cpsula,
lo que constituye su factor de virulencia. Es difcil de mantener en las resiembras.
Es sensible a la Optoquina.
MATERIALES Y MTODOS
I. DETERMINACIN DE PORTADORES DE STAPHYLOCOCCCUS AUREUS.

36

1.

Tome un exudado nasofarngeo de un compaero con un hisopo estril en la

forma tradicional y deposite la muestra en el extremo de una placa de agar
sangre. Extienda el inculo con un asa por estra cruzada. El resto de la muestra
que qued en el hisopo depostelo en un portaobjetos y haga un frotis. Tia con
gram y determine cules bacterias predominan. Cada estudiante deber seguir
el proceso de su propia muestra.

2.

Siembre

cepas

puras

en

agar

sangre

de

Streptococcus

pyogenes

Staphylococcus aureus, y Streptococcus mutans. Incube a 37 C por 24 hs.

Haga un Gram de las cepas puras y observe al microscopio.
3.

Determine en todas las placas de gelosa sangre sembradas, cules colonias

produjeron hemlisis y de qu tipo (alfa o beta). Compare las cepas tipo con
las de las muestras.

4.

Haga un gram de las colonias diferentes de las muestras.

5.

Haga la siguientes pruebas para la cepa pura de S. aureus y las colonias

semejantes a S. aureus desarrolladas en las muestras, adems de observar
que es beta hemoltica:

6.

Prueba de la catalasa. Tome una colonia bien aislada con el asa estril y
sumrjala en una gota de agua oxigenada en un portaobjetos. Observe una
efervescencia por desprendimiento del O2

7.

Prueba de la coagulasa: Con el asa estril obtenga una colonia beta hemoltica
bien aislada y mzclela con 0.5 ml de plasma. Incube a 37 C por 30 min. y lea el
resultado. Si hay coagulacin del plasma, es coagulasa positivo.

8.

Cultivo en medio sal-manitol. Tome con el asa estril una colonia bien aislada,
beta hemoltica y simbrela en una placa de sal-manitol-agar por estra cruzada.
Incube

a 37 C durante 24 hs. Observe el desarrollo de colonias color dorado y

el cambio de color del medio a amarillo, por fermentacin de la lactosa y

acidificacin.
9.

Estudio de S. pyogenes (estreptococos del gpo. A): Siembre la cepa tipo en agar
sangre y observe su beta-hemlisis. Elija colonias semejantes en la caja donde
sembr el exudado. Practique la prueba de sensibilidad a la Bacitracina,
sembrando una colonia bien aislada en un cuadrante de una placa de tripticasa37

soya-agar y coloque un crculo de papel filtro impregnado con Bacitracina. En

otra parte del mismo cuadrante sembrado, coloque un crculo impregnado con
Trimetroprin para determinar su resistencia. Incube a 37 C por 24 hs. Determine
el dimetro del halo de inibicin alrededor de cada antibitico para determinar la
sensibilidad.
10.

En todos los experimentos compare los resultados de las cepas tipo con los de
las muestras.

11.

En todos los En todos los En el otro sector de la caja , coloque un crculo

impregnado con Trimetroprim para determinar su resistencia. Incube a 37 C por
24 hs. Determine el dimetro del halo de inhibicin alrededor de cada antibitico
para determinar la sensibilidad.

12.

Para la identificacin del estreptococo beta hemoltico del grupo B

(Streptococcus agalactiae), realice la prueba de CAMP:
Tome una colonia beta hemoltica con el asa y simbrela en una sola lnea
perpendicular a otra lnea previamente sembrada con S. aureus. Incube a 37 C
por 24 hs. Determine si hubo hemlisis en forma de punta de flecha, en el lugar
donde se unen las dos bacterias.

13.

Para identificar Streptococcus pneumoniae y en las colonias semejantes

determine su susceptibilidad a la optoquina, colocando un crculo de papel
impregnado con el antibitico en un medio con agar-sangre donde se sembr la
bacteria. Incube a 37 C por 24 hs. Mida el halo de inhibicin para determinar la
sensibilidad:

Prueba de Camp

Prueba de Bacitracina, Optoquina y Camp

38

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

Cuestionario.
1. Investigue en la literatura el significado de los portadores de S. aureus y el
riesgo en las prcticas odontolgicas.
2. Investigue la importancia de S. pyogenes presente en la cavidad oral.

PRCTICA 7
ESTREPTOCOCOS ORALES
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Conocer las diferentes clases de estreptococos de la cavidad oral y las especies
patgenas.

39

INTRODUCCIN
Los estreptococos facultativos constituyen el grupo ms grande de bacterias
aisladas de la cavidad oral. Comprenden casi el 50 % de los organismos
aislados de la placa dental y del sulcus gingival. Los estreptococos ms
abundantes son los alfa-hemolticos (Viridans). Los Gamma-hemolticos
usualmente se encuentran en pequeas cantidades. Los beta-hemolticos
estn frecuentemente presentes en pequeo nmero o como flora
transitoria de la orofaringe y raras veces producen infecciones en la
cavidad oral. Se puede comprobar la diferencia de la morfologa colonial
de los estreptococos orales facultativos, creciendo en agar sangre y en
agar-M-S (agar-Mitis-salivarius) el cual contiene colorantes, nutrientes,
sacarosa al 5 % e inhibidores de crecimiento para las bacterias que no
sean estreptococos.
- Streptococcus viridans incluye un grupo de cocos alfa-hemolticos que requieren
atmsfera con 5-10 % de CO2 para su crecimiento. Su nomenclatura an no est
bien clara y algunas cepas se han clasificado como nuevas especies, por ejemplo
Streptococcus mutans, asociado con caries dentales y endocarditis.
- S. mutans es acidognico y acidrico, es decir, produce cidos que pueden
disolver la sustancia de los dientes y sobrevive en pH cido. Los ttulos elevados
de S. mutans estn asociados significativamente con una disminucin en la
concentracin de mucina Mg2 en saliva completa no-estimulada.

40

- S. mutans produce glucanos extracelulares que se adhieren a la superficie de

los dientes. Tambin forma dextranas, un polisacrido extracelular que
puede acumularse en tubos de cultivo de vidrio, formando una masa
gelatinosa. En los pacientes la dextrana se combina con componentes de
la saliva para formar complejos insolubles que se adhieren a la superficie
del diente. La produccin in-vitro de dextrana por S.mutans permite un
anlisis de la placa pura sin interferencia de otros microorganismos
orales ni de saliva.
MATERIALES Y MTODOS
I. Aislamiento de S. mutans.
1. Marque tres tubos conteniendo 5 ml de thioglicolato con las claves 5, 50 y 500.
2. Transfiera 1 mL de una suspensin de placa dental al tubo #5. Mezcle
cuidadosamente.
3. Transfiera 1 mL del tubo #5 al tubo #50. Mezcle.
4. Transfiera 1 mL del tubo #50 al tubo #500. Mezcle.
5. Transfiera 0.1 mL de cada dilucin al extremo de una placa de medio agar-M-S y
mrquelas igual.
6. Use un hisopo estril en cada placa para extender el inculo en la superficie
7. Siembre igualmente 0.1 mL de cada dilucin en placas de agar sangre.
8. Siembre en los mismos medios cepas tipo de Streptococcus mutans,
Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis y Streptococcus sanguis.
9. Incube todas las placas en anaerobiosis a 37 oC por 24 a 48 hs.
II. Identificacin de S. mutans.
1. Examine cada cultivo y compare las colonias de las cepas tipo, determinando
color, forma, tamao, textura, etc.
2. Determine el tipo de hemlisis producida.
3. Desarrolle un Gram para cada cepa tipo y para cada clase diferente de colonias
de la muestra de placa dental. Haga dibujos.
4. Elija las colonias que presenten cocos gram-positivos en cadenas. Compare con
las cepas tipo para ver si alguna especie se parece.
41

5. Las colonias de S. mutans

frecuentemente estn

rodeadas de un rea

gelatinosa clara, constituda por grandes cantidades de dextranas.

6. Compare el nmero de colonias obtenidas de S.mutans en M-S agar con el
nmero en las placas de agar sangre.
III. Produccin de dextranas.
1. Streptococcus mutans (cariognico) y Streptococcus salivarius (no-cariognico)
se inoculan individualmente en tubos de cultivo conteniendo sacarosa al 5 %. En
cada tubo se deja insertado un alambre estril
2. Se incuban a 37 C.
3. Diariamente el alambre de cada tubo se transfiere a un nuevo tubo con caldo
sacarosa al 5 % conteniendo inculo nuevo de las especies respectivas.
4. El experimento se contina por 7 das.
5. Iniciando con el da 1 observe los tubos de cultivo de cada especie de
estreptococos para determinar la produccin de dextranas. Note el incremento de
la cantidad de dextranas cada da.
6. Si las dextranas estn presentes, determine cual especie bacteriana es la
responsable.
7. Registre sus datos usando la siguiente escala:
0 = no hubo produccin de dextranas
(+) = escasas dextranas
Entre (++) y (+++) = moderada produccin de dextranas
(++++) = mximo de dextranas producidas

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES

42

PRCTICA 8
COCOS PIGENOS GRAM-NEGATIVO ORALES

OBJETIVO DE LA PRCTICA.
Conocer y diferenciar las especies de Neisseria y Hemophilus.
INTRODUCCIN
Los organismos pigenos estudiados en este ejercicio son principalmente
patgenos del

tracto respiratorio superior aunque pueden encontrarse en

ausencia de enfermedad en la

nasofaringe. Los gneros

importantes son

Neisseria y Hemophilus.
La familia Neisseriae comprende organismos gram-negativos, cuya mayora son
habitantes del tracto respiratorio superior, no-patgenos. Son cocos agrupados en
parejas con las uniones ligeramente achatadas, lo que les da una apariencia de
frijol. Todos los miembros de esta familia producen la enzyma oxidasa, lo que los
diferencia de otras bacterias gram-negativas (excepto Pseudomonas).
Dos especies de esta familia son importantes patgenos humanos. Neisseria
meningitidis

causa

meningitis

purulenta,

ocasionalmente

en

distribucin

epidmica. Las infeciones debidas a N. gonorrhoeae ltimamente han alcanzado

proporciones epidmicas. Causa una a infeccin venrea primaria y una secuela
posterior a la infeccin inicial, que puede consistir de artritis sptica

endocarditis.
Branhamella sicca, Branhamella flavescens y otros miembros de la familia
Neisseriae son flora normal de la nasofaringe, y tambin pueden ser encontradas
en el tracto genital femenino. Estos usualmente no son patgenos y deben ser
diferenciados de los patgenos en los cultivos tomados de reas contaminadas
con flora normal. Aunque se encuentran colocados en un gnero diferente

43

(Branhamella), estos exhiben reaccin a la tincin de gram, idntica a la de

especies patgenas de Neisseria.
El gnero Hemophilus incluye bacilos Gram-negativo, inmviles, aerobios,
pleomrficos. Estos organismos requieren medios enriquecidos para el aislamiento
primario y todos crecen mejor en presencia de sangre (Hemophilus = amantes de
la sangre). Los factores esenciales para el crecimiento de varias o de todas las
especies de este gnero son el factor-X (termo-stable) identificado como hemina o
hematina, y el V-factor (termo-lbil) factor reemplazable por nicotinamida-adenindinucletido (NAD) o compuestos relacionados.

MATERIALES Y MTODOS

I. DIFERENCIACIN DE ESPECIES DE NEISSERIA.

1. Desarrolle un Gram de cepas puras de Neisseria (patgenas y no-patgenas) y
de Haemophilus.
2. Efecte la prueba de la Oxidasa en los cultivos de Neisseria crecidas en agarsangre, adicionando una gota del reactivo. Observe que las colonias rpidamente
cambian de color a negro (prueba positiva en presencia de la enzyma oxidasa.
3. Siembre las neiserias no-patgenas en medio agar nutritivo y demuestre su
habilidad para crecer a temperatura ambiente (22C).
4. Siembre las neisserias en tubos con medio base para carbohidratos
adicionado de glucosa, maltosa y sacarosa. Determine cules carbohidratos utiliza
cada cepa.

Crecimiento en
ESPECIES
N. gonorrhoeae
B. flavescens
N. meningitidis
B. sicca

UTILIZACION DE CARBOHYDRATOs

Agar Nutritivo

glucosa

maltosa

sacarosa

a 22C
+
+

+
+
+

+
+

44

II. DIFERENCIACIN DE ESPECIES DE HEMOPHILUS.

1. A partir de cultivos de Hemophilus en agar-chocolate, siembre 2 placas de TSA
(Tripticasa soya agar) conteniendo tiras de papel con Factores V y X . Note
que el Haemophilus crece slo donde se encuentran los factores de
crecimiento.

ESPECIES
H. influenzae
H. parainfluenzae

FACTORES DE CRECIMIENTO
Hemin (X factor)
NAD (V factor)
+
+
+

HEMOLISIS
-

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

45

PRCTICA 9
BACTERIAS ENTRICAS

OBJETIVO DE LA PRCTICA
Desarrollar las tcnicas de aislamiento e identificacin de enterobacterias,
comprendiendo el significado de las pruebas bioqumicas.
INTRODUCCIN
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae

son bacilos gramnegativos,

anaerobios facultativos que fermentan la glucosa en anaerobiosis; citocromo

oxidasa negativos; reducen los nitratos a nitritos. Cuando son mviles son
flagelados peritricos. Son llamadas enterobacterias porque residen en el aparato
digestivo de animales y humanos, pero algunas especies tambin viven en la tierra
y en el agua. Incluye los gneros Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Salmonella,
Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia, Morganella,

Proteus,

Providencia, Yersinia, Erwinia y Pantoea. La mayora forman parte de la flora

normal o son bacterias ambientales, a excepcin de los gneros Salmonella,
Shigella y Yersinia, quienes son causantes de infecciones gastrointestinales; es
por eso que cuando se detectan en heces, es muy probable que estn causando
dao.
Cuando las enterobacterias se introducen a un sitio del cuerpo estril, producen
enfermedades como neumona, infecciones de vas urinarias, septicemia,
infecciones neonatales, infecciones de heridas y de cirugas. Se comportan como
patgenos oportunistas sobre todo en pacientes inmunocomprometidos.
A semejanza de las enterobacterias, los gneros Campylobacter y Helicobacter
causan enfermedades gastrointestinales.
Helicobacter pylorii es un bacilo un poco curvo, microaeroflico, con flagelos
polares mltiples. Requiere medios especficos para cultivarse. Causa gastritis
crnicas y lceras gstricas y duodenales. Se encuentra tambin en saliva.

46

MATERIALES Y MTODOS.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS PATGENAS.
1. Siembre cepas puras de enterobacterias, por estra cruzada, en medios
selectivos en placa de SS, EMB y

agar-verde-brillante, descargando la

muestra con el asa en un extremo de la caja y extendiendo despus. Incube 24

hs a 37o C.
2. Describa el crecimiento colonial de las cepas control.
3. En agar-verde brillante observe que todas las salmonellas, excepto S. typhi,
forman colonias rojas o rosas a las 48 hs de incubacin. El Proteus mirabilis
forma colonias amarillas o amarillo-verdosas con un halo amarillo verdoso. E.
coli no crece.
4. En EMB E. coli forma colonias negruscas o moradas, usualmente con brillo
verde metlico. La Shigella produce colonias sin color
5. En SS el Enterobacter forma colonias rojas o rosas a las 24 hs. Salmonella
forma colonias sin color con centro negro. E. coli crece poco.
6. Haga un Gram de todas las cepas y compruebe que son bacilos Gramnegativo.
PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS:
MEDIO DE DOBLE AZCAR:
1.

Cada cepa control deber sembrarse en todos los medios para pruebas

bioqumicas. En primer lugar siembre tubos con medio Agar Kligler, que es un medio
con doble azcar (lactosa y dextrosa) es un medio de color naranja:
2. Con una asa normal con anillo, se toma una colonia bien aislada y se siembra
por estra en la superficie de agar del tubo
3. Usando una asa recta sin anillo, tome otra colonia igual a la anterior y siembre
por picadura en el centro del mismo tubo, sin tocar el fondo, cuidando que no le
tiemble la mano. Incube 24 hs a 37 oC . Al cabo de este trmino, la fermentacin
de la glucosa ocurre en anaerobiosis hasta cido, lo cual se manifiesta por un
cambio de color del indicador de pH en el medio, de rojo a amarillo en el fondo
47

del tubo. La degradacin de la lactosa en aerobiosis es indicada por un color

amarillo en la superficie del agar.
MEDIO DE SIM EN TUBO
1. A partir de una colonia siembre un tubo SIM (color amarillo) por picadura en el
centro, sin tocar el fondo, cuidando que no le tiemble la mano e incube a 37 o C
por 24 hs .
2. La produccin de sulfuros toma lugar a partir de aminocidos con azufre y es
indicada por la aparicin de un color negro
3. La movilidad positiva es demostrada por crecimiento de la bacteria
homogneamente en todo el medio, observndose una turbidez
4. La produccin de metabolito indol es indicada por un anillo de color rojo que se
forma despus de adicionar unas 2 o 3 gotas del reactivo de Kovacs.
MEDIO MIO EN TUBO
En un tubo con medio MIO (color caf) siembre una colonia por picadura en el
centro e incube igual. El indicador de pH en el medio cambia de color, de caf a
color violeta al alcalinizarse, lo que indica la descarboxilacin de la ornitina por la
enzima ornitn descarboxilasa
MEDIO CITRATO SIMMONS
Este medio (color verde) se utiliza como nica fuente de carbono en tubo
inclinado. Siembre una colonia por estra en la superficie del agar e incube igual.
En condiciones alcalinas el crecimiento y el cambio de color verde del indicador
de pH, a color azul, indica la utilizacin del citrato positiva.
UREA
Este medio en tubo con agar inclinado (color amarillo), se siembra por estra y se
incuba igual. La aparicin de un color rosa brillante (rosa mexicano) en el medio,
indica la accin de la ureasa y alcalinizacin del medido. El indicador de pH se
torna rosa en condiciones alcalinas.
48

FENIL ALANINA
Este medio en tubo con agar inclinado, se siembra en la superficie y por picadura
sin tocar el fondo.

Despus de la incubacin se agrega cloruro frrico,

interpretndose como positivo si da una coloracin verdosa, desaminacin de la

fenil alanina
LISINA IRON AGAR (LIA)
Em medio en tubo con agar inclinado se siembra por estra en la superficie y por
picadura. En condiciones alcalinas toma color violeta, si se produce cido se torna
color amarillo. Se utiliza para conocer la accin de la Lisina descarboxilasa
VOGES PROSKAWER
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de
fermentar la glucosa con produccin de acido por la va acido-mixta o con
produccin de acetona por la via butanodilica. Para el efecto se incocula un tubo
con medio lquido de Voges proskawer. Despus de la incubacin, el cultivo se
divide en dos tubos y se adicionan los reactivos diferentes por separado.
1. Prueba del rojo de metilo: Aadir unas gotas de una solucin de rojo de metilo
al 0.04%, observar el color del medio. El rojo de metilo, es un indicador, permite
revelar la presencia de productos cidos. Positivo: color rojo. Negativo: amarillo.
2. Prueba del Voges Proskauer: Aadir 0.6 ml de alfa-naftol al 5% en alcohol
etlico absoluto y 0.2 ml de hidrxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar
vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
Observar el color de la superficie del medio. La adicin de alfa-naftol e hidrxido
de potasio permite evidenciar la presencia de productos finales neutros.
Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos despus de una completa
agitacin del tubo. Negativo: ausencia de color rojo.
Haga una tabla de todos resultados y compare con los datos de la literatura
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.
49

PRCTICA 10
BACTERIAS ANAEROBIAS ORALES
OBJETIVO DE LA PRCTICA.
Conocer las tcnicas de aislamiento especiales para bacterias anaerobias de la
cavidad oral y su identificacin.
INTRODUCCIN
Actualmente se conocen infecciones amenazantes como abscesos cerebrales,
peritonitis, septicemia, aborto sptico, etc., causadas por anaerobios endgenos.
La fuente natural ms accesible de estos microorganismos es la cavidad oral,
donde estn formando la mayor parte de la flora oral normal, pero donde tambin
pueden estar relacionados directamente a la patognesis o a la destruccin de los
dientes y de las estructuras de soporte. Cada una de estas condiciones pueden
ser fuente tambin de infecciones sistmicas en sitios distantes. Puede parecer
ilgico que los anaerobios estrictos, que son altamente sensibles al oxgeno,
pudieran habitar normalmente en la cavidad oral, misma que est expuesta al aire
constantemente. Sin embargo, las condiciones anaerbicas son mantenidas
gracias a la presencia de cualquier tejido necrtico en espacios periodontales y
creviculares. Por otro lado, las bacterias aerobias creciendo en el mismo
microambiente utilizan el oxgeno.
El aislamiento de anaerobios orales requiere medios de cultivo selectivos y
sistemas de incubacin especiales. La identificacin de las cepas generalmente es
complementada por cromatografa de gases para cidos grasos, los cuales
marcan patrones dados caractersticos para cada cepa bacteriana.
Medios recomendados para el aislamiento de anaerobios:
- Agar sangre para anaerobios en placa (ANABAP). Es un medio rico no-selectivo
donde quedar el total de microflora anaerobia cultivable (facultativos y estrictos).
Es suplementado con hemina y vitamina K (factores de crecimiento)

50

- Columbia CAN agar con sangre de carnero 5 %. Contiene colistina (C) y cido
nalidxico (NA), dos antibiticos contra bacterias Gram-negativas. Se obtiene el
crecimiento de Gram-positivos anaerobios totales cultivables de la microflora oral.
- Columbia CAN agar con sangre de carnero 5 % y metronidazol. La mayora de
los anaerobios estrictos son sensibles al metronidazol, mientras que la mayora
de los anaerobios facultativos son resistentes. Estima la microflora total Grampositiva-facultativa.
- Tripticasa soya agar con sangre de carnero 5 %, hemina, vitamina K y
vancomicina (TSA + SHKV). El antibitico es aadido contra la mayora de las
bacterias Gram-positivas. Permite el desarrollo de la microflora total de Gramnegativos anaerobios.
- Tripticasa soya agar con sangre de carnero, hemina, vitamina K, vancomicina y
metronidazol (TSA + SHKVM). Este medio permite estimar la microflora de Gramnegativos facultativos totales.
MATERIALES Y MTODOS.
1. Marque tres tubos conteniendo 5 ml de thioglicolato con las claves 1, 2 Y 3.
2.

Transfiera 1 mL de una suspensin de placa dental al tubo #1. Mezcle

cuidadosamente (dilucin 1:10).

3. Transfiera 1 mL del tubo #1 al tubo #2. Mezcle (dilucin 1:100).

4. Transfiera 1 mL del tubo #2 al tubo #3. Mezcle (dilucin 1:1000).
5. Coloque 0.1 mL de cada dilucin de placa dental en el extremo de una placa
de cada medio y extienda el inculo en la superficie con un hisopo estril. Los
diferentes medios son:
Clostrisel Agar y/ Agar sangre
6. Siembre cepas puras de Fusobacterium, Bacteroides y de otras anaerobias
orales, como Corynebacterium matruchotii, Eikenella corrodens, Lactobacillus
acidophilus, Leptotrichia buccalis, Prevotella melaninogenica, Porphyromonas
gingivalis y Veillonella parvula
7. Incube todas las placas sembradas a 37C, por 24 a 48 hs.

51

8. Revise las colonias desarrolladas. Para obtener el # de colonias por dilucin,

multiplique el nmero de colonias por el factor de dilucin para cada placa.
Solo se cuenta en las placas con ms de 50 colonias o menos de 200.
9. Compare las colonias de la muestra con las de las cepas tpicas. Las colonias
de Bacteroides se observan de color gris oscuro o negras.
10. Desarrolle la tcnica de Gram en cepas puras de Fusobacterium y de
Bacteroides y en las colonias de la muestra que son semejantes. Ambos son
bacilos gram-negativos no-esporulados. Fusobacterium es bacilo recto o
ligeramente curvo, de extremos adelgazados (puntiagudos),

con flagelos

peritricos. Bacteroides es bacilo recto o ligeramente curvo, con extremos

redondeados, individual o en parejas, con flagelos peritricos. Todas son
bacterias asociadas con periodontitis.

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

52

PRCTICA 11
ACTYNOMYCETOS ORALES
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Conocer las principales especies patgenas de actinomicetales encontradas en la
cavidad oral.
I. INTRODUCCIN
Los gneros de bacterias mdicamente importantes en el orden de los
Actinomycetales incluyen Actinomyces, Mycobacterium, Nocardia y Streptomyces,
de los cuales todos contienen especies patgenas o potencialmente patgenas
para el hombre. Algunos

miembros de

los Actinomycetales, as como las

infecciones que producen han sido agrupados

tradicionalmene junto con los

hongos y las micosis. En forma semejante a los hongos, estas bacterias

superiores forman filamentos ramificados a semejanza de los hongos, crecen
lentamente, producen infecciones crnicas e inducen una respuesta inmune
mediada por clulas en el husped. Sin embargo, los

Actinomycetales son

procariotas, bacterias verdaderas y no deben ser confundidas con los hongos.

Actinomyces israelii es la especie ms comn e importante, causa actinomycosis
humana, una enfermedad crnica supurativa y granulomatosa, caracterizada
por la formacin de abcesos con diseminacin perifrica a tejidos contiguos y la
formacin de caminos sinuosos a partir de las lesiones supurativas. A. israelii,
as como otros agentes de actinomycosis humana, son indgenos de la cavidad
oral humana, y pueden iniciar una infeccin siguiendo a un trauma en el tejido
oral. Otras especies of Actinomyces son encontradas en la cavidad oral, algunas
de las cuales pueden contribuir junto con otros microorganismos, en la
patognesis de la caries dental (Actinomyces viscosus).
El miembro ms importante del gnero Mycobacterium es Mycobacterium
tuberculosis (hominis), la causa principal de tuberculosis humana. La exposicin
53

al bacilo

tuberculoso es un riesgo occupational significativo para los

profesionales dentales. El bacilo es altamente

sobrevive por largos

resistente a la desecacin y

perodos en esputo seco. Debido a que es una de las

bacterias ms resistentes a la desinfeccin, es el principal blanco de cualquier

proceso riguroso para asegurar la proteccin de los

profesionales de

enfermedades contagiosas. Las cepas emergentes de Mycobacteria que son

resistentes a uno o ms antibiticos mycobacterianos estndar, hace la
preocupacin de todos, ante la posible exposicin a este organismo.
Las enfermedades bucales por Mycobacterias tambin pueden ser causadas por
cualesquiera de las mycobacteria no-tuberculosas. Estas se dividen en 4 grupos
en base a la velocidad de su crecimiento, morfologa colonial y produccin de
pigmento. Todas ellas son menos patgenas que M. tuberculosis.
Las Mycobacterias son bacillos cido-resistentes, es decir, son resistentes a la
decoloracin con cido despus de una coloracin primaria con un colorante
bsico. Esta propiedad es debida a la gran cantidad de complejos lipdicos en la
pared celular. La identificacin de M. tuberculosis en especimenes clnicos es la
nica base para un diagnstico clnico definitivo de infeccin tuberculosa. En
tuberculosis activa pulmonar, son liberados bacilos tuberculosos viables en las
secreciones bronquiales (esputo), las que constituyen la mejor fuente potencial
para recuperar la bacteria. Si la concentracin de

M. tuberculosis es

suficientemente alta, el diagnstico presuntivo se realiza mediante la tincin de

esputo y observacin microscpica, revelando los tpicos bacilos cido resistentes.
La confirmacin se efecta por cultivo en un medio apropiado. Las mycobacteria
tambin incluyen el bacilo de la lepra Mycobacterium leprae, o bacilo de Hansen,
el cual no se ha logrado cultivar en medios artificiales.

54

Grupos de Mycobacterium bucales

Organismo
M. tuberculosis
Grupo I
Fotocromgenos

Pigmento
No
Naranja
(claro)

M. kansasii
Grupo II

Amarillo-

Escotocromgenos

naranja

M. scrofulaceum
Grupo III

(oscuro)

No-cromgenos

No

M. avium
Grupo IV
crecimiento rpido
M.fortuitum
M. phlei

Temp.
Rango

Velocidad
de creci-

Niacina

colonia

producida

Rugosa

37C

miento
Semanas

24-37C

Semanas

Lisa

24-37C

Semanas

Lisa

24-42C

Semanas

Lisa

De haber:
amarillo-

Tipo

Lisa
24-45C

Das

naranja

rugosa

MATERIALES Y MTODOS.
1. Describa las colonias de Actinomyces israelii (cultivo anaerobio de 7 das) y de
Actinomyces viscosus (cultivo aerobio de 48 horas)
2. Haga una tincin de Gram de cada cultivo y observe a 100 X.
3. Examine macroscpicamente un cultivo de Mycobacterium tuberculosis en
medio de Lowenstein-Jensen en tubo, con tapn de rosca bien cerrado y sin tratar
de abrirlo. Describa las colonias y note la presencia o ausencia de pigmento.
4. Examine cultivos de los 4 grupos de mycobacterias no-tuberculosis. Describa
las colonias y la produccin del pigmento.

RESULTADOS DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

55

PRCTICA 12
HONGOS DE LA CAVIDAD ORAL
OBJETIVO DE LA PRCTICA:
Conocer e identificar los principales hongos relacionados con la cavidad oral.
INTRODUCCIN
Los hongos son organismos eucariotes, unicelulares o pluricelulares y presentan
una pared celular, de composicin diferente a la de las plantas. No contienen
clorofila ni sintetizan macromolculas a partir del CO2 ni de la luz. Todos son
heterotrficos. Se encuentran ampliamente distribudos en la naturaleza y los de
mayor inters son los ornamentales, los comestibles, los venenosos, los txicos,
los degradadores de materia orgnica, los que descomponen los alimentos, los
alucingenos, los medicinales y finalmente los patgenos, tanto de humanos,
como de animales y plantas).
Reino fungi
Subdivisin

Clase

Zygomycotina

Zygomycetes

Ascomycotina

Ascomycetes

Basidiomycotina

Basidiomycetes

Deuteromycotina

Deuteromycetes o Fungi Imperfecti

El cuerpo de los hongos se denomina talo, ya sea unicelular o pluricelular.

a) Talo unicelular: de forma ovoide o redonda, como las levaduras
b) Talo pluricelular: con aspecto filamentoso. A stos se les conoce como mohos y
estn formados por hifas microscpicas que consisten de filamentos tubulares
ramificados, con un crecimiento apical; las hifas pueden ser cenocticas (sin
divisiones y multinucleadas) o tabicados (divididas en segmentos). La masa de
hifas constituye el micelio.
56

c) Los hongos carnosos macroscpicos (macromicetos) estn formados por hifas

ms organizadas y se les denomina setas (championes).
En las hifas en general se producen diferentes clases de esporas reproductivas:
- esporas asexuales: talosporas, conidios, esporangiosporas.
- esporas sexuales: ascosporas, basidiosporas.
Identificacin de los hongos:
Para la identificacin de los hongos filamentosos (mohos) las caractersticas ms
empleadas son las

coloniales. Su aspecto en el frente

es variado,

como

algodonoso, aterciopelado, polvoso. En el reverso tambin cambia. Puede haber

micelio areo y profundo. La morfologa microscpica del micelio se refiere al tipo
de hifas, estructura y modo de formacin del cuerpo reproductivo sexual, tipo de
esporas: forma, tamao, aspecto externo, agrupacn, nmero de clulas, flagelos.
Las levaduras forman colonias semejantes a las bacterianas. Para la identificacin
de levaduras se requiere conocer adems de la morfologa, la determinacin de
caractersticas fisiolgicas y bioqumicas, especialmente su accin sobre
azcares.
Los hongos en general, presentan requerimientos nutricionales muy simples, pero
su desarrollo es ms lento que el de las bacterias, por lo que requieren varios das
de incubacin.
Infeccin por la levadura Candida:
La candidiasis es una micosis representada clnicamente por una sobrepoblacin
de las especies de Cndida en individuos inmunocomprometidos. El hongo se
establece y prolifera en la superficie epitelial, formando colonias blancas y
cremosas fcilmente observables clnicamente. En las infecciones crnicas, los
microorganismos pueden penetrar profundamente en los tejidos, causando un
adelgazamiento del epitelio y la formacin de queratina superficial (Leucoplasia
candidisica). Algunas condiciones que favorecen la infeccin son la terapia
prolongada con antibiticos y supresin de clulas mediadoras de la inmunidad ya
sea por quimioterapia o por radiacin. El organismo es dimrfico; la forma de
57

levadura ocurre naturalmente en vas respiratorias altas, en el tracto intestinal y en

la vagina, mientras que la fase invasiva en forma de hifas, se encuentra en
mucosas, lesiones cutneas y tejidos profundos. La infeccin se inicia cuando
ocurre una alteracin significativa en mucosas o en piel, permitiendo a la levadura
producir hifas y pseudohifas que penetran el epitelio. El aislamiento de la levadura
se puede efectuar en agar-sangre, a partir de raspados orales o especmenes de
sangre. La identificacin de Candida albicans est basada en la produccin de un
tubo germinal o en la produccin de clamidosporas en las hifas y el desarrollo de
pseudohifas en medios especiales a 25 C, as como en la asimilacin de
carbohidratos y patrones de fermentacin.
Las Infecciones Micticas Profundas son causadas por Coccidioides immitis, e
Histoplasma capsulatum pueden presentarse clnicamente como lesiones en la
cavidad oral, pero solo como lesiones secundarias de la enfermedad, cuyos
sntomas primarios son pulmonares. El diagnstico es serolgico. La fase parsita
de estos hongos puede detectarse en esputo, mediante cultivo en medios
especiales, en forma semejante a Mycobacterium tuberculosis.
MATERIALES Y MTODOS
1. A partir de cultivos puros de los hongos Candida albicans, Coccidioides
immitis, e Histoplasma capsulatum, haga descripcin de las colonias.
2. Enseguida haga una preparacin de Candida albicans en un portaobjetos
conteniendo una gotita de lactofenol y monte con un cubreobjetos. Observe a
10 y a 40 X. Tia con Gram. Haga dibujos.
3. Para observar la formacin del tubo germinal inocule el hongo en tubos
conteniendo suero e incube a 37 C por 2 a 3 horas. En un portaobjetos mezcle
una gota del cultivo con una gota de tinta china. Observe al microscopio y
busque la presencia de tubos germinales.
4. Observe preparaciones fijas teidas de los otros dos hongos, a 40 X. Haga
dibujos.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES

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PRCTICA 13
VIRUS ORALES
INTRODUCCIN
Algunas de las lesiones orales comunes observadas en la boca son las de tipo
vesicular, causadas por los Virus Herpes, como el Herpes-Simplex y el HerpesZoster. Las vesculas

se rompen y son fcilmente distinguibles para su

diagnstico.
Los individuos inmunocomprometidos, son infectados por diversos virus. En
individuos con SIDA se han registrado hasta 40 manifestaciones orales de la
infeccin con este virus y pueden ser las primeras caractersticas clnicas de la
infeccin; su presencia es una indicacin de inmunodeficiencia y pronostican el
progreso de la enfermedad, lo que conduce a su diagnstico.
Recientemente se ha establecido una asociacin entre los papilomavirus humanos
(PVH) y algunas lesiones orales benignas, premalignas y malignas, incluido el
liquen plano oral (LPO), existiendo evidencias que involucran a los PVH en la
carcinognesis oral.
La Leucoplasia Vellosa (LV) resulta del adelgazamiento de la capa de queratina en
respuesta a la infeccin de las clulas del epitelio oral por el virus de Epstein Barr
(VEB). Este virus afecta mayormente los bordes laterales de la lengua, por lo
tanto, la apariencia blanca y la ubicacin pueden hacer que tanto la Candidiasis
Oral como la Leucoplasia Vellosa se vean clnicamente semejantes
Adems, son frecuentes otros tipos de lesiones orales por patgenos que no son
de boca, pero que son adquiridos por individuos que practican el sexo oral.
La hepatitis viral es una inflamacin del hgado causada por diferentes virus. Los
virus de la hepatitis B, C y D, son los ms eficientemente transmitidos por sangre
infectada, pero tambin pueden ser transmitidos por exposicin a otros fluidos
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corporales infectados. Pueden causar hepatitis crnica. La gente con hepatitis

crnica viral puede desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular.
Estos tres virus requieren pruebas inmunolgicas para su diagnstico.
Los trabajadores de la salud dental deben preocuparse de la transmisin de del
virus de la hepatitis-B (HBV), hepatitis-C (HCV) y hepatitis-D (HDV), como un riesgo
de exposicin ocupacional a estos patgenos. Vacunas e immunoglobulinas estn
disponibles y son efectivas para proteger contra infectiones contra HAV, HBV y
HDV, pero no de HCV.
Los virus son los microorganismos ms pequeos y pueden pasar a travs de los
filtros que retienen las bacterias. Son parsitos intracelulares estrictos y requieren
que la clula husped los replique. La Clasificacin e identificacin of virus est
basada principalmente en la morfologa y substructura del virin. Para cultivarse
son necesarios huspedes vivos, cultivos de tejidos o embriones de pollo.
Los virus de la influenza son aislados por inoculacin de los especmenes en las
cavidades alantoidea y amnitica

del embrn de pollo, incubando tres das.

Aunque la infeccin viral puede ser fatal para el embrin, los virus son colectados
del fluido de las cavidades inoculadas y pueden ser utilizados para determinar la
presencia de hemaglutininas virales.
Ciertos virus son difciles de aislar o de propagar en cultivos de clulas, pero
pueden recuperarse bien de los llamados cultivos de rganos. Sin embargo, estos
cultivos de rganos no crecen bien y tienen un tiempo muy limitado de vida en el
laboratorio, por lo que no son utilizados en forma rutinaria, pero son buenos para
investigacin y estudios especiales.
La mayora de los laboratorios de virologa utilizan cultivos de tejidos porque son
los ms baratos y convenientes para especmenes clnicos. La mayora de los
virus comunes crecen bien en ellos y producen cambios reconocibles en las
clulas cultivadas derivadas de tejidos humanos, de monos y de pequeos
animales de laboratorio. Las clulas crecen en el cultivo en una monocapa y los
virus son inoculados despus. La deteccin de la infeccin viral en una monocapa
de tejido depende del tipo de virus. Se producen cambios morfolgicos celulares
60

caractersticos por el proceso de replicacin de los virus llamado efecto citoptico

(ECP), el cual puede utilizarse para identificar diferentes tipos de virus. Los que
no producen efecto citoptico deben ser identificados por otras tcnicas.
La necrosis de clulas blanco pueden servir como clave til en la etiologa. Por
ejemplo en el virus herpes simplex genital solo es destrudo el epitelio escamoso.
En algunas virosis se producen cuerpos de inclusin caractersticos para cada
tipo

de virus, dentro de la clula husped, por ejemplo los papovavirus,

herpesvirus y adenovirus producen inclusiones intranucleares. Los rabiesvirus,

poxvirus y citomegalovirs producen inclusiones citoplsmicas.
Los sincitios se obseva al microscopio como masas de clulas gigantes
multinucleadas, en los herpes simplex y los parainfluenza.
Diferentes tcnicas inmunolgicas son tiles en la identificacin de virus, como
mtodos de inmunofluorescencia, ELISA, y otros.
La microscopa electrnica es limitada por su alto costo.
MATERIALES Y MTODOS
1. Haga una investigacin de virosis orales en Mxico.

RESULTADOS DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

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PRCTICA 14
PROBLEMA DE UNA INFECCIN ORAL
1. Cada alumno deber obtener una muestra oral de un paciente con infeccin
para identificar el patgeno. En base a los sntomas debe guiarse para
sospechar del posible organismo involucrado.
2. Disee la prctica con Materiales, Mtodos y Resultados.

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