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Capitolo 8. Sviluppo linfocitario e riarrangiamento ed espressione dei geni dei recettori antigenici

La maturazione consiste in una serie di eventi che avvengono negli organi linfoidi generativi o primari:
1. Orientamento verso linfociti T o B. A partire da cellule staminali dette HSC (Hematopoietic Stem
Cells) nel midollo osseo e nel fegato fetale si ha la maturazione a CLP (progenitore linfoide comune)
che poi a seconda degli stimoli ricevuti dai recettori di membrana si differenzier in linfocita B o
T. I linfociti T terminano la loro maturazione allinterno del timo.
2. Riarrangiamento dei geni per il recettore. Elemento chiave della maturazione linfocitaria che
avviene nei linfociti B immaturi nel midollo osseo e nei linfociti T immaturi nel timo. A partire
da un numero modesto di geni grazie a tagli, ricongiungimenti ed aggiunte si genera un numero
elevatissimo di esoni differenti che codificano per il recettore, tutto questo prima dellincontro con
lantigene.
3. Selezione dei linfociti utili ed eliminazione di quelli pericolosi. Le cellule che non esprimono un
recettore o pre-recettore corretto muoiono per apoptosi; quelle che sono in grado di legare con
bassa avidit gli MHC vengono portate avanti nella maturazione dalla selezione positiva; quelle
che legano con elevata avidit antigeni self vengono eliminate dalla selezione negativa fenomeno
detto delezione clonale; Possono anche andare incontro a un successivo riarrangiamento del
recettore detto editing recettoriale.
4. Proliferazione.
5. Differenziazione in sottogruppi (CD4, CD8, etc).

Orientamento verso le linee B e T Lorientamento dipende dalle istruzioni ricevute dalla superficie
della cellula seguite dallinduzione di specifici fattori trascrizionali. Lo stadio precoce dello sviluppo
caratterizzato dalla proliferazione stimolata soprattutto dallIL-7 prodotta dalle cellule stromali di
midollo e timo. Mutazioni nel recettore per questa citochina portano ad immunodeficienze quali le
SCID.

1.1

Riarrangiamento dei geni recettoriali

I geni che codificano per il recettore per l antigene sono generati per riarrangiamento di regioni diverse
del gene che codifica per la regione variabile(V) con segmenti di geni della diversit (D) e quelli della
ricongiunzione(J).Tale processo detto ricombinazione V(D)J.
1.1.1

Organizzazione dei loci per le IG

Esistono tre loci genici separati su cromosomi diversi che codificano per le tre catene delle IG (pesante,
, ). Ciascun locus contiene una regione costante (C) che codifica la parte C delle catene e una regione
V che codifica la parte variabile composta da copie multiple di segmenti V e J, nel locus per la catena
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pesante sono presenti anche segmenti D. Nelluomo nei segmenti o geni V al 5 di ognuno vi una
sequenza L che codifica per un peptide leader che caratterizza tutte le proteine neo-sintetizzate e
svolge un ruolo essenziale nellindirizzamento verso lER. Nel 3 della regione V cio tra i geni V e
quelli C vi sono segmenti J e nei loci per le catene pesanti vi sono anche dei segmenti D. La regione C
della catena pesante costituita da circa 9 geni C, solo 3 o 4 bastano per codificare lintera regione C
della catena pesante e altri 2 per la regione carbossi-terminale di membrana. Nel locus per le catene
leggere vi un unico esone C che basta da solo a codificare lintera regione C della catena leggera. Nelle
catene leggere il dominio V codificato dai segmenti V e J mentre quelle pesanti da V(D)J.

1.1.2

Organizzazione dei loci per TCR

Lorganizzazione molto simile a quella per le Ig. I geni che codificano per le catene , e sono su
cromosomi separati, mentre quello per la catena contenuto in quello per la catena . La struttura
di questi uguale a quella detta prima: regione V con segmenti V, J e D solo nelle catene e e una
regione C con 2 geni nelle catene , e uno solo nelle altre due. Ciascun gene V preceduto in 5 da
una sequenza L che codifica per il peptide leader.

1.1.3

Ricombinazione V(D)J

La ricombinazione V(D)J d origine alla specificit e variabilit del recettore e consiste nellunione di
segmenti V, D(se presente) e J presi a caso. Siccome i segmenti scelti si trovano lontani sul cromosoma devono essere effettuate rotture e riallacciamenti. Durante la ricombinazione sono aggiunti o
rimossi nucleotidi che aumentano enormemente la variabilit dell esone V(D)J. Il risultante esone
V(D)J codificher la regione variabile, in associazione con le regione C che sono invece costanti.Tale
ricombinazione effettuata da un complesso detto ricombinasi.

Il complesso della ricombinasi riconosce specifiche sequenze dette RSS situate nel 3 del segmento V
e 5 del segmento J; tali sequenze sono costituite da una sequenza altamente conservata di 7 nucleotidi
detta eptamero distaccata da una sequenza spaziatrice d 12 o 23 nucleotidi da una seconda sequenza
conservata di 9 nucleotidi detta nonamero. Un enzima specifico una volta avvicinati i due eptameri
(uno adiacente a V e uno adiacente a J) taglia lelica tra il segmento V e J e il rispettivo eptamero,
successivamente segue lunione dei due segmenti codificanti e leliminazione del frammento contentente
le RSS sotto forma di anello. In alcuni casi gli eptameri sono situati entrambi a destra sia di V che di J
in tal caso necessaria una inversione del Dna intermedio e le RSS tagliate non vengono eliminate ma
rimangono nel cromosoma. La ricombinazione tra due segmenti si verifica solo uno fiancheggiato da
uno spaziatore di 12 e l altro di 23: la cosiddetta regola 12/23.

Il processo di ricombinazione V(D)J si pu riassumere in quattro eventi fondamentali:


1. sinapsi: i due segmenti codificanti e le RSS adiacenti vengono in contatto tra loro grazie alla
formazione di un anello sul cromosoma.
2. taglio: rottura del doppio filamento di Dna.

3. codifica e processazione: le estremit tagliate vengono modificate mediante aggiunta o rimozione


di nucleotidi.
4. unione:le estremit codificanti vengono unite in un processo detto NHEJ (Non Homolgous End
Joining).
In tali processi svolgono un ruolo centrale due proteine dette Rag-1 e Rag-2 che formano il complesso
ricombinasi V(D)J. Rag-1 e Rag-2 mantengono uniti i segmenti genici durnte la ricombinazione e poi
Rag-1 riconosce le sequenze tra leptamero e la sequenza codificante e le taglia. Il taglio viene effettuato
solo su una delle eliche e lestremit tagliata si lega allaltra formando una struttura a forcina detta
hairpin. Laltra estremit da origine a una terminazione blunt ancora legata alle RSS e non processata. Le due hairpin chiuse, una del V e laltra di J si trovano a essere una di fronte allaltra e vengono
a essere modificate con aggiunta di nucleotidi. I geni per Rag sono attivi solo nei linfociti immaturi,
in fase proliferativa o matura sono silenti proprio per minimizzare il rischio di rotture inapropriate del
Dna. Le hairpin vengono aperte e modificate da un enzima detto Artemis, attivato da Dna-Pk (protein
chinasi DNA dipendenti) a sua volta attivato dalle due proteine Ku70 e Ku80 che svolgono un ruolo
chiave nel riparo della rottura.
Generazione della diversit linfocitaria Lenorme diversificazione dei linfociti B e T dovuta soprattutto al riarrangiamento dei geni per il recettore (IG e TCR). Questa diversificazione dovuta a una
diversit combinatoria dovuta semplicemente alle diverse combinazioni possibili tra i diversi segmenti
V,J e D e a una diversit giunzionale data dalla aggiunta e rimozione di nucleotidi dai segmenti V, J
e D. Questultima mediata da diversi meccanismi:
primo meccanismo la rimozione di nucleotidi dalla sequenza germinale alle estremit del gene a
opera di una endonucleasi.
un secondo la aggiunta di nuove sequenze nucleotidiche alle giunzioni scisse da Artemis. Se
la scissione asimmetrica i nucleotidi aggiunti devono essere complementari a quelli del tratto
parallelo e tali nucleotidi sono detti nucleotidi P.
ultimo meccanismo di diversit giunzionale la aggiunta casuale di un massimo di 20 nucleotidi
non codificati da alcuno stampo detti nucleotidi N mediata da unenzima chiamato TdT.
La massima diversificazione si ha nella regione CDR3 delle Ig e TCR che si forma nei siti di ricombinazione V(D)J. Proprio per la sua elevata specificit la sequenza dei nucleotidi contenuta in questa
regione funziona come marcatore clonale specifico: in questo modo nei tumori linfocitari si pu stabilire
quale clone la causa.

1.2

Sviluppo dei linfociti B

Durante la maturazione, le cellule della linea linfocitaria B passano attraverso stadi distinti caratterizzati da markers specifici e Ig caratteristiche. Il precusore pi precoce destinato a diventare linfocita B
detto linfocita pro-B; queste cellule non producono alcuna Ig e possono essere distinte per lespressione di molecole di superficie quali CD19 e CD10. Le proteine Rag sono espresse per la prima volta a
questo stadio e la prima ricombinazione nei geni delle Ig ha luogo nel locus della catena pesante. I
passi di questa prima ricombinazione sono:
1. Avvicinamento di un segmento D e un segmento J con eliminazione del DNA interposto
2. Aggiunta di un gene V 5 allunit DJ appena creata: tutto i segmenti V e D interposti vengono
eliminati
3. Aggiunta di nucleotidi da parte di TdT
4. Trascrizione di VDJ (se laggiunta di nucleotidi ha generato una sequenza produttiva)
Se il riarrangiamento della catena pesante ha successo la cellula smette di essere chiamata linfocita
pro-B e passa alla fase di linfocita pre-B. I linfociti pre-B sono cellule B in sviluppo che esprimono la
proteina Ig ma che devono ancora riarrangiare il locus per la catena leggera. La catena pesante
infatti associata con le proteine 5e VpreB dette surrogati delle catene leggere. Linsieme di catena
pesante, catene leggere surrogate e proteine trasduttrici dette Ig e Ig formano quello che prende
il nome di recettore pre-B. Nelle cellule con riarrangiamenti in frame del locus IgH il pre-BCR a
fornire i segnali di transizione da fase pro-B a fase pre-B. I segnali in arrivo da questo recettore sono
responsabili dellespansione in termini numerici di questa popolazione linfocitaria.
Numerose molecole segnalatrici sono necessarie sia al BCR che al pre-BCR per superare il checkpoint. Una tirosin chinasi detta Btk (Brutons tyrosine kinase) attivata a valle di questi recettori ed
necessaria per la sopravvivenza e la maturazione della cellula oltre la fase di linfocita pre-B. Mutazioni
nel gene Btk portano alla patologia detta agammaglobulinemia X-linked.
Il complesso pre-BCR regola i successivi riarrangiamenti dei geni Ig in due modi. In primo luogo se
una proteina viene prodotta da un locus ricombinato in un cromosoma il pre-BCR blocca la ricombinazione sullaltro cromosoma omologo. Se il primo arrangiamento non invece produttivo viene
consentita la ricombinazione V(D)J sullomologo. Grazie a questa attivit in ogni clone solo un allele
espresso mentre laltro in configurazione germinale e non utilizzato: ci si riferisce a questo processo
con il termine di esclusione allelica. Il secondo sistema in cui il pre-BCR regola la ricombinazione lo
stimolo al riarrangiamento del gene per la catena leggera.
Nel successivo stadio di maturazione si ha il riarrangiamento dei geni delle catene leggere che producono le rispettive proteine: queste vanno ad associarsi alla catena pesante formando lIgM completa. La cellula a questo punto esprime IgM e viene detta cellula B immatura. La produzione di una
catena leggera inibisce il riarrangiamento del locus per la catena e viceversa: le Ig hanno dunque
sempre la stessa catena leggera grazie a questo processo detto di esclusione dellisotipo della catena
leggera.

Sottogruppi diversi di linfociti B sviluppano a partire da progenitori diversi. Le HSC derivate dal
fegato fetale sono precursori delle cellule B tipo B-1; le HSC derivate dal midollo danno invece origine

alla maggior parte dei linfociti B. Questo secondo gruppo di cellule passa rapidamente attraverso due
stadi che lo orienta verso lo sviluppo o di cellule B della zona marginale o di cellule B follicolari. La
maggior parte dei linfocti B maturi di tipo follicolare e coesprime le catene pesanti e : presentano
dunque sia IgD che IgM nella forma di membrana. Lespressione simultanea delle due diverse catene
pesanti dovuta a splicing alternativo dello stesso mRNA. La coespressione di IgD ed IgM si accompagna allacquisizione di competenza funzionale e abilit di ricircolo: a questo punto si parla dunque di
linfocita B maturo. I linfociti B maturi naive sono capaci di rispondere agli antigeni e sono destinati a
morire in pochi mesi se non incontrano lantigene per il quale hanno grande affinit.
Selezione dei linfociti B maturi La selezione nei linfociti T maturi molto ben definita e precisa,
mentre nellambito dei linfociti B un processo molto meno rigido. Le cellule B immature che riconoscono antigeni self con troppa avidit vengono indotte a cambiare la loro specificit tramite il
processo di editing recettoriale. In questo processo si ha riattivazione dei geni Rag, con una seconda
ricombinazione dei geni della catena leggera: normalmente viene modificata la catena leggera e questo
altera la specificit del recettore. Se lediting fallisce si ha selezione negativa, un processo responsabile
almeno in parte del mantenimento della tolleranza dei linfociti B; il riconoscimento dellantigene in
questo caso porta a morte apoptotica. Quando la transizione a linfocita B maturo IgD+ IgM + completata, il riconoscimento dellantigene non porta pi ad apoptosi o a editing ma a proliferazione e
differenziazione.
Linfociti B-1 e linfociti della zona marginale Molte delle cellule B-1 esprimono la molecola CD5 che
pu essere usata come marker; nelladulto grandi quantit di queste cellule si trovano nel peritoneo e
nelle mucose. Questi linfociti secernono spontaneamente IgM che spesso reagiscono con polisaccaridi
e lipidi: questi anticorpi sono detti anticorpi naturali in quanto prodotti senza immunizzazione, anche
se si sospetta che sia la flora intestinale ad indurne la produzione.
I linfociti della zona marginale si trovano nella milza e rispondono ad antigeni polisaccaridici generando anticorpi naturali. Il marker per queste cellule CD21.

1.3
1.3.1

Maturazione dei linfociti T


Ruolo del timo

Il timo il pi importante sito di maturazione dei linfociti T e a dimostrazione di questo:


1. Se viene rimosso il timo in un topo neonato questo non sviluppa linfociti T maturi
2. Lassenza congenita di timo, come nella sindrome di DiGeorge, porta a un ridotto numero di
linfociti T in circolo e nei tessuti linfoidi e a pesanti carenze di risposte mediate da questo tipo di
cellula
Il timo involve spontaneamente con lavanzare dellet, ma poich i linfociti T della memoria hanno una
vita anche di oltre ventanni il bisogno di nuovi linfociti T diminuisce negli anziani.

I linfociti T in fase di sviluppo nel timo sono detti timociti e non esprimono TCR e nemmeno CD4 o
CD8. Nella corteccia timica queste cellule esprimono per la prima volta il TCR ( o ) e per quelle che
esprimono il tipo inizia anche la maturazione verso il sottogruppo CD4+ o CD8+ . Lambiente del timo
fornisce gli stimoli necessari per la proliferazione e la maturazione dei timociti; molti di questi stimoli
arrivano direttamente dalle cellule del timo, cio cellule epiteliali, macrofagi o cellule dendritiche. La
migrazione dei timociti in questo tipo di ambiente garantisce interazioni fisiche con le altre cellule,
passaggio necessario per la maturazione. Due tipologie di molecole prodotte dalle cellule timiche non
linfoidi sono importanti per la maturazione:
Le molecole MHC di classe I e II espresse su cellule epiteliali e dendritiche. Le interazioni tra i
timociti in maturazione e queste molecole sono essenziali per la selezione del repertorio linfocitario.
Citochine e chemochine secrete dalle cellule stromali. La pi importante IL-7, inoltre le chemochine CCL19 e CCL21, legandosi al recettore CCR7, guidano i timociti nellattraversamento del
timo.
1.3.2

Stadi di maturazione linfocitaria

I timociti corticali pi immaturi, di recente giunti dal midollo, contengono i geni per il TCR in
configurazione terminale e quindi non esprimono TCR, CD3 o catene e nemmeno CD4 o CD8: queste
cellule vengono dette timociti doppio negativi o cellule pro-T. Come nel caso dei linfociti pro-B, le
proteine Rag vengono espresse per la prima volta in questa fase: il riarrangiamento dei geni porta alla
transizione verso la fase pre-T e il seguente sviluppo del linfocita . Il riarrangiamento, se svolto
con successo, porta alla traduzione di una catena beta funzionante che viene espressa sulla superficie
della cellula in associazione con una proteina invariante detta pre-T. Linsieme di catena beta, catena
invariante pre-T, proteine CD3 e proteina prende il nome di complesso pre-TCR. I segnali dal preTCR mediano la sopravvivenza dei timociti e la loro espansione proliferativa; i segnali mediano inoltre
linizio della ricombinazione del locus per la catena alfa e guidano la transizione da fase doppio negativa
a fase doppio positiva. I segnali del pre-TCR inibiscono inoltre ulteriori riarrangiamenti della catena
limitando laccessibilit della cromatina.
Nello stadio successivo di maturazione i timociti esprimono sia CD4 che CD8 e sono dunque detti
timociti doppio positivi. Questi timociti esprimono inoltre il recettore per chemochine CCR7 e quindi
migrano verso la midollare del timo. A questa fase la cellula esprime leterodimero completo del TCR.
In caso di incapacit di riarrangiare la catena del TCR il timocita muore per apoptosi. Importante,
il riarrangiamento del gene per la catena alfa causa la delezione del locus : questa cellula non potr
quindi mai pi diventare un linfocita . In virt della neo acquisita capacit di rispondere agli antigeni,
i timociti doppio positivi subiscono selezione positiva o negativa: le cellule che subiscono il processo
maturano in linfociti CD4+ o CD8+ , quindi diventano timociti singolo positivi. I timociti singolo
positivi entrano nella midollare e lasciano infine il timo per andare a popolare i tessuti linfoidi periferici.
1.3.3

Processi di selezione

Il repertorio linfocitario immaturo non selezionato consiste di linfociti T i cui recettori possono riconoscere qualsiasi antigene peptidico presentato su una molecola MHC qualsiasi. In ogni individuo gli
unici linfociti T utili sono quelli specifici per i peptidi non-self presentati dalle molecole MHC self; parallelamente, i linfociti T che riconoscono antigeni self con troppa avidit sono potenzialmente pericolosi
perch possono innescare processi autoimmuni.
Quando i timociti doppio positivi esprimono per la prima volta il TCR questo incontra peptidi self
presentati su molecole MHC delle cellule timiche epiteliali. La selezione positiva il processo per
cui i timociti i cui TCR riconoscono blandamente questi peptidi e le molecole MHC associate vengono
stimolati a sopravvivere. La selezione negativa invece il processo in cui i timociti i cui TCR riconoscono
troppo avidamente i peptidi self o le molecole MHC vengono eliminati per prevenire reazioni contro
lorganismo stesso.
Selezione positiva Se il TCR di un timocita riconosce le molecole MHC I associate al peptide e allo
stesso tempo il CD8 interagisce con lMHC, questo riceve segnali che ne evitano la morte e promuovono
il proseguimento della maturazione. Per procedere il linfocita doppio positivo pu continuare ad esprimere CD8 e il TCR ma pu smettere di esprimere CD4; il risultato un linfocita T CD8+ MHC I
ristretto. Un processo totalmente analogo avviene per produrre un linfocita CD4+ MHC II ristretto.
Durante la transizione da doppio positivo a singolo positivo gli helper diventano CD4+ CD8 mentre i
citotossici CD4 CD8+ .
Selezione negativa La conseguenza di un riconoscimento troppo avido lo scatenarsi dellapoptosi:
questo processo elimina i linfociti T autoreattivi e garantisce la tolleranza al self. La tolleranza indotta
nei timociti dal riconoscimento degli antigeni self nel timo detta tolleranza centrale, per differenziarla
dalla tolleranza periferica indotta nei linfociti gi maturati. La selezione negativa pu avvenire sia
nella fase doppio negativa che nella fase singolo positiva. Nella midollare, le cellule epiteliali del timo
esprimono una proteina nucleare detta AIRE che induce lespressione di parecchi geni tessuto-specifici
in modo da rendere questi peptidi disponibili per la presentazione.
1.3.4

Linfociti T

Questo tipo di linfociti ha una linea di sviluppo totalmente a parte: una esclude laltra. La diversit del
repertorio di queste cellule limitata perch vengono usati solo pochi dei segmenti V, D e J disponibili:

questi linfociti servono infatti a difendersi da un numero limitato di microbi il cui incontro molto
frequente alle barriere epiteliali.
1.3.5

Cellule NK-T

Le cellule NK-T esprimono TCR non MHC ristretto ma CD1 ristretto: riconoscono infatti antigeni
lipidici legati a questa molecola.