Pruebas Bioquimicas PDF

CONTENIDO
Pgina
Introduccin
Generalidades de bacterias
Morfologa y estructura
Nutricin
10
Quimiohetertrofos
12
Auttrofos
12
Fotoauttrofos
Fotohetertrofos
12
12
Reproduccin
13
Transformacin
14
Conjugacin
14
Transduccin
15
Identificacin bacteriana
16
Medios de cultivo
16
Medios bsicos
18
Medios enriquecidos
19
Medios selectivos, diferenciales y

de enriquecimiento
20
Medios especiales
Clasificacin por consistencia
22
23
Slidos
Semislidos
Lquidos
Clasificacin por composicin
Sintticos
23
No sintticos
Tcnicas de inoculacin
En placa
24
26
Estra cruzada
Estra en "Z"
Estra simple
Siembra masiva
Vaciado en placa
En tubo: medio semislido
Siembra en medios lquidos
27
28
En tubo: medios slidos
29
Incubacin de los medios
30
Morfologa colonial
31
Identificacin basada en caractersticas

metablicas: Pruebas bioqumicas
35
Fermentacin de carbohidratos
35
Prueba de citrato
Licuefaccin de gelatina
42
48
Prueba de leche con tornasol
52
Reduccin de leche con azul de metileno

Prueba de fermentacin y oxidacin (O/F)
59
Prueba de ureasa
Prueba de Voges - Proskauer
69
73
Prueba de rojo de metilo
78
Reduccin de nitratos
82
Prueba de fenilalanina
Sulfuro, indol y movilidad: SIM
87
92
Agar hierro triple azcar: TSI
102
Agar lisina - hierro: LIA

Movilidad, indol y ornitina: MIO
112
116
63
Metabolismo
Produccin de energa
Va de degradacin de las hexosas
125
128
Gluclisis
130
Entner-Duodoroff
Pentosa fosfato
134
135
Ciclo de Krebs
139
Fermentacin
Lctica
142
143
Heterolctica
144
Alcohlica
Propinica
144
146
cido mixta (frmica)
147
De metano
148
Butilenglucoltica (acetonica)
148
Respiracin anaerbica con aceptores
149
inorgnicos de hidrgeno
Fijacin de nitrgeno
149
Reduccin de sulfatos
151
Mtodos para el aislamiento e identificacin de bacterias

Enterobacterias
Coprocultivo
Familia Micrococaceae
153
155
157
Estafilococos
158
Estreptococos
Urocultivo
160
162
Hemocultivo
163
Exudado faringeo
164
Referencias
165
Direcciones electrnicas
168
NDICE DE FIGURAS
No.
1
Figura
Referencia
Enciclopedia Encarta, 2002
Pg.
9
Morfologa bacteriana
Formas de nutricin de bacterias
11
Reproduccin bacteriana
13
Reproduccin bacteriana: Transformacin
14
Reproduccin bacteriana: Conjugacin
15
Superficie de placas de agar EMB que ilustra el brillo verde

producido por miembros de las Enterobacterias que fermentan
Koneman, 1992
16
Koneman, 1992
18
vidamente lactosa: Escherichia coli.

Placa de agar soya - tripticasa, inoculado con una bacteria que
produce un pigmento amarillo. La produccin de pigmento es una
importante caracterstica diferencial para identificar bacilos
Gram negativos no fermentadores.
Superficie de placas de agar EMB que ilustra cultivo mixto de
Koneman, 1992
19
Escherichia coli y Shigella sp.

Morfologa colonial en agar sangre.
20
Superficie de placas de agra EMB que ilustra el brillo verde
Koneman, 1992
21
10
producido por Escherichia coli.

11
Agar BCYE
Koneman,1992
31
12
Streptococcus sp.
Museun of History Natural
37
13
Pruebas bioqumicas: Fermentacin de carbohidratos
38
14
Pruebas bioqumicas: Citrato
45
15
Pruebas bioqumicas: Licuefaccin de gelatina
16
Micrococcus sp
17
Pruebas bioqumicas: Leche con tornasol
18
Pruebas bioqumicas: Leche con azul de metileno
19
Salmonella sp.
20
Pruebas bioqumicas: Oxidacin/fermentacin
66
21
Interpretacin O/F
67
22
Pruebas bioqumicas: Urea
23
Salnonella typhi
24
Pruebas bioqumicas: Voges - Proskauer
25
Escherichia coli
26
Pruebas bioqumicas: Rojo de metilo
80
27
Escherichia coli, observese pili
81
28
Pruebas bioqumicas: Reduccin de nitratos
85
29
Pruebas bioqumicas: Fenilalanina desaminasa
91
30
Salmonella typhi
31
Pruebas bioqumicas: SIM
99
32
Salmonella typhi
101
33
Escherichia coli
34
Pruebas bioqumicas: TSI
35
Salmonella sp.
36
Fundamento: TSI
37
Pruebas bioqumicas: LIA
38
Pruebas bioqumicas: MIO
39
Shigella
Museum of History Natural,

2002
124
40
Produccin de quesos
Black, 1996
144
41
Produccin de vino
Black, 1996
145
50
Sullivan, 2002
51
57
61
62
71
72
76
Prskznki, 2002
University of east Anglia

Norwich, 2002
Pfeizer, 2002
77
96
101
107
107
Koneman, 2002
110
114
121
ndice de Tablas
Tabla
No.
Pg.
Reporte de resultados: prueba de oxidacin y fermentacin
68
Reporte de resultados: Sulfuro, indol y movilidad (SIM)
98
Aplicaciones: SIM
101
Aplicaciones: TSI
111
Aplicaciones: LIA
115
Reporte de resultados: MIO
123
Aplicaciones: MIO
124
Caractersticas bioqumicas de bacilos Gram negativos
154
Caractersticas bioqumicas de la Familia Micrococcaeae
157
10
11
Caractersticas bioqumicas de Staphylococcus

Caractersticas bioqumicas de Streptococcus
159
161
ndice de Esquemas
No.
Esquema
Pgina
Gluclisis
133
Va de Hexosa monofosfato
138
Ciclo de Krebs
141
Coprocultivo
155
Aislamiento de bacterias patgenas de heces
156
Aislamiento de Staphylococcus
158
Urocultivo
162
Exudado faringeo
164
Introduccin
Para poder conocer los principios, bases bioqumicas, mtodos,
aplicaciones, interpretacin y precauciones as como los
resultados esperados en cada prueba es necesario a menudo
recurrir a muchas referencias bibliogrficas y publicaciones
que no siempre se encuentran a disposicin de los alumnos o
microbilogos en general.
El usuario encontrar la informacin suficiente y necesaria pero sobre
todo, sencilla y amena de cada prueba, su principio fundamental,
bases bioqumicas, medios de cultivo, reactivos empleados,
resultados, interpretacin, reporte de resultados, precauciones y
observaciones, tcnicas de inoculacin y condiciones de
incubacin as como referencias bibliogrficas. Estas han sido
reunidas al final para permitir, cuando se desee una
profundizacin acerca de un aspecto determinado de algn
tema, donde se podr tambin observar diferentes imgenes

de algunas especies bacterianas. En las ilustraciones a color de
los resultados de cada prueba tambin se incluyen medios no
inoculados para una mejor y mayor comparacin para los
lectores.
Antes de la parte dedicada a la explicacin de las bases para
cada prueba bioqumica se encontrarn tambin clasificaciones
concretas y ejemplos de los medios de cultivo, as como las
tcnicas de inoculacin ms empleadas.
Este atlas de colores y texto de microbiologa ha sido descrito
con el objeto de proporcionar a estudiantes de microbiologa,
tecnlogos mdicos, residentes de patologa y otros
interesados en microbiologa clnica, una introduccin prctica
a la identificacin de laboratorio de los agentes microbianos
asociados con enfermedades infecciosas y de las pruebas
bioqumicas ms empleadas o las mnimas necesarias para su
identificacin.
Figura 1. Morfologa bacteriana
1.
Morfologa y estructura.
Las bacterias son microorganismos procariotas de
organizacin muy sencilla. La clula bacteriana consta
de:
Citoplasma. Presenta un aspecto viscoso, y en
su zona central aparece un nucleoide que
contiene la mayor parte del ADN bacteriano, y
en algunas bacterias aparecen fragmentos
circulares de ADN con informacin gentica,
dispersos por el citoplasma: son los plsmidos.
membrana
plasmtica
presenta
invaginaciones, que son los mesosomas, donde
se encuentran enzimas que intervienen en la
sntesis
de
ATP,
y
los
pigmentos
fotosintticos en el caso de bacterias
fotosintticas. En el citoplasma se encuentran
inclusiones de diversa naturaleza qumica.
La
Muchas bacteria s pueden presentar flagelos

generalmente rgidos, implantados en la
corpsculo basal.
Pueden poseer tambin, fimbrias o pili muy
numerosos y cortos, que pueden servir como
pelos sexuales para el paso de ADN de una
clula a otra.
Poseen ARN y ribosomas caractersticos, para
la sntesis de protenas.
Pared celular rgida y con molculas exclusivas
de bacterias.
membrana
2.
mediante
un
Nutricin
El xito evolutivo de las bacterias se debe en parte a su

versatilidad metablica. Todos los mecanismos posibles de
obtencin de materia y energa podemos encontrarlos en las
bacterias.
10
Segn la fuente de carbono que utilizan, los seres vivos se

dividen en auttrofos, cuya principal fuente de carbono es el
CO 2, y hetertrofos cuando su fuente de carbono es materia
orgnica.
Por otra parte segn la fuente de energa, los seres vivos
pueden ser fottrofos, cuya principal fuente de energa es la
luz, y los organismos quimiotrofos, cuya fuente de energa es
un compuesto qumico que se oxida.
Figura 2. Formas de nutricin de las bacterias
11
Atendiendo a las anteriores categoras, entre las bacterias

podemos encontrar las siguientes formas, como puede
apreciarse en el esquema:
1. Las
bacterias
quimiohetertrofas,
utilizan
un
compuesto qumico como fuente de carbono, y a su vez,
este mismo compuesto es la fuente de energa. La
mayor parte de las bacterias cultivadas en laboratorios
y las bacterias patgenas son de este grupo.
2. Las bacterias quimioauttrofas, utilizan compuestos

inorgnicos reducidos como fuente de energa y el CO2
como
fuente
de
carbono.
Como
por
ejemplo,
Nitrobacter yThiobacillus.
3. Las bacterias fotoauttrofas, utilizan la luz como

fuente de energa y el CO 2 como fuente de carbono.
Bacterias purpreas.
4. Las bacterias fotohetertrofas, utilizan la luz como

fuente de energa y biomolculas como fuente de
carbono. Ejemplos como Rhodospirillum y Chloroflexus.
12
3.
Reproduccin
Generalmente
las
bacterias
se
reproducen
biparticin, como se ve en el siguiente esquema:
Figura 3. Reproduccin bacteriana
Tras la duplicacin del ADN, que esta dirigida por la ADNpolimerasa que se encuentra en los mesosomas, la pared
bacteriana crece hasta formar un tabique transversal
separador de las dos nuevas bacterias.
Pero adems de este tipo de reproduccin asexual, las
bacterias poseen unos mecanismos de reproduccin sexual o
parasexual, mediante los cuales se intercambian fragmentos
de ADN. Este tipo de reproduccin puede realizarse por:
13
por
TRANSFORMACION:
Consiste
intercambio
en
el
gentico
producido cuando una

bacteria es capaz de
captar fragmentos de
ADN, de otra bacteria
que
se
encuentran
dispersos en el medio
donde vive.
Figura 4. Reproduccin bacteriana: Transformacin
CONJUGACIN: En este proceso, una bacteria

donadora F+ transmite a travs de un puente o
pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria
receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee
un plsmido, adems del cromosoma bacteriano.
14
Figura 5. Reproduccin bacteriana: Conjugacin
TRANSDUCCIN: En este caso la transferencia

de ADN de una bacteria a otra, se realiza a
travs de un virus bacterifago, que se
comporta como un vector intermediario entre las
dos bacterias.
(Biblioteca de Consulta Microsoft Encarta 2002. 1993-2001 Microsoft Corporation.)
15
En la naturaleza los microorganismos se encuentran

formando poblaciones mixtas de una gran variedad de tipos
diferentes. Sin embargo, el desarrollo de la microbiologa se
ha conseguido mediante el estudio de especies aisladas,
crecidas en medios desprovistos de cualquier otra forma de
vida contaminante.
Los microorganismos necesitan nutrientes apropiados as
como condiciones ambientales favorables. En primer lugar el
medio
de
cultivo
debe
contener
aquellos
nutrientes
esenciales para el crecimiento de una determinada especie.

Como la mayor parte de los estudios en el laboratorio se
realizan los cultivos puros (una sola especie bacteriana), se
debe esterilizar el medio de cultivo y mantenerlo en
condiciones estriles hasta que sea utilizado.
Un
medio
de
cultivo
es
cualquier
sustancia que puede ser usada para el

cultivo de microorganismos, puede ser
llamada un medio o, dicho con mayor
precisin un medio de cultivo.
Figura 6. Crecimiento de Escherichia coli en agar EMB
16
Los medios sirven para dos propsitos principales:

a) Fomentar el crecimiento microbiano en forma que
puedan comprobarse las caractersticas de cultivo.
b) Facilitar
algunas
reacciones
bioqumicas
que
luego
puedan ser demostrables por observacin directa, o

bien, indirectamente por la reaccin en presencia de
algunos reactivos adicionales.
Todas las reacciones de cultivo as como las bioqumicas,
dependen de la composicin del medio y de la naturaleza del
cultivo que se estudie. Los medios de cultivo se pueden
clasificar en cuatro tipos diferentes:
1. Medios bsicos
2. Medios enriquecidos
3. Medios selectivos, diferenciales y de
enriquecimiento
4. Medios especiales
17
1. Medios bsicos
Solo contienen algn extracto de carne u otra infusin
simple, peptona, sal y agua.
El extracto o la infusin de carne proporcionan al organismo
los aminocidos, vitaminas, sales, y pequeas cantidades de
carbono, nitrgeno, hidrgeno y otros elementos.
Las sales (usualmente cloruro de sodio) sirven para obtener
isotonicidad requerida para el mantenimiento de presiones
osmticas constantes.
El agua sirve como disolvente, como medio de transporte, o
para ambos fines (siempre se debe usar agua destilada para
preparar los medios de cultivo).
Los medios de cultivo que solo contienen extracto de carne,
peptona, sal y agua, son lquidos; para el estudio de las
caractersticas de las colonias es indispensable el uso de
medios slidos.
La
solidificacin
se
consigue
agregando agar, gelatina, albmina

de suero o de huevo, a los otros
ingredientes.
Figura 7. Agar Soya - tripticasa
18
Es preferible utilizar el agar, ya que es un medio slido que

no se desintegra por los medios fsicos usados en el cultivo
de la mayora de los microorganismos.
Ejemplos de ste tipo de medios son los siguientes:
1. Caldo y agar nutritivo
2. Caldo de triptona y soya
3. Caldo de infusin de cerebro y
corazn
4. Agar de infusin de cerebro y
corazn
5. Caldo de infusin de corazn
6. Agar y extracto de hgado
Figura 8. Agar EMB con cultivo mixto
de Escherichia coli y Shigella sp.
7. Dextrosa de Saboraud
2. Medios enriquecidos
Son aquellos medios bsicos que han sido complementados
con lquidos corporales, vitaminas especficas, aminocidos,
protenas y otros nutrientes claramente definidos como
tales.
19
7. Medios
suero
Ejemplos:
1. Agar proteosa
inclinados
con
2. Agar sangre
8. Agar de Bordet Gengou
3. Agar chocolate
9. Medio de Levinthal
4. Caldo de suero
10.Agar de Mueller-Hinton
5. Agar con suero
11.Agar
6. Suero de Loeffler con
infusin
de
cerebro corazn
sangre
12.Agar sangre
Figura 9. Morfologa colonial en Agar sangre
3.
Medios
selectivos,
enriquecimiento
diferenciales
Los medios selectivos son usualmente medios de agar bsico,

o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertos
reactivos que impiden el crecimiento de la mayora de las
bacterias, permitiendo por lo tanto el aislamiento de unas
cuantas, seleccionadas en los especimenes que contengan
grandes nmeros de organismos indeseables.
Los medios diferenciales son medios bsicos o enriquecidos,
a los cuales se les han agregado ciertos reactivos que
reaccionarn con algunos tipos especficos de bacterias en
cierta forma observable.
20
de
Los medios de enriquecimiento son por lo general medios

lquidos enriquecidos, que contienen algunas sustancias
inhibidoras, con lo que se crea un ambiente especialmente
favorable para lmites ms bien estrechos de bacterias.
Ejemplos:
1. Medio de Thayer
Martin
lactosa, desoxicolato)
11. Agar sangre con azida
2. Agar con feniletanol
12. Agar con sal y manitol
3. Agar con sangre y bilis
13. Agar de Mc Conkey

14. Agar Salmonella -
al 40%
Shigella
4. Agar con esculina y bilis

5. Agar
con
sangre
15. Agar con eosina y azul
de metileno (EMB)
telurito
6. Medio
16. Agar de bilis y rojo de
Tinsdale
de
violeta
modificado
7. Agar
con Lowenstein
Jensen
en
tubos
17. Agar
inclinados
8. Agar con
18. Agar entrico Hektoen

citrato
de
19. Agar S-110
20. Agar tergitol 7

sulfito
21. Agar verde brillante
de
22. Agar Vogel Jhonson
bismuto
10.Caldo selenito de sodio
11.
Agar
XLD
tripticaseina
desoxicolato
9. Agar
dextrosa
23. Agar Baird-Parker
xilosa,
Figura 10. Crecimiento de Escherichia coli en Agar EMB
21
4. Medios especiales
Son los medios que no pueden ser fcilmente agrupados
bajo alguno de los anteriores grupos.
La
mayora
de
ellos
sern
medios
empleados
para
comprobar una o ms a caractersticas bioqumicas.

Ejemplos:
Pruebas bioqumicas
1. Fermentacin de carbohidratos
2. Prueba de citrato
3. Prueba de leche con tornasol
4. Reduccin de leche con azul de metileno
5. Prueba de oxidacin y fermentacin: Hugh-Leifson
(O/F)
6. Prueba de ureasa
7. Prueba de Voges - Proskauer
8. Prueba con rojo de metilo
9. Reduccin de nitratos
10. Prueba de fenilalanina
11.
Prueba de Sulfuro, indol, movilidad: SIM
12. Agar hierro y triple azcar: TSI

13. Descarboxilacin de la arginina y lisina: LIA
14. Descarboxilacin de la ornitina: MIO
22
Otras clasificaciones de los medios de cultivo son las

siguientes:
De acuerdo a la consistencia
1. Medios slidos. Son tiles para el crecimiento, aislamiento y
obtencin de cultivos puros de bacterias y hongos.
2. Medios
semislidos.
tiles
para
la
observacin
de
metabolismo, as como la propagacin y obtencin de cultivos

de bacterias anaerbicas.
3. Medios lquidos. Permiten la difusin del microorganismo.
De acuerdo a la composicin
1. Medios sintticos
Es aquel en el que se conoce la composicin qumica exacta
de los ingredientes.
2. Medio no sinttico
No se conoce de una manera definida la composicin
precisa de alguna o de todas las sustancias nutritivas.
23
El desarrollo o cosecha de microorganismos obtenido en

algn medio se designa como un cultivo. Cuando las
bacterias de un cultivo son todas de la misma especie, se
dice que son cultivos puros; cundo dos o ms especies de
bacterias s desarrollan en un medio como un cultivo mixto.
Si un cultivo contiene accidentalmente ms de una especie
de bacterias se habla de un cultivo contaminado.
Las bacterias se cultivan en alguno de los siguientes tipos
de material de vidrio, una vez limpios y esterilizados.
1. Tubos de ensayo
2. Cajas o placas de Petri
3. Matraces de Florencia y Erlenmeyer
4. Tubos de fermentacin
Antes de su esterilizacin, un tubo que contiene medio de
cultivo se tapa generalmente con algodn o con un tapn de
caucho o plstico. As se evita la entrada de nuevos
contaminantes a la vez que se permite el libre intercambio
de aire o gases.
Para sembrar un cultivo bacteriano en un medio estril, un
cierto nmero de clulas: "inculo", se transfieren (se
inoculan)
al
medio
con
precauciones
conservar la pureza del cultivo.
24
especiales
para
En el procedimiento de inoculacin el asa de cultivo o aguja

de siembra, debe calentarse al rojo sobre la llama
inmediatamente antes y despus de hacer la transferencia.
La
flama
destruye
cualquier
forma
de
vida
sobre
la
superficie de la aguja o del asa. Se mantiene la aguja hacia

abajo sobre la flama, para calentar la totalidad de la aguja y
la parte inferior del mango.
Durante la siembra, se mantiene el tubo en la mano izquierda
y se sostiene el tapn o capuchn entre los dedos meique y
anular
de
la
mano
derecha.
NO
DEBE
NUNCA
DEPOSITARSE EL TAPN sobre la mesa. Mantener el tubo

lo ms cerca posible de la flama durante la siembra. Las
bocas de los tubos de donde tomamos los cultivos y las de
aquellos donde van a ser transferidos deben tambin
flamearse inmediatamente antes y despus de que la aguja
sea introducida y sacada. Adems de destruir cualquier
organismo del borde del tubo, la flama tiende a crear
corrientes de conveccin hacia fuera, decreciendo as el
riesgo de contaminacin.
Despus de inocular, un cultivo bacteriano se conserva o se
incuba en un lugar apropiado para el crecimiento. En este
caso "crecimiento", significa el desarrollo de una poblacin
de clulas a partir de una o pocas clulas. La masa de las
clulas hijas llega a ser visible a simple vista, bien como una
opacidad "enturbamiento", en medio lquido; o como una
poblacin aislada "colonia" en medio slido, donde el aspecto
de stas ofrece un medio para diferenciar especies.
25
La inoculacin primaria puede hacerse con un asa, hisopo u

otros dispositivos adecuados.
Diseminacin en placas:
a) Estra
1 Cruzada
2 En Z
3 Simple (en ngulos rectos)
4 Masiva
b)Vaciado en placa
En el caso de la estra cruzada el inculo se disemina con
un movimiento hacia atrs y hacia delante en cada
cuadrante girando la placa a 90. El asa o alambre debe
esterilizarse en cada diseminacin entre cada cuadrante.
El propsito de esta tcnica consiste en diluir el inculo en
forma suficiente en la superficie del agar para que sea
posible obtener colonias.
El mtodo de dilucin o vaciado en placa proporciona por lo
general placas con un nmero apropiado de colonias, y se
basa en una dilucin aproximadamente cuantitativa de la
muestra original en un medio slido.
26
Una tcnica muy comn en medicina consiste en obtener

especies de microorganismos en un aplicador de algodn
(hisopo). Si se utiliza el aplicador infectado para sembrar
directamente en caja petri se obtiene una mezcla compleja
de organismos sin ninguna colonia aislada, lo cual no reporta
ningn beneficio. Para resolver esto existe una tcnica que
permite aislar una colonia pura de un algodn infectado, para
lo cual; debe trazar con el hisopo unas lneas, inoculando una
pequea zona en el borde de una placa. Cubra la caja y queme
el aplicador en el mechero. Esterilice el asa y psela en el
sector inoculado con el algodn para recoger algunas
bacterias, luego inocule con ellos la otra zona en la misma
caja (estra cruzada).
Inoculacin de medios semislidos en tubo

Por picadura en forma vertical
La inoculacin de este tipo de medios se describe en el
Atlas interactivo.
El agar inclinado es un tubo conteniendo un medio con agar
que, durante su enfriamiento, se coloc inclinado. El
contenido de un tubo as inclinado constituye un medio
adecuado para el desarrollo de bacterias, especialmente de
aerobias y anaerobias facultativas. Algunas caractersticas
de los cultivos, como la formacin de pigmentos se
observan ms fcilmente sobre cultivos inclinados.
27
Cuando se inocula agar semislido en un tubo para pruebas

de motilidad (aunque no sea la nica prueba que se valora),
es importante que el asa de inoculacin sea retirada a lo
largo
del
mismo
camino
que
se us para atravesar
inicialmente el medio. Solo se pica el agar con un

movimiento uniforme y recto y para ello se utiliza el asa
recta.
Inoculacin de medios lquidos (tubo)

El crecimiento bacteriano en medios lquidos se observa de
la siguiente manera:
1. Enturbamiento, opacidad ms o menos densa.
2. Formacin de velo, pequea masa de clulas que
flotan en la parte superior del cultivo.
3. Sedimento, depsito de clulas que permanece en la
parte
inferior
del
cultivo,
pero
que
se
pone
nuevamente en suspensin si el tubo se sacude

suavemente.
Difusin
Los medios lquidos pueden inocularse como en el mtodo
ilustrado (Atlas interactivo); el tubo debe inclinarse
aproximadamente 30, con un asa de inoculacin se t oca la
superficie interna del vidrio, exactamente por encima del
punto donde la superficie del medio forma un ngulo agudo.
Se debe utilizar el asa con arillo.
28
Posteriormente se vuelve a colocar el tubo en posicin

recta, as el rea de inoculacin queda sumergida en el
medio.
Agitar suavemente cada tubo. No dejar que el lquido
salpique la tapa del tubo. Por lo comn es suficiente un solo
inculo para inocular una batera de 8 a 10 tubos.
Cuando se inocula una batera con una misma especie de
bacteria no hay necesidad de pasar por la llama entre cada
inoculacin.
Cuando se utiliza una aguja o asa para inocular una batera
con un solo inculo, el traspaso de azcares de un tubo a
otro es tan infinito que no hay problema de que un tubo
contenga una mezcla de carbohidratos.
Cuando se inocula una batera no es necesario observar en
forma apreciable el inculo en cada uno de los tubos. Un
solo inculo espeso tomado de cultivo contiene millones de
bacterias que son suficientes para inocular cada tubo con
un nmero apreciable de bacterias necesarias para que se
produzca el metabolismo.
Inoculacin de medios slidos (tubo): Pico de flauta o

cola de pescado
a) Por puncin (picadura)
b) Por estra
c) Por puncin y estra
29
Los picos de flauta (planos inclinados) de agar se inoculan

de la siguiente forma: primero se atraviesa todo el fondo
del agar con el asa recta de inoculacin, esto cuando sea
necesario ya que no todos los medios lo requieren,
posteriormente ste se retira con un movimiento en S a
travs del agar que se disemina el inculo. Se utiliza el asa
recta.
Las temperaturas ptimas de incubacin de las bacterias

son diferentes. En laboratorios pequeos donde es
probable que los recursos sean limitados, puede no ser
posible proporcionar todas las temperaturas ptimas para
el crecimiento de la totalidad de los aislamientos clnicos.
La
mayora
de
los
microorganismos
utilizados
en
el
laboratorio as como los aislados de muestra clnicas

crecen a una temperatura de 35 C, por ende se debe
mantener la incubadora a 35 - 37 C.
El crecimiento de muchas bacterias se incrementa con una
atmsfera de 5-7 % de CO 2. Si solo se dispone de una
incubadora con aire ambiente sin CO 2 los tubos y placas
para cultivos pueden colocarse en una jarra con una vela
encendida y cerrar lo mejor posible la jarra.
30
La interpretacin de los cultivos primarios despus de 24 48 horas de la incubacin requiere de la observacin o

anlisis de la morfologa colonial. La evaluacin debe ser de la
siguiente forma:
1. Observar las caractersticas y el nmero relativo de
cada tipo de colonia recuperado en medios de agar.
2. Determinar la pureza,
coloracin de Gram y
morfologa
de
las
bacterias en cada tipo

de colonia.
Figura 11. Agar BCYE
3. Observar cambios en el
medio que rodea las colonias, que reflejan actividades

metablicas especficas de las bacterias recuperadas.
La evaluacin de las caractersticas macroscpicas de las
colonias habitualmente se lleva a cabo por medio de la
inspeccin visual del crecimiento en la superficie de las
placas de agar.
31
La interpretacin de los cultivos primarios se lleva a cabo

sosteniendo la placa en la mano y observando la superficie
del agar en busca de crecimiento bacteriano.
Colonias puntiformes de bacterias que crecen lentamente,
pueden pasarse por alto entre colonias ms grandes en
particular si el crecimiento tiene tendencia a diseminarse
sobre la superficie de la placa.
Durante el examen las placas deben inclinarse en diversas
direcciones, con una iluminacin directa brillante, de modo
que la luz se refleje desde varios ngulos. Las placas de
agar sangre tambin deben examinarse con transiluminacin
con una luz brillante desde detrs de la placa para detectar
reacciones hemolticas en el agar.
La morfologa de las colonias es una de las caractersticas
bsicas
de
las
bacterias
es
indispensable
para
la
identificacin preliminar.
El
tamao
de
las
colonias
bacterianas
es
asumiendo
condiciones de cultivo favorables bastante uniforme de

toda una especie.
La forma de la colonia viene determinada por su borde y su
espesor. El borde puede ser liso o irregular y aserrado.
Cuando
el
grosor
es
mucho
mayor
en
el
centro,
disminuyendo uniformemente hacia el borde, se dice que la

colonia es elevada.
32
La consistencia y textura de la masa celular tambin son

rasgos distintivos de la morfologa de las colonias. Pueden
tener una consistencia desde seca y frgil a grasienta y
cremosa, o viscosa y pegajosa.
La consistencia viscosa de la colonia es propia de las
bacterias que tienen cpsulas. La superficie de la colonia
puede ser uniforme, lisa y brillante, rugosa y granular, o
estriada y dentada. Al examinarla con luz transmitida, la
masa celular puede parecer de una textura amorfa o
granular, y variar desde casi completamente translucida,
quiz con un tinte azulado pasando por varios grados de
opalescencia,
hasta
un
color
blanco
una
opacidad
amarillenta.
No todas las colonias bacterianas son pigmentadas: la
pigmentacin
es
ms
frecuente
entre
las
bacterias
atrficas. Debido a que la mayor parte de los pigmentos son

sustancias carotenoides, las clulas pueden aparecer de
color rojo, naranja o amarillo.
La diferenciacin con un criterio morfolgico de las colonias
es slo orientativa, y para poder identificar una bacteria se
necesita
un
estudio
detallado
de
fisiolgicas e inmunolgicas.
33
sus
caractersticas
Lectura de morfologa colonial
Tamao: dimetro en mm.

Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular,
rizoide.
Elevacin: plana, sobre elevada, convexa, pulvonada,

umbonada, umbilicada.
Margen (borde): entero, ondulante, lobulado, lacerado,

filamentoso, rizado.
Color: blanco, amarillo, negro, naranja, etc.
Superficie: brillante, opaca, erizada, rugosa.
Transmisin de luz: opaca, translucida, transparente.
Consistencia:
membranosa).
cremosa,
seca,
34
mucoide
(viscosa),
La mayor parte de las pruebas usadas para evaluar la

actividad bioqumica o metablica de bacterias (por medio
de la cual puede hacerse una identificacin final de
especie), se lleva a acabo mediante el subcultivo del
aislamiento primario en una serie de medios diferenciales,
cuyos resultados pueden interpretarse despus de uno o
dos das de incubacin.
1. FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS
Medio de cultivo: Caldo bsico rojo de fenol
Composicin:
a) Peptona 10g.
b)Extracto de carne 1g.
c) Cloruro de sodio 5g
d) Agua destilada 1000 ml.
e) Indicador de pH: Rojo de fenol
cido: Color amarillo (pH = 6.8)
Alcalino : Color rojo ( pH = 8.4)
Medio no inoculado: Rojo (pH = 7.4)
35
Fundamento
La fermentacin es un proceso metablico de oxido-reduccin
que ocurre en un medio ambiente anaerobio y, en lugar de
oxgeno, un sustrato orgnico sirve como el aceptor final de
hidrgeno
(electrones).
En
los
sistemas
de
prueba
bacteriolgicos, este proceso se detecta observando cambios

de color en indicadores de pH a medida que se forman
productos cidos.
Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono son por
lo general anaerobios facultativos. Por medio del proceso de
fermentacin un hidrato de carbono es degradado y
descompuesto en dos molculas de carbono (triosas) que son
nuevamente degradadas en un nmero de compuestos de 1,
2, 3 y 4 carbonos. Los productos finales varan con cada
especie bacteriana y depende del sistema enzimtico
existente en la especie y las condiciones del medio
ambiente.
El ms importante ciclo fermentativo de la degradacin de
la glucosa es el ciclo de
Embden - Meyerhof aun cuando
ste tambin puede producirse por la derivacin de pentosa

o el ciclo de Entner - Duodoroff. Pueden utilizarse diversos
hidratos de carbono. La bacteria usada depende de las
dificultades que se presenten para identificar un organismo
determinado.
36
Utilizando un indicador de pH con un determinado hidrato

de carbono puede determinarse si una bacteria ha
degradado
el
mismo
en
varios
productos
terminales,
observando un cambio de color visible en el medio.
Bacteria
Indicador de pH
(aldehdos)
CHO
gluclisis
H 2CO2
+
cambio de color
Consistencia del medio

Lquido
Inoculacin
Por difusin, inculo denso
Condiciones de incubacin
Tiempo: 24 - 48 horas
Figura 12. Streptococcus
Temperatura: 35 - 37 C
37
Resultados
NEGATIVO
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
Figura 13. Pruebas bioqumicas de Fermentacin de Carbohidratos
Interpretacin
Positiva = Color amarillo (cido)
Negativa = Color rosa - rojizo (alcalina)
Color naranja
38
Observaciones
Existen ocasiones que con algunas especies de bacterias es
necesaria la incubacin ms prolongada, esto se recomienda
cuando aparece un color naranja, se incuban bajo las
mismas condiciones 24 horas ms. S aun as se presenta
este color la prueba se reporta como negativa ya que lo
ms probable es que el microorganismo est formando
productos metablicos que no necesariamente son por
fermentacin por ello no alcanza el color rojo esperado.
El hecho de incubar por 24 horas ms es poco prctico ya
que la mayor parte de las ocasiones se tiene el tiempo
necesario para la incubacin de 24 horas, por ello en este
manual se considera que la prueba se tome como negativa si
presenta un color naranja.
Reporte de resultados
A = cido
K = alcalino
G = gas
39
Aplicaciones
Microorganismos fermentadores de carbohidratos:
Fermentadores de glucosa: Todos los miembros

de las Enterobacteriaceae.
Fermentadores de glucosa y lactosa:
Escherichia coli, Klebsiella y grupos

Enterobacter.
Fermentadores de manitol: Staphylococcus
aureus
Fermentadores de inositol: Proteus rettgeri
Fermentadores de lactosa: Neisseria lactamica
Fermentadores
de
adonitol:
Providencia
alcaligenes.
de inulina:
Streptococcus
Fermentadores
salivarius y Streptococcus sanguis.
Yersinia
de
sacarosa:
Fermentadores
enterocolitica.
Fermentadores
monocytogenes.
de
40
salicina:
Listeria
Microorganismos no fermentadores de Carbohidratos:
No
fermentadores
de
lactosa:
Enterobacterias patgenas como Salmonella y
Shigella.
No fermentadores de manitol: Staphylococcus
epidermidis.
No fermentadores de salicina: Especies de
Corynebacterium.
No fermentadores de rafinosa: Otras especies
de Aeromonas.
No fermentadores de inositol: Proteus
morganii.
No fermentadores de adonitol: Providencia
stuartii.
No fermentadores de inulina: Streptococcus
del grupo D.
No fermentadores de sacarosa: Otras
especies de Yersinia.
41
2. PRUEBA DE CITRATO
Medio de cultivo: Citrato de Simmons

Composicin:
a) Sulfato de magnesio
b) Monofosfato de amonio
c) Fosfato dipotsico
d) Citrato de sodio
e) Cloruro de sodio
f) Agar
g) Agua destilada
h) Indicador de pH: Azul de bromotimol (pH= 6)
Alcalino: color azul de Prusia intenso (pH = 7.6)
Medio no inoculado: Color verde (pH = 6.9)
Fundamento
Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato
como nica fuente de carbono para el metabolismo y
crecimiento, provocando alcalinidad.
El medio incluye citrato de sodio, un anin como nica
fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente
de nitrgeno.
42
Normalmente el metabolismo del citrato comprende una

condensacin de acetilo con la coenzima A y oxalacetato
para entrar en el ciclo de Krebs. El desdoblamiento del
citrato comprende un sistema enzimtico sin la intervencin
de la coenzima A. Esta enzima se denomina citritasa o
citrato desmolasa.
Citrato
Oxalacetato
Piruvato
acetato
CO2
Los productos obtenidos del metabolismo del citrato

dependen del pH del medio:
pH bsico:
Citrato
CO2 + cido frmico + 2 cido actico
pH cido:
2 Piruvato
acetato + CO
2 Piruvato
acetona
43
+ lactato
+ 2CO2

Slido inclinado (pico de flauta)
Inoculacin
Se toma una colonia bien aislada de la superficie del medio
de aislamiento primario y se inocula como una estra nica
en la superficie del pico de flauta.
Incubacin
Tiempo = 24 - 48 horas
Temperatura = 35 - 37 C
Precauciones
El inculo debe ser liviano.
S
ste
es
demasiado
grande,
compuestos
orgnicos
preformados dentro de la pared celular de las bacterias

que estn muriendo pueden liberar suficiente carbono y
nitrgeno como para dar un resultado falso - positivo.
44
Cuando se inocula una serie de tubos de medios de cultivo

diferenciales con un microorganismo desconocido, es
importante sembrar primero el medio citratado para
prevenir el arrastre de protenas o carbohidratos de los
otros medios, aunque se supone se esteriliza el asa en cada
inoculacin.
Resultados
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
POSITIVO
Figura 14. Pruebas bioqumicas de citrato
45
POSITIVO
Interpretacin
Positivo: Crecimiento aunque no exista cambio de color.
Crecimiento y el medio de color azul intenso en
pico de flauta.
Negativo: No se observa crecimiento y medio de color
verde.
Si se utiliza carbono a partir de citrato de sodio, tambin
se extrae nitrgeno del fosfato de amonio contenido en el
medio, liberndose amoniaco. En ocasiones se detecta un
crecimiento visible a lo largo de la lnea de siembra antes
de la aparicin de color. Este crecimiento visible tambin
indica resultado positivo.
Negativo
(-)
Positivo
(+)
46
Aplicaciones
Microorganismos positivos
Especies de:
Salmonella
Arizona
Citrobacter
Enterobacter
Klebsiella
Serratia licuefaciens
Pseudomonas cepacia
Microorganismos negativos
Edwarsiella
Yersinia enterocoltica
Escherichia coli
Shigella
Yersinia pseudotuberculosis
Otras especies de Moraxella
Proteus morganii
47
3.
PRUEBA
DE
LICUEFACCIN
GELATINA
Medio de cultivo: Gelatina nutritiva
Composicin:
a) Extracto de carne
b)Peptona
c) Gelatina
d) Agua destilada
Fundamento
Determinar la capacidad de un organismo de producir
enzimas de tipo proteoltico (gelatinasas) que licuan la
gelatina.
Las protenas que se producen naturalmente son demasiado
grandes para entrar en una clula bacteriana; por lo tanto,
para que una clula utilice las protenas, primero deben ser
catabolizadas en componentes ms pequeos. Las enzimas
exonucleares
de
tipo
proteltico,
gelatinasas,
son
secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las

protenas
esta
capacidad
ayuda a la identificacin
bacteriana.
48
DE
gelatinasas
Protena + H 2O
polipptidos
Proteasas
gelatinasas
Polipptidos + H 2O
Peptidasas
aminocidos
individuales

Semislido
Inoculacin
Picadura en posicin vertical hasta una profundidad de 2 2.5 cm, inculo denso.
Al trmino de la incubacin se coloca el tubo en un
refrigerador o bao de hielo durante dos horas para
determinar si se ha producido o no la digestin de la
gelatina (licuefaccin).
49
Resultados
MEDIO NO
INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
Figura 15. Pruebas bioqumicas de licuefaccin de gelatina
Interpretacin
Positivo: Medio licuado (estado lquido)
Negativo: Medio slido
El medio de gelatina nutritiva para puncin no es conveniente

para las pruebas de rutina de la actividad de la gelatinasa,
dado
que
muchas
especies
requieren
una
incubacin
prolongada antes de que aparezcan muestras de licuefaccin.

En los mtodos diagnsticos de rutina para identificar
bacterias, la duracin de la incubacin deber alcanzar un
periodo razonable.
50
Positivo
(+)
Negativo
(-)
Aplicaciones
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis (lenta)
Serratia liquefaciens
Serratia marcescens
Pseudomonas aeruginosa
Especies de Flavobacteriumm
Listeria monocytogenes
51
Figura 16. Micrococcus
4. PRUEBA DE LA LECHE CON TORNASOL

Medio de cultivo: Medio de leche tornasolada
Composicin:
a) Leche descremada
b) Agua destilada
c) Indicador de pH: Tornasol
cido: Color rojo (pH = 4.5)
Alcalino: Color azul ( pH = 8.3)
Medio no inoculado: Azul purpreo (pH = 6.8)
Fundamento
Permite diferenciar organismos sobre la base de sus
mltiples reacciones metablicas en un medio lcteo como:
fermentacin de lactosa, caselisis, y coagulacin de la
casena. El tornasol incorporado a la leche es un indicador
de pH y de oxidacin-reduccin que hace que el medio pueda
indicar diversas funciones metablicas. La leche contiene
lactosa, casena, lactalbmina y lactoglobulina, por lo tanto,
un organismo puede mostrar una o varias propiedades
metablicas en la leche tornasolada ayudando as a la
identificacin bacteriana:
1. Fermentacin de lactosa
2. Reduccin del tornasol
3. Formacin de cogulo
4. Peptonizacin (digestin)
5. Formacin de gas
52
1. Fermentacin de lactosa
Cuando un organismo es capaz de fermentar lactosa,
produce principalmente cido lctico, con una condicin
cida indicada por el cambio de color del medio que se
vuelve rojo rosado. A veces el cido butrico es el producto
final.
Ciertas
bacterias
que
forman
lcalis
no fermentan
lactosa, pero actan sobre las sustancias nitrogenadas que

se encuentran en la leche liberando amoniaco, y dando en
consecuencia un pH alcalino que se manifiesta por un color
prpura azulado.
Lactosa
Glucosa
glucosa + galactosa
cido pirvico
cido lctico
cido butrico
CO
+ H2
2. Reduccin del tornasol

El tornasol es un
indicador de pH y un indicador de
oxidacin reduccin; algunos organismos son capaces de

reducir el tornasol a una leucobase.
53
3. Formacin de cogulo
Las enzimas proteolticas provocan la hidrlisis de las
protenas de la leche lo que da como resultado su
coagulacin. La principal enzima responsable de la formacin
de cogulo es la renina.
La formacin del cogulo es causada por la precipitacin de
la casena, por la formacin de cidos o por la conversin de
la casena en paracasena por la enzima renina. La casena es
una fosfoprotena compleja y es la protena ms importante
de la leche.
Formacin de un cogulo cido
La precipitacin de la casena provocada por los cidos
orgnicos a partir de lactosa en condiciones cidas produce
un cogulo firme y gelatinoso que no se separa de las
paredes del tubo.
Lactosa
cido lctico
caseinasa
c. Lctico
casenato de Ca
caseingeno (pp)
54
Formacin del cogulo

Otra forma de cogulo es el coajo, o sea el proceso de
coajado de la leche por la conversin de la casena en
paracasena por las enzimas renina, pepsina o quimiotripsina
contenidas en la leche. La renina provoca el cuajado de la
leche
convirtiendo
la
sal
de
casena
soluble
en
una
paracasena insoluble que es el cuajo o requesn.

renina
Casena
paracasena (pp)
Ca
4. Peptonizacin (digestin)
La hidrlisis de la casena por la actividad enzimtica
produce una conversin final del precipitado caseingeno en
un lquido claro; el proceso se denomina peptonizacin y se
manifiesta por una aclaracin acuosa del medio causada por
una digestin del precipitado (cogulo) y las protenas de la
leche por las enzimas proteolticas de las bacterias. Sin
embargo, solo se produce una peptonizacin cuando la
bacteria que se desarrolla en la leche tornasolada contiene
la enzima proteoltica caseinasa.
55
5. Formacin de gas
Los gases CO
y H
se forman como resultado final de la
fermentacin de la lactosa.

Lquido
Inoculacin
Difusin
Tiempo: 18-48 horas
56
Resultados
Medio no
inoculado
Fermentacin
de lactosa
Figura 17. Pruebas bioqumicas de leche con tornasol
Digestin
Reduccin
de tornasol
No fermentacin
de lactosa
Interpretacin
Rojo rosado: cido; fermentacin de lactosa
Azul purpreo: No fermentacin de lactosa; sin cambio del
indicador de pH.
Azul:
Alcalino;
organismo
Ausencia
ataca
las
fermentacin
sustancias
de
lactosa.
nitrogenadas
que
El
se
encuentran en el medio.
Blanco: Reduccin del tornasol a una leucobase.
Formacin de cogulo: Coagulacin de la protena de la
leche.
Aclaracin del medio: Digestin; se a ingerido la protena de
la leche.
Gas: Produccin de burbujas en la campana de Durham.
57
Cogulo
En la tabla de resultados solo se escribirn las letras que
aparecen dentro del parntesis.
Rojo rosado (A)
Azul purpreo (SC)
Azul (K)
Blanco (Red)
Cogulo (C)
Digestin (D)
Gas (G)
Aplicaciones
Ayuda a la diferenciacin de especies sobre todo del
gnero Clostridium.
Sin crecimiento:
Clostridium cochlearium
C. difficile
C. putrefaciens
C. tetanomorphum
Streptococcus equinus
Con crecimiento:
Streptococcus bovis
58
5. PRUEBA DE REDUCCIN DE LA LECHE CON

AZUL DE METILENO
Medio de cultivo: Medio de leche con azul de

metileno
Composicin:
a) Leche descremada deshidratada
b) Agua destilada
c) Indicador : Azul de metileno
Incoloro : Estado reducido

Azul : Estado oxidado; medio no inoculado
(pH=6.4)
Fundamento
Permite diferenciar organismos por su capacidad de reducir
el azul de metileno en un medio con leche.
citocromo
oxidasa
activa
la
oxidacin
del
El sistema
citocromo
reducido por el oxgeno molecular que a su vez acta como

un aceptor de electrones en el periodo terminal del sistema
de transferencia de electrones. Cuando existen condiciones
aerbicas el oxgeno es el aceptor final del hidrgeno,
produciendo agua o perxido de hidrgeno segn la especie
bacteriana y su sistema enzimtico.
59
Los sustratos artificiales como el azul de metileno, pueden

sustituir a los aceptores de electrones naturales en
cualquier lugar de la cadena de transporte de electrones,
donde actan como reductores del sistema citocromo.
Cuando se agrega el colorante sinttico reducible, azul de
metileno
un
medio
que
contenga
organismos
metabolizantes, los electrones producidos por un sustrato

oxidable son desplazados de su ciclo normal, si se produce
reductasa y son utilizados para reducir el colorante.
H
N(CH )
(CH ) N
N(CH
))____
(CH ) N
3 2
3 2
3 2
3 2
Azul de metileno (estado

reducido, incoloro).
Azul de metileno (estado

oxidado, color azul).

Lquido
Inoculacin
Difusin, inculo denso
60
Tiempo: 18-24 horas
Resultados
MEDIO NO
INOCULADO
NEGATIVO
Figura 18. Pruebas bioqumicas de leche con azul de metileno
Interpretacin
Positiva: Incoloro; reduccin
Negativa: Azul; no hay reduccin
61
POSITIVO
R = Reduccin
(-) = Negativo, sin cambio de color
Aplicaciones
Esta capacidad enzimtica se utiliza fundamentalmente
para
diferenciar
los
enterococos
(especies
de
Streptococcus del grupo D) de otros miembros del gnero

Streptococcus.
Enterococos (Streptococcus del grupo D)
Especies de Streptococcus que por lo general no son
enterococos.
Figura 19. Salmonella
62
6. PRUEBA DE OXIDACIN FERMENTACIN
Medio de cultivo: Medio bsico de Hugh Leifson,

medio O/F.
Componentes:
a) Peptona
b) Cloruro de sodio
c) Fosfato de potasio
d) Hidratos
de
carbono
(glucosa,
lactosa,
sacarosa,
maltosa).
e) Agar
f) Agua destilada
g) Indicador de pH: Azul de bromotimol
cido : Color amarillo (pH = 6)

Alcalino : Azul de Prusia intenso (pH = 7.6)
Medio no inoculado: Verde (pH = 7.1)
Se deben tener dos tubos para esta prueba uno sin sello y
otro con sello de parafina.
Fundamento
Determina el metabolismo oxidativo o fermentativo de un
hidrato de carbono.
63
La utilizacin que una bacteria hace de los hidratos de

carbono tiene lugar por alguno de dos procesos: de
fermentacin o de oxidacin. Algunas bacterias son capaces
de
metabolizar
aerbicas,
un
mientras
carbohidrato
que
otras
solo
en
producen
condiciones
cido
tanto
aerbica como anaerbicamente. La diferencia principal

entre el metabolismo fermentativo y oxidativo depende de
los
requerimientos
fosforilacin
inicial.
de
oxgeno
atmosfrico
La
fermentacin
es
un
de
la
proceso
anaerbico que requiere la fosforilacin inicial de la glucosa

previamente a su degradacin, mientras que la oxidacin, en
ausencia de compuestos inorgnicos como nitrato y sulfato,
es un proceso estrictamente aerbico que comprende la
oxidacin directa de una molcula de glucosa no fosforilada
(inicialmente). La fermentacin produce una acidez ms
elevada que el proceso metablico oxidativo.
El
medio
OF
contiene
una
elevada
concentracin
de
carbohidratos con una baja concentracin de peptona,

produciendo as una condicin alcalina que neutraliza la ms
ligera acidez producida por un organismo oxidativo. El
fosfato
de
potasio
agregado
al
medio
favorece
la
fermentacin y acta como buffer para controlar el pH. La

concentracin
de
agar
empleado
permite
tambin
la
determinacin de la movilidad y ayuda a la distribucin por

todo el tubo del cido producido en la superficie del medio.
64
Son necesarios dos tubos de cada medio de hidratos de

carbono para la prueba. El medio en un tubo se expone al
aire, el otro se cubre con aceite mineral o parafina lquida
estriles. Las bacterias oxidativas producen cidos solo en
el tubo abierto expuesto al oxgeno atmosfrico; los
micoorganismos fermentadores producen cidos en ambos
tubos; y las bacterias no sacarolticas son inertes en este
medio, que permanece con un pH alcalino despus de la
incubacin.
La prueba OF tiene algunas limitaciones; los bacilos no
fermentadores de crecimiento lento pueden no producir
cambios de color durante varios das, y especies que son
particularmente activas sobre aminocidos pueden hacer
que reacciones cidas dbiles reviertan con el tiempo,
confundiendo la interpretacin final.

Semislido (tambin permite la observacin de movilidad).
Inoculacin
Picadura,
inculo
poco
denso.
aproximadamente hasta 0.6 mm de fondo.
65
Picar
ambos
tubos
Condiciones de incubacin:
Temperatura: 35-37 C
Resultados
MEDIO NO INOCULADO
OXIDANTE NO FERMENTADOR
FERMENTADOR
NO OXIDANTE NO FERMENTADOR
Figura 20. Pruebas bioqumicas de Oxidacin / Fermentacin
66
Interpretacin
Amarillo: cido
Burbujas: Gas
Incubacin
Verde: alcalino
Fermentador
No
oxidativo
No
fermentador
Oxidativo
No
fermentador
Figura 21. Diagrama de interpretacin de la prueba de Oxidacin / Fermentacin
Aplicaciones
1.
Fundamentalmente
para
diferenciar
gneros
intestinales no entricos, Gram negativos de la Familia

Enterobacteriaceae.
67
2. Ayuda a la diferenciacin entre los gneros de la

Familia Micrococcaceae.
Micrococcus oxida glucosa

Staphylococcus fermentan glucosa
3. Ayuda a la identificacin de Enterobacterias

Fermentadoras de glucosa: Escherichia coli
Oxidativas de glucosa: Pseudomonas aeruginosa
No sacaroltico: Especies de Moraxella
Metabolismo
Tubo
c/reaccin
Tubo sin sello
Tubo con sello
Oxidacin (O)
Abierto
Amarillo (A)
Verde (-)
Fermentacin (F)
Cubierto
Amarillo (A)
Amarillo (A)
Fermentacin (F)
Cubierto
Amarillo (AG)
Amarillo (AG)
Ni
Ninguno
Azul o verde (-)
Verde (-)
Ambos
Amarillo (A
Amarillo (A
fermentacin
ni oxidacin (-)
Fermentacin
AG)
oxidacin (O+F)
Tabla 1. Reporte de resultados de O / F
68
AG)
6. REACCIN DE LA UREASA
Medio de cultivo: Agar urea de Christensen
Composicin:
a) Peptona
b) Cloruro de sodio
c) Fosfato monopotsico
c) Glucosa
d) Urea
e) Agar
f) Agua destilada
g) Indicador de pH: Rojo de fenol
cido: Amarillo (pH = 6.8)
Alcalino : Rojo rosado (pH = 8.4)
Medio no inoculado: Amarillo (pH = 6.8)
Fundamento
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la
urea formando dos molculas de amoniaco por la accin de la
enzima ureasa produciendo un cambio de color rojo en el
medio.
La hidrlisis de la urea es catalizada por la ureasa, para dar
dos molculas de amoniaco. La ureasa es una importante
enzima microbiana vinculada con la descomposicin de los
compuestos orgnicos.
69
H 2N
C=O + 2 HOH
CO
+ H 2O + 2 NH3
H 2N
Urea

Slido en pico de flauta (cola de pescado)
Inoculacin
Estra en pico de flauta (no hacer puncin).
Tiempo: 18-24 horas
70
(XH )4 CO
2 2
Resultados
MEDIO NO INOCULADO
NEGATIVO
POSITIVO
POSITIVO
Figura 22. Pruebas bioqumicas: Urea
Interpretacin
Positivo: Rojo rosado intenso en el pico de flauta
Negativo: Amarillo
Positivo (+)
Negativo (-)
71
Observaciones
En muchas especies, la reaccin positiva de ureasa se
detecta primero por un cambio de color rojo en la parte de
pico de flauta, el cual, al principio se vuelve rojo porque la
accin alcalina, resultado de la degradacin de pequeas
cantidades de urea, es aumentada por las aminas formadas
a partir de la descarboxilacin oxidativa de los aminocidos
en la parte del medio expuesta al aire.
Aplicaciones
Proteus
rpidamente ureasa positivos de otros miembros de las
enterobacterias, otros gneros pueden ser positivos
retardados.
1. Se
usa
para
diferenciar
los
organismos
- Klebsiella (+)
- Escherichia coli (-)
- Proteus (+ rpido)
- Providencia (-)
Figura 23. Salmonella typhi
72
8. REACCIN DE VOGES-PROSKAUER (VP)

de Clark y Lubs (caldo
Medio de cultivo: Medio

RM/VP)
Composicin:
a) Polipeptona
b) Dextrosa
c) Fosfato de potasio
d) Agua destilada
Fundamento
Determina la capacidad de algunos organismos de producir
un producto final neutro, la acetona a partir de la
fermentacin de glucosa.
La reaccin de VP se basa en la deteccin de acetona como
producto final neutro derivado del metabolismo de la
glucosa.
sta
es
metabolizada
en
cido
pirvico,
intermediario clave en la gluclisis. A partir del cido

pirvico,
una
bacteria
puede
seguir
muchas
vas.
La
produccin de acetona (precursor de la produccin de 2,3butanediol) que es uno de los ciclos para la degradacin de
la glucosa en las bacterias. La formacin de acetona y
butilenglicol es una va alternativa del metabolismo del cido
pirvico. Las bacterias que utilizan esta va producen solo
pequeas cantidades de cidos mixtos que son insuficientes
73
para disminuir el pH del medio de rojo de metilo, lo

bastante como para producir un cambio de color. Por este
motivo muchas de las especies de Enterobacterias son VP
positivas, con pocas excepciones son RM negativas y
viceversa.
El primer reactivo agregado a una alcuota incubada es el
catalizador
alfa-naftol
porque
ste
acta
como
intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la

reaccin sin prdida de su especificidad. El segundo
reactivo es el KOH que cuando se agrega al medio de VP
contribuye a la absorcin de CO 2. No debe excederse de un
volumen exacto. El KOH reaccionar con la peptona dando
un color rosado salmn y con el agregado posterior de alfanaftol no habr alteracin del color.
O H
C H 3
C H 3
O 2 OXIDADO
O
C
+
KOH
O
C H O H
Alfa-naftol (catalizador)
C H 2
C H 2
Diacetilo
Acetona
+
N H 2
N H
N H
condensacin
Color rojo rosado
Ncleo de guanidina
74

Lquido
Inoculacin
Difusin
Reactivos adicionales
a) Alfa naftol al 5%, intensificador del color
b) Hidrxido de potasio 40%, agente oxidante
Agregar directamente los reactivos al tubo despus de la
incubacin en el siguiente orden:
1) 0.6ml de alfa naftol
2)0.2ml de KOH
3)Agitar el tubo suavemente, dejar reposar de 10 a
15 minutos antes de la interpretacin.
75
Precauciones
El orden de adicin de los reactivos es importante, ya que la
inversin de incorporacin dar como resultado un dbil
positivo o falso negativo.
No debe excederse un volumen exacto de KOH ya que el
exceso puede ocultar una reaccin VP dbilmente positiva.
Resultados
POSITIVO
NEGATIVO
MEDIO NO
INOCULADO
Figura 24. Prueba bioqumicas de la reaccin de Voges - Proskauer
Interpretacin
Positivo: Rojo rosado en la superficie del medio (presencia
de acetona).
Negativo: Amarillo. Puede formarse un color cobrizo pero
an as la reaccin es negativa.
76
Positivo (+)
Negativo (-)
Aplicaciones
- Klebsiella pneunoniae
- Yersinia enterocolitica
Microorganismos
negativos
-Escherichia coli
-K. ozaenae
Figura 25. Escherichia coli
77
9. REACCIN DE ROJO DE METILO (RM)
Medio de cultivo : Medio de Clark y Lubs (caldo RM/VP)

Composicin:
e) Polipeptona
f) Dextrosa
g) Fosfato de potasio
h) Agua destilada
i) Indicador: rojo de metilo
PH inicial = 6.9, medio no inoculado, color rojo.
cido: rojo (pH = 4.4)
Alcalino: amarillo (pH = 6)
Fundamento
Comprobar la capacidad de un organismo de producir y
mantener estables los productos terminales cidos de la
fermentacin
de
la
glucosa
vencer
la
capacidad
amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa de la

produccin de cido (determinacin de pH). Las bacterias
que principalmente siguen la va de fermentacin de cidos
mixtos a menudo producen suficiente cido para mantener
un pH menor de 4.4.
78
La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un

indicador de pH para determinar la concentracin de iones
hidrgeno
presentes
cuando
un
organismo
fermenta
glucosa. Las bacterias RM positivas producen cidos

estables manteniendo una alta concentracin de iones
hidrgeno hasta alcanzar cierta concentracin y entonces
cesa toda actividad.
Los organismos RM negativo tambin producen cidos pero
tienen una menor concentracin de iones hidrgeno porque
hay una reversin hacia la neutralidad debida a la nueva
degradacin de los cidos orgnicos en carbonatos.
La validez de la prueba de RM depende de un tiempo de
incubacin suficiente como para permitir que se produzca la
diferencia en el metabolismo de la glucosa. Los organismos
en estudio se incubarn por lo menos 2 das, lo que permite
que todos los organismos con baja proporcin gaseosa
muestren su lmite en la concentracin de iones hidrgeno.

Lquido
Inoculacin
Difusin
79
Tiempo: 48 horas
Reactivos adicionales para Rojo de Metilo

Rojo de metilo. Adicionar 5 gotas al tubo previamente
incubado.
Interpretar el resultado del color inmediatamente.
Conservacin: Guardar el reactivo en refrigeracin (4 C)
mientras no se usa.
Resultados
MEDIO NO INOCULADO
NEGATIVO
POSITIVO
Figura 26. Pruebas bioqumicas de la reaccin de Rojo de Metilo
80
Interpretacin de rojo de metilo

No debe intentarse interpretar un resultado con el rojo de
metilo despus de menos de 48 horas de incubacin.
Positiva: Rojo en la superficie del medio (pH = 4.4)
Algunas bacterias pueden producir menores cantidades de
cido a partir del sustrato por ello es posible que aparezca
un color naranja. Esto indica una prueba positiva.
Negativo: Amarillo (pH = 6) naranja
Positivo (+)
Negativo (-)
Aplicaciones
- Escherichia coli
- Especies de Yersinia
Figura 27.
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Klebsiella
81
10. PRUEBA DE REDUCCIN DE NITRATOS

Medio de cultivo: Caldo con nitrato
Ingredientes:
b) Peptona
c) Nitrato de potasio
d) Agar
e) Agua destilada
f) PH inicial = 7.0
Fundamento
Determinar la capacidad de un organismo de reducir el
nitrato en nitritos o en nitrgeno libre.
La reduccin de nitrato en nitrito y en gas nitrgeno tiene
lugar generalmente en condiciones anaerobias, en las cuales
un organismo obtiene su oxgeno del nitrato. El oxgeno
sirve como un aceptor de hidrgeno.
Reduccin del nitrato en nitrito
NO3
Nitrato
2 e 2 H+
NO2
nitrito
82
H 2O
Nitrato en nitrgeno molecular

2 NO
+ 10 e + 12 H+
N2 + 6 H 2O
La reduccin de nitrato en nitrito est indicada por la

aparicin de color cuando el nitrito reacciona con los dos
reactivos. La reaccin de color resultante se debe a la
formacin de un compuesto diazoico, p-sulfobenceno-azoalfa-naftilamina.
NH2
+ HNO2
NH2
SO 2H
SO 2H
cido sulfanilico
(incoloro)
P-sulfobenceno-azo-affa-naftilamina
(rojo)
Alfa-naftilamina
NH2
Zn
+
CH 2COOH
cido actico
SO2H
NH2
83
(C H
6 NHNH
3
3) - OSO H
Arilhidracina

Lquido
Inoculacin
Difusin, inculo denso.
Tiempo: 18-24 horas
Temperatura 35 - 37 C
Raramente es necesaria una incubacin prolongada de hasta
5 das. La mayora de los organismos capaces de reducir el
nitrato, lo hacen dentro de las 24 horas.
1. Alfa - naftilamina 0.05 %
2. cido sulfanilico 0.8 %
Adicionar directamente al tubo de reaccin en el siguiente
orden:
1. Alfa - naftilamina 1 ml.
2. cido sulfanilico 1 ml.
84
Conservacin: Guardar ambos reactivos en el refrigerador

mientras no se usan. Por lo general se mantienen estables
durante tres meses.
Resultados
MEDIO NO INOCULADO
POSITIVO
NEGATIVO
Figura 28. Pruebas bioqumicas de Reduccin de Nitritos
Interpretacin
Se interpretan los resultados un minuto despus de adicionar
los reactivos.
Positivo: rosa a rojo intenso
Negativo: Amarillo
85
Precauciones
Una prueba negativa indica que los nitratos, no han sido
reducidos o que han sido reducidos a otros productos, como
amoniaco, nitrgeno molecular, oxido ntrico u xido nitroso
e hidroxilamina.
Dado que los reactivos de prueba detectan solo nitritos, este
ltimo proceso llevara a una lectura falsa - negativa. Por
ende es necesario agregar una pequea cantidad de polvo de
zinc a todas las reacciones negativas.
Los iones zinc reducen nitratos a nitritos y la aparicin de
color rojo despus del agregado de zinc indica una reaccin
positiva.
Positivo (+)
Negativo (-)
Aplicaciones
Ayuda a la identificacin de Enterobacterias que por lo
general son positivas.
Todas las Enterobacterias, con excepcin de ciertos tipos de
Enterobacter agglomerans y especies de Erwinia, reducen

nitratos a nitritos.
86
11. PRUEBA DE FENILALANINA DESAMINASA
Medio de cultivo: agar fenilalanina

Composicin:
a) D-L-fenilalanina
b) Extracto de levadura
c) Cloruro de sodio
d) Fosfato de sodio
e) Agar
f) Agua destilada
g) PH inicial = 7.3
Fundamento
Determina la capacidad de un organismo de desaminar la
fenilalanina
en
cido
fenilpirvico
por
su
actividad
enzimtica, con la consiguiente acidez resultante.

El aminocido aromtico fenilalanina sufre una desaminacin
oxidativa catalizada por un aminocido oxidasa para producir
el cido cetnico.
La desaminacin oxidativa da como resultado la extraccin
del grupo amino del aminocido para formar un doble enlace
alfa-cetocido y libre de amoniaco.
87
Este es un proceso en dos etapas:

1. La extraccin del hidrgeno dando un aminocido y el
hidrgeno se combina con el oxgeno para formar agua.
2. El aminocido es hidrolizado en un cetocido
CH
COOH
CH
- 2H
NH
1/2 O
FLAVOPROTENA
FENILALANINA
C
CH
COOH
NH
2
AMONIACO
CIDO FENILPIRVICO
Qumica de la accin reactiva

Como la fenilalanina se encuentra desaminada, el color
producido como consecuencia del agregado de cloruro
frrico al 10 % se debe a la formacin de un cetocido el
88
cido fenilpirvico. La reaccin positiva con este reactivo se

debe a la formacin de una hidrazona. El cloruro frrico
acta
como
agente
quelante
actuando
con
el
cido
fenilpirvico para formar un color verde.

Cuando se expone al oxgeno atmosfrico un tubo de cultivo
con fenilalanina despus del agregar el cloruro frrico
aumenta la produccin y la intensidad de la reaccin
positiva.
CH2
COOH
CH2
N
O + RNH
NH2
Hidracina
cido fenilpirvico
Fenilhidrazona

Slido en pico de flauta
Inoculacin
Estra en pico de flauta, inculo denso.
89
COOH
NHR
Tiempo: 18-24 horas
Cloruro frrico 10%
Adicionar de 4-5 gotas a un tubo incubado
Hacer rotar suavemente el tubo para que el crecimiento se
separe.
Esperar de 1 a 5 minutos para leer la reaccin.
Conservacin: Guardar los reactivos en refrigeracin y
colocarlos
en
frascos
oscuros
para
evitar
la
descomposicin.
Aplicaciones
Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las
especies de Proteus y del grupo Providencia, y se usa para
separar estos dos gneros de otros miembros de las
Enterobacterias.
90
Resultados
MEDIO NO
INOCULADO
NEGATIVO
POSITIVO
NEGATIVO
Figura 29. Pruebas bioqumicas de fenilalanina desaminasa
Interpretacin
Positiva: Rojo claro a intenso en el pico de flauta.
Negativo: Amarillo
Positivo (+)
Negativo (-)
91
12. PRUEBA DE SULFURO INDOL MOVILIDAD

(SIM)
Medio e cultivo: Medio SIM
Composicin:
b) Peptona
c) Hierro peptonizado (indicador de SH 2)
d) Tiosulfato de sodio (indicador de SH 2)
e) Agar
f) Agua destilada
g) pH = 7.3
Fundamento
Determinar si un organismo es mvil o inmvil, si es capaz de
liberar cido sulfhdrico por accin enzimtica de los
aminocidos que contienen azufre produciendo una reaccin
visible de color negro y por ltimo la capacidad de
desdoblar el indol de la molcula triptfano, adems que la
consistencia
del
medio
permite
movilidad de algunas bacterias.

1. Produccin de cido sulfhdrico
2. Produccin de indol
3. Movilidad
92
la
observacin
de
la
1.
La
Prueba de cido sulfhdrico
proteolisis
de
las
protenas
en
aminocidos
(aa.)
individuales, algunas especies bacterianas son capaces de

liberar azufre enzimticamente de los diferentes aa. que
las contienen, produciendo el gas cido sulfhdrico (SH 2). La
peptona, cistena y tiosulfato, todos son fuentes de azufre,
pero las diferentes especies utilizan distintos compuestos o
aa. que contienen azufre para producir SH 2. La enzima
responsable de sta actividad es la cisteinasa.
Primera etapa:
La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio
de una reaccin de reduccin que da un sulfito y un sulfato.
Este es un proceso de respiracin anaerbica donde el
tomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la
oxidacin
de
los
sustratos
orgnicos.
El
tiosulfato
reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es una

fuente de azufre para el organismo.
Segunda etapa:
El gas incoloro SH 2 reacciona con una sal pesada, citrato
frrico de amonio para producir un precipitado negro
insoluble, sulfuro ferroso.
93
Bacteria (medio cido)
SH2
tiosulfato de sodio
iones frricos
gas SH2
sulfuro ferroso (pp. negro)
Medios para la deteccin de H 2S
Agar sulfito de bismuto

Agar citrato sulfuro
Agar desoxicolato - citrato
Medio LIA
Medio TSI
Agar acetato de plomo
Agar S-S
Agar XLD
Medio SIM
2.
Prueba de la produccin de indol
El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por

ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales:
indol,
escatol
indolactico.
Diversas
enzimas
intracelulares que intervienen en ste proceso reciben el

94
nombre de triptofanasa, lo que implica el sistema completo

de enzimas vinculadas con la produccin del indol. El
principal intermediario en la degradacin del triptfano es
el cido indolpirvico.
La degradacin del triptfano libera indol, cido pirvico,
amoniaco y energa. El cido pirvico puede ser nuevamente
metabolizado por medio del ciclo glucoltico o entrar en el
ciclo de Krebs para liberar CO
y H 2O y una gran produccin
de energa. El NH 3 puede ser utilizado para sintetizar

nuevos aminocidos empleando la energa que se encuentra
para la reaccin anablica.
La prueba de indol se bas en la formacin de un complejo
de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo
de
p-dimetilaminobenzaldehdo
(sustancia
activa
del
reactivo de Kovacs).
La formacin de indol se produce solamente en aquellos
organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono.
La elevada acidez producida por la fermentacin de la
glucosa puede impedir el crecimiento del organismo o inhibir
la enzima.
El agregado de triptfano estimula la produccin de indol
mientras que la glucosa la inhibe.
95
COOH
NH
T riptofanasa
H 2O
D esam inacin
- T riptfano
+
H
N H
COOH
Indol
A m oniaco
cido P irvico
3. Movilidad
Determina si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias
tienen
movilidad
por
medio
de
sus
flagelos,
que
se
encuentran principalmente entre los bacilos; sin embargo

algunas formas de cocos son inmviles.
Las bacterias mviles pueden contener un solo flagelo o
muchos; adems su localizacin vara
con
su
especie
bacteriana
las
condiciones de cultivo. A veces, las

bacterias
con
movilidad
producen
variantes no mviles que parecen ser

estables y raramente se revierten en
formas mviles.
96
Medios para la deteccin de movilidad

1. SIM
2. MIO

Semislido en forma vertical
Inoculacin
Picadura en forma vertical
Los cultivos que van a someterse a pruebas de indol debern
ser incubados aerbicamente el descenso de la tensin de
oxgeno disminuye la produccin de indol.
97
Prueba de indol
Reactivo de Kovacs
Adicionar
5 gotas y agitar suavemente el tubo
Interpretar
inmediatamente.
Conservacin:
Los
reactivos
debern
guardarse
en
el
refrigerador (4 C) mientras no se usan, su estabilidad es

variable, por lo tanto se har todas las semanas un control
de calidad, desechndolos si muestran una reaccin dbil o
negativa con un organismo positivo conocido.
PRUEBA
Sulfuro
POSITIVO
+
NEGATIVO
-
Indol
Movilidad
Tabla 2. Reporte de resultados del medio SIM
98
Resultados
INDOL
NEGATIVO
INDOL
POSITIVO
MEDIO SIN
INOCULAR
H 2S
NEGATIVO
H S
2
GAS
POSITIVO
Figura 31. Pruebas bioqumicas del medio SIM
Interpretacin
1.
cido sulfhdrico
Positivo: Ennegrecimiento del medio

Negativo: Sin ennegrecimiento
99
2.
Indol
Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio.

Negativa: No se produce color
Negativa: Color naranja en la superficie del medio. Indica
desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser
el precursor de la formacin de indol.
La reaccin positiva despus de 24 horas indica una prueba
completa.
Si el cultivo de 24 horas es negativo deber incubarse otras
24 horas y repetirse la prueba.
3.
Movilidad
Positiva. Los organismos mviles migran de la lnea de siembra

y se difunden en el medio provocando turbiedad.
Negativa. Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la lnea
de siembra.
100
Aplicaciones
Bacterias
Produccin de
H 2S
Produccin de Movilidad
indol
+o-
+o-
E. coli
+o-
Klebsiella
+o-
Enterobacter
Citrobacter
Shigella
+o-
+o-
Salmonella
typhi
Salmonella
Tabla 3. Aplicaciones del medio SIM
Figura 33. Escherichia coli
101
12.
AGAR TRIPLE AZUCAR HIERRO: TSI
Medio de cultivo: Agar hierro triple azcar (agar hierro

de Kligler, AHK)
Composicin:
f) Extracto de carne
g) Extracto de levadura
h) Peptona
i) Proteasa
j) Lactosa
k) Dextrosa
l) Sulfato ferroso
m) Cloruro de sodio
n) Tiosulfato de sodio
o) Agar
p) Agua destilada
q) Indicador: Rojo de fenol
cido: amarillo
Alcalino: rojo
Medio no inoculado: naranja rojizo (pH =7.4)
102
Fundamento
Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato
de
carbono
especfico
incorporado
en
un
medio
de
crecimiento bsico, con produccin o no de gases, junto con la

determinacin de posible cido sulfhdrico.
El agar AHK es un medio diferencial que determina tanto la
fermentacin de los hidratos de carbono y la produccin de
cido sulfhdrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de
los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados,
caractersticas que son utilizadas para la diferenciacin de
stas, principalmente para las Enterobacterias.
Este medio contiene lactosa con una concentracin de 1% y
glucosa
0.1%,
lo
cual
permite
la
observacin
de
la
fermentacin de uno o de ambos carbohidratos por parte de

las bacterias, adems de la produccin de gas y de cido
sulfhdrico.
La fermentacin es un proceso que se lleva acabo en
condiciones aerbicas (pico de flauta) y anaerbicamente
(capa inferior). En el pico de flauta la glucosa (monosacrido)
es catabolizada inicialmente por medio del ciclo anaerbico de
Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por
los anaerobios para dar cido pirvico, y posteriormente ste
ser degradado a travs del ciclo de Krebs para dar CO 2, H 2O
y energa.
103
Por otra parte la lactosa (disacrido) ser primero degradada

a sus monosacridos correspondientes (glucosa y galactosa).
Beta-galactosidasa
Lactosa
glucosa + galactosa
Ciclo de Krebs
Glucosa o galactosa
CO
+ H 2O + energa anaerbico
El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una

concentracin
10
veces
mayor
de
lactosa.
Las
Enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan
metabolizando este azcar, ya que las enzimas que utilizan la
glucosa
bacterias,
estn
y
presentes
stas
como
pueden
constituyentes
obtener
mayor
de
las
energa
por
utilizacin del azcar ms simple.

Todos los otros carbohidratos deben ser convertidos en
glucosa para entrar en el ciclo de Embden-Meyerhof. La
utilizacin de la glucosa se realiza en forma aerobia sobre la
estra, donde el oxgeno presente acta como aceptor
terminal de electrones y en la parte terminal de la columna en
condiciones de anaerobiosis. Una vez que una bacteria
fermentadora
de
glucosa
ha
reducido
toda
la
glucosa
disponible a piruvato, comenzar a metabolizar el piruvato a

travs del ciclo aerbico de Krebs (sobre la estra), formando
104
productos finales cidos. El cido en el medio hace virar el

amarillo del indicador de pH, rojo de fenol. Entonces, luego de
6 horas de incubacin, la zona de la estra y el fondo del tubo
inoculado con un fermentador de glucosa tendrn un color
amarillo. Si el microorganismo no fermenta la glucosa, el
fondo permanecer rojo (indicando que no hay variacin del
pH) o se alcalinizar (lo que puede visualizarse por un color
rojo algo ms intenso que del medio original), demostrando
que
la
bacteria
no
es
miembro
de
la
familia
Enterobacteriaceae.
Despus de haber agotado la cantidad limitada de glucosa,
una bacteria con capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa
comenzar a degradarlas. Como el medio contiene 10 veces
ms lactosa que glucosa, las bacterias encontrarn sustrato
suficiente para continuar la formacin de productos finales
cidos. Luego 18 - 24 horas de incubacin todo el medio TSI
permanecer de color amarillo. Esta reaccin se denomina
cido sobre cido (A/A) y el organismo se identifica como un
fermentador de lactosa. La produccin de gas provocar la
ruptura de la columna de agar o la empujar hacia la parte
superior, de modo que un fermentador de lactosa que produce
gas dar una reaccin A/A ms gas.
Si el organismo en estudio no es capaz de usar la lactosa del
medio, debe producir energa en forma menos eficiente al
utilizar las protenas y aminocidos del medio como fuentes
nutritivas.
105
El metabolismo proteico se produce en la superficie de la

zona inclinada donde el oxgeno es abundante. Los productos
de la degradacin de la peptona (como el amoniaco) son
alcalinos y provocan el viraje del indicador rojo de fenol a su
color rojo original. Un TSI inoculado con una bacteria que no
fermenta la lactosa al cabo de 18-24 horas de incubacin
presentar la zona inclinada roja y el fondo del agar
permanecer amarillo debido al metabolismo anaerobio de la
glucosa durante la primera etapa. Esta reaccin se denomina
alcalina sobre cido (K/A).
Las bacterias que fermentan la glucosa tambin pueden
formar productos alcalinos a partir de la utilizacin de la
peptona, sobre la zona inclinada. Estas reacciones sern K/K.
Inoculacin
Picadura y estra en pico de flauta
106
Resultados
K/A
K/K
K/A
MEDIO
MEDIO
NO INOCULADO
NO INOCULADO
GAS
K/K
GAS
H2S
A/A
H2S
A/A
Figura 34. Pruebas bioqumicas del medio TSI
Figura 35. Salmonella
107
Interpretacin
1. Rojo en pico de flauta: alcalino; degradacin aerbica de
glucosa.
Amarillo en capa profunda: cido; degradacin anaerbica
de la glucosa.
2. Amarillo en pico: cido
Amarillo en capa profunda: cido
3. Rojo en pico de flauta: alcalino
Sin cambio de color en capa profunda: alcalina.
4. Produccin de H 2S: precipitado negro
5. Produccin de gases: Produccin de burbujas,
descomposicin del medio, ligera muesca del medio sobre
el costado del tubo o desplazamiento del medio del fondo,
dejando un espacio libre.
Observaciones
Una bacteria productora de H 2S puede dar tal cantidad de
precipitado
negro
de
sulfuro
ferroso
que
oculte
completamente la acidez producida en la capa profunda. Sin

embargo, si se forma H 2S es que existe en la capa profunda
una condicin cida, aun cuando no se observe, y debe ser
registrada como tal.
Es esencial que se interprete la fermentacin al trmino de
18 - 24 horas de incubacin, ya que una interpretacin
prematura o demorada dar formas de fermentacin no
vlidas que llevarn a errores en el agrupamiento del gnero
o especie.
108
1. K / A
(Fermentacin de glucosa solamente)
2. A / A
(Fermentacin de glucosa y lactosa)
3. K / K
(No fermentacin de glucosa y lactosa).
Los resultados se escriben siempre siguiendo un patrn.

Primero la reaccin del pico de flauta seguida por la reaccin
de la capa profunda, separadas por una barra.
Reacciones de TSI
Pico de flauta alcalino / profundidad alcalina (K/K). No
fermentacin de hidratos de carbono. Caracterstico de
bacterias no fermentadoras como Pseudomonas aeruginosa.
Pico de flauta alcalino / profundidad cida (K/A). Glucosa
fermentada,
lactosa
no
fermentada.
Caracterstico
de
bacterias no fermentadoras de lactosa como especies de
Shigella.
Pico
de
flauta
alcalino
profundidad
cida
(negra)
(K/A/H 2S). Glucosa fermentada, lactosa no fermentada;

produccin
de
H 2S.
Caracterstico
de
bacterias
no
fermentadoras de lactosa y productoras de H 2S como:

Salmonella, Arizona, Citrobacter y algunas especies de
Proteus.
109
Pico de flauta cido / profundidad cida (A/A). Glucosa y

lactosa fermentadas. Caracterstico de coliformes que
fermentan
lactosa
como:
E.
coli
grupo
Klebsiella-
Enterobacter.
No fermentador
No fermentacin
pH = 7.4
O2
Aminas
Pptidos
Aminas
Pptidos
Pico de flauta alcalino/profundidad alcalina
No fermentador de lactosa
Dextrosa
cidos mixtos
Dextrosa
cidos mixtos
O2
Aminas
Pptidos
Pico de flauta cido/profundidad cida

Reaccin inicial
O2
Pico de flauta alcalino/profundidad cida

Reaccin retardada
O2
Pico de flauta cido/profundidad cida
Fermentador de lactosa (sacarosa)

Dextrosa + lactosa
cidos mixtos
Aminas
Pptidos
Figura 36. Fundamento de la Prueba bioqumica TSI
Aplicaciones
Este tipo de pruebas se utilizan principalmente para la
identificacin
Enterobacterias.
primaria
de
110
los
miembros
de
las
Especie
bacteriana
Superficie Fondo Gas
H 2S
inclinada
Enterobacter
Hafnia
Klebsiella
K
A
++
+
++
E. coli
Shigella
Salmonella
typhi
S. paratyphi
S.
choleraesuis
Otras
Salmonellas
+++
Citrobacter
+++
Edwarsiella
+++
Serratia
Proteus
vulgaris
+++
P. mirabilis
P. morganii
+++
P. rettgeri
Providencia
+o-
Tabla 4. Aplicaciones de la Pruba con TSI
111
13. Agar lisina hierro: LIA

Medio de cultivo: Base de descarboxilasa de Moller
Composicin:
a) Peptona
b)Extracto de carne
c) Piridoxal
d) L-lisina
e) Citrato de amonio
f) Tiosulfato de sodio
g) Glucosa
h) Agua destilada
i) Agar
j) Indicador de pH: Prpura de bromocresol
cido: color amarillo (pH = 5.2)
Alcalino: color prpura (pH = 6.8)
Medio no inoculado: color prpura intenso
brillante (pH = 6.0)
Fundamento
Mide
la
capacidad
enzimtica
de
un
organismo
para
descarboxilar un aminocido (lisina y arginina) para formar

una amina, con la consiguiente alcalinidad.
112
La descarboxilacin es el proceso mediante el cual las

bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas
son capaces de atacar a los aminocidos en su grupo
carboxilo dando una amina o una diamina y anhdrido
carbnico. La descomposicin de los aminocidos se produce
anaerbicamente.
El
proceso
de
descarboxilacin
es
irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima comn, el

fosfato de piridoxal.
El aminocido L-lisina sufre la descarboxilacin para dar
cadaverina y CO
por accin de la enzima especfica lisina-
descarboxilasa.

Reporte
resultados
de
Inoculacin
A = cido
Por picadura y estra, inculo liviano.
K = Alcalino
N = Neutra
Temperatura: 35 -37 C
113
R = Rojo (desaminacin
oxidativa)
Resultados
K/K
K/K
H2S
H2S
K/A
K/A
GAS
GAS
MEDIO
MEDIO
NO INOCULADO
NO INOCULADO
H2S
H2S
K/K
K/K
Figura 37. Pruebas bioqumicas con medio LIA
Interpretacin
K/K = azul de Prusia /azul de Prusia
Desaminacin oxidativa / descarboxilacin
K/A= azul de prusia / lila
No desaminacin
Produccin de H 2S = Ennegrecimiento del medio
Produccin de gas = Burbujas o levantamiento del
medio de cultivo de las paredes del tubo.
114
Aplicaciones
Especie
bacteriana
Superficie
inclinada
Fondo
Gas
H 2S
E. coli
KoN
-o+
Shigella
Salmonella
+o-
S. paratyphi
+o-
-o+
Otras
KoN
Arizona
KoN
Citrobacter
-o+
+o-
Edwarsiella
-o+
Klebsiella
KoN
+o-
Enterobacter
+o-
E. aerogenes
KoN
E. hafniae
KoN
-o+
Proteus
P. mirabilis
P. morgarnii
KoR
P. rettgeri
Providencia
typhi
Salmonellas
cloacae
vulgaris
Tabla 5. Aplicaciones de la Prueba Bioqumica LIA
115
13.
Movilidad, indol y ornitina: MIO

Medio de cultivo
Composicin:
a) Extracto de levadura
b)Peptona
c) L-ornitina
d) Dextrosa
e) Agar
f) Agua
g) Indicador de pH: prpura de bromocresol
cido: color amarillo (pH = 5.2)
Alcalino: color prpura (pH = 6.8)
Medio no inoculado: color prpura intenso
brillante (pH = 6.0)
Fundamento
El
medio
MIO
se
utiliza
para
la
identificacin
de
Enterobacterias sobre la base de movilidad, la produccin de

ornitina descarboxilasa y de indol.
1. Descarboxilacin de ornitina
2. Produccin de indol
3. Movilidad
116
1. Descarboxilacin de ornitina
Mide
la
capacidad
enzimtica
de
un
organismo
para
descarboxilar un aminocido (ornitina) para formar una

amina, con la consiguiente alcalinidad.
La descarboxilacin es el proceso mediante el cual las
bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas
son capaces de atacar a los aminocidos en su grupo
carboxilo dando una amina o una diamina y anhdrido
carbnico. La descomposicin de los aminocidos se produce
anaerbicamente.
El
proceso
de
descarboxilacin
es
irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima comn, el

fosfato de piridoxal.
El aminocido L-lisina sufre la descarboxilacin para dar
cadaverina y CO
por accin de la enzima especfica lisina-
descarboxilasa.
El aminocido L-ornitina es descarboxilado por la enzima
ornitina descarboxilasa para dar la diamina putrescina y CO 2,
producidos en condiciones anaerobias.
2. Prueba de la produccin de indol

El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por
ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales:
indol, escatol e indolactico.
117
Diversas enzimas intracelulares que intervienen en ste

proceso reciben el nombre de triptofanasas, lo que implica el
sistema completo de enzimas vinculadas con la produccin
del indol. El principal intermediario en la degradacin del
triptfano es el cido indolprvico.
La degradacin del triptfano libera indol, cido pirvico,
amoniaco y energa. El cido pirvico puede ser nuevamente
metabolizado por medio del ciclo glucoltico o entrar en el
ciclo de Krebs para liberar CO
y H 2O y una gran produccin
de energa. El NH 3 puede ser utilizado para sintetizar nuevos

amiocidos empleando la energa que se encuentra para la
reaccin anablica.
La prueba de indol se basa en la formacin de un complejo de
color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo de
p-dimetilaminobenzaldehdo (sustancia activa del reactivo de
Kovacs).
La formacin de indol se produce solamente en aquellos
organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono.
La elevada acidez producida por la fermentacin de la
glucosa puede impedir el crecimiento del organismo o inhibir
la enzima. El agregado de triptfano estimula la produccin
de indol mientras que la glucosa la inhibe.
118
3. Movilidad
Determina si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias
tienen
movilidad
por
medio
de
sus
flagelos,
que
se
encuentran principalmente entre los bacilos; sin embargo

algunas formas de cocos son inmviles.
Las bacterias mviles pueden contener un solo flagelo o
muchos;
adems
su
localizacin
vara
con
su
especie
bacteriana y las condiciones de cultivo. A veces, las

bacterias con movilidad producen variantes no mviles que
parecen ser estables y raramente se revierten en formas
mviles. Los organismos no mviles carecen de flagelos.
Medios para la deteccin de movilidad

3. SIM
4. MIO

Semislido en forma vertical
Inoculacin
Por picadura, en forma vertical
119
Temperatura: 35 -37 C
Prueba de indol
Reactivo de Kovacs
Adicionar 5 gotas y agitar suavemente el tubo
Interpretar inmediatamente.
Conservacin:
Los
reactivos
debern
guardarse
en
el
refrigerador (4 C) mientras no se usan su estabilidad es

variable, por lo tanto se har todas las semanas un control
de calidad, desechndolos si muestran una reaccin dbil o
negativa con un organismo positivo conocido.
120
Resultados
ORNITINA NEGATIVO
MOTILIDAD POSITIVO
ORNITINA POSITIVO
MOTILIDAD NEGATIVO
INDOL
NEGATIVO
INDOL
POSITIVO
MEDIO NO
INOCULADO
Figura 38. Pruebas bioqumicas del medio MIO
Interpretacin
1.
Ornitina descarboxilasa
Positivo: color prpura del medio

Negativo: Color amarillo en el fondo del tubo que puede ser
prpura al final.
121
2.
Indol
Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio.

Negativa: No se produce color
Negativa: Color naranja en la superficie del medio.
Indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que
puede ser el precursor de la formacin de indol.
La reaccin positiva despus de 24 horas indica una
prueba completa.
Si el cultivo de 24 horas es negativo deber incubarse
otras 24 horas y repetirse la prueba.
3.
Movilidad
Positiva. Los organismos mviles migran de la lnea de

siembra y se difunden en el medio provocando turbiedad.
Negativa. Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la
lnea de siembra.
*Se
leen
las
reacciones
de
movilidad
de
ornitina
descarboxilasa antes de agregar el reactivo de Kovacs para

la prueba de indol.*
122
Prueba
Movilidad
Indol
Ornitina
Positivo
Negativo
Tabla 6. Reporte de resultados del medio MIO
Aplicaciones
Microorganismos ornitina positivos
Especies de Enterobacter
Proteus mirabilis
Proteus morganii
Yersinia enterocolitica
Microorganismos ornitina negativos
Especies de Klebsiella
Enterobacter aglomerans
Proteus vulgaris
Proteus rettgeri
Yersinia pestis
Yersinia pseudotuberculosis
123
Bacterias
Produccin
de indol
Movilidad
+o-
+o-
+o-
+o-
Enterobacter
Citrobacter
+o-
+o-
Salmonella
Produccin
de H 2S
typhi
Otras
Salmonellas
E. coli
Klebsiella
Shigella
Tabla 7. Aplicaciones de la Prueba bioqumica MIO
Figura 39. Shigella
124
El metabolismo se define como una serie de reacciones

qumicas que se llevan acabo en el microorganismo de tipo
fisiolgico para que se adapte al medio.
Las funciones especficas del metabolismo son cuatro:
1.
Obtencin
de
energa
qumica
de
las
molculas
combustibles.
2. La conversin de principios nutritivos exgenos en
sillares
de
construccin
precursores
de
los
componentes macromoleculares de la clula.

3. El ensamblaje de estos materiales para formar,
protenas,
cidos
nucleicos,
lpidos
otros
componentes celulares.
4. La
formacin
degradacin
de
las
biomolculas
necesarias para las funciones especializadas de las

clulas.
Anabolismo:
Sntesis
de
macromolculas
(cpsulas,
membranas, protenas, etc).

La biosntesis de las molculas orgnicas a partir de estos,
precisa del consumo de energa qumica aportada por el ATP
generado durante el catabolismo.
125
Catabolismo: Degradacin o rompimiento de molculas

grandes (glcidos, lpidos y protenas), se degradan para
producir molculas ms sencillas.
El catabolismo va acompaado de la liberacin de la energa
qumica inherente a la estructura de las molculas orgnicas
o nutritivas y a su conservacin en forma de ATP.
Las clulas pueden dividirse en dos grandes grupos segn la
forma qumica del carbono que precisan tomar del entorno:
Auttrofas: (auto alimentadas), pueden utilizar el
CO
como fuente nica de carbono y construir a
partir de l los esqueletos carbonados de todas sus

biomolculas orgnicas.
Hetertrofas:
(alimentadas
de
otros),
que
no
pueden emplear el CO 2 y tienen que obtener el

carbono de su entorno en una forma reducida
relativamente compleja, tal como la glucosa.
El segundo criterio por el que pueden clasificarse las clulas

es la naturaleza de su fuente de energa:
Fottrofas. Clulas que emplean la luz como fuente
de energa.
Quimiotrfas.
Las
que
emplean
reacciones de oxidacin-reduccin.
126
energa
de
las
Quimiorgantrofos. Quimiotrfos que necesitan

molculas
orgnicas
complejas
como
dadores
electrnicos, tales como glucosa.
Quimiolittrofos. Organismos que pueden emplear

dadores electrnicos inorgnicos sencillos, tales
como el hidrgeno, sulfuro de hidrgeno, amoniaco
o azufre.
Los hetertrofos pueden dividirse en las siguientes clases:

Aerobios. Emplean oxgeno molecular como ltimo
aceptor de electrones en sus dadores electrnicos
orgnicos.
Anaerobios. Emplean como aceptor electrnico alguna
otra molcula en lugar del oxgeno.
Facultativos. Clulas que viven en condiciones ya sean
aerbicas o anaerbicas.
Anaerobios estrictos. Clulas que no pueden utilizar
el oxgeno en ninguna circunstancia.
Hay dos grupos principales de bacterias: las saprofitas, que
viven sobre los cuerpos muertos de animales y vegetales, y
las simbiontes, que viven en animales o plantas vivas. Las
saprofitas son importantes porque descomponen los cuerpos
de las plantas y animales muertos en sus componentes
esenciales, hacindolos accesibles para ser utilizados como
alimento por las plantas.
127
Muchas bacterias simbiontes se encuentran, en condiciones

normales, en los tejidos humanos, incluso en el tubo digestivo
y la piel, donde pueden resultar indispensables para los
procesos fisiolgicos. Este tipo de relacin recibe el nombre
de mutualismo. En el comensalismo, las bacterias simbiontes
obtienen los nutrientes de sus huspedes vivos causndoles
un dao considerable. Los parsitos, el tercer tipo, pueden
provocar la destruccin de las plantas o de los animales en
los que viven.
Por lo general las macromolculas son hidrolizadas en el
exterior de la clula por la accin de exoenzimas y son
introducidos en la clula en forma de monmeros o de
dmeros.
Las hexosas tras unos pasos previos de transformacin son
hidrolizados en dos mitades; los productos de esta hidrlisis
se convierten en cido pirvico; ste ltimo ocupa un lugar
clave en el metabolismo intermediario y constituye el punto
de partida de numerosas vas anablicas y catablicas.
PRODUCCIN DE ENERGA
Las clulas en crecimiento requieren una provisin constante
de energa metablica, en una forma que pueda ser usada
para la biosntesis. El mundo microbiano ha desarrollado
modelos
productores
de
energa
128
extraordinariamente
diversos. Algunos de ellos usan donantes de electrones

inorgnicos y varios aceptores de electrones (oxgeno,
nitratos, sulfatos) para proporcionar energa destinada a
formar sus propios constituyentes orgnicos a partir del
CO 2.
El fin primordial de la degradacin de los sustratos consiste
en
obtener
energa
(ATP).
Las
reacciones
que
van
acompaadas de una obtencin de energa son reacciones

oxidativas. Las clulas se liberan del carbono oxidado en
forma de anhdrido carbnico, los distintos microorganismos
utilizan diferentes caminos para eliminar el hidrgeno que se
va formando de manera constante (NADH 2), esto es, para
regenerar el NAD. Segn sea el aceptor final de H
se
diferencian la respiracin, la fermentacin y la respiracin

anaerbica.
VIAS DE DEGRADACIN DE LAS HEXOSAS
Rutas catablicas:
- Gluclisis
- Pentosa fosfato
- Entner-Duodoroff
129
I. Gluclisis
Se refiere a la degradacin de la glucosa hasta piruvato. La
gluclisis puede ocurrir en condiciones aerobias o anaerobias.
En aerobiosis generalmente funciona en conjunto con el ciclo
de Krebs en el cual el piruvato se oxida hasta CO
y agua. En
anaerobiosis el piruvato se lleva a la fermentacin.

En la gluclisis ocurren dos fosforilaciones a nivel del
sustrato:
1) En el paso de 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato en
donde se sintetiza un ATP.
2) En el ltimo paso de la va, en la transformacin de
fosfoenilpiruvato a piruvato, en donde se forma otro
ATP.
Secuencia de reacciones en la gluclisis

En conjunto, la ecuacin de la gluclisis para producir lactato
es la siguiente:
Glucosa + 2 ADP (adenosina difosfato) + 2 fosfato + 2

lactato + 2 ATP (adenosina trofosfato) + 2 H 2O
130
Aunque las etapas intermedias implicadas son muchas y

complejas, una visin simplificada podra describir el proceso
como:
1. La incorporacin inicial de dos grupos fosfato dentro
de la molcula de glucosa de seis tomos de carbono.
Los grupos fosfato los proporcionan dos molculas de
ATP, mediante la utilizacin de energa.
2. El compuesto intermedio de seis tomos de carbono que
se forma, fructosa 1,6-difosfato, se rompe en dos
compuestos ms simples, con tres tomos de carbono
cada uno.
3. Estos compuestos de tres tomos de carbono, fosfato
de dihidroxiacetona y gliceraldehdo-3-fosfato, son
cada uno metabolizados para dar piruvato, en una va
con
numerosos
pasos
intermedios.
Durante
este
proceso, cada uno de los compuestos de tres tomos de

carbono
produce
dos
molculas
de
ATP
que
se
utilizaron en la etapa 1. Adems se producen dos

molculas del cofactor intermediario NADH, las cuales
pueden ser oxidadas bajo condiciones aerobias, en una
ruta separada que rinde seis molculas de ATP. De esta
forma, la gluclisis puede producir seis molculas de
ATP por cada molcula de glucosa cuando hay oxgeno
disponible, pero slo dos molculas de ATP bajo
condiciones con dficit de oxgeno.
4. Las dos molculas de piruvato resultantes pueden ser
utilizadas por el ciclo mitocondrial del cido ctrico
despus de convertirse en acetil-CoA produciendo
131
otras 30 molculas de ATP. En resumen, se pueden

producir un total de 36 molculas de ATP mediante el
metabolismo completo de molcula de glucosa bajo
condiciones aerobias, pero slo dos molculas de ATP
bajo condiciones anaerobias.
5. Por ltimo, una de las molculas intermediarias de tres
tomos de carbono, el gliceraldehdo-3-fosfato puede
en
una
reaccin
lateral,
convertirse
en
2,3-
difosfoglicerato.
Todas
las
reacciones
reversibles,
con
la
del
sistema
excepcin
de
son
tres
fcilmente
de
ellas:
la
fosforilacin de la glucosa catalizada por la hexocinasa, la

de
la
fructosa-6-fosfato
catalizada
por
la
fosfofructocinasa y la conversin de fosfoenolpiruvato en

piruvato catalizada por la piruvato cinasa.
La coenzima esencial NAD (dinucletido de adenina y
nicotinamida) es necesaria para un proceso de conversin
enzimtica en la formacin del piruvato. Cuando el oxgeno
es deficiente, esta coenzima slo puede regenerarse por
reoxidacin
del
NADH
en
presencia
de
oxgeno,
produciendo NAD, energa y agua. La gluclisis puede

continuar en condiciones anaerobias en la formacin de
lactato y la regeneracin del NAD, pero a cambio de
producir
menos
energa
por
metabolizada.
132
molcula
de
glucosa
GLUCLISIS
2 ADP
Glucosa
fosfoenolpiruvato
2 ATP
ADP
ATP
piruvato
H2O
2 2-fosfoglicerato
Glucosa-6-fosfato
2 3-fosfoglicerato
Fructosa-6-fosfato
2 ADP
ATP
ADP
2 ATP
2 1,3-bifosfoglicerato
Fructosa-1,6-bifosfato
2 NAD
2 NADH
2 PO4
3-fosfogliceraldehdo
Dihidroxiacetonafosfato
Esquema 1. Gluclisis
133
II. Ruta de Entner-Duodoroff
En esta va se produce slo una molcula de ATP por

cada molcula de glucosa.
Sus productos finales son piruvato y gliceraldehdo-3fosfato.
Esta va es mucho menos usada por los microorganismos

que la ruta de la gluclisis.
Es ms rpida que la gluclisis por la menor cantidad de

reacciones que se llevan acabo.
En esta va la glucosa 6-fosfato sufre en primer lugar una

deshidrogenacin y se convierte en 6-fosfoglucnico. Por la
accin de una 6-fosfogluconatodeshidrogenasa se pierde una
molcula de agua y se forma cido 2-ceto-3-desoxi-6fosfoglucnico (KDPG), el cual se divide por accin de una
aldosa especfica, en cido pirvico y 3-fosfogliceraldehdo.
134
III. Hexosa monofosfato (ruta de pentosas- fosfato)

Aunque la gluclisis y el cido del ciclo tricarboxlico son las
principales vas catablicas de la glucosa en la mayora de los
tejidos,
algunas
clulas
poseen
vas
alternativas
para
producir metabolitos tiles a partir de la glucosa.

La va hexosa monofosfato es de gran inters por ser la
principal fuente de NADP reducido en el organismo (el NADP
reducido
participa
en
muchas
reacciones
de
sntesis,
aportando sus hidrgenos).

Esta va comprende una serie de reacciones estrechamente
conectadas con la gluclisis, ya que ambos procesos forman
intermediarios comunes.
La va puede dividirse en dos fases:
En la primera, la glucosa 6-fosfato sufre dos oxidaciones por
deshidrogenacin y una descarboxilacin que la transforma
en una pentosa fosfato. Se forma ribulosa-5-fosfato y se
libera CO
y con la formacin de la ribulosa 5-fosfato se
pone fin al verdadero proceso oxidativo.

En la segunda fase la ribulosa-5-fosfato da lugar a dos
ismeros distintos. sta junto con la xilosa-5-fosfato se
combina para formar una triosa-fosfato y una heptosafosfato, las cuales a su vez darn una hexosa-fosfato y una
triosa fosfato.
135
En un ciclo que permite la oxidacin completa de los

carbohidratos no parece operar en su forma completa en
sistemas microbianos anaerobios.
En esta ruta se forman pentosas y luego estas se rompen en
unidades de 3 y 2 carbonos, dando lugar a lactato y etanol. El
rendimiento neto en la va de las HMP es de una molcula de
ATP por cada molcula de glucosa catabolizada.
Es la nica va o fuente de D-ribosa para la sntesis de
nucletidos. Se lleva a cabo en el citoplasma; todas las
enzimas que intervienen son solubles.
Es
una
va
energtica
para
microorganismos
aerobios
facultativos.
Sus funciones metablicas son diversas pero se resumen en
lo siguiente:
1. Es una va alternativa de degradacin de la glucosa para
obtener ATP acoplada con la fosforilacin oxidativa.
2. Es la fuente principal, sino la nica, de NADPH
citoplasmtico en clulas eucariticas como fuente de
poder reductor, el cual es necesario para la biosntesis
de cidos grasos y otros procesos como la reduccin
del
glutatin,
la
biosntesis
reacciones de hidroxilacin.
136
de
esteroides
las
3. Es la va que proporciona pentosas fosfato para la

sntesis de ribosa y desoxirribosa necesarias para la
biosntesis de cidos nucleicos en general; adems para
la
sntesis
de
histidina
cuyo
precursor
es
el
fosforribosil pirofosfato, derivado de la pentosa.

4. Es la va de degradacin de la ribosa y la desoxirribosa,
procedentes tanto de la digestin de cidos nucleicos
como del recambio metablico de nucletidos.
5. Es la ruta que conecta el metabolismo de las hexosas
con el de otros azcares, tales como arabinosa, y
xilosa, componentes estructurales de glucoprotenas y
paredes celulares de vegetales, as como principales
fuentes carbonadas de muchas bacterias. Por otro lado
la sntesis de ribulosa-5-fosfato, intermediario de la
va de las pentosas, es fundamental en las plantas
verdes para llevar acabo el ciclo de Calvin.
6. Es la fuente de un importante azcar de cuatro
carbonos, la eritrosa-4-fosfato, precursor para la
biosntesis de los compuestos aromticos en bacterias
y plantas.
137
Esquema 2. Va Hexosa - fosfato
138
G licer aa l deh do
Ribulosa-5-P
- 3- P
- 7- P
F r u c to s a -5 -P
Er i t r o s a -4 -P
S e do he p tu los a
N ADPH
F r u c to s a -5 -P
N ADP
- 3- P
Glucosa
G licer ald e h d o
N ADP
Xi l u s a - 5 - P
Glucosa-6-fosfato
Ri b o s a - 5 - p
VA HEXOSA FOSFATO
GLUCOLISIS
5-P-gluconato
N ADPH
CO2
CICLO DE KREBS
Es el proceso de la respiracin mediante el cual, las clulas
aerbicas obtienen energa a partir de la oxidacin de las
molculas combustibles por el oxgeno molecular.
El ciclo de los cidos tricarboxlicos es una secuencia de
reacciones que tiene efecto en los organismos aerbicos.
Esta catalizada por un sistema multienzimtico que acepta el
grupo acetilo del acetil CoA como combustible degradndolo
hasta CO 2 y H +. Estos ltimos son conductores a travs de
una secuencia de protenas transportadoras de electrones
hasta el oxgeno molecular, que se reduce para formar agua.
El piruvato ocupa una posicin clave en las diferentes rutas
de degradacin de carbohidratos, es el principal producto de
la
gluclisis
transformaciones,
puede
sufrir
dependiendo
una
de
gran
s
el
variedad
de
organismo
se
encuentra en un ambiente aerobio o anaerbico:

1. En aerobiosis el piruvato pasa al ciclo de Krebs.
2. En anaerobiosis puede ser transformado en alcoholes o
cidos.
Mediante la descarboxilacin del cido pirvico se forman
compuestos con dos tomos de carbono que se unen a
continuacin con la molcula aceptora adecuada (cido
oxalactico) y entrar a formar parte del ciclo de los cidos
tricarboxilicos (TCC) y mediante una serie de reacciones
139
escalonadas son oxidados hasta anhdrido carbnico; los

tomos de hidrgeno que se liberan en los pasos que suponen
una deshidrogenacin entran a formar parte de la cadena
respiratoria productora de ATP (fosforilacin oxidativa).
Sin embargo, entre los compuestos intermediarios del TCC
se encuentran diversos cidos orgnicos que constituyen los
productos iniciales de varias cadenas biosintticas (cido
alfa-cetoglutrico, cido frmico, cido oxalactico).
El TCC no constituye nicamente una oxidacin terminal de
las sustancias nutritivas sino que es tambin un gran <<pvot>>
y como tal tambin suministra los productos iniciales para la
sntesis de los compuestos elementales de la clula. Si estos
cidos fuesen constantemente eliminados del ciclo, no podra
regenerarse la molcula aceptora y el ciclo se detendra.
Mediante
las
denominadas
reacciones
complementarias
(secuencias anapletricas) se consigue que el nmero de

compuestos intermediarios que se integran secundariamente
al TCC iguale a la prdida que ocasionan los procesos
biosintticos.
Oxidacin completa
Se
le
conoce
tambin
como
ciclo
de
los
cidos
tricarboxilicos, sirve para la oxidacin completa del piruvato

y constituye un eslabn clave del metabolismo, ya que
muchos de sus compuestos intermediarios pueden alimentar
140
rutas de biosntesis de aminocidos, piridinas, tetrapirroles

y lpidos. Comprende la fase aerbica de la oxidacin de la
glucosa y es donde se obtiene un mayor rendimiento de
energa.
Sus productos finales son: CO
y H 2O. En el patrn ms
comn el piruvato de la ruta glucoltica se oxida para dar

origen a una molcula de acetil-CoA y CO
y la acetil-CoA se
oxida en el ciclo de Krebs.

El balanceo neto de una molcula de glucosa que se ha
oxidado por gluclisis primero y luego por el ciclo de Krebs
es de 38 ATP.
Adems de tener funciones degradativas, en el ciclo de
Krebs se sintetizan sustancias que actan como precursores
de aminocidos, pirimidinas y porfirinas.
CICLO
NADH
DE KREBS
Esquema 3
NAD
CoA
Piruvato
CoA
CO2
Acetil CoA
oxalacetato
citrato
NADH
NAD
malato
isocitrato
NAD
H2O
CO2
NADH
fumarato
Alfa-cetoglutarato
FADH2
NAD
NADH
FAD
succinato
Succinil CoA
CoA
141
GTP
GDP
CO2
CoA
METABOLISMO AEROBIO Y ANAEROBIO

Las bacterias se integran en varios grupos segn el efecto
del O 2, sobre su crecimiento y metabolismo, estas
propiedades son importantes para la patogenia y para el
aislamiento e identificacin de las bacterias.
FERMENTACIONES
En sentido estricto se designan fermentaciones aquellos
procesos de consecucin de energa en los que el hidrgeno
pasa finalmente a un aceptor orgnico de electrones. El
oxgeno no interviene en los procesos fermentativos.
El trmino fermentacin hace referencia al metabolismo
anaerobio de los hidratos de carbono.
En la fermentacin el aceptor de electrones es un compuesto
orgnico, mientras que en la respiracin suele ser el oxigeno
(respiracin aerobia).
Cierto nmero de fermentaciones estn basadas en la va
glucoltica (Embden Meyerhof). Esta va genera ATP dos
veces:
primeramente
travs
de
la
oxidacin
gliceraldehido-3-fosfato
de
nuevo
travs
conversin del fosfoenolpiruvato.
142
de
del
la
1. Fermentacin lctica
Es la fementacin ms simple: Una reaccin en un solo paso
catalizado por la lacticodeshidrogenasa ligada a ADN reduce
el piruvato a lactato. No se forma gas. Dado que se consumen
dos molculas de ATP en la formacin de hexosa difosfato a
partir de glucosa y que se producen cuatro molculas de
ATP, el rendimiento neto son dos ATP por hexosa.
La fermentacin homolctica que forma solamente lactato.
Streptococcus lactis
S. faecalis
S. salivarius
S. pyogenes
S. cremoris
S. thermophilus
S. diacetilactis
Lactobacillus lactis
L. acidophilus
L. bulgaricus
L. casei
L. plantarum
L. inulinus
143
Fermentacin
molcula
de
heterolctica
glucosa
en
convierte
lactato
solamente
producen
cada
adems
cantidades considerables de etanol, acetato y CO 2.

Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc cirovorum
Lactobacillus brevis
Lactobacillus viridescens
C 6H
12O6
CH 3-CHOH-COOH + CH 3-CH 2OH + CO2
Black J.G. 1996
Figura 40. Produccin de queso
2. Fermentacin alcohlica
El piruvato se convierte en CO2
ms acetaldehdo que
despus se reduce a etanol en una reaccin ligada a NAD.

Esta fermentacin es rara en las bacterias como va
principal, es ms bien caracterstica en las levaduras.
144
El etanol es uno de los productos ms extendidos entre los

microorganismos resultantes de la fermentacin de los
azcares. Los principales productores de etanol son las
levaduras (Saccharomyces cerevisiae); el alcohol aparece
tambin como producto secundario de la fermentacin de las
hexosas y de las pentosas en diversas bacterias anaerobias y
aerobias facultativas.
La transformacin del piruvato en etanol abarca dos pasos.
En el primero el piruvato es descarboxilado en una reaccin
catalizada por la piruvatodescarboxilasa y en la que participa
el tiaminpirofosfato dando acetaldhdo, el cual es reducido
con NADH
por la alcoholdeshidrogenasa convirtindose en
etanol.
2 C 6H
12O 6
+ H 2O
CH 3-CH 2OH + CH 3-COOH

+
2CO
Figura 41. Produccin de vino
145
+ 2 C 3H 8O3
3. Fermentacin propinica
Esta va extrae energa adicional del substrato. El piruvato
es carboxilado para producir oxalacetato, que es reducido
para proporcionar succinato y despus es descarboxilado
para proporcionar propionato.
Gnero Propionibacterium
Clostridium propionicum
Selenomonas ruminantium
La produccin de cido propinico a partir de cido lctico se
efecta de acuerdo a la siguiente reaccin:
3CH 3-CHOH-COOH
2CH 3-CH 2-COOH + CH 3-COOH

+
CO 2 +H 2O
La reduccin del lactato o del piruvato a propionato se lleva

acabo
con
un
complejo
biotina-CO 2,
el
piruvato
es
carboxilado en primer lugar hasta oxalacetato y entonces es

reducido hasta succinato pasando por malato y fumarato. El
succinato es transformado en succinil-CoA de la forma
habitual
con
la
participacin
de
ATP
de
la
CoA,
posteriormente es transformado en metil-malonil-CoA en una

reaccin catlizada por la metil-malonil-CoA-isomerasa y en la
que interviene tambin la vitamina B 12. El succinil-CoA es
descarboxilado y el propionil-CoA es hidrolizado dando
propionato y CoA.
146
La liberacin de una molcula de CO 2 se lleva a cabo con

ayuda de una transcarboxilasa que contiene biotina que lo
transfiere nuevamente a piruvato.
4. Fermentacin cido mixta (frmica)

Es caracterstica de las Enterobacterias. Estos organismos
utilizan
su
sustrato,
parcialmente
travs
de
una
fermentacin lctica, pero de modo principal a travs de una

fermentacin
caracterizada
por
el
desdoblamiento
del
piruvato a formato y acetil CoA, a su vez ste ltimo genera

un ATP.
Produccin de gas: El formato producido en este tipo de
fermentacin puede permanecer como tal siempre que el pH
sea
alcalino.
Sin
embargo
en
la
mayora
de
las
fermentaciones, el pH se acidifica: al alcanzarse un pH igual

o menor a 6.0 las bacterias productoras de gas producen una
enzima, llamada hidrogenasa frmica que convierte el cido
frmico en CO 2 y H 2. Las enterobacterias que no forman
esta enzima producen cido pero no gas.
La fermentacin se lleva acabo con la formacin de gran
nmero de compuestos en los que predominan los cidos
orgnicos; los productos ms importantes de la fermentacin
son
el
glicerina;
cido
actico,
acetona;
2,3-
frmico,
mlico,
butanodiol,
molecular.
147
CO2
lctico;
e
etanol;
hidrgeno
5. Fermentacin de metano: CO
como aceptor de
hidrgeno
Las bacterias metnicas (Methanobacterium) son tambin
organismos anaerobios obligados. Transforman los alcoholes
y cidos orgnicos en metano (CH 4) y CO 2, con lo que algunos
cidos orgnicos son parcialmente oxidados:
CO
+ 4 H2
CH
+ 2 H 2O
Se oxidan los cidos grasos a hidratos de carbono a

expensas del CO 2 a CH 4.
6. Fermentacin butilenglucolca (acetona)

El acetaldehdo activo resultante no es oxidado, si no que se
condensa con un piruvato. El producto de esta reaccin es
transformado en butilenglicol (butanodiol) en las reacciones
siguientes, en las que los cuatro hidrgenos absorbidos
equilibran los hidrgenos liberados en la produccin de las
dos molculas de piruvato.
Esta fermentacin
al igual que la alcohlica, da solo
productos neutros, formndose dos ATP por unidad de

glucosa. Se denomina con frecuencia fermentacin acetonica
debido a que con la exposicin al aire se oxida parte del
butilenglicol que se transforma en acetona, la cual se
reconoce con facilidad con una prueba especfica: VogesProskauer.
148
El cido butirico, butanol, acetona, isopropanol, y otros

cidos orgnicos son productos tpicos de la fermentacin de
los hidratos de carbono que llevan acabo los productores
anaerobios
de
esporas
(Clostridium).
Durante
la
fermentacin se forman cantidades variables de cidos,

alcoholes, acetona y gas. Como sustratos se utilizan la
glucosa y algunos polisacridos, cidos orgnicos y alcoholes.
El cido butrico se forma por la condensacin de dos
molculas de Acetil CoA, reaccin catalizada por la enzima
tiolasa. El acetil CoA es reducido a continuacin con NADH2
reaccin
catalizada
por
la
beta-hidroxibutiril-CoAdeshidrogenasa,
una
flavoenzima,
dando
butiril-CoA.
Mediante una desacilacin se libera cido butrico.
RESPIRACIN ANERBICA CON ACEPTORES

INORGNICOS DE HIDRGENO
FIJACIN DE NITRGENO
El nitrgeno atmosfrico se utiliza en primera instancia para
la sntesis de biomolculas. Sin embargo slo un nmero
relativamente pequeo de bacterias son capaces de utilizar
el nitrgeno en esta forma. Las bacterias fijadoras de
nitrgeno
reducen
nitrgeno
molecular
amoniaco.
149
para
sintetizar
En cierta forma el sulfato y el nitrato actan como

transportadores de oxgeno el hidrgeno procedente del
sustrato los reduce. La capacidad de transferir electrones al
sulfato o al nitrato permite a las bacterias oxidar el
sustrato incluso en ausencia de oxgeno molecular y de esta
forma obtener ms energa que por simple fermentacin.
Reduccin de nitratos
La reduccin de nitratos tiene en las bacterias dos destinos
diferentes: asimilacin y desasimilacin.
En el primer caso ocurren una serie de reducciones desde
nitratos hasta nitritos y amoniaco. Este ltimo se utiliza
para
la
sntesis
de
aminocidos,
protenas
bases
nitrogenadas, entre otros compuestos.

En el segundo caso los nitratos se utilizan como aceptores de
electrones; lo cual ocurre en la respiracin anaerobia.
NH 2OH
HIDROXILAMINA
NO3
NO2
NITRATO
NITRITO
NH3
AMONIACO
NO
XIDO DE
NITRGENO
N 2O
XIDO
NITRSO
150
N2
NITRGENO
REDUCCIN DE SULFATOS
Varios Compuestos inorgnicos de azufre son aceptores de
electrones en la respiracin anaerbica.
El sulfato la forma ms oxidada del azufre, es uno de los
aniones principales en el agua de mar y se utiliza por las
bacterias reductoras de sulfato.
El producto final de la reduccin del sulfato es el sulfito, un
importante
producto
natural
que
participa
en
muchos
procesos bioqumicos.
La mayora de las plantas y los microorganismos utilizan el
sulfato como fuente de azufre y obtienen el sulfuro
necesario para la sntesis de los aminocidos sulfurados por
reduccin asimilatoria de sulfato. Como producto secundario
de esta reduccin
hidrgeno:
8H
del sulfato aparece el sulfuro de
+ SO4
H 2S + 2 H 2O + 2 OH
Estas bacterias reductoras de sulfato, tambin llamadas

desulfatizantes, son frente a los reductores de nitratos
organismos anaerobios obligados y requieren condiciones
estrictamente anaerobias.
151
El metabolismo de los desulfatizantes es oxidativo. Obtienen

la energa por fosforilacin oxidativa.
La reduccin del sulfato se inicia en la clula mediante una
activacin
del
sulfato;
por
una
ATP-sulfurilasa
se
intercambia el resto pirofosfato del ATP con el sulfato. El

pirofosfato es hidrolizado por la pirofosfatasa. El adenosin5-fosfosulfato (APS) es finalmente reducido con formacin
de sulfito y liberacin de AMP.
Ejemplos
de
microorganismos
sulfato:
Desulfovibrio desulfuricans
D. vulgaris
Desulfotomaculum nigrificans
D. orientis
D. ruminis
152
que
reducen
el
ENTEROBACTERIAS
Las enterobacterias ms importantes se incluyen en la
familia Enterobacteriaceae, la cual est constituida por
bacilos Gram negativos. Hay especies mviles e inmviles.
Todas fermentan glucosa con produccin de cido y gas,
reducen los nitratos a nitritos y dan resultado negativo en la
prueba
de
indofenol
oxidasa.
Esta
familia
comprende
bacterias patgenas y no patgenas. Conviene recalcar que

las
caractersticas
de
patogenicidad
relativa
en
las
enterobacterias en su hbitat natural, que es el tracto

gastrointestinal, se modifican radicalmente cuando estas
bacterias alcanzan una localizacin extra intestinal, en sitios
como
el
tracto
genitourinario,
lquido
cefalorraqudeo,
torrente sanguneo, mdula sea o la cavidad peritoneal.

En vista de lo anterior, es posible aislar y cultivar miembros
de la familia Enterobacteriaceae tanto a partir de muestras
fecales
productos
que
pudieron
haber
sufrido
contaminacin fecal como el agua, alimentos, utensilios, etc.
153
una
Es muy importante recordar que las muestras de cualquier

tipo que se envan al laboratorio para investigar la presencia
de estas bacterias, deben ser colectadas en condiciones
aspticas transportadas y procesadas con la mayor rapidez,
a fin de evitar alteraciones de muestras y prdida de
viabilidad de las bacterias que se buscan, o crecimiento
excesivo de grmenes banales que pudieran entorpecer el
estudio.
BACTERIA
O XIDASA
INDO L
VP
RM
CITRATO
SH2
E. Coli
Shigella
Edwardsiella
Salmonella
Arizona
--
Citrobacter
Klebsiella
Enterobacter
Serratia
Proteus
vulgaris
Providencia
UREA MOVILID GELATI LISINA

ARGINI
AD
NA
DESC. NA
DESC.
Tabla 8. Caractersticas bioqumicas de bacilos Gram negativos
154
COPROCULTIVO
En cualquier caso, es importante contar con procedimientos
de laboratorio bien controlados que permitan detectar la
presencia
de
agentes
patgenos
bien
dar
alguna
informacin sobre alteraciones en el equilibrio de la forma

normal.
El esquema que se propone en ste atlas para aislamiento e
identificacin de enterobacterias patgenas figura entre
numerosas variantes de trabajo utilizadas por diferentes
autores. Se considera que este esquema es uno de los ms
usuales
que
puede
dar
resultados
consistentes
satisfactorios.
COPROCULTIVO
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar entrico Hektoen
Agar de eosina y azul de metileno
Agar ENDO
Agar XLD
Agar Salmonella Shigella
Agar verde brillante
PARA ENRIQUECIMIENTO
Base de caldo tetrationato
Caldo de selenito y cistina
AISLAMIENTO
PARA IDENTIFICACIN
Agar de hierro y triple azcar
Caldo rojo de fenol y carbohidratos
Medio urea
Medio SIM
Agar hierro y lisina
Medio MIO
Agar citrato de Simons
ENRIQUECIMIENTO
PLACAS: Agar S-S,
ver de brillante, sulfito de
bismuto.
TUBOS: Caldo
tetrationato y/o
caldo selenito
Agar sangre
INCUBACIN
24 h - 37 C
PLACA: Agar EMB
ENDO, XLD, Mac
Conkey
IDENTIFICACIN
BIOQUMICA
TSI, MIO, LIA, SIM,
fenilalanina,
RMVP,Citrato de
Simmons, urea
Esquema 4. Coprocultivo
155
PLACAS: Agar
ver de brillante,sulfito
de
bismuto,XLD,EMB,
ENDO, Mac
Conkey.
Aislamiento de bacterias patgenas en

heces
Salmonella, Shigella, E. coli, Y. enterocolitica
Materia fecal
Mac Conkey
EMB o XLD
Seleccionar coloniaslactosa (-)= Salmonella

Lactantes: colonias lactosa (+)=E. coli y
Shigella
Sulfito de bismuto
Caldo de selenito
Colonia negra = Salmonella
Certifique Y. enterocolitica
Sulfito de
Colonia negra
Salmonella
Salmonella
typhi
Esquema 5. Aislamiento de bacterias patgenas de heces
156
XLD, VB
Colonia lactosa
(-) =
FAMILIA MICROCOCACEAE
CARACTERSTICA MICROCOCCUS STOMATOCOCCUS PLANOCOCCUS STAPHYLOCOCCUS
Racimos
irregulares
Ttradas
Cpsula
Movilidad
Crecimiento G-
No
furazolidona
Fermentacin
de glucosa
Oxidasa
desarrolla
Resistencia
de
de
lisostafina
Glicina
pptido-glicana
cidos
teicoicos
en
pared celular
Tabla 9. Caractersticas bioqumicas de la Familia Micrococaeeae
157
ESTAFILOCOCOS
El estafilococo es un microorganismo poco exigente y de
fcil desarrollo. En los medios no selectivos sus colonias son
grandes, opacas, lisas, circulares y enteras. A veces pueden
presentar bordes ligeramente ondulados, coloracin amarilla
o blanca.
En
agar
sangre
las
colonias
tienen
los
caracteres
anteriormente mencionados y pueden adems presentar

hemlisis. La mayor parte de las cepas virulentas son
hemolticas,
concentraciones
fermentan
de
cloruro
manitol,
de
sodio
resisten
y
altas
generalmente
producen pigmento dorado, aunque otras cepas virulentas son

blancas carecen de pigmento.
La mejor prueba de virulencia es la facultad que tiene de
coagular el plasma (estafilococos coagulasa positivos).
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar de Vogel Johnson
PARA IDENTIFICACIN
Medio CTA
Caldo rojo de fenol
Caldo SF
Tincin de Gram
1.Examen directo
2. Siembra
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar de Vogel Johnson
3. Frotis
4. Pruebas bioqumicas
Coagulasa
Catalasa
Fermentacin de
manitol
Susceptibilidad a
novobicina
Esquema 6. Aislamiento de Staphylococcus
158
PRUEBA
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
Pigmento colonial
10-90% cepas +
Coagulasa
Factor de agregacin
Nucleasa termoestable
Fosfatasa alcalina
Ornitina descarboxilasa
Ureasa
10-90% cepas +
10-90% cepas +
Beta-galactosidasa
Produccin de acetona
Resistencia a novobiocina
Resistencia a polimixina
Trehalosa
Manitol
10-90% cepas +
Manosa
Xilosa
Celulosa
Maltosa
Sacarosa
Tabla 10. Caractersticas bioqumicas de Staphylococcus
159
ESTREPTOCOCOS
El estreptococo puede estar presente en grandes nmeros

como componentes de la flora normal, pero bajo ciertas
circunstancias puede estar asociado con infecciones o ser el
responsable principal de las mismas.
Los estreptococos ms importantes generalmente pueden
demostrarse por la produccin de hemlisis en los medios
que contienen sangre.
Los Streptococcus del grupo A son beta hemolticos y se
aslan generalmente de exudados farngeos. Sin embargo,
entre la flora existen diversos tipos de estreptococos, los
cuales pueden ser alfa o beta hemolticos es necesario
efectuar otras pruebas para identificarlos, tales como la
composicin antignica y la prueba de sensibilidad de
bacitracina.
En agar sangre las colonias de esta bacteria son pequeas,
elevadas, de color blanco a gris, duras y secas con un halo
claro bien definido de hemlisis completa (hemlisis beta).
160
Especie
Susceptibilidad Susceptibilidad Hidrlisis Hidrlisis Crecimiento Crecimiento CAMP Fenmeno

en
bacitracina
optoquina
hiprato esculina en bilis
NaCl
satelitismo
6.5%
Estreptococos
betahemolticos
Grupo A
Grupo B
S
R
R
R
+
-
Enterococos
enterococos
S. viridans
S.
pneumoniae
No
Tabla 11. Caractersticas bioqumicas de Streptococcus
161
UROCULTIVO
El urocultivo debe hacerse cuando hay signos o sntomas de
infeccin
urinaria,
insuficiencia
renal
hipertensin.
Llevndolo a cabo siempre en personas en que se sospecha

infeccin sistmica o que presenten fiebre de origen
desconocido.
Las infecciones agudas o crnicas pueden afectar en forma
ascendente
desde
la
uretra
hasta
los
riones,
especialmente cuando se trata de una invasin por la flora

normal del tracto genitourinario que al actuar sobre el
mismo provoca una accin patognica importante.
PARA IDENTIFICACIN
TSI, Caldo rojo de fenol
Urea, SIM, MIO, LIA, Citrato
de simmons
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar sangre
Agar EMB
Agar S-110
Agar sal y manitol
Agar Biggy
PARA SENSIBILIDAD A
ANTIBITICOS
Agar de Mueller Hinton
Agra soya tripticasena
Orina
AISLAMIENTO E
IDENTIFICACIN
Tincin de Gram
Agar sangre,
identificacin de:
Estafilococos
Estreptococos
Neumococos
Observacin de
hemlisis
Agar EMB
Identificacin de:
Enterobacterias
Pseudomonas
Salmonella y
Shigella
Esquema 7. Urocultivo
162
Agar S-110 sal

y manitol
Identificacin de
Staphylococcus y
otros Micrococos
HEMOCULTIVO
En el paciente con fiebre, con o sin signos o sntomas de

localizacin el hemocultivo es la prueba ms til y ms usada
para demostrar la frecuencia de infeccin sistmica. La
demostracin de bacteremia es tambin esencial en las
personas en que se sospecha endocarditis bacteriana.
Es importante conocer las infecciones en las que se pueden
aislar microorganismos de la sangre. Entre estos se
encuentran
la
fiebre
tifoidea,
neumonas,
meningitis,
endocarditis bacteriana, osteomielitis, peritonitis, etc.

La posibilidad de obtener cultivos positivos depende de la
etapa de la enfermedad en que se tome la muestra y el
grado de evolucin de la misma. En la mayora de los casos,
por lo general es conveniente tomar varias muestras a
intervalos apropiados ya que un solo cultivo puede ser
insuficiente.
163
EXUDADO FARINGEO
MEDIOS
PARA AISLAMIENTO
Agar sangre
Agar eosina y azul de metileno
Agar sal y manitol
Agar S-110
Medio de transporte Stuart
Agar BIGGY
Tincin de Gram
Hemoltico grupo A
Disco de bacitracina
Agar sangre
Streptococcus
Neumococos
Agra eosina y
azul de metileno
Enterobacterias
Staphylococcus
aureus y otros
Micrococos
Agra S-110, sal

y manitol
Candida albicans
Agar BIGGY
Esquema 8. Exudado faringeo
164
Disco de optoquina
Solubilidad de bilis
TSI, LIA, MIO, citrato y urea
Catalasa y coagulasa
Tubos germinales y
clamidiosporas
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Medios selectivos, diferenciales y

En tubo: medios slidos

Incubacin de los medios

Identificacin basada en caractersticas

Prueba de leche con tornasol

Reduccin de leche con azul de metileno

Prueba de rojo de metilo

Agar hierro triple azcar: TSI

Agar lisina - hierro: LIA

cido mixta (frmica)

Respiracin anaerbica con aceptores

Mtodos para el aislamiento e identificacin de bacterias

Enciclopedia Encarta, 2002

Enciclopedia Encarta, 2002

Reproduccin bacteriana: Transformacin

Enciclopedia Encarta, 2002

Reproduccin bacteriana: Conjugacin

Enciclopedia Encarta, 2002

Superficie de placas de agar EMB que ilustra el brillo verde

vidamente lactosa: Escherichia coli.

Superficie de placas de agar EMB que ilustra cultivo mixto de

Escherichia coli y Shigella sp.

Enciclopedia Encarta, 2002

Superficie de placas de agra EMB que ilustra el brillo verde

producido por Escherichia coli.

Museun of History Natural

Pruebas bioqumicas: Fermentacin de carbohidratos

Pruebas bioqumicas: Citrato

Pruebas bioqumicas: Licuefaccin de gelatina

Pruebas bioqumicas: Leche con tornasol

Pruebas bioqumicas: Leche con azul de metileno

Pruebas bioqumicas: Oxidacin/fermentacin

Pruebas bioqumicas: Urea

Pruebas bioqumicas: Voges - Proskauer

Pruebas bioqumicas: Rojo de metilo

Escherichia coli, observese pili

Pruebas bioqumicas: Reduccin de nitratos

Pruebas bioqumicas: Fenilalanina desaminasa

Pruebas bioqumicas: SIM

Pruebas bioqumicas: TSI

Pruebas bioqumicas: LIA

Pruebas bioqumicas: MIO

Museum of History Natural,

Enciclopedia Encarta, 2002

University of east Anglia

Reporte de resultados: prueba de oxidacin y fermentacin

Reporte de resultados: Sulfuro, indol y movilidad (SIM)

Reporte de resultados: MIO

Caractersticas bioqumicas de bacilos Gram negativos

Caractersticas bioqumicas de la Familia Micrococcaeae

Caractersticas bioqumicas de Staphylococcus

Aislamiento de bacterias patgenas de heces

tema, donde se podr tambin observar diferentes imgenes

Figura 1. Morfologa bacteriana

Muchas bacteria s pueden presentar flagelos

El xito evolutivo de las bacterias se debe en parte a su

Segn la fuente de carbono que utilizan, los seres vivos se

Figura 2. Formas de nutricin de las bacterias

Atendiendo a las anteriores categoras, entre las bacterias

2. Las bacterias quimioauttrofas, utilizan compuestos

3. Las bacterias fotoauttrofas, utilizan la luz como

4. Las bacterias fotohetertrofas, utilizan la luz como