Profa.

Ana Maria Viana Pinto

Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Instituto Biomdico
Universidade Federal Fluminense

QUANDO SOLICITAR O EXAME LABORATORIAL DE UMA VIROSE

Confirmao do diagnstico clnico infeces com sinais clnicos

confundveis: gastrenterites, doenas exantemticas, vesiculares

Necessidade de confirmao de uma infeco devido s srias implicaes
que a mesma pode ter para o paciente: AIDS, hepatite, rubola gestacional,
BVDV
Para diferenciar a fase da doena determinao de infeces aguda ou
crnicas (p.ex. pesquisa dos marcadores sorolgicos das hepatites virais), no
prognstico da doena e como critrio de cura;
No diagnstico de doenas congnitas (pesquisa de Ac IgM): rubola,
parvovrus
B19, citomegalovrus; AIE, BVDV.
(
Na seleo de doadores de sangue: hepatites B e C, AIDS, HTLV e semem
Quando a interveno quimioterpica importante e possvel: infeces
herpticas, AIDS e hepatite C;

QUANDO SOLICITAR O EXAME LABORATORIAL DE UMA VIROSE?

Durante surtos epidmicos adoo de medidas profilticas

adequadas (vacinao, combate a vetores, etc.). Ex: febre amarela,

dengue, sarampo, raiva, entre outras;
Na busca de um agente etiolgico de uma dada doena, seja ela
nova ou no. Ex: Coronavrus da SARS.
Na avaliao da imunidade naturalmente adquirida aps uma
infeco viral ou artificialmente induzida aps vacinao, pela pesquisa
de anticorpos da classe IgG;
Em estudos epidemiolgicos:
(

Avaliao da prevalncia de diferentes doenas virais em uma

determinada comunidade pesquisa de anticorpos IgG
Verificao da erradicao de doenas
Reintroduo de novos casos em reas consolidadas

AMOSTRAS CLNICAS:

Infeco respiratria: aspirado de nasofaringe

swab de garganta

Infeco entrica: Fezes

Pele: lquido da vescula, bipsia

Urina

Infeco no SNC: lquor, crebro

Sangue soro

Morte: qualquer tecido

OBS: Todo material deve ser acompanhado de uma ficha contendo:

nome, endereo, telefone, idade, dados clnicos, histrico de vacinas

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES

A colheita

do material deve ser feita na fase aguda

da doena.

material deve ser transportado imediatamente

para o laboratrio, mantido em temperatura baixa (
gelo). No entanto, sem congelar. As partculas virais
apresentam instabilidade a fatores ambientes.

Quando

o material for remetido para locais

distantes, deve ser acondicionado em gelo seco.

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES

Mtodos diretos:
Deteco do vrus:

Mtodos clssicos

Mtodos rpidos

Mtodos indiretos:
Deteco de anticorpos no soro do paciente

Microscpio eletrnico

Microscopia eletrnica

Adenovrus

Astrovrus

DETECO DE VRUS

Mtodos clssicos

Isolamento do vrus:

Ovos embrionados

Cultura de clulas

Animais

Aplicao do Cultivo Celular

Atividade intracelular. Mecanismos envolvidos nos processos
intracelulares como transcrio, traduo e metabolismo energtico.
Estudo de interao celular
Virologia: isolamento de vrus e produo de vacinas.
Estudo da biologia do cncer
Imunologia: Produo de anticorpos monoclonais.

Gentica: Estudo de clulas somticas e clonagem

Produo de protenas: Interferon, insulina, hormnio de crescimento.
Terapia dos queimados (transplante de pele)
Farmacologia

Cultura de clulas
Microscpio invertido

Frasco de cultura de tecido

Efeito citoptico
Herpes simplex 1
Vrus Influenza em
Cultivo celular

Herpes simplex 1

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES

Reao de
Hemadsoro
Uma suspenso de
hemcias
adicionada
cultura e estas iro
se ligar s
protenas virais
expressas na
superfcie das
clulas infectadas.

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES

Reao de
Hemaglutinao
Os vrus se ligam
s hemcias
aglutinando-as

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS

VIROSES

Reao de
Inibio da
Hemaglutinao

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS

Reao de Neutralizao
Os vrus interagem com os
anticorpos especficos
so neutralizados e
perdem a capacidade de
infectar as clulas
permissivas

VIROSES

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES

Reao de
Imunofluorescncia
Direta

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES

Reao de
Imunofluorescncia
Indireta

ELISA

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES

Immunoblotting
Western Blotting
(WB)
Blotting significa
transferncia de
DNA.
Separao das
protenas virais
usando o mtodo
de eletroforese
em gel de
poliacrilamida.

TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Deteco do cido Nuclico Viral

Reao em Cadeia pela Polimerase (PCR)

Reao de Hibridizao in situ

QUANDO A DETECO DO GENOMA VIRAL

PARTICULAMENTE IMPORTANTE:
Para o estudo de vrus que no podem ser isolados em
cultura de clulas, como os papilomavrus e alguns
agentes associados a gastrenterites,

Para vrus com alta diversidade antignica, como os

enterovrus, o que dificulta a utilizao de tcnicas
sorolgicas de deteco de antgeno,
A anlise do genoma viral diretamente da amostra
clnica pode ser vantajosa principalmente para aqueles
vrus com genoma RNA, que podem sofrem mutaes
atravs de sucessivas passagens in vitro.

Tcnicas de Biologia Molecular:

PRINCPIO
Todo ser vivo tem sequncias de cido nuclico que so
especficas e podem ser detectadas por uma reao de
hibridizao ou de amplificao
DNA

RNA

REAO EM CADEIA PELA POLIMERASE : PCR

As fitas da molcula de
DNA (dupla hlice) podem
ser separadas. Esse
processo denominado
desnaturao.
A renaturao ocorre
quando as fitas volta s
condies fsico qumicas
iniciais.

PCR AMPLIFICA UMA SEQNCIA ALVO

ALTERNNCIA DE TEMPERATURAS A CADA CICLO:
DESNATURAO

ANELAMENTO
POLIMERIZAO

Replicao in vitro do DNA Sequncia Alvo

DNA/DNA Supercoiled Cromossomo

Denaturaopelo
calor 95C

Seqncia alvo

Anelamento dos
primers 55-64C
Extenso

5
5

DNAPolymerase

REAO EM CADEIA PELA

POLIMERASE : PCR
Mtodo para produzir cpias de uma segmento de DNA
especfico

Polimerizao de DNA em Cadeia

Polimerizao feita por uma DNA polimerase
termoestvel
So utilizados dois primers, o que delimitam o
segmento amplificado e determinam o crescimento

exponencial do nmero de molculas de DNA

Sensibilidade : 10 cpias de genoma

Primers genricos x primers especficos

Qualquer sequncia alvo de DNA pode ser

amplificada por PCR
A localizao da seqncia alvo feita pelos primers.
Oligonucleotdeos com 20 -24 bases so usualmente
seletivos o suficiente para localizar um stio nico em um
genoma de alta complexidade, tal como o genoma
humano.
O pareamento dos primers com a seqncia alvo se faz
pelo estabelecimento de pontes de hidrognio, segundo
o pareamento convencional descrito por Watsone Crick:
A =T
C =G

VISUALIZAO DO PRODUTO DA PCR

Herpesvrus Nested PCR

150pb

Cuba de eletroforese

150pb

Produtos da reao de PCR em um gel de agarose

HIBRIDIZAO IN SITU
Uso de sondas marcadas para deteco de
genoma em tecido com alteraes
patolgicas (material de arquivo)
SONDA: fragmento de DNA marcado com

substncia reveladora (radioistopo,

enzima...)
Triagem X Tipagem
Sensibilidade: 100 cpias DNA/clula
Relevncia clnica

REAO DE HIBRIDIZAO IN SITU

MTODOS INDIRETOS: DETECO DE AC

Diagnstico de infeco recente:

Deteco de IgM especfica

Converso sorolgica:

soro de fase aguda

soro de fase de convalescncia

DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES

REAO IMUNOENZIMTICA (ELISA) AC CONJUGADO COM ENZIMA.

O RESULTADO DADO PELA MUDANA DE COR DA REAO.