UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA

VETERINARA
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII INDUSTRIALE

PROIECTAREA UNEI INSTALATII INDUSTRIALE DE

OBTINERE A -AMILAZELOR

COORDONATOR
Prof. Univ. Drd Ovidiu Popa

Student,
Dobre Ovidia
Matache Gabriela
Mitrofan Ruxandra
Prvu Lavinia
Tudor Ionela

BUCURESTI
201

Cuprins

Introducere..................................................................................................................... 3
Capitolul 1 : Aplicatiile industriale ale -amilazelor...................................................................5
1.1 Conversia amidonului................................................................................................ 6
1.2Industria detergentilor................................................................................................. 6
1.3 Producerea de combustibili......................................................................................... 7
1.4 Industria alimentara................................................................................................... 8
1.5 Industria textila........................................................................................................ 8
1.6 Industria hartiei........................................................................................................ 9
1.7 Industria panificatiei.................................................................................................. 9
Capitolul 2 : Producatori de -amilazele............................................................................... 11
Capitolul 3 : Metode de obtinere a -amilazei........................................................................14
3.1 Cultivarea submersa................................................................................................ 14
3.1.1 Fermentatie..................................................................................................... 16
3.1.2 Biosinteza -amilazelor bacteriene.........................................................................17
3.1.3 Biosinteza -amilazelor cu tulpini modificate genetic..................................................17
3.1.4 Purificarea.................................................................................................. 22
3.1.5 pH, temperatura, agitare...........................................................................23
3.2 Dozarea activitatii -amilazei dupa o metoda adaptata dupa Metais si Bieth...........................24
3.3 Determinarea activitatii enzimatice a -amilazei dupa metoda Hostettler...............................25
3.4 SCHEMA TEHNOLOGICA DE OBTINERE A AMILAZELOR PRIN CULTIVARE
SUBMERSA............................................................................................................. 27
Capitolul 4 : Bilan de materiale......................................................................................... 28
Capitolul 5: Dimensionarea utilajelor utilizate pentru obinerea - amilazelor...............................35
5.1 Atomizorul............................................................................................................ 35
5.2 Centrifuga............................................................................................................ 36
5.3 Cromatografia prin coloane....................................................................................... 38
5.4 Schimbtorul de cldur........................................................................................... 39
5.5 Dimensionarea bioreactorului.................................................................................... 41
5.6 Filtrele de aer................................................................................................... 45
Concluzii..................................................................................................................... 47
Bibliografie................................................................................................................... 48

Introducere
Amilazele (E.C.3.2.1.1) sunt enzime care catalizeaza hidroliza legaturilor glicozidice 1,4 din amidon in produse cu greutate moleculara scazuta ca molecule de glucoza, maltoza,
maltotrioza (Gupta et al.,2003; Kandra L.,2003).
-amilaza se gaseste frecvent in microorganisme, plante si animale. Este produsa la nivel
industrial prin fermentatii microbiene. Productia enzimatica microbiana de -amilaze poate
satisface in general cerintele industriale (Gupta et al.,2003). Catalizeza hidroliza legaturilor
glicozidice -1,4 in interiorul lantului polizaharidic, la polizaharidele care au un grad de
polimerizare mai mare sau egal cu 3. pH-ul si temperatura optima variaza in functie de sursa
microbiana. Implica prezenta calciului (1-20 ppm) drept cofactor enzimatic si necesar in
stabilitatea enzimei. Reducand dependenta de calciu se pot scadea costurile hidrolizei amidonului
(Santa-Maria et al.,2009). Alti cofactori de stimulare raportati au fost ioni metalici precum Mg 2+
si Mn2+ (Krishnan&Chandra,1983). Activitatea enzimatica optima variaza intre temperaturi de
70-900C si pH de 6-7.
Amilazele sunt printre cele mai valoroase enzime si au o mare importanta pentru
biotehnologii, constituind clasa de enzime industriale avand o pondere de aproximativ 25% din
piata mondiala de enzime (Rajagopalan et al.,2008; Reddy et al.,2003). Pot fi obtinute din cateva
surse, ca plante, animale si microorganisme. In prezent, sunt disponibile o mare varietate de
amilaze microbiene la nivel comercial si au inlocuit aproape in totalitate hidroliza chimica a
amidonului in industria de procesare a amidonului.
Printre -amilazele termostabile, foarte cunoscuta este Liquozyme X, care a fost
comercializata de Novozyme in 2001. Este o -amilaza obtinuta prin inginerie genetica pornind
de la o bacterie termofilica Bacillus licheniformis, care are o temperatura optima de crestere in
jurul valorii de 500C si un randament maxim de secretie la 370C. Liquozyme X are o temperatura
optima ridicata (95C), un pH relativ scazut (5.2-5.6) si cerinte minime de calciu (0.25-5 ppm).
Aceasta enzima termostabila poate fi inactivata in 10 minute prin scaderea pH-ului la 3,8 si
mentinerea la 950C. Industria alimentara a folosit aceasta enzima pentru lichefierea amidonului
timp indelungat.

Hidroliza enzimatic a amidonului se efectueaz practic n dou etape:

- prima etap dextrinizarea - fragmentare rapid a macromoleculelor de amiloz i amilopectin

pn la fraciuni cu greuti moleculare mai mici dextrinele; amidonul se lichefiaz
- a doua etap - zaharificare - dextrinele sunt hidrolizate complet la oligozaharide i apoi la
maltoz i glucoz n funcie de compoziia preparatului utilizat; dextrina se dizolv n ap
- determinarea coninutului n glucide reductoare: dup aciunea -amilazelor, concentraia n
glucide reductoare este de aproximativ 1/3 din concentraia iniial a amidonului; dup etapa a
doua de hidroliz efectuat cu -amilaze, dac hidroliza este complet, concentraia n glucide
reductoare este egal cu cea a amidonului.

Capitolul 1 : Aplicatiile industriale ale -amilazelor

Amilaza (diastaza), a fost obtinuta pentru prima data din bobul de orez sub forma unui
extract apos de catre Kirchoff in 1811. Datorita proprietatilor sale in ceea ce priveste rezistenta la
temperaturi inalte, activitatea intr-un domeniu larg de pH -amilaza bacteriana obtinuta din
tulpini de Bacillus are o larga aplicabilitate in practica, in industria hidrolizatelor de amidon,
berii, spirtului, textila, detergentilor, chimica, zootehnie, etc.
Unele tari au organizat o puternica industrie producatoare de enzime. Astfel Japonia
produce anual cca 11.000 t de -amilaza utilizand urmatoarele microorganisme: B.subtillis;
B.amylolichefaciens; A.oryzae; A.niger. In practica sunt utilizate si -amilaze de natura fungica
produse de specii ale genului Aspergillus (A.oryzae;A.niger). Aceste amilaze fungice sunt
utilizate in practica la obtinerea siropurilor bogate in maltoza, in panificatie, industria berii,
sucurilor de fructe.
Amilazele din microorganisme au un spectru larg de aplicatii industriale deoarece acestea
sunt mai stabile decat cele obtinute din plante si animale (Tanyildizi et al.,2005). Avantajul major
al utilizarii microorganismelor pentru productia de amilaze este capacitatea economica de
productie in masa si faptul ca bacteriile sunt usor de manipulat pentru a obtine enzime cu
caracteristicile dorite.
-amilazele au fost derivate din cateva specii de fungi, drojdii si bacterii. Totusi, enzimele
din surse microbiene si fungice predomina aplicatiile din sectoarele industriale (Gupta et al.,
2003). -amilazele au aplicatii potentiale intr-un numar mare de procese industriale ca industriile
farmaceutice, alimentare, de fermentatie, textile, detergenti, hartie. Amilazele fungice si
bacteriene ar putea fi folosite in industriile farmaceutice si industria chimiei fine. Totusi, cu
progresele in industrie, aplicatiile amilazelor s-au extins in mai multe domenii cum ar fi chimia
analitica, clinica si medicinala precum si aplicarea pe scara larga in zaharificarea amidonului si in
industriile de textile, alimentare, de producerea berii si distilare (Gupta et al.,2003; Kandra, L.,
2003; Pandey et al.,2000). -amilazele reprezinta unele dintre cele mai cunoscute si cea mai
importanta forma a amilazelor industriale si studiul prezent subliniaza microorganismele care
produc aceste enzime.

1.1 Conversia amidonului

Cele mai raspandite aplicatii ale -amilazei sunt in industria amidonului, care sunt
utilizate pentru hidroliza amidonului in procesul de lichefiere care converteste amidonul in sirop
de glucoza si fructoza (Nielsen et al.,2000). Conversia enzimatica a tuturor amidonurilor include:
gelatinizarea, care implica dizolvarea granulelor de amidon, formand astfel o suspensie vascoasa;
lichefierea, care implica hidroliza partiala si pierderea in vascozitate; si zaharificarea, implicand
producerea de glucoza si maltoza prin continuarea hidrolizei (Gupta et al.,2003; Prakash et
al.,2009). Initial, -amilaza din Bacillus amyloliquefaciens a fost utilizata, dar a fost inlocuita cu
-amilaza din Bacillus stearothermophilus or Bacillus licheniformis (van der Maarel et al.,2002).
Enzimele din speciile Bacillus sunt de interes special pentru procesele biotehnologice pe scara
larga datorita termostabilitatii lor remarcabile si pentru ca sisteme de expresie eficiente sunt
disponibile pentru aceste enzime (Prakash et al.,2009).

1.2Industria detergentilor
Industriile de detergenti sunt consumatorii principali de enzime, atat in termeni de volum
cat si de valoare. Utilizarea enzimelor in formularilor detergentilor mareste abilitatea
detergentilor de a elimina pete dificile si pentru a face detergentul sigur penru mediu (ecologic).
Amilazele sunt cel de-al doilea tip de enzime utilizate in formularile detergentului enzimatic, si
90% din toate detergentele lichide contin aceste enzime (Gupta et al.,2003; Hmidet et al.,2009;
Mitidieri et al.,2006). Aceste enzime snt utilizate in detergenti pentru spalatorii si masini
automate de spalat pentru a degrada resturile bogate in amidon cum ar fi cartofi, sosuri, creme,
ciocolata, etc. la dextrine si alte oligozaharide mai mici (Mukherjee et al.,2009; Olsen et
al.,1998).
Amilazele prezinta activitate la temperaturi mai scazute si la pH alcalin, mentinerea
stabilitatii necesare in conditii de detergent si stabilitatea oxidanta a amilazelor este unul din cele
mai importante criterii pentru utilizarea lor in detergenti unde mediul de spalare este foarte
oxidant (Chi et al.,2009; Kirk et al.,2002). Indepartarea amidonului de pe suprafete este de
asemenea importanta in asigurarea proprietatii de a fi imaculat, deoarece amidonul poate fi un
atractant pentru multe tipuri de pete. Exemple de amilaze folosite in industria detergentilor sunt
derivate din Bacillus sau Aspergillus (Mitidieri et al.,2006).
6

(Sursa : http://www.chem.ubbcluj.ro/~mtosa/RAPORT_TOSA_2012.pdf)

1.3 Producerea de combustibili

Etanolul este cel mai utilizat biocombustibil lichid. Pentru productia de etanol, amidonul este cel
mai utilizat substrat datorita pretului scazut si materiilor prime usor accesibile in majoritatea
regiunilor din lume (Chi et al.,2009). In aceasta productie, amidonul trebuie sa fie solubilizat si
apoi supus la doua etape enzimatice cu scopul de a obtine zaharuri fermentabile. Bioconversia
amidonului in etanol implica lichefierea si zaharificarea unde amidonul este convertit in zaharuri
folosind un microorganism amilolitic sau enzime precum -amilaza, urmata de o fermentatie,
unde zaharurile sunt convertite in etanol folosind un microorganism de fermentare a etanolului,
asa cum este drojdia Saccharomyces cerevisiae (Moraes et al.,1999; ner et al.,2006).
Producerea de etanol prin fermentatii realizata de drojdii joaca un rol important in economia
Braziliei (de Moraes et al.,1995). Pentru a obtine o noua tulpina de drojdie care sa produca direct
etanol din amidon, fara a fi nevoie de procesul de zaharificare separat, a fost realizata o fuziune
7

de protoplasti intre drojdiile amilolitice Saccharomyces fibuligera and S. cerevisiae (Chi et

al.,2009).
Printre bacterii, -amilaza obtinuta din bacterii termorezistente ca Bacillus licheniformis
sau din tulpini modificate genetic ca Escherichia coli or Bacillus subtilis este folosita in timpul
primei etape a hidrolizei suspensiei de amidon (Sanchez et al.,2008).

1.4 Industria alimentara

Amilazele se folosesc pe scara larga in industria alimentelor procesate cum ar fi :
panificatie, industria berii, producerea prajiturilor, a sucurilor de fructe si in siropurile de amidon
(Couto et al.,2006). -amilazele au fost larg folosite in industria panificatiei. Aceste enzime pot fi
adaugate aluatului pentru a degrada amidonul din faina in dextrine mai mici, care sunt ulterior
fermentate de drojdii. Adaugarea -amilazei in aluat conduce la cresterea ratei de fermentatie si la
scaderea vascozitatii aluatului, ceea ce are ca rezultat imbunatatirea texturii si volumului
produselor. Mai mult, se genereaza zaharuri aditionale in aluat, care imbunatesc gustul, culoarea
crustei si calitatile de rumenire a painii. Pe langa generarea componentelor fermentabile, amilazele au de asemenea efect anti-invechire, mentin fragezimea produselor de patiserie si cresc
durata de valabilitate a produselor (Gupta et al.,2003; van der Maarel et al.,2002). Frecvent, o
amilaza maltogenica termostabila din Bacillus stearothermophilus este folosita in industria de
panificatie (van der Maarel et al.,2002). Amilazele sunt folosite de asemenea la clarificarea berii
sau suurilor de fructe sau pentru pretratamentul hranei animalelor cu scopul de a imbunatati
digestia fibrelor (Gavrilescu et al.,2005; Ghorai et al.,2009; van der Maarel et al.,2002).

1.5 Industria textila

Amilazele sunt folosite in industria textila in procesele de descleiere. Agenti de incleiere
precum amidonul sunt aplicati pe fire inainte de producerea materialelor pentru a asigura un
proces de tesere rapid si sigur. Amidonul este un agent de incleiere foarte atractiv deoarece este
ieftin, usor accesibil in majoritatea regiunilor din lume si poate fi eliminat usor. Amidonul este
ulterior indepartat din tesatura intr-un proces umed al industriei de finisaj textil. Descleierea
implica indepartarea amidonului din material, care serveste ca agent de intarire pentru a preveni
ruperea urzelii in timpul procesului de tesere. -amilazele elimina selectiv agentul de incleiere si
8

nu ataca fibrele (Ahlawat et al.,2009; Feitkenhauer H., 2003; Gupta et al.,2003). Amilazele din
tulpini de Bacillus au fost folosite in dustria textila pentru o lunga perioada.

1.6 Industria hartiei

Folosirea -amilazei in industria celulozei si a hartiei este pentru modificarea amidonului
din hartia cretata adica pentru producerea unui amidon cu greutate moleculara mare, cu
vascozitate mica (Gupta et al.,2003, van der Maarel et al.,2002). Tratamentul de cretare serveste
pentru a face suprafata hartiei suficient de neteda si tare, pentru a imbunatati calitatea de scriere a
hartiei. In aceasta aplicatie, vascozitatea amidonului natural este prea mare pentru incleierea
hartiei si aceasta poate fi modificata prin degradarea partiala a polimerului cu -amilaze in
procese continue sau dicontinue. Amidonul este un bun agent de incleiere pentru finisarea hartiei,
imbunatind rigiditatea, rezistenta si capacitatea de stergere, pe langa a fi o acoperire buna pentru
hartie (Bruinenberg et al.,1996; Gupta et al.,2003). Exemple de amilaze obtinute din
microorganisme folosite in industria hartiei includ Amizyme (PMP Fermentation Products,
Peoria, USA), Termamyl, Fungamyl, BAN (Novozymes, Denmark) and -amylase G9995
(Enzyme Biosystems, USA) (Saxena et al.,2004).

1.7 Industria panificatiei

Pentru a controla capacitatea de producere a gazelor de catre aluat este necesara
adaugarea de - amilaza. Amilaza poate influenta consistenta aluatului. Granulele de amidon
deteriorate absorb mai multa apa decat granulele intacte. Aceasta capacitate este micsorata cand
asupra granulelor deteriorate actioneaza amilazele. Astfel, avand capacitate mica de a imobiliza
apa, granulele deteriorate elibereaza apa, care inmoaie aluatul si il face mai mobil.
A treia functie a amilazelor este capacitatea lor de a intarzia invechirea painii. In timp,
miezul painilor coapte se sfaramiteaza datorita unui complex de schimbari, care include
recristalizarea (sau retrogradarea) amilopectinei din amidon. Prin hidroliza amilopectinei in
unitati mai mici, -amilaza bacteriana poate mentine prospetimea si poate mari termenul de
garantie al produselor de panificatie.

In unele aplicatii, au fost adaugate enzime exogene specifice, in primul rand, pentru a imbunatati
aroma. Utilizarea -amilazei fungice a condus la imbunatatirea aromei si a acceptabilitatii
generale a painilor care contin faina de orez.
Un ultim motiv pentru folosirea amilazelor in produsele de panificatie este inlocuirea
bromatului de potasiu, ca agent de oxidare care intareste glutenul. Glutenul intarit produce un
aluat cu o capacitate de retentie a gazelor imbunatatita si, in consecinta, un produs finit cu un
volum mai mare. Studii privind sanatatea au aratat ca folosirea bromatului este in declin. Alti
oxidanti, cum ar fi acidul ascorbic, pot promova un volum comparabil, dar nu constituie o
pereche potrivita pentru bromat. In compensatie, -amilaza se poate adauga, in combinatie cu
acidul ascorbic, pentru imbunatatirea volumului si a structurii miezului. Brutarii pot adauga amilaza si acid ascorbic separat sau sa utilizeze un amestec optimizat al celor doua componente
(Hegenbart, 1994).

10

Capitolul 2 : Producatori de -amilazele

Cererea mondiala de enzime este satisfacuta de 12 producatori majori si inca 400 de mici
producatori. Aproape 75% din enzime sunt produse de 3 companii principale : Novozymes din
Danemarca, DuPont din SUA si Roche- Elvetia. Piata este extrem de competitiva, are marje de
profit mici si este intensiva din punct de vedere tehnologic.
Potrivit unui raport de cercetare al Agentiei Federale de Mediu din Austria, aproximativ
158 enzime sunt folosite in industria alimentara, 64 in aplicatii tehnice si 57 in furaje, din care 24
enzime sunt utilizate in 3 sectoare industriale. Aproape 75% din enzimele industriale sunt enzime
hidrolitice. Carbohidrazele, proteazele si lipazele domina piata enzimelor, reprezentand mai mult
de 70% din totalul vanzarilor de enzime.
Enzimele tehnologice sunt folosite de obicei ca enzime vrac in industria detergentilor,
textilelor, celulozei, hartiei, sintezei organice si biocombustibililor. Aceste enzime sunt evaluate
la peste 1 miliard $ de catre mai multe asociatii de cercetare. S-a estimat ca piata de enzime
tehnologice va creste cu o rata anuala de 6,6% pana va ajunge la 1,5 miliarde $ in 2015 cu cele
mai mari vanzari in piata de bioetanol si piata de piele.
Enzimele disponibile la nivel comercial utilizate in industrie sunt amilazele, proteazele,
lipazele, celulazele, xilanazele, catalazele, etc. Printre acestea, -amilazele par sa fie cele mai
versatile enzime in sectorul industrial fara indoiala datorita abundentei amidonului, avand
aplicatii variate de la conversia amidonului in sirop de zahar, pana la productia de ciclodextrine in
industria farmaceutica. Odata cu cresterea spectrului de aplicatii, cercetarea este concentrata pe
dezvoltarea de noi amilaze care sa prezinte caracteristici ameliorate: sa fie termofile,
termotolerante si sa prezinte toleranta la pH pentru a imbunatati gelatinizarea amidonului, sa
scada vascozitatea mediului, sa accelereze reactiile catalitice si sa reduca riscul contaminarilor
bacteriene. Cea mai termostabila -amilaza folosita frecvent in procesele industiale este obtinuta
cu ajutorul tulpinii Bacillus licheniformis. Ramane activa timp de mai multe ore la 90 0C. A fost
izolata o enzima extracelulara din Pyrococcus woesei care este activa intre 40-1300C, cu o
activitate optima la 1000C si pH =5.5. In ciuda acestui fapt, pastrarea amilazelor cu activitate
inalta in jurul valorii de pH=4, este inca de dorit in procesarea industriala a amidonului.

11

(Sursa: http://www.bizoo.ro/catalog-firme/enzime-culturi-drojdii-cat-687/start-0/10/)
Productia mondiala de amilaze este 40 000 de tone pe an. Novozymes ocupa 46% din
piata mondiala, ceea ce inseamna ca ii revine o productie anuala de aproape 18 000 tone amilaze.

(Sursa : http://www.bizoo.ro/catalog-firme/enzime-culturi-drojdii-cat-687/start-0/10/)

12

13

Capitolul 3 : Metode de obtinere a -amilazei

3.1 Cultivarea submersa
Producerea de -amilaze prin fermentatie submersa (SmF) si prin fermentatie in strat solid
(SSF) a fost cercetata si depinde de o serie de factori fizico-chimici. SmF a fost traditional
folosita pentru producerea la nivel industrial a enzimelor importante datorita posibilitatii de a
controla usor diferiti parametri ca pH-ul, temperatura, aerarea, umiditatea, transferule de oxigen
(Couto et al., 2006; Gangadharan et al., 2008).
Tulpinile de Bacillus licheniformis MTCC 2617 si MTCC 2618 au fost cumparate de la
Microbial Type Culture Collection (MTCC) Chandigarh si crescute in medii nutritive cu agar,
inclinate, la 37C si subcultivate in fiecare luna.Inoculul a fost pregatit prin adaugarea apei
distilate sterile in mediile de cultura inclinate agar nutritiv, 0.5 ml de suspensie a fost inoculata in
100 ml de mediu de fermentatie sterilizat si a fost incubat intr-un incubator cu agitator la 100 rpm
la 370C. Compozitia mediului a fost (g/l) peptona bacteriologica-6g, MgSO 47H2O- 0.5g, KCl 0.5g, substrat - 1g (Vidyalakshmi et al., 2009).
Dupa incubare, bulionul de cultura a fost centrifugat la 5000 rpm, 20 minute la 4C. S-a
colectat

supernatantul

si

s-a

estimat

activitatea

amilazei

(Vidyalakshmi

et

al.,

2009).Supernatantul a fost purificat mai departe pentru a obtine enzima bruta. Aceasta a fost
purificata prin precipitatre cu sulfat de amoniu, dializa si cromatografie de schimb ionic pentru a
obtine enzima pura.
Avantajele folosirii cultivarii submerse
Sistemele SSF par promitatoare datorita potentialului natural si avantajelor pe care le
ofera. SSF se aseamana habitatul natural al microrgansimelor si este prin urmare, alternativa
preferata pentru microorganisme, pentru a creste si a produce produse utile cu valoare adaugata.
SmF poate fi considerat o violare a habitatului lor natural, mai ales in cazul fungilor (Singhania
et al., 2000). Drojdiile si fungii au fost definiti ca microorgaisme adecvate pentru SSF in
conformitate cu conceptul teoretic al activitatii apei, in timp ce bacteriile au fost considerate
necorespunzatoare. Totusi, experienta a aratat ca culturile bacteriene pot fi bine administrate si
14

manipulate in procesele SSF. Exista mai multe avantaje ale folosirii SSF in comparatie cu SmF
cum ar fi : productivitate superioara, tehnici mai simple, investitii de capital mai mici, consum de
energie si debit de apa mai mic, o recuperare a produsilor mai buna si lipsa formarii spumei ; pe
langa acestea s-a raportat ca fiind cel mai adecvat proces pentru tarile in curs de dezvoltare.
Recent, cercetarile au stabilit ca SSF este cel mai bun sistem pentru producerea de enzime.
Cercetatorii au aflat ca SSF este adecvat pentru producerea de enzime si alte produse termolabile,
in special cand pot fi obtinute randamente mai mari in comparatie cu SmF (Couto et al., 2006;
Tanyildizi et al., 2007).
Optimizarea conditiilor de fermentatie,mai ales a parametrilor fizico-chimici, este
importanta in dezvoltarea proceselor de fermentatie datorita impactului lor asupra economiei si
practicabilitatii procesului (Francis et al., 2003). Rolul diferitilor factori incluzand pH,
temperatura, ioni metalici, surse de carbon si azot, agenti cu actiune de suprafata, fosfat si
agitarea au fost studiate pentru producerea de -amilaze. Proprietatile fiecarei -amilaze ca
termostabilitatea, profilul si stabilitatea pH-ului, independenta de Ca trebuie adaptate fiecarei
aplicatii. De exemplu, -amilazele utilizate in industria amidonului trebuie sa fie active si stabile
la pH scazut, dar la un pH ridicat in industria detergentilor. Cele mai notabile printre acestea sunt
compozitia mediului de crestere, pH-ul mediului, concentratia de fosfat, varsta inoculului,
temperatura, aerarea, sursa de carbon si de azot (Couto et al., 2006; Sajedi et al., 2005).
Parametrii fizico-chimici ai -amilazelor din bacterii si fungi au fost larg studiate si descrise
(Gupta et al., 2003).
3.1.1 Fermentatie
In cazul productiei amilazei cu Bacillus flavothermus prin cultivare batch intr-un
fermentator de 20 L, productia de amilaza si biomasa a atins maximul de 2 ori si cea mai mare
activitate a fost obtinuta dupa 24 ore. Culturile obtinute prin sisteme continue si semicontinue au
fost recunoscute ca fiind cele mai eficiente pentru productia enzimei si mai multe grupe de
cercetatori au studiat eficienta acestor culturi. Productia -amilazei din Bacillus subtilis a fost
substantial imbunatatita prin extinderea cultivarii batch cu alimentare fed-batch
Activitatea enzimatica a fost cu 54% mai mare in cazul sistemelor de operare semicontinue
formate din doua etape la o rata de alimentare de 31.65 ml h -1, decat cea obtinuta doar intr-o
singura etapa.
15

Sistem de cultivare batch

Pstrarea culturii n azot lichid, cu efectuare periodic de teste de viabilitate;
Inoculul se transfer din flaskuri n fermentatorul din etapa pilot i de aici n cel din

etapa de de fermentare ppropriu-zis periodic;

- n proporie de 1 5% n volume
n etapa de propagare celular se utilizeaz un mediu mbogit pentru a determina o

cretere bun;
n etapa de cretere logaritmic - compoziia mediului este ajustat n funcie de producia
dorit

3.1.2 Biosinteza -amilazelor bacteriene

-amilazele bacteriene sunt enzime termostabile;

speciile din genul Bacillus i anume Bacillus subtilis i B. amyloliquefaciens, B.

licheniformis i B. stearothermophilus;
gradul de hidroliz calculat prin determinarea cantitii de glucide reductoare obinute
n urma hidrolizei enzimatice raportate la cantitatea total de substrat (amidon) utilizat,

este aproximativ acelai (20-25%)

cultivat n sistem discontinuu, submers
enzima este produs n mod normal dup ce a atins faza maxima de cretere i ncepe

faza staionar;
nivelul de producere a enzimei este limitat de concentraia sursei de carbon datorit

procesului de inhibiie prin catabolit ) - demonstrat pe B. licheniformis.

Bacillus subtilis producerea este influenat de particularitile morfo-fiziologice
corelate cu potenialul productiv al tulpinii

Parametrii digestiei:

starea fiziologic a microorganismului utilizat;

potenialul productiv al tulpinii folosite;
compoziia mediului de biosintez;
parametrii de biosintez (temperatur, pH, vitez de agitare, viteza de aerare, durata
cultivrii).

3.1.3 Biosinteza -amilazelor cu tulpini modificate genetic

16

studiile de inginerie genetic efectuate pn n prezent au demonstrat posibilitatea

transferrii genelor de la o specie la alta;

cele mai des utilizate sunt bacteriile din genul B. subtilis ; se mai utilizeaz B.

sterothermophilus
atunci cnd genele -amilazei sunt clonate n E. coli, ele se exprim, enzima acumulndu-

se n spaiul periplasmatic;
biosinteza -amilazelor este influenat de compoziia mediului nutritiv i de condiiile de
cultivare a microorganismului
-surs de carbon - varieti de amidon, glicogenului, maltotetraozelor, maltotriozele,

maltoza (de cinci ori mai slabe dect la glicogen)

- sursele de azot - sruri de amoniu, aminoacizi, cazein
-3 vitamine;
-7 aminoacizi
mediul de reacie
- fin de pete, prot de soia mai mult proteaz dect -amilaz
- mediu pe baz de amidon - -amilaza
- mediu se adaug glucoz - biosinteza -amilazei este inhibat parial sau total
ionii de calciu i amoniu
temperatura de cultivare:
- variaz de la o specie la alta:
- ntre 30 i 370C pentru B. subtilis
- ntre 50 i 650C pentru B. coagulans i B. stearothermophilus
pH-ul optim:
- 6,0 i 7,5
- controlat i meninut constant pe toat durata biosintezei
- proteinele mbuntesc capacitatea de tamponare a mediului
proces intens aerob:
- oxigenul insuflat o data cu aerul sterilizat este utilizat numai ca oxigen dizolvat
- cantitatea de oxigen este cu att mai mare cu ct perioada de cretere a unei
generaii este mai mic
Proprietile fizico-chimice ale mediului de cultur:
- vscozitatea
tendina de spumare

17

18

Sistemele apoase bifazice (SAB) se pot utiliza n procesele de separare a proteinelor prin
extracie L L. Tehnica se bazeaz pe incompatibilitatea a doi polimeri hidrofili diferii la
dizolvarea lor ntr-un solvent uzual cum este apa, sau pe incompatibilitatea dintre un polimer
hidrofil i o sare anorganic. Pentru o evaluare economic corect, este important de tiut c
extracia n SAB este o tehnologie integrativ, permind ndeprtarea solidelor i creterea
activitii specifice a produselor ntr-o singur etap. n plus, produsul poate fi separat de acizii
nucleici cu mas molecular mic i poate fi concentrat, mbuntindu-se astfel performana
urmtoarelor etape de separare.
19

Pentru exemplificare, n fig. 4.35 este redat schema de principiu a obinerii -amilazei
din Bacillus sp. prin tehnologia convenional i prin extracia n SAB. Extracia n SAB s-a
realizat la scar mare (capacitate de 50 m3). Fa de procesul convenional, procesul utiliznd
extracia n SAB necesit mai puine etape, randamentul global fiind de 80% la extracia ntr-o
singur treapt i de 95% la extracia n dou trepte, fa de numai 70% prin procedeul
convenional. Costurile se reduc cu 35% la extracia ntr-o singur treapt i cu 50% la extracia
n dou trepte . Dei nou i relativ puin utilizat n practica industrial, extracia n SAB este o
tehnic important pentru izolarea i separarea moleculelor proteice. Numrul mare de cercetri
n domeniu (mii de articole publicate), numrul crescut de aplicaii brevetate i implementate la
nivel pilot i industrial, corelate cu creterea mrimii produciei de proteine terapeutice vor face
din aceast tehnic o alternativ atractiv n biotehnologiile industriale, mai ales dac se rezolv
tehnico-economic problema recuperrii i recirculrii eficiente a chimicalelor de proces.
3.1.4 Purificarea

Enzimele industriale produse in vrac necesita putina prelucrare si sunt prin urmare,
preparate relativ brute. Utilizarea comerciala a -amilazei nu necesita in general, purificarea
acesteia, dar aplicatiile in domeniile farmaceutice si clinice necesita amilaze de inalta puritate.
Purificarea la nivel de laborator a amilazelor include diferite combinatii de schimb ionic, gelfiltrare, interactiuni hidrofobe si cromatografia cu faza inversa.
Alternativ, au fost propuse protocoale de extractie a -amilazei folosind solventi organici
ca etanolul, acetona, sulfatul de amoniu pentru a realiza precipitarea [Glymph and Stutzenberger
1977; Hamilton et al.1999; Khoo et al. 1994] sau ultrafiltrarea [Moraeset al. 1999]. Aceste
metode conventionale compuse din mai multe etape necesita echipamente scumpe, ceea ce le face
laborioase, consumatoare de timp, greu reproductibile si pot conduce la scaderi ale produsului
dorit [Arauza et al. 2009].
Procesele de purificare sunt puternic dependente cererea pietii, de costurile de procesare,
de calitatea finala, si de tehnologia disponibila. Majoritatea enzimelor sunt purificate prin tehnici
de cromatografie dupa izolarea bruta prin precipitare si separare prin membrane.
Nevoia de producere pe scara larga la costuri mici a condus la evolutia tehnicilor care ofera
protocoale rapide, eficiente si economice cu doar cateva etape de prelucrare [Amritkar et al.

20

2004].Tehnicile de prelucrare care produc preparate omogene de amilaze intr-o singura etapa sunt
prezentate in tabelul 3.

Cromatografia de afinitate este o tehnic de purificare, care de obicei ofer puritate > 95%
ntr-un singur pas. Metoda cromatografiei de afinitate a fost aplicata de mai multi cercetatori
(Damodara Rao Mendu et al, Eva Bernhardsdotter et al.). Amestecul de macromolecule supus
separarii este aplicat in partea superioara a unei coloane continand particule poroase insolubile,
Sepharose, si este eluat cu 2% dextrina alba. Capacitatea de legare a amilazei la coloana de
amidon este de 380 mol/g amidon. Specificitatea enzimei purificate a fost confirmata prin
imunodifuzie, imunoelectroforeza, care au analizat sinteza amilazei la diferite puncte de timp.

3.1.5 pH, temperatura, agitare

Majoritatea tulpinilor comerciale de Bacillus folosite in producerea de amilaze bacteriene prin

SmF prezinta un pH optim intre 6.0-7.0 pentru cresterea si producerea enzimei. Acest lucru se
aplica si la obtinerea enzimei prin SSF.In majoritatea cazurilor pH utilizat nu este specificat, cu
exceptia cazurilor Aspergillus oryzae pH=4.2, 8.0 in Aspergillus oryzae si 6.8 pentru Bacillus
amyloliquefaciens [55, 35].

21

Producerea amilazei in sistem de operare continuu din Bacillus amyloliquefaciens la 36C

a obtinut randamente mari.
Intensitatea agitarii influenteaza amestecarea si rata de transfer a oxigenului in majoritatea
fermeentatiilor fungice si prin urmare, influenteaza morfologia miceliului si formarea produsului.
S-a constatat ca o viteza mai mare de agitare conduce la o scadere a cresterii miceliului si ca
atare, la o scadere a productiei de enzima. Intensitati ale agitarii pana in 300 rpm au fost in mod
obisnuit folosite pentru producerea amilazei din diferite microoorganisme.

3.2 Dozarea activitatii -amilazei dupa o metoda adaptata dupa Metais si Bieth
Principiul metodei
Amilaza hidrolizeaza o solutie de amidon, iar substratul ramas nehidrolizat este dozat
spectofotometric la =565 nm, in urma reactiei cu iod.
Reactivi si solutii
1)
2)
3)
4)
5)

Solutie tampon Na2HPO4 0,2 M-acid citric 0,1 M, pH=7;

Solutie tampon 0,4% preparata in tampon (1);
Solutie de acid acetic 6%;
Solutie iod N/1500
EPT- 1 g ficat, mojarat fin se lasa la extras 1 h in 10 ml apa distilata, se centrifugheaza iar
supernatantul reprezinta extractul proteic total.

Mod de lucru
Amestecul de reactie contine: 0,3 ml solutie de amidon
0,2 ml EPT (diluat 1/3)
Incubare 5 minute la 370C
5 ml solutie de acid acetic 6%
5 ml Iod N/1500

22

Complexul violet format (ce contine amilodextrine) se colorimetreaza la =565 nm fata

de apa distilata
Pentru a determina concentratia de amidon prezenta initial in mediul de reactie si se
prepara o proba de control in care acelasi amestec de reactie este stopat la timpul zero.

3.3 Determinarea activitatii enzimatice a -amilazei dupa metoda Hostettler

Principiul metodei
Amidonul este hidrolizat sub actiunea catalitica a -amilazei la fragmente ale caror
grupari reducatoare semiacetalice pot fi determinate in urma reactiei cu acid 3,5-dinitrosalicilic.
Concentratia de acid nitroaminosalicilic format si masurata la =546 nm, corespunzatoare
activitatii enzimatice.

Acid 3,5-dinitrosalicilic

acid 3-amino-5-nitrosalicilic

Reactivi si solutii
1) Solutie tampon NA2HPO4-KH2PO4 20 mM, pH=6,9 ce contine NaCl 10mM;
2) Solutie amidon 0,1% preparata in tampon (1)
3) Reactiv 3,5-dinitrosalicilic (se dizolva la cald 10 g acid 3,5-dinitrosalicilic in 300 ml apa
distilata, se adauga 400 ml NaOH 1N si 300 g tartrat de Na si K- dupa dizolvare se adauga
la un volum final de 1 l);
4) Solutie standard de maltoza
5) EPT- 1 g ficat, mojarat fin se lasa la extras 1 h in 10 ml apa distilata, se centrifugheaza iar
supernatantul reprezinta extractul proteic total.
23

Mod de lucru
Amestecul consta din 1 ml solutie tampon
1 ml solutie amidon
0,2 ml EPT
Incubare 10 min la 250 C
2 ml DNS
Incubare 5 min la fierbere
Racire sub jet de apa
Repaus 20-60 min la temperatura camerei
Citire DO la =546 nm
Pentru a determina concentratia de acid 3-amino-5-nitrosalicilic, se prepara o proba
de control in care acelasi amestec de reactie este stopat la timpul zero.

24

3.4 SCHEMA TEHNOLOGICA DE OBTINERE A AMILAZELOR PRIN

CULTIVARE SUBMERSA
Amidon
MgSO47H2O + Peptona
bacteriologica+KCl
Preparare

mediu

Sterilizare

Aer + Inocul Bacillus licheniformis

CO2

Fermentatie

Biomas
Separare
a
biomasa

Ape reziduale

Concentrare

Precipitare cu sulfat de
Sulfat de amoniu rezidual +
amoniu
Purificare
amilaze

Ape

Uscare

Amila
ze

25

Capitolul 4 : Bilan de materiale

Determinarea productiei pe sarje (Pan)
Pan = 5000 tone/an = 5*106kg/an
Numarul de sarje (ns)

ns

FAT (ore)
ts

FAT = fondul anual de timp

FAT = 310 zile = 310 * 24 h=7440 h

ts= tf+ taux

tf = durata fermentatiei

Ps

Pan
ns

tf = 140 h
taux= timpii auxiliari = [10-15] h -> se adopta taux = 15 h
ts= 140 + 15 = 155 ore
Productia pe sarje

ns

310 24
48sarje
155

Ps=

5 106
48

= 104 170 kg/sarja

26

ETAPA DE USCARE
Cantitatea de amilaze obtinute intr-o sarja, la terminarea procesului biotehnologic este de

104170kg ;
In etapa de uscare, pierderile se considera a fi de 3% ;
Intrare : 104170 kg ;
Iesire amilaze
77%
80 211 kg
Apa
20%
20 833 kg
Pierderi
3%
3126 kg

Amilaze
purificate

USCARE

ApAAAAAa
Apa
Areziduala
reziduala

Amilaze
brute

USCARE

M1

M0 = 104 170 kg
P0=3%

M1 = M0 + p0

Dar

p0

2M 1
100

, adic pierderile la uscarea produsului sunt de 2% din masa produsului finit.

=>

M1 =104170 + 0,03M1=> 0,97M1 = 104170

=>

M1 = 107392 kg/sarja

ETAPA DE PURIFICARE
27

 Cantitatea de amilaze purificate obtinute intr-o sarja, in urma procesului de uscare este de
107 392 kg;
In etapa de purificare, pierderile se considera a fi de 10% ;
Intrare : (NH4)2SO4 15%
16 109 kg ;

Amilaze
85%
91 283 kg;
Iesire amilaze
80%
85 914 kg

Apa
5%
5 370 kg

Pierderi
10%
10 739 kg

AA Amilaze

Precipitare cu
sulfat de

PURIFICA
RE

brute

ApAAAAAa
Solutie
Areziduala
apoasa

Amilaze
purificate

PURIFICARE

M2

M1= 106 291 kg

P1=10 %

M2 = M1 + p1

Dar

p1

10M 2
100

, adic pierderile la purificarea produsului sunt de 10% din masa de amilaze

obtinuta dupa concentrare.

=>

M2 =107 392 + 0,1M2 => 0,90M2 = 107 392 kg

=>

M1 = 119 324 kg/sarja

ETAPA DE CONCENTRARE

28

 Cantitatea de amilaze obtinute intr-o sarja, in urma procesului de purificare este de 119
324 kg ;
In etapa de concentrare , pierderile se considera a fi de 9% ;
Intrare : 119 324 kg ;
Iesire amilaze
78%
93 072 kg

Apa
13%
15 512 kg

Pierderi
9%
10 740 kg

ASolutie filtrata

CONCENTR
ARE

ApAAAAAa
Apa
Areziduala
reziduala

Solutie
concentrata

M3

CONCENTR
ARE

M2 = 119 324 kg
P2=9%

M3 = M2 + p2

Dar

p2

9M 3
100

, adic pierderile la uscarea produsului sunt de 9% din masa bruta de amilaze..

=>

M3 =119 324 + 0,091M3 => 0,091M3 = 119 324 kg

=>

M1 = 131 125 kg/sarja

ETAPA DE SEPARARE A BIOMASEI

29

 Cantitatea de amilaze obtinute intr-o sarja, in urma procesului de concentrare este de 131

125 kg ;
In etapa de uscare, pierderile se considera a fi de 5% ;
Intrare : 131 125 kg ;
Iesire amilaze
85%
111 455 kg

Apa
10%
13 113 kg

Pierderi
5%
6557 kg

Biomasa
celulara

SEPARAREA
BIOMASEI

ApAAAAAa
Precipitat
Areziduala

Lichid de
fermentatie

M4

SEPARAREA
BIOMASEI

M3 = 131 125 kg
P3=5%

M3 = M2 + p2

Dar

p3

5M 4
100

, adic pierderile la separarea biomasei sunt de 5%.

=>

M3 = 131 125+ 0,095M4 => 0,095M4 = 119 324 kg

=>

M1 = 138 026 kg/sarja

ETAPA DE FERMENTATIE

30

 Cantitatea de amilaze purificate obtinute intr-o sarja , in urma procesului de separare a

biomasei este de 138 026 kg;
In etapa de purificare, pierderile se considera a fi de 5% ;
Intrare : inocul
4%
5522 kg ;

aer
5%
6901 kg;

mediu
91%
125 603 kg;
Iesire biomasa
92%
128 983 kg

CO2
2%
2760 kg

NH2
1%
1381 kg

Pierderi
5%
6902 kg

bApAAAAAa
Aer
Areziduala

Inocul Bacillus
licheniformis

ApAAAAAa
CO2, NH2
Areziduala

FERMENTA
TIE

Biomasa
celulara

M5

M4 = 138 026 kg

Fermentati
e

P4=5%

M4= M3+ p3

p5
Dar

5M 5
100 , adic pierderile la fermentatie sunt de 5% din cantitatea de mediu sterilizat.

=>

M5 =138 026 + 0,095M1

=>

M1 = 145 290 kg/sarja

=> 0,095M1 = 138 026 kg

Bilant global de materiale

Materiale intrate
Nr.
Crt.

Denumire
material

Materiale iesite
U.M.

Cantitat
e

Nr.
Crt.

Denumire
material

U.M.

Cantitat
e
31

Amilaze
sub Kg/sarj
forma pulverizata a

104170

Kg/sarj
a

104170

Total

Amilaze 85%
Kg/sarj
Sulfat de amoniu a
15%

Total

Kg/sarj
a

Total

92283
16109

108392

Amilaze
77%
Kg/sarj
Apa 20%
a
Pierderi 3%

Total

Lichid
fermentatie

Total

Total
Total
genera
l

Inocul 4%
Aer 5%
Mediu 91%

Kg/sarj
a

119324

Kg/sarj
a

119324

de Kg/sarj
a

131125

Kg/sarj
a

131125

Kg/sarj
a
Kg/sarj
a
Kg/sarj
a

5522
6901
125603
138026
601307

Amilaze
80%
Apa 5%
Pierderi
10%
Solutie
apoasa 5%

Total

3
Solutie filtrata

Kg/sarj
a

Total

Total

Total

Kg/sarj
a

Kg/sarj
a
Amilaze
78%
Apa 13%
Pierderile
9%

Kg/sarj
a

80211
20834
3125
104170
85914
5370
11739
5369

108392
93072
15512
10740

Kg/sarj
a

119324

Amilaze
85%
Kg/sarj
Apa 10%
a
Pierderi 5%

111455
13113
6557

Kg/sarj
a

131125

CO2 2%
NH2 1%
Biomasa
Kg/sarj
Pierderi 5% a

2760
1381
126983
6902

Kg/sarj
a
Kg/sarj
a

138026
601307

32

Capitolul 5: Dimensionarea utilajelor utilizate pentru obinerea amilazelor

5.1 Atomizorul

Atomizarea este un proces de evaporarea al apei folosind un flux de aer cald. Aparatul
pulverizeaz o perdea fin de vapori; vaporii care intr n contact cu fluxul de aer sunt
transformai ntr-o pudr fin, care se separ gravimetric ntr-un ciclon.
Tehnologia funcioneaz n proces continuu, temperatura de uscare i prelucrare a
produsului ramne constant, fiind posibile ajustri de parametri pe perioada uscrii. Este un
proces rapid i continuu de uscare, fiind n final cel mai economic.
Atomizarea prezint cteva avantaje comparativ cu procedurile similare ca, flux continuu
de procesare, control permanent al debitului de lichid i al temperaturii de uscare, consum de
energie sczut, etc.
Nr

Parametri tehnici

Caracteristici

Apa evaporata kg/ ora

150

Tipul de pulverizare

Atomizor rotativ

Viteza de atomizare

18000 r/min

Diametru de atomizare

150 mm

Diametrul turnului

3m

Lungimea de acoperire

7m

Limea de acoperire

5.5 m

nlimea turnului

7,2 m

Material

Oel inoxidabil

Descriere funcii :
33

Componentele de baz ale atomizorului: Toi rulmenii sunt de nalt precizie (rulmeni SKF,
Suedia)
Funcionare fr problema: Pn la 7000 ore sau mai mult.
Sistemul electric de control: varietate de opiuni de control pentru a satisface nevoi diferite,
abordare logic clasic; sistem cu proces dinamic de simulare; software special de programare
FX - DU / WIN C; control de configurare; ecran touch screen pentru controlul operaional.

Ciclu inchis de uscare prin pulverizare folosind un atomizor rotativ

5.2 Centrifuga
Centrifugarea este operatia hidrodinamica cu ajutorul careia se poate realiza separarea
amestecurilor eterogene. Aceasta are loc cu ajutorul fortei centrifuge, care apare la rotirea
amestecului cu viteza mare. Aparatele cu ajutorul carora se realizeaza se numesc generic
centrifuge. Centrifugele se caracterizeaza prin elementele in miscare de rotatie la turatie mare. In
unele cazuri centrifugele primesc denumiri speciale, determinate in special de operatia realizata:
separator, clarificator, concentrator, etc.
Principiul separarii
34

Conform principiului separarii vor exista 3 faze : un lichid subtire, unul mai grosier, si
sedimentul cauzat de diferentele de densitate si insolubilitate in lichidul mixt dobandite in timpul
vitezei de sedimentare. In campul fortei centrifugale sau in cel al fortei gravitationale, faza
lichidului mai usor, a lichidului mai greu si a sedimentului cu densitati diferite si reciproc
insolubile in lichidul amestecat, toate acestea, au viteze diferite de sedimentare, drept urmare are
loc separarea si stratificarea lor. In campul fortei centrifugale aceasta separare se numeste
separare centrifugala, iar in campul gravitational separare gravitationala.

Nr.

Parametri tehnici

Caracteristici

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Material
Viteza de rotatie
Capacitate (m3/h)
Capacitate ( l/h)
Motor principal (kW)
Motor secundar (kW)
Lungime (m)
Inaltime (m)
Latime (m)
Greutate ( kg)

Otel inoxidabil
2000-5000rpm
12-20
100 000
55-99
15-22
2,5
5
1,9
4500

Aplicatii
35

 Orice suspensie cu 3 faze: lichid subtire, lichid grosier si sediment cum ar fi : apa cu
namol, grasime
Industria farmaceutica sau industria chimica care obtin: hidroxid de aluminiu, sulfat de
amoniu, carbonat de calciu, antibiotice, caseina, celuloza, sodiu fosfat, acid tartric, nitrat
de sodiu, pesticide, ulei de gatit, enzime precum si alte substante .
Ulei mineral, ulei de palmier, ulei de masline, ulei de avocado, ulei recuperat .
Produse de origine animala sau vegetala (proteine, ulei, amidon )
Bauturi ( vin, bere, sucuri de fructe )

5.3 Cromatografia prin coloane

Bioprocesul de purificare prin coloane au un design elegant, caracterizat prin simplitate
i calitate in care purificarea proteinelor se realizeaza intr-o maniera rapida, reproductibila.
Bioprocesele sunt conduse prin comprimare dinamica axiala n conformitate cu standardele
industriale, reducnd dramatic volumul de tampon necesar pentru despachetarea coloanei.

Presiune 5-6 bari

Posibilitate de ridicare la scara pana la 2m

Compatibil cu cromatografia de afinitate, de schimb ionic, de excluziune (gelcromatografie) si cu cea de interactiune hidrofoba

Timp mai scurt si o cantitate mai mica de solutie tampon

Debitul ajunge pana la 15 000 L/h

Confectionat din otel inoxidabil cu EPDM (etilenpropilendienmonomer), un tip de cauciuc
sintetic
36

Comprimare dinamica axiala

Se refera la o coloana in care presiunea constant este plasat pe un piston mobil pentru a
facilita impachetarea de inalta calitate in timp minim. Distributia optimizata a debitului
imbunatateste rezolutia.

5.4 Schimbtorul de cldur

Schimbatoarele de caldura sunt aparatele termice in care are loc transferul de caldura de la
un agent termic primar la un agent termic secundar. Energia termica a agentului secundar este cea

37

care se utilizeaza in diferite scopuri tehnologice, de incalzire etc. Schimbatoarele de caldura sunt
aparate termice de forme constructive si functionale foarte diversificate.
Schimbtoarele de cldur se folosesc n procese de incalzire, topire, sublimare, fierbere,
vaporizare, condensare, racire si solidificare. Ele isi gasesc o larga aplicabilitate in instalatiile de
incalzire, refrigerare, climatizare, distilare, in centralele termice, termoficare si ca anexe ale
masinilor termice.

Nr.

Parametri tehnici

Caracteristici

Putere termic

280kW

Debit ACM circuit secundar

4,87 m3/ h

Presiune maxima de lucru

16 bar

Pierderi de presiune circuit primar

0,39 bar

Pierderi de presiune circuit secundar

0,07 bar

Temperatura maxima de lucru

120 C

Lungime

405 mm

Lime

180 mm

nlime

480 mm

10

Dimensiune racord

1 1/4

11

Greutate

29 kg

12

Garnituri material plci

Oel inoxidabil

13

Material garnituri

Nitril

38

5.5 Dimensionarea bioreactorului

In urma procesului de preparare a mediului si a sterilizarii acestuia s-au obtinut masele
M6 (sterilizare), respectiv M7 (preparare mediu). In cadrul proceselor s-au inregistrat pierderi de
4%, respectiv 5%.

p6

4M 6
100

, adic pierderile la sterilizare sunt de 4% din masa de amilaze obtinuta dupa

fermentatie
=>

M6 =145 290 + 0,96M6 => 0,96M6 = 145 290 kg

=>

M1 = 151 343 kg/sarja

p7

5M 7
100

, adic pierderile la prepararea mediului sunt de 5% din masa de amilaze obtinuta

dupa sterilizare
=>

M7 =151 343 + 0,95M7 => 0,95M7 = 151 343 kg

=>

M1 =156 023 kg/sarja

Densitatea amilazelor=1,25 g/ml=1,25 kg/l= 12 500 kg/m3

1000 L=1 m3

A Mm=masa mediului
39

V1=volumul mediului
Vt=volumul total al bioreactorului
=gradul de umplere al bioreactorului=0,85

A m/V1=>V1= 156023
=M
12500
A

V1=12,5 m3

2
D H
4

Vt=

Vt= V1 / = 15 m3
Raport intre dimensiunile bioreactorului
H

A D =2

VA
t=

H=2 D

3,14 D2 2 D
4

m3

3,14 D3
2

15=

D=1,75 m
H=3,50 m

40

Bioreactor pentru obinerea amilazelor

Nr
1

Parametri tehnici
Volum nominal

Caracteristici
100000 L
Titan, Nichel, Tantal, Zirconiu

Material

cptuit cu PTFE
(politetrafluoroetilena)

Presiune

0,1-5 MPa

Temperatura

3500C

Raport H/D

Puterea motorului

45-75 KW

Tipul de conectare al motorului

Vertical

Cuplaj motor agitare

Cupl magnetic

Agitator

Cu ax radial

10

Control agitare

Automat

11

Tip rotor agitare

Tip pale nclinate

12

Agitare in regim turbulent

2 000 000 cps (ciclu/secunda)

13

Viteza de amestecare

0-250 r/min

14

Incalzire/racire

Dubla manta

15

Tipul de nclzire

Cu abur

41

.5

42

5.6 Filtrele de aer

Marele avantaj al filtrelor e reprezentat de dimensiunile reduse cu o inalta suprafata
filtranta disponibila. Amploarea modularitatilor si diversele tipologii de materiale filtrante
consimte acoperirea in totalitate a problemelor legate de materialele tratabile cu acest tip de filtru.
In functie de tipologia de instalare, sunt disponibile filtre cu dimensiuni si caracteristici diferite
pentru o vasta gama de exigente. Fiecare filtru este disponibil fie in versiune cu motoventilator
fie fara motoventilator.
Eficienta

de

filtrare

poate

atinge

nivelul

de

pana

la

99,92%

teste

B.I.A.-

Berufgenossenschaftliches Institut fuer Arbeitssicherheit (Institutul Interprofesional pentru

Protectia Muncii) la care periodic se supun filtrele utilizate.
Aplicatiile acestui tip de filtru sunt nelimitate, contribuind la largirea campului de actiune
chiar si pentru pulberi cu pericol de deflagratie.

Functionare
Tehnologia de filtrare se bazeaza prin proprietatile filtrelor. Rama metalica protejaza
materialele filtrate si aduce o mare stabilitate la structura, executate in tabla zincata usor
demontat/demontat.
Curentul creat de ventilator in amonte, obliga aerul poluat sa traverseze filtre prin reductia montat
pe latura opus si intra in ventilatoare care o trimite in hala.
Instalare
Instalarea grupurilor filtrante se face prin conectare la tubulatura rigida din tabla zincata
cu gura de aspiratie a ventilatorului. Aerul introdus in mediu va respecta normele in vigoare.

43

44

Concluzii
Amilazele (E.C.3.2.1.1) sunt enzime care catalizeaza hidroliza legaturilor glicozidice 1,4 din amidon in produse cu greutate moleculara scazuta ca molecule de glucoza,
maltoza, maltotrioza;

Amilazele sunt printre cele mai valoroase enzime si au o mare importanta pentru
biotehnologii, constituind clasa de enzime industriale avand o pondere de aproximativ
25% din piata mondiala de enzime;

Amilaze prezint diverse aplicaii industriale, fiind utilizate cu preponderen n industria

alimentar, industria detergenilor, industria textil, industria hrtiei, panificaie, conversia
amidonului i producerea de biocombustibili;

Metoda de obinere a a -amilazei care prezint cele mai multe avantaje este cultivarea
submers ( SmF);

Utilajele folosite pentru obinerea -amilazei sunt: atomizorul, cromatografia prin

coloane, schimbtorul de cldur cu plci i bioreactorul.

45

Bibliografie
Ahlawat, S.; Dhiman, S.S.; Battan, B.; Mandhan, R.P.; Sharma, J. (2009). Pectinase production
by Bacillus subtilis and its potential application in biopreparation of cotton and micropoly fabric.
Process Biochemistry 44, 521526.
Bruinenberg, P.M.; Hulst, A.C.; Faber, A.; Voogd, R.H. (1996) A process for surface sizing or
coating of paper. In: European Patent Application.
Chi, M.; Chen, Y.; Wu, T.; Lo, H.; Lin, L. (2009). Engineering of a truncated -amylase of
Bacillus sp. strain TS-23 for the simultaneous improvement of thermal and oxidative stabilities.
J. Biosci. Bioeng. xx, xxx-xxx.
Chi, Z.; Chi, Z.; Liu, G.; Wang, F.; Ju, L.; Zhang, T. (2009). Saccharomycopsis fibuligera and its
applications in biotechnology. Biotechnol Adv 27, 423-431.
Couto, S.R.; Sanromn, M.A. (2006). Application of solid-state fermentation to food industry- A
review. Journal of Food Engineering 76, 291-302.
Couto, S.R.; Sanromn, M.A. (2006). Application of solid-state fermentation to food industry- A
review. Journal of Food Engineering 76, 291-302.
de Moraes, L.M.; Astolfi-Filho, S.; Oliver, S.G. (1995). Development of yeast strains for the
efficient utilisation of starch: evaluation of constructs that express alpha-amylase and
glucoamylase separately or as bifunctional fusion proteins. Appl Microbiol Biotechnol 43, 10671076.
Feitkenhauer, H. (2003). Anaerobic digestion of desizing wastewater: influence of pretreatment
and anionic surfactant on degradation and intermediate accumulation. Enzyme Microb. Technol.
33, 250258.

46

Francis, F.; Sabu, A.; Nampoothiri, K.M.; Ramachandran, S.; Ghosh, S.; Szakacs, G.; Pandey, A.
(2003). Use of response surface methodology for optimizing process parameters for the
production of -amylase by Aspergillus oryzae. Biochem. Eng. J. 15, 107115.
Gavrilescu, M.; Chisti, Y. (2005). Biotechnology-a sustainable alternative for chemical industry.
Biotechnol Adv 23, 471-499.
Gangadharan, D.; Sivaramakrishnan, S.; Nampoothiri, K.M.; Sukumaran, R.K.; Pandey, A.
(2008). Response surface methodology for the optimization of alpha amylase production by
Bacillus amyloliquefaciens. Bioresour Technol 99, 4597-4602.
Gupta, R.; Gigras, P.; Mohapatra, H.; Goswami, V.K.; Chauhan, B. (2003). Microbial -amylases:
a biotechnological perspective. Process Biochem 38, 1599 - 1616.
Ghorai, S.; Banik, S.P.; Verma, D.; Chowdhury, S.; Mukherjee, S.; Khowala, S. (2009). Fungal
biotechnology in food and feed processing. Food Res. Int. 42, 577587.
Gupta, R.; Gigras, P.; Mohapatra, H.; Goswami, V.K.; Chauhan, B. (2003). Microbial -amylases:
a biotechnological perspective. Process Biochem 38, 1599 - 1616.
Hegenbart,S.1994. Learning and speaking the language of flavor. Food Product Design.August
1994, 33, 34, 39, 40, 43, 44, 46-49.
Hmidet, N.; El-Hadj Ali, N.; Haddar, A.; Kanoun, S.; Alya, S.; Nasri, M. (2009). Alkaline
proteases and thermostable -amylase co-produced by

Bacillus licheniformis

NH1:

Characterization and potential application as detergent additive. Biochemical Engineering

Journal 47, 7179.
Kandra, L. (2003). -Amylases of medical and industrial importance. Journal of Molecular
Structure (Theochem) 666667, 487498.

47

Kirk, O.; Borchert, T.V.; Fuglsang, C.C. (2002). Industrial enzyme applications. Curr Opin
Biotechnol 13, 345-351.
Krishnan T & Chandra AK. 1983. Purification and Characterization of Alpha-Amylase from
Bacillus-Licheniformis Cumc305. Appl Environ Microb 46(2):430-437.

Mitidieri, S.; Souza Martinelli, A.H.; Schrank, A.; Vainstein, M.H. (2006). Enzymatic detergent
formulation containing amylase from Aspergillus niger: a comparative study with commercial
detergent formulations. Bioresour Technol 97, 1217-1224.
Moraes, L.M.P.; Filho, S.A.; Ulhoa, C.J. (1999). Purification and some properties of an amylase glucoamylase fusion protein from Saccharomyces cerevisiae. World J. Microbiol.
Biotechnol. 15, 561-564.
Mukherjee, A.K.; Borah, M.; Ra, S.K. (2009). To study the influence of different components of
fermentable substrates on induction of extracellular -amylase synthesis by Bacillus subtilis DM03 in solid state fermentation and exploration of feasibility for inclusion of -amylase in laundry
detergent formulations. Biochem. Eng. J. 43, 149 156.
Nielsen, J.E.; Borchert, T.V. (2000). Protein engineering of bacterial alpha-amylases. Biochim
Biophys Acta 1543, 253-274.
Olsen, H.S.O.; Falholt, P. (1998). The Role of Enzymes in Modern Detergency. Journal of
Surfactants and Detergents 1, 555567.
ner, E.T. (2006). Optimization of ethanol production from starch by an amylolytic nuclear petite
Saccharomyces cerevisiae strain. Yeast 23, 849856.
Pandey, A.; Nigam, P.; Soccol, C.R.; Soccol, V.T.; Singh, D.; Mohan, R. (2000). Advances in
microbial amylases. Biotechnol Appl Biochem 31 (Pt 2), 135-152.

48

Prakash, O.; Jaiswal, N. (2009). alpha-Amylase: An Ideal Representative of Thermostable

Enzymes. Appl Biochem Biotechnol.
Rajagopalan, G.; Krishnan, C. (2008). Alpha-amylase production from catabolite derepressed
Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate. Bioresour Technol 99, 30443050
Reddy, N.S.; Nimmagadda, A.; Sambasiva Rao, K.R.S. (2003). An overview of the microbial amylase family. Afr. J. Biotechnol. 2, 645- 648.

Sanchez, O.J.; Cardona, C.A. (2008). Trends in biotechnological production of fuel ethanol from
different feedstocks. Bioresour Technol 99, 5270-5295.
Santa-Maria MC, Chou CJ, Yencho GC, Haigler CH, Thompson WF, Kelly RM & Sosinski B.
2009. Plant Cell Calcium-Rich Environment Enhances Thermostability of Recombinantly
Produced alpha-Amylase From the Hyperthermophilic Bacterium Thermotoga maritime.
Biotechnol Bioeng 104(5):947-956.
Saxena, R.K.; Malhotra, B.; Batra, A. (2004). Commercial Importance of Some Fungal Enzymes.
In: Arora, D.K. (ed) Handbook of fungal biotechnology. Marcel Dekker, New York, USA, p 287298.
Sajedi, R.H.; Naderi-Manesh, H.; Khajeh, K.; Ahmadvand, R.; Ranjbar, B.; Asoodeh, A.;
Moradian, F. (2005). A Ca-independent -amylase that is active and stable at low ph from the
Bacillus sp. KR-8104. Enzyme Microb. Technol. 36, 666671
Singhania, R.R.; Patel, A.K.; Soccol, C.R.; Pandey, A. (2009). Recent advances in solid-state
fermentation. Biochem. Eng. J. 44, 1318.
Tanyildizi, M.S.; Ozer, D.; Elibol, M. (2005). Optimization of -amylase production by Bacillus
sp. using response surface methodology Process Biochem 40, 22912296.

49

Tanyildizi, M.S.; Ozer, D.; Elibol, M. (2007). Production of bacterial -amylase by B.

amyloliquefaciens under solid substrate fermentation. Biochem. Eng. J. 37, 294297.
van der Maarel, M.J.; van der Veen, B.; Uitdehaag, J.C.; Leemhuis, H.; Dijkhuizen, L. (2002).
Properties and applications of starch-converting enzymes of the alpha-amylase family. J
Biotechnol 94, 137-155.
Vidyalakshmi R.; Paranthaman R.; Indhumathi J. (2009). Amylase Production on Submerged
Fermentation by Bacillus spp. World Journal of Chemistry 4 (1), 89-91.
http://www.bizoo.ro/catalog-firme/enzime-culturi-drojdii-cat-687/start-0/10/
http://www.chem.ubbcluj.ro/~mtosa/RAPORT_TOSA_2012.pdf

50