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MANUAL DE PRCTICAS DE
LABORATORIO DE
BACTERIOLOGA Y MICOLOGA
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CONTENIDO
Pgina
I. INTRODUCCIN
III. PRCTICAS
1. Procedimientos de rutina para identificar bacterias y hongos
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IV. BIBLIOGRAFA
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I.
INTRODUCCIN
La microbiologa tiene numerosas reas o ramas con fundamentos tcnicos comunes, pero cada
rama tiene sus caractersticas particulares, dado que hay diversos tipos de microorganismos
hallados en diferentes hbitats. Una de estas divisiones es la bacteriologa y micologa mdica que
estudia aquellas bacterias, levaduras y hongos que afectan la salud del hombre y de los animales,
especialmente por su capacidad patgena. De tal manera que la bacteriologa y micologa son
ramas de la microbiologa que estudian a las bacterias, levaduras y hongos.
La importancia de los microorganismos en la vida de los humanos y animales, as como la relacin
con el medio ambiente no fue reconoci inmediatamente, pero en 1893 Theobald Smith dijo: En el
estudio de las formas microscpicas conocidas como bacterias, tenemos lo que puede llamarse
justamente el punto focal de varias ramas de la ciencia biolgica. El desarrollo de la bacteriologa
y micologa mdica en los aos subsecuentes ha probado esta veracidad. Lo que ha permitido la
interaccin de las bacterias y hongos en la historia natural de la enfermedad, puesto que el
concepto de enfermedad infecciosa, su prevencin y tratamiento se mantienen actualizados hasta
la fecha.
El desarrollo de la microbiologa se ha debido a la curiosidad cientfica y al inters de
investigadores y cientficos, auxiliados muchas veces por su firmeza en sostener lo que saban que
era cierto, en contra de las refutaciones aparentes y el desdeo de sus compaeros. La historia de
la bacteriologa y micologa mdica, es la evolucin del conocimiento de las causas del proceso
salud-enfermedad.
Este manual de prcticas de bacteriologa y micologa, abarca aquellas especies bacterianas y
micticas de importancia en salud animal, para lo cual se considera sus caractersticas
morfolgicas, fisiolgicas y patognicas. Se realiza una descripcin bsica de los agentes
patgenos que afectan tanto al hombre como a los animales. La ntima relacin existente entre el
hombre y los animales y el consumo de productos de origen animal exigen que toda la gente
involucrada en la microbiologa mdica veterinaria se familiarice con los agentes infecciosos de los
animales si desean comprender las enfermedades que producen.
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II.
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
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Normas disciplinarias:
1. Leer el reglamento interno del laboratorio de prcticas
2. No se permitir el ingreso al laboratorio, despus de 15 minutos del horario estipulado de
inicio de la prctica.
3. El acceso al laboratorio es exclusivamente con bata blanca y limpia, por lo que no se permitir
la permanencia en la sesin prctica de los discentes que no porten su bata.
4. Se prohbe fumar, comer, beber o realizar cualquier otra actividad que no est relacionada con
la prctica correspondiente.
5. Se prohbe el uso de celulares y otros medios electrnicos de comunicacin durante la
realizacin de las prcticas y uso de los laboratorios.
6. Ningn discente podr salir o entrar sin previa autorizacin del docente.
7. Las comunicaciones verbales sern de manera ordenada, en voz baja y solo con la mesa que
integra el equipo.
8. Evitar lo ms posible el estar circulando entre mesas del laboratorio durante la sesin prctica
9. En caso de accidentes (quemadura, salpicadura y heridas) avisar inmediatamente al docente
encargado de la prctica.
10. Colocar los desechos en el contenedor correspondiente.
11. No verter sustancias en la superficie de la mesa, suelo o tarjas.
Manejo adecuado de residuos peligrosos biolgico infecciosos:
Sangre y material orgnico: Cogulos, aplicadores de madera e hisopos, se sumergirn en una
solucin de hipoclorito de sodio al 1.0%, posteriormente sern colocados en bolsas de plstico
rojas (sangre) y amarillas (desechos patolgicos) para su eliminacin e incineracin.
Materia fecal: Al trmino de la prctica se colocar en una solucin de hipoclorito de sodio al
1.0%, posteriormente sern colocados en bolsas de plstico amarillas (desechos patolgicos) para
su eliminacin e incineracin.
Material de vidrio: tubos, portaobjetos, cubreobjetos, varillas de vidrio, cajas de Petri, matraces y
frascos de diferentes capacidades, sern depositados en contenedores con agua jabonosa
adicionada con hipoclorito al 1.0%, en esta solucin permanecern por tres horas antes de su
lavado y secado.
Nota: Material como papel, aplicadores de madera, algodn y similares que hayan estado en
contacto con material infeccioso, debern ser rociados con hipoclorito al 1.0 %, y posteriormente
colocarlos en bolsas de plstico amarillas (desechos patolgicos) para ser incinerados.
Desinfectantes
Es importante conocer las diferentes soluciones desinfectantes, como el cloro, que se utiliza para
mantener limpio y desinfectado el laboratorio, materiales, equipos, as como su preparacin en las
concentraciones que se necesiten.
Al inicio y al final de cada prctica el discente debe lavarse las manos y colocarse alcohol al 70 %
o benzal al 5 %.
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Las superficies de trabajo deben ser limpiadas y suministrar con un pao una solucin de
hipoclorito de sodio al 0.5 % esperar 3 minutos e iniciar a trabajar.
ADVERTENCIA: No usar fenol, debido a que es una solucin custica, no se recomienda su
empleo sobre la piel, por su efecto irritativo y acumulativo en la piel.
Preparacin de soluciones:
Solucin de alcohol al 70 %
Alcohol al 96.. 73 mL
Agua bidestilada o desionizada 27 mL
Hipoclorito de sodio al 0.5 % (reas sin presencia de material orgnico)
Hipoclorito de sodio (5.0 % presentacin comercial)... 100 mL
Agua bidestilada o desionizada.... 900 mL
Hipoclorito de sodio al 1.0 % (reas con presencia de material orgnico)
Hipoclorito de sodio (5.0 % presentacin comercial)... 200 mL
Agua bidestilada o desionizada.... 800 mL
Cuestionario.
1. Qu es la bioseguridad?
2. Cul es el objetivo de la bioseguridad?
3. Cules son los tipos de riesgos que existen en un laboratorio?
4. En que se basa la clasificacin de los agentes biolgicos?
5. Menciona cuales son las vas de entrada de los agentes biolgicos al cuerpo?
6. Mtodos para disminuir los riesgos biolgicos?
7. Menciona 5 recomendaciones para buenas prcticas de trabajo?
8. Menciona 5 normas disciplinarias de un laboratorio?
9. Qu desinfectantes se pueden usar en la piel?
10. Qu causa el fenol en el organismo?
Glosario de trminos:
Accidente: suceso eventual o accin de que involuntariamente resulta dao para las personas o
las cosas.
Desinfectante: sustancia que destruye los microorganismos presentes, a excepcin de las
esporas bacterianas
Precaucin: accin para evitar o prevenir los inconvenientes, dificultades o daos que pueden
temerse durante el procedimiento.
Investigacin: actividad que tiene por fin ampliar el conocimiento, sin perseguir, en principio,
ninguna aplicacin prctica.
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III.
PRCTICAS
Movimiento flagelar o real de las bacterias cuyas caractersticas pueden variar en los diversos
microorganismos.
Para los estudios bacteriolgicos y micolgicos adems se han ensayado y propuesto gran
variedad de mtodos de tincin, los que apoyan en proporcionar contraste entre el microorganismo
y el medio que la rodea, permitiendo llevar a cabo la diferenciacin entre los distintos tipos
morfolgicos; adems permite el estudio de estructuras u organelos propios de la clula bacteriana
y mictica. Dentro de las tinciones importantes para bacterias y hongos son las siguientes:
Tincin de Gram:
En 1884 un mdico Dans, Christian Gram, desarroll un mtodo de tincin de gran utilidad en el
laboratorio de bacteriologa. Est tincin revela detalles referentes a la forma y agrupacin
bacteriana y permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram
negativas.
Durante el proceso de tincin, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas
retienen el colorante primario. Sin embargo al aplicar el agente decolorante, la pared de las
bacterias Gram positivas sufre una deshidratacin que impide la salida de colorante. En el caso de
las bacterias Gram negativas, el agente decolorante destruye la integridad de la membrana
externa, incrementando as su permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario.
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Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fcilmente en las bacterias Gram
positivas debido a la deshidratacin de su pared; adems de que estas bacterias quedaron
previamente teidas con el colorante primario. Por el contrario, las bacterias Gram negativas se
tien fcilmente con el colorante de contraste. El resultado final es que las bacterias Gram
positivas se tien de violeta o azul y las Gram negativas de rojo.
La tincin de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la identificacin de las
bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos en los cuales la tincin de
Gram no es de utilidad taxonmica; como son: espiroquetas, micoplasmas, micobacterias,
clamidias y rickettsias.
Tincin para Bacterias Acido-Alcohol Resistentes:
Este mtodo de tincin la penetracin del colorante primario se facilita debido a que ste se
encuentra disuelto en fenol y a que es aplicado en presencia de calor. El mtodo para demostrar la
cido-alcohol resistencia es la tincin de Ziehl-Neelsen.
Una vez que el colorante penetra a la clula bacteriana, este se combina con las mismas
estructuras con las que se combina en cualquier otra bacteria y adems reacciona con cidos
miclicos libres, lo cual hace que la pared celular se vuelva an ms hidrofbica.
Con la tincin de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias cido-alcohol resistentes, como las bacterias no
cido-alcohol resistente se tien con el colorante primario. Sin embargo, al aplicar el agente
decolorante, compuesto por una mezcla de alcohol-cido, este no solubiliza los lpidos de la pared
de las bacterias cido-alcohol resistentes, y por lo tanto no se decoloran. Las bacterias no cidoalcohol resistentes se decoloran fcilmente, por lo que se vuelve a teir al aplicar el colorante de
contraste.
El grupo de bacterias cido-alcohol resistentes, est representado principalmente por el gnero
Mycobacterium.
Tincin para Endoesporas:
La endoespora bacteriana es una estructura altamente deshidratada y rgida, que es formada por
algunos bacilos Gram positivos. Los gneros bacterianos de inters en medicina veterinaria que
son capaces de formar endoesporas son Bacillus y Clostridium. Estos responden de manera
diferente a las condiciones ambientales que inducen la formacin de la espora.
Las endoesporas son estructuras ovales o esfricas que pueden encontrarse tanto
intracelularmente, como fuera de la bacteria (clula vegetativa). Por su localizacin dentro de la
clula pueden ser centrales, subterminales o terminales, y presentan adems variacin en su
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tamao. Estas caractersticas son de utilidad taxonmica para la identificacin de algunas especies
de los gneros capaces de esporular.
Se preparan 2 frotis fijos a partir del cultivo, uno de los frotis ser teido con la tincin de Gram y el
otro con la tincin de Schaeffer y Fulton.
En la tincin de Gram las esporas se observan como cuerpos refringentes sin teir, mientras que
con la tincin de Schaeffer y Fulton las esporas se observan de color verde y las formas
vegetativas rojas.
Tincin Lactofenol Azul de Algodn:
Este es un mtodo utilizado rutinariamente para la realizacin de preparaciones microscpicas de
hongos filamentosos con el fin de determinar sus estructuras morfolgicas y por lo consiguiente su
identificacin. Cada uno de los constituyentes del colorante lactofenol azul de algodn cumple una
funcin determinada.
El fenol sirve como fungicida, la glicerina permite tener una preparacin semipermanente, el azul
de algodn tie el exterior de la pared de los hongos y el cido-alcohol lctico acta como agente
aclarante.
Objetivo: El discente realizar las tinciones de rutina en el laboratorio de Bacteriologa y Micologa
para la identificacin de estructuras bacterianas y micticas, y comprender su utilidad.
Competencias:
1. Describir la diferencia entre una preparacin hmeda y un frotis fijo, as como su utilidad
diagnstica.
2. Aplicar los principios y procedimientos de las tinciones para la observacin de bacterias y
hongos.
3. Emplear la tincin de Gram y lactofenol azul de algodn, para observar la morfologa, tamao,
agrupacin y afinidad tintorial de bacterias y hongos.
Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM.
Tiempo Destinado a la Prctica:
2 Horas
Material de laboratorio:
Portaobjetos, cubreobjetos, lpiz graso, asas bacteriolgicas graduadas, papel secante, aceite de
inmersin, mechero, tren de tincin de Gram, tincin de lactofenol azul de algodn, solucin
desinfectante, KOH al 3%, Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), vaselina o plastilina
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Material biolgico:
Cultivo en agar de Escherichia coli
Cultivo en agar de Staphylococcus spp.
Cultivo en agar de una levadura
Cultivo en agar de Aspergillus spp.
Metodologa:
Preparaciones Hmedas:
1. Depositar una capa delgada de vaselina alrededor del borde del cubreobjetos o un pedazo
pequeo de plastilina en las 4 esquinas del cubreobjetos, SIN TOCAR las caras del cubreobjetos
con los dedos.
2. En el centro del cubreobjetos preparado con vaselina plastilina, coloque con el asa
microbiolgica varias gotas del cultivo bacteriano (un cubreobjetos por muestra)
3. Tome una laminilla y colquela sobre el cubreobjetos, presionando suavemente.
4. Invierta la preparacin y obsrvala al microscopio con los objetivos de 40X y 100X si se utiliz
vaselina, o con el de 10X en el caso de haberse utilizado plastilina.
Preparacin de Frotis Fijos para Tinciones:
a) Realizar un frotis fijo de cada uno de los cultivos proporcionados.
b) Utilizar laminillas limpias y marcadas para su identificacin, con el lpiz graso marcar el rea
donde se va a colocar la muestra.
c) La metodologa para realizar el frotis bacteriano depender si el cultivo se encuentra en medio
slido o lquido.
a) Cultivo en lquido: con un asa bacteriolgica previamente flameada y fra, se introduce
en el cultivo bacteriano se coloca en el portaobjetos y se difunde en el rea marcada y se
fija al calor.
b) Cultivo en medio slido: se coloca una gota de agua destilada estril en el
portaobjetos, se recolecta una colonia de medio solido y se mezcla, realizando un
extendido uniforme.
d) Se debe extender la gota sobre el portaobjetos de forma que el resultado sea una capa fina.
Debe evitarse preparar un frotis demasiado grueso.
e) Dejar secar las preparaciones (frotis) a temperatura ambiente.
f) Cuando se haya secado el frotis pasar el portaobjetos por la llama del mechero con la capa del
frotis hacia arriba, no aplicar calor en forma excesiva ya que estropeara la morfologa normal y
la estructura de los microorganismos que se van a teir.
Procedimiento para la tincin de Gram:
1. Preparar frotis fijos a partir de cada uno de los cultivos bacterianos
2. Agregar sobre la preparacin cristal violeta durante 30 segundos.
3. Lavar con agua destilada
4. Aadir lugol durante 30 segundos.
5. Lavar con agua destilada
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Fig. 2. (a). Medio de cultivo solido en caja Petr, la superficie debe ser lisa y el nivel de llenado
debe estar parejo, (b). Inoculacin de la cepa bacteriana para realizar la prueba de
sensibilidad.
Medios Slidos para el Aislamiento en Cultivo Puro: el medio para cultivo bacteriano se envasa
en cajas de Petr, con el objetivo es obtener un crecimiento uniforme de colonias bacterianas, es
decir, colonias puras, libres de otros grmenes contaminantes, con el fin de estudiar e identificar
la especie bacteriana. La inoculacin se realiza con el asa graduada (Fig. 3).
Fig. 3. (a) Distribucin del medio de cultivo en cuadrantes envasado en caja Petr para el
aislamiento bacteriolgico (b) modo de sembrado con el asa bacteriolgica y el sentido de la
dilucin.
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El estudio de la morfologa de las colonias es de gran importancia debido a que gracias a sta
puede iniciarse una identificacin preliminar de los microorganismos aislados. Las colonias
bacterianas presentan caractersticas morfolgicas muy variadas, mismas que son constantes para
cada especie de bacterias en idnticas condiciones de cultivo. Estas caractersticas pueden
modificarse cuando factores tales como la humedad relativa, medio de cultivo, temperatura,
atmsfera de incubacin varan.
La descripcin de las colonias bacterianas debe realizarse cuando stas se encuentran separadas
unas de otras en el medio de cultivo, tomando en cuenta las siguientes caractersticas: tamao,
color, superficie, borde, opacidad, elevacin, estructura interna.
Las caractersticas de la superficie, borde, opacidad, elevacin y estructura interna, estn sujetas a
la interpretacin del observador. Para describirlas es necesario el uso de un microscopio
estereoscpico, por lo que su valor descriptivo es menos relevante (ver Anexo 3). De acuerdo a
estos criterios, las colonias pueden clasificarse de la siguiente forma:
Superficie: lisas, rugosas.
Estructura interna: mucoide, granular, filamentosa.
Opacidad: translcidas, opacas, brillantes.
Borde: enteras, onduladas, lobuladas, erizadas, filamentosas.
Elevacin: umbilicales, difusas, planas, convexas.
Otro dato til en la identificacin preliminar de colonias bacterianas es la produccin de
hemolisinas. Estas se ponen de manifiesto en medios de cultivo adicionados con sangre, tales
como el agar sangre y el caldo sangre. En el agar sangre la produccin de hemolisinas conduce a
la formacin de un halo de lisis de eritrocitos alrededor de las colonias. Si dicho halo es
transparente se interpreta como hemlisis completa (hemolisis ) mientras que si el halo es de
color gris verdoso se trata entonces de hemlisis incompleta (hemolisis ).
Al hacer la identificacin de las colonias bacterianas aisladas no siempre ser necesario detallar
todas las caractersticas morfolgicas mencionadas; generalmente se toman en cuenta aquellas
que son relevantes.
Objetivo: El alumno analizar las diferentes tcnicas de siembra para el cultivo de bacterias y
hongos in vitro, utilizando medio de cultivo segn su utilidad y describir la morfologa colonial.
Competencias:
1. Describir la importancia del cultivo de bacterias y hongos in vitro.
2. Identificar las condiciones necesarias para el cultivo in vitro de las bacterias y hongos.
3. Clasificar los medios de cultivo bsico, de enriquecimiento, diferenciales, selectivos y de
transporte.
4. Realizar las tcnicas de siembra en medios de cultivo lquidos semislidos y slidos.
5. Explicar las reacciones metablicas de bacterias y hongos en algunos medios diferenciales.
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8. Cerrar la caja y rotularla con el nmero o nombre de muestra, nmero de equipo y fecha.
9. Incubar placas a 37 C por 24 horas.
Segundo Da (Sesin Dos)
1. Desinfectar la mesa de trabajo y encender el mechero.
2. Analizar cuidadosamente el crecimiento en las cajas de Petr, sin abrirlas.
3. Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes
caractersticas: tamao, color de la colonia, pigmentacin de medio, estructura interna, borde y
hemlisis.
4. Interpretar las formas y caractersticas de las colonias (ver Anexo 3).
5. Guarda las cajas en el refrigerador, hasta la prxima clase (OPCIONAL).
Proceso de Inoculacin y Siembra en Tubo (Medio Slido):
Primer Da (Sesin Uno)
1. Destapar el tubo y flamear la parte superior.
2. Esterilizar el asa recta y enfriarla.
3. Tomar una colonia del medio que contiene el cultivo puro con el asa recta estril.
4. Siembre en los tubos con agar inclinado de acuerdo al mtodo que se utilice de siembra, a una
distancia aproximada de 20 cm. del mechero (ver Fig. 1).
5. Rotular los tubos de la misma manera que las placas.
6. Incubar placas a 37 C por 24 horas.
Segundo Da (Sesin Dos)
1. Analizar y observar cuidadosamente el crecimiento en los tubos, sin abrirlos, y anotar lo
interpretado.
2. Guarda las cajas en el refrigerador, hasta la prxima clase.
Proceso de Inoculacin en Tubo (Medio Lquido):
Primer Da (Sesin Uno)
1. Seleccionar una colonia del medio a una distancia aproximada de 20 cm. del mechero
2. Esterilizar el asa recta y enfriarla
3. Destapar el tubo y flamear la parte superior.
4. Introducir el asa con el inocul a sembrar, agitar el asa hasta que la muestra sea homognea
(ver Anexo 2).
5. Esterilizar el asa y dejarla enfriar
6. Flamear el tubo y taparlo.
7. Rotular los tubos de la misma manera que las placas.
8. Desinfectar la mesa de trabajo
9. Incubar tubos a 37 C por 24 horas.
Segundo Da (Sesin Dos)
1. Analizar y observar cuidadosamente el crecimiento en los tubos, sin abrirlos, y anota lo
observado.
2. Guarda los tubos en el refrigerador, hasta la prxima clase (OPCIONAL).
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Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregar un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.
Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.
CUESTIONARIO:
1. Por qu se debe trabajar cerca del mechero?
2. Qu es un cultivo puro?
3. Qu estudios se realizan aislando un microorganismo?
4. Qu sucede si se recolecta una colonia bacteriana con el asa caliente?
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Anexos:
Anexo 1. Tcnicas de Siembra en Placa y Tubo
(b)
(a)
(c)
(d)
Anexo 1. (a) Inicio de la inoculacin y distribucin de la muestra con asa bacteriolgica, (b) y (c)
distribucin de los cuadrantes 2 y 3 se toca una o dos estras del cuadrante anterior (d) el cuarto
cuadrante se toca una o dos estras del tercer cuadrante y se hace la distribucin con estras
separadas con la finalidad de obtener colonias aisladas. Terminada la distribucin en cada cuadrante
se flamea el asa. Ntese que el procedimiento es en sentido a las manecillas del reloj.
(a)
(b)
(c)
(d)
Anexo 2. (a) Se flamea el asa bacteriolgica. (b) Se enfra y se recolecta la muestra. (c) Se introduce
en el tubo con medio lquido y se gira el asa para que se desprenda la muestra. (d) Se cierra el tubo y
se flamea el asa. El proceso se realiza cerca de la flama del mechero.
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Anexo 3. Caractersticas morfologa de las colonias bacterianas en cultivos primarios (Stanchi N. O., et
al 2007)
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antimicrobianos, cules y durante cunto tiempo; as como un diagnstico presuntivo con base
en signos clnicos y epidemiolgicos.
Es importante hacer notar que el manejo de las muestras clnicas deben realizarse con
precaucin debido a que algunos agentes involucrados en las enfermedades infecciosas de
animales constituyen un riesgo de zoonosis para la salud del clnico y del bacterilogo.
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Por Equipo:
Material para sujecin del animal
Medio de transporte Stuart
Hisopos estriles
Frascos tipo Gerber estriles
Bolsa de plstico nuevas
Estuche de disecciones
Por Discente:
Equipo de proteccin personal (dependiendo si se decide realizar en laboratorio o explotacin
pecuaria)
Metodologa:
Obtener muestras de exudado, leche, sangre, heces, orina, rgano y pelos de animales que
presenten problemas clnicos, as como de agua y alimento si amerita.
Recopilar los datos ms importantes para realizar la historia clnica
Conservar y enviar las muestras al laboratorio de diagnstico para su anlisis bacteriolgico o
micolgico.
Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.
Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.
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Anexos:
Anexo 4. Recomendaciones para la Toma y Envi de Muestras de Acuerdo a Condiciones
Patolgicas Especficas.
Condicin
Patolgica
Abortos
Artritis
Clostridiasis
Invasivas (Miositis
Necrticas,
Hepatitis
Necrtica)
Enterotoxemia
Dermatomicosis
Pelos y Escamas
Diarreas
Intestino
Heces (1 g.)
Nodulos Linfaticos Mesentericos,
Vescula Biliar.
Alimento (100 g.)
Agua (100 mL)
Abscesos,
Granuloms
Exudados
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Forma de
Coleccin y
Envo
Frascos,
Bolsas
de
Plstico,
Hisopos,
Jeringas.
Jeringa,
Hisopo,
Frasco, Bolsa
de Plstico.
Jeringa,
Hisopo, Bolsa
de Plstico.
Frasco, Bolsa
de Plstico
Segmento
Ligado
de
Intestino
en
Frasco.
Frascos,
Sobres
de
Papel Nuevos,
Portaobjetos
Segmento
Ligado
del
Intestino
en
Frasco.
Guantes
de
Palpacin.
Frascos,
Bolsas,
Observaciones
Infecciones
Genitales
Exudados (1 mL)
Lavados Prepuciales o Vaginales
(10 mL)
rganos: Testculos, Epididimo,
tero. (Completos o 6 cm. por
lado)
Hisopos.
Hisopos,
Jeringas,
Frascos
Bolsas
Plstico.
Infecciones
Urinarias
Orina (6 mL)
Rin (6 cm. por lado)
Mastitis
Neumonas
Jeringas,
Frascos,
Bolsas
Plstico
Exudado (1 mL)
Hisopos,
Jeringas
Problemas
Nerviosos
Septicemias
Bolsas
Plstico,
Frascos,
Jeringa,
Hisopos.
Jeringas,
Frascos,
Bolsas
Plstico
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o
de
Cateter,
Jeringa,
Frasco, Bolsa
de Plstico.
Frascos,
Bolsas
de
Plstico
de
de
de
Si
se
sospecha
de
Campylobacter, Leptospira
o
mycoplasma,
las
muestras deben enviarse
dentro de las siguientes 3
horas de su coleccin en
refrigeracin.
Las
muestras
deben
enviarse dentro de las
siguientes 2 horas de su
coleccin.
Lavar y desinfectar el
pezn previo a la obtencin
de la muestra, cuidar de no
tocar la piel con el frasco,
slo el chorro de leche
tendr contacto con el
frasco.
Si
se
sospeche
de
micoplasmosis
o
clamidiasis, las muestras
deben enviarse dentro de
las siguientes 4 horas a su
coleccin.
Limpiar el canal externo
con un antisptico y tomar
la muestra en el odo
medio.
El liquido cefalorraqudeo
debe ser procesado de
inmediatos
Si el animal tiene ms de 3
horas de muerto debe
enviarse mdula sea.
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Por Equipo:
Agar Sangre
Agares selectivos diferenciales: MacConkey, Verde Brillante, XLD, Salmonella-Shigella,
Bismuto sulfito.
Agar de Triple Hierro y Azcar (TSI)
Medio SIM
Citrato de Simmons
Urea
Lisina Descarboxilasa
Agar de Fenilalanina
Base de rojo de Fenol con Lactosa, glucosa, manitol y maltosa.
Medio MIO.
Reactivo de Cloruro ferrico al 10 %.
Reactivo de Oxidasa
Reactivo de Indol
Tren de tincin de Gram
Reactivo de KOH al 3 %
Metodologa:
Primer Da (Sesin Uno)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana establecida a cada
equipo.
3. Realice la tincin de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 %
4. Realice la prueba de Oxidasa, utilizando el papel filtro
5. Siembre las pruebas bioqumicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo
6. Incube los medios de cultivo y las pruebas bioqumicas a 37 C por 24 horas
7. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
8. Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.
Segundo Da (Sesin Dos)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Realice la tincin de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de Oxidasa.
3. Realice la interpretacin de las pruebas bioqumicas.
4. Observe la morfologa colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo.
5. Concluya la identificacin del microorganismo con base a los resultados de las pruebas
bioqumicas.
6. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.
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Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.
CUESTIONARIO:
1. Menciona las principales enterobacterias de importancia en Medicina Veterinaria?
2. Cules son las enfermedades que producen y que especies afectan las enterobacterias que
mencionaste anteriormente?
3. Qu medios de cultivo y pruebas complementarias necesitaras para confirmar el gnero y
especie de las enterobacterias antes mencionadas?
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Realizar las pruebas bioqumicas mnimas necesarias para la identificacin del gnero y
especie de las bacterias estudiadas.
Utilizar las tablas de identificacin para confirmar el gnero y la especie de cada
microorganismo.
Describir los principales procesos patolgicos en los que se presentan los gneros Pasteurella,
Mannheimia y Bordetella.
Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la
Facultad
Tiempo Destinado a la Prctica:
4 Horas (dos sesiones)
Material:
General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, papel
secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriolgica a 37 C
(temperatura constante). Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), tiras de papel filtro.
Seccin:
1 cultivo en agar de Pasteurella multocida
1 cultivo en agar de Mannheimia haemolytica
1 cultivo en agar de Bordetella Bronchiseptica
Por Equipo:
Agar sangre
Agar MacConkey.
Agar de Triple Hierro y Azcar (TSI)
Medio SIM
Urea
Base de rojo de Fenol con Lactosa, glucosa, manitol y maltosa.
Medio MIO.
Reactivo de Oxidasa
Reactivo de Indol
Tren de tincin de Gram
Reactivo de KOH al 3 %
Metodologa:
Primer Da (Sesin Uno)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana establecida a cada
equipo.
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3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
32/52
33/52
34/52
3. Medio selectivo (Staphylococcus): Agar sal y manitol, Agar staphylococcus 110 Agar
Chapman stone.
4. Agar sangre con azida de sodio
5. Agar MacConkey
6. Agua Oxigenada (reactivo de catalasa).
7. Agar de Triple Hierro y Azcar (TSI)
8. Urea
9. Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol, trehalosa, sorbitol y maltosa.
10. Medio MR-VP.
11. Tren de tincin de Gram
12. Reactivo de KOH al 3 %
Metodologa:
Primer Da (Sesin Uno)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana establecida a cada
equipo.
3. Realice la tincin de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 %
4. Realice la prueba de catalasa, y efectu la prueba de coagulasa en portaobjetos
5. Siembre las pruebas bioqumicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo
6. Incube los medios de cultivo y pruebas bioqumicas a 37 C por 24 h
7. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
8. Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.
Segundo Da (Sesin Dos)
1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
2. Realice la tincin de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de catalasa.
3. Realice la interpretacin de las pruebas bioqumicas.
4. Observe la morfologa colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo.
5. Concluya la identificacin del microorganismo con base a los resultados de las pruebas
bioqumicas.
6. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.
Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.
Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.
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Cuestionario:
1. Menciona las principales diferencias morfolgicas de entre las bacterias Gram positivas y
bacterias Gram negativas?
2. Cules son las diferencias entre Staphylococcus y Streptococcus?
3. Qu medios de cultivo y pruebas complementarias necesitaras para confirmar el gnero y
especie de los agentes bacterianos antes mencionados?
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Material:
General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, cubreobjetos,
papel secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriolgica entre
24 y 28 C (temperatura constante). Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de
4X, 10X, 40X, 100X), Hojas y mangos de Bistur, pinzas sin dientes de uso clnico.
Por Equipo:
Agar sangre.
Medio selectivo: Agar Sabouraud, agar para seleccin de hongos (agar micobitico) o agar
tripticasa de soya.
Agar MacConkey
Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol, trehalosa, sorbitol y maltosa.
Tren de tincin lactofenol azul de algodn
Metodologa:
Primer Da (Sesin Uno)
Preparacin y Acondicionamiento de la Muestra:
La muestra ha utilizar para el aislamiento e identificacin micolgica debe ser caracterstica, y
debe ser tomada bajo las debidas medidas de bioseguridad exigidas para este gnero y del
tamao adecuado, y procesarse inmediatamente.
Procedimiento:
1. Con un hisopo estril se toma la muestra y se siembra en una caja de agar Sabouraud o agar
micobitico, agar sangre y agar Mc Conkey, e inocular bajo el procedimiento de aislamiento en
cultivo puro incubando a 30 C por 24 a 72 h.
2. Sembrado en el microcultivo:
a. Dentro de una caja petr estril agregar entre 2 a 4 mL de agua bidestilada estril.
b. Colocar un soporte y poner un portaobjetos con un cuadro de Agar Sabouraud o
Agar para hongos de aproximadamente 1 cm2.
c. Con el asa tomar la muestra y sembrar por picadura en cada lado del agar,
posteriormente colocar el cubreobjetos, tapar la caja e incubar de 24 a 28 C de
entre 24 a 120 h aprox.
d. Una vez observado crecimiento se procede a la realizacin del frotis, previa
inactivacin del cultivo.
3. Preparacin del frotis.
a. Introduce un algodn impregnado con formol al 10 % en la caja y djalo actuar
durante 30 minutos con el fin de inactivar al hongo.
b. En un portaobjetos coloca dos gotas separadas de lactofenol azul de algodn. Con
las pinzas toma cada uno de los cubreobjetos y colcalos sobre cada una de las
gotas del colorante.
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Cuestionario:
1. Menciona las principales diferencias morfolgicas entre las bacterias y los hongos
microscpicos?
2. Qu diferencia hay entre la tincin de Gram y la tincin Lactofenol azul de algodn?
3. Qu medidas de bioseguridad utilizaras para manipular y procesar muestras de
enfermedades micticas?
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ANEXOS:
Anexo 5: Principales agentes micoticos de importancia en medicina veterinaria (Hungerford, et al.,
1998)
a)
c)
Microsporum canis
Conidiobolus coronatus
e)
g)
b)
d)
Aspergillus flavus
f)
Malassezia pachydermatis
h)
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Microsporum gypseum
Sporothrix schenckii
Blastomyces dermatitidis
Trichophyton mentagrophytes
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Lugar de Realizacin:
Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la
Facultad
Tiempo Destinado A La Prctica:
4 Horas (dos sesiones)
Material:
General: Asas bacteriolgicas graduadas, pinzas de diseccin sin dientes de uso clnico, Comps
de calibracin, Vernier, regla o platilla diseada para este propsito, hisopos estriles, papel
secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriolgica a 37 C
(temperatura constante).
Seccin:
1 cultivo en agar de E. coli
1 cultivo en agar de Staphylococcus spp
Medio Agar Muller-Hinton
Caldo Muller-Hinton
Multidiscos de 12 antibiticos para bacterias Gram positivos (Sanofi Diagnostics Pasteur, S. A.)
Multidiscos de 12 antibiticos para bacterias Gram negativos (Sanofi Diagnostic Pasteur, S. A.)
Metodologa:
Primer Da (Sesin Uno)
Preparacin y Acondicionamiento de la Muestra:
Preparar el medio de agar Mueller-Hinton de acuerdo a las instrucciones del fabricante, el pH final
a temperatura ambiente deber estar entre 7.2 y 7.4, este medio favorece el crecimiento de casi
todos los microorganismos para los que son ms importantes las pruebas de susceptibilidad.
Tomar con una asa bacteriolgica de 4 a 5 colonias aisladas del mismo tipo morfolgico e inocular
en 4 mL de caldo Mueller-Hinton, se incuba a 35 C hasta que aparece una turbidez ligera
(generalmente 2 a 5 horas), la turbidez se ajusta con solucin salina estril o caldo estril hasta
tener una densidad de 0.5 de MacFarland, comparable con un estndar de sulfato de bario [El
estndar se prepara mezclando 0.5 mL de BaCl2 0.048 M (1.175 % peso/volumen de BaCl2H20)
con 99.5 mL de H2SO4 al 1% v/v (0.36N)].
La suspensin ajustada del inoculo no debe permanecer ms de 15 a 20 minutos antes de
proceder a inocular en la caja de Petr.
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Procedimiento:
1. Para inocular el agar se utiliza un hisopo estril de algodn, el cual se humedece con la
suspensin, se quita el exceso de caldo presionado y girando el hisopo sobre la pared interna
del tubo, por arriba del nivel del caldo, se estra el medio en tres direcciones sobre la totalidad
de la superficie de agar, para obtener un inculo uniforme, se efecta un ltimo barrido del
hisopo sobre el reborde de la caja de Petr y el agar. Cuando el inculo se haya secado (de 3 a
5 minutos) se procede a colocar los discos.
2. Los discos se toman con pinza estril y se colocan en el medio en un tiempo menor de 15
minutos despus de haber inoculado la placa, los discos debern presionarse ligeramente para
asegurar un contacto con la superficie, deber prevenirse una sobreposicin de las zonas de
inhibicin con la distribucin adecuada de los discos y con un lmite no menor de 15 mm de los
bordes de la placa.
3. Despus de 15 minutos de haber colocado los discos, invertir la caja de Petr e incubar a 35
C. El tiempo de incubacin es de 18 a 24 horas.
Interpretacin:
Segundo Da (Sesin Dos)
La medicin de los halos de inhibicin se hace con comps de calibracin, Vernier, regla o platilla
diseada para este propsito, por el fondo de la caja la cual se ilumina con luz reflejada. El punto
final de todos los sistemas de lectura ser hasta la completa inhibicin del crecimiento determinada
visualmente, ignorando colonias tenues o muy pequeas que pueden ser observadas con
minuciosidad (ver Anexos 6 y 7).
Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar
el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.
Evaluacin (Criterios):
Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la
prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de
conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen
con la prctica.
Cuestionario:
1. Que otros medios de cultivo se pueden utilizar para preparar el inoculo?
2. Cmo sabremos que el tubo con el inoculo ya est listo para ser inoculado?
3. Que otros medios de cultivo se pueden utilizar en lugar del agar Mueller-Hinton?
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Anexos:
Anexo 6: Visualizacin de los diferentes resultados obtenidos en la prueba de susceptibilidad in
vitro, por el mtodo de difusin en Agar (Kirby-Bauer).
CONCENTRACIN
(MICROGRAMOS/mL)
AMIKACINA
AMPICILINA
Enterobacteriaceae
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Estreptococcus spp.
CARBENICILINA
Enterobacteriaceae
Pseudomona aeruginosa
CEFALOTINA
CEFOTAXIMA
CEFTAZIDIMA
CETRIAXONA
CEFUROXIMA
CLORANFENICOL
DICLOXACILINA
Estafilococcus spp.
ENOXACIMA
Enterobacteriaceae
ERITROMICINA
Enterococcus spp.
GENTAMICINA
30
10
12-13
22-29
14
29
17
30
17
13
14
14
14
13
14
12
18-22
14-16
15-17
15-22
15-17
14-20
15-17
13-17
23
17
18
23
18
21
18
18
10
11-12
13
14
15-17
18
13
14-17
18
100
30
30
30
30
30
30
1
10
15
10
45/52
Enterobacteriaceae
12
NETILMICINA
30
12
NITROFURANTOINA
300
14
PEFLOXACINA
5
14
PENICILINA
10 UI
Etaphylococcus spp
28
N. gonorrhoeae
19
Enterococcus spp.
14
Estreptococcus spp.
19
TETRACICLINA
30
Enterobacteriaceae
14
TRIMETROPRIMSULFAMETOXAZOL
25
10
(***): Instructivo de multidiscos Gram positivos, Gram negativos BIO-RAD
46/52
13-14
13-14
15-16
15-22
15
15
17
23
29
20
20
15-18
19
11-15
16
47/52
Material:
General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, papel
secante, solucin desinfectante, marcador permanente, mechero, estufa bacteriolgica a 37 C
(temperatura constante). Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,
40X, 100X), tiras de papel filtro.
Por Equipo:
agar Sangre
agares selectivos: MacConkey, Sal y manitol, Agar dextrosa y papa
agar de Triple Hierro y Azcar (TSI)
Medio SIM
Citrato de Simmons
Urea
Lisina descarboxilasa
agar de Fenilalanina
Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol y maltosa.
Medio MIO.
Reactivo de cloruro frrico.
Reactivo de Oxidasa
Reactivo de Indol
Tren de tincin de Gram
Reactivo de KOH al 3%
Metodologa:
Leche:
La siguiente metodologa es la sugerida por el Consejo Nacional de la Mastitis de los Estados
Unidos de Amrica, en su publicacin procedimientos de diagnstico de la mastitis bovina
Primer Da (Sesin Uno)
a) Las muestras refrigeradas deben ser calentadas a 25 C durante 15 minutos con el fin de
liberar los microorganismos atrapados en la grasa de la leche.
b) La muestra debe agitarse vigorosamente para homogeneizarla.
c) Inmediatamente proceda a realizar dos frotis fijos, teir con Gram, obsrvalos y anotar los
resultados.
d) Inocula 3 asadas de la muestra (son necesarias por los menos 0.025 mL) en la caja de agar
sangre, agar MacConkey, agar Sal y manitol y a partir de este inculo realiza la primera estra
y completa la tcnica para aislamiento en cultivo puro. Incuba 24 horas a 37 C, en algunos
casos ser necesario incubar hasta 48 h.
Segundo Da (Sesin Dos)
a) De las colonias aisladas describe nmeros relativos y morfologa macroscpica.
b) Realiza un frotis a partir de las colonias representativas del aislamiento y describe forma,
agrupacin y reaccin al Gram.
c) Realiza las pruebas de identificacin necesarias para determinar gnero y especie.
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50/52
IV. BIBLIOGRAFA
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Carter G. R., Wise D. J. (2004): Essentials of veterinary bacteriology and mycology. Sixth edition.
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susceptibility Testing; Seventeenth Informational Supplement. MS100-S17. Vol 27. No.1.
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Cullimore D. R. (2010): Practical Atlas for Bacterial Identification. Second Edition. CRC Press.
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edicin. Acribia. Espaa.
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micologa veterinarias. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional
Autnoma de Mxico. Mxico D.F.
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Microbiologa Veterinaria. Editorial Intermedica. Argentina.
World Organization for Animal Health, OIE (2008): Manual of diagnostic tests and vaccines for
terrestrial animals (mammals, birds and bees). Sixth Edition. Volume 1 and 2. France.
V. ACTUALIZACIN
Manual de Prcticas de Laboratorio de Bacteriologa y Micologa. Facultad de Medicina Veterinaria
y Zootecnia de la Universidad Autnoma del Estado de Mxico. Toluca, Mxico; 08 de Julio de
2013.
Primera Edicin
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