CROMATOGRAFIA

La cromatografa comprende un conjunto de tcnicas que tienen como finalidad

la separacin de mezclas basndose en la diferente capacidad de interaccin
de cada componente en otra sustancia. De forma general, consiste en pasar
una fase mvil (una muestra constituida por una mezcla que contiene el
compuesto deseado en el disolvente) a travs de una fase estacionaria fija
slida. La fase estacionaria retrasa el paso de los componentes de la muestra,
de forma que los componentes la atraviesan a diferentes velocidades y se
separan en el tiempo. Cada uno de los componentes de la mezcla presenta
un tiempo caracterstico de paso por el sistema, denominado tiempo de
retencin. Cuando el tiempo de retencin del compuesto deseado difiere del
de los otros componentes de la mezcla, ste se puede separar mediante la
separacin cromatografa.
La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen
mutuamente:
Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y
que puedan ser usados posteriormente.

Medir la proporcin de los componentes de la mezcla. En este caso, las

cantidades de material empleadas son pequeas.

FUNDAMENTO
La separacin de los diferentes componentes de una mezcla que se
encuentran en un lquido o gas es el resultado de las diferentes interacciones
de los solutos a medida que se desplazan alrededor o sobre una sustancia
lquida o slida (la fase estacionaria). Las diversas tcnicas para la
separacin de mezclas complejas se fundamentan en la diversidad de
afinidades de las substancias por un medio mvil gas o lquido y un medio
absorbente estacionario (papel, gelatina, almina o slice) a travs del cual
circulan.

HISTORIA
El botnico ruso Mijal Tsweet2 (Mikhail Semenovich Tsweet, 1872-1919)
emple por primera vez en 1906 el trmino "cromatografa" (que proviene del
griego y que significan respectivamente chroma "color" y
graphos "escribir"). A comienzos del ao 1903, Mijail Tsweet us columnas de
adsorcin
de lquidos para separar pigmentos vegetales (por
ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacan pasar a travs de una columna
de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido de un material
poroso que interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla,
de forma que stos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo de
la columna.

Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en el mercado a

mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografa lquida de alta
resolucin(HPLC) comenz a desarrollarse en los aos 1960, aumentando su
importancia en las dcadas siguientes, hasta convertirse en la tcnica
cromatogrfica ms empleada. Sin embargo esto se ir modificando con el
paso de los aos.
TERMINOS EMPLEADOS EN CROMATOGRAFIA
Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografa.

Cromatografa analtica se emplea para determinar la existencia y

posiblemente tambin la concentracin de un analito en una muestra.

Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente

las partculas de soporte o a las paredes internas de la columna.

Cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso

de separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla separada.

Cromatgrafo es el equipo que permite una separacin sofisticada. Por

ejemplo, un cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de lquidos.

Cromatografa es el mtodo fsico de separacin en el cual los

componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases,
una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra
(la fase mvil) se mueve en una direccin definida.

Eluyente es la fase mvil que atraviesa la columna.

Serie eluotrpica es una lista de disolventes clasificados segn su

poder de dilucin.

Fase inmovilizada es una fase estacionaria que est inmovilizada

sobre partculas de soporte, o en la pared interior del tubo
contenedor o columna.

Cromatograma correspondiente a una cromatografa liquida en fase

reversa para compuestos fenlicos

Fase mvil es la fase que se mueve en una direccin definida.

Puede ser un lquido (cromatografa de lquidos o CEC). un gas
(cromatografa de gases) o un fluido supercrtico (cromatografa de
fluidos supercrticos). La fase mvil consiste en la muestra que est
siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el
interior de la columna. En el caso de la cromatografa lquida de alta
resolucin, HPLC, la fase mvil es un disolvente no-polar como
el hexano (fase normal) o bien algn disolvente polar (cromatografa
de fase reversa) y la muestra que va a ser separada.. La fase mvil
se mueve a travs de la columna de cromatografa (fase
estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la fase
estacionaria y se separa.

Cromatografa preparativa se usa para purificar suficiente cantidad

de sustancia para un uso posterior, ms que para anlisis.

Tiempo de retencin es el tiempo caracterstico que tarda un

analito particular en pasar a travs del sistema (desde la columna de
entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas.

Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografa.

Puede consistir en un simple componente o una mezcla de varios.
Cuando la mezcla es tratada en el curso del anlisis, la fase o fases
que
contienen
los
analitos
de
inters
es
llamada
igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya separacin
no resulta de inters es llamada residuo.

Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser

separado.

Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra, y

especialmente la fase lquida mvil en cromatografa de lquidos.

Fase estacionaria es la sustancia que est fija en una posicin en

el procedimiento de la cromatografa. Un ejemplo es la capa
de silica en la cromatografa en capa fina.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA PLANA

Papel

En capa fina

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Intercambio Inico

Por exclusin molecular

Por afinidad

CROMATOGRAFIA DE GASES
CROMATOGRAFIA EN PAPEL
La cromatografa en papel es un proceso muy utilizado en los
laboratorios para realizar anlisis cualitativos ya es sencilla de
implementar y no requiere de equipamiento sofisticado. En esta tcnica
la fase estacionaria est constituida simplemente por una tira o circulo
de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando
pequeas gotas de una solucin de la muestra y evaporando el
disolvente luego de cada aplicacin. Luego el disolvente o mezcla de
disolventes empleada como fase mvil (eluente o eluyente) se hace
ascender por capilaridad. Para esto se coloca una porcin del papel en
contacto con la fase mvil dentro de un recipiente que la contiene
(cmara de desarrollo). Despus de unos minutos, cuando el
disolvente deja de ascender o ha llegado al borde extremo del papel,
se retira el papel y seca. Es importante que la cmara de desarrollo
permanezca bien tapada durante el proceso de ascenso capilar de la
fase mvil (desarrollo cromatogrfico), pues de lo contrario no se
alcanza el equilibrio necesario entre el lquido (fase mvil) y el vapor
del lquido. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias
tienen color propio se debern ver manchas de distinto color separadas
a lo largo del papel. Cuando los componentes no tienen color propio el
papel se somete a procesos de revelado.
La cromatografa es un sistema de separacin dinmica, porque continuamente
se producen equilibrios entre los componentes de la mezcla a separar y las
fases mvil y estacionaria. El proceso de separacin se produce a causa de las

interacciones entre los componentes de la mezcla con la fase mvil y la fase

estacionaria; lo cual causa la distribucin de los componentes de la mezcla
entre las dos fases. A este proceso se le denomina particin de los
componentes. Las interacciones mencionadas pueden tener su origen en dos
fenmenos:
1. La adsorcin, que es un fenmeno de interaccin superficial por el cual
tomos, iones o molculas son retenidas en la superficie de un material. Puede
ser de dos tipos:
a) Fisisorcin, debida a fuerzas atractivas dbiles, generalmente fuerzas de
Van der Waals; es la forma ms simple de adsorcin.
b) La quimisorcin ocurre cuando se forma un enlace qumico
2. La absorcin, es un fenmeno de retencin que incluye la penetracin de
una especie qumica en todo el volumen del material por lo cual se la considera
como un fenmeno msico y no superficial.
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
Por este mtodo se pueden analizar mezclas de aminocidos. La
muestra para anlisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de
una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida
en la superficie por la accin de fuerzas electrostticas (Fuerzas de Van der.
Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes ms
utilizados son gel de silica, alumina, tierra silcea, celulosa y poliamidas. Como
soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plsticas o
metlicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia: f254 f366.
La placa seca se coloca en el tanque cromatogrfico o cmara, en el cual
debe encontrarse saturado el eluente (Fase Mvil lquida). El eluente
ascender o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrar los
componentes a lo largo de sta produciendo manchas que representan a los
componentes, la separacin se da por migracin diferencial, es decir que la
fase mvil arrastra a las substancias apolares y aquellas ms polares son
retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separacin. Posteriormente
se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de mtodos qumicos en
el que por inmersin o rociado se obtienen derivados coloreados o
fluorescentes (Adicin de Ninhidrina a aminas, cido sulfrico para carbonizar
compuestos orgnicos, etc), o por medio de mtodos fsicos pticos utilizando
radiacin
UV
o
luz
visible.
El anlisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero
se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre
otras. En el semicuantitativo se observa dimetro y comparacin visual e
intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentracin
conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisin
a travs de la sustancia y medidas de emisin o medida de luz reflejada desde
la sustancia, y espectrofotometra por fluorescencia.
.

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Almina (Al2O3),
Slica u Oxido de Magnesio. La fase estacionaria esta constituida
por un slido poroso, el cual queda soportado en el interior de una
columna generalmente fabricada en plstico o vidrio. La fase mvil
se encuentra formada por la solucin que lentamente va
atravesando la fase estacionaria. La solucin que sale al final de la
columna se reemplaza constantemente por nueva solucin que se
suministra desde un contenedor por la parte superior de la
columna.
La migracin de las sustancias de la mezcla a travs de la columna se
encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que
cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se
separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la
separacin, y por tanto la resolucin, aumenta con la longitud de la columna. La
banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a
procesos
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
INTERCAMBIO IONICO.-En este tipo de cromatografa la fase estacionaria
tiene grupos cargados que interaccionan electroestticamente con ione de
signo contrario de la fase mvil
EXCLUSION MOLECULAR.-La cromatografa por exclusin molecular es un
mtodo de cromatografa en columna por el cual las molculas se separan en
solucin segn su pelo molecular
Separa protenas segn su tamao.
La fase solida consiste en pequeas perlas que contienen iones porosos
o cavidades de tamao calibrado.
Las protenas de mayor tamao no pueden entrar en las cavidades.
La protenas ms pequeas penetran en las cavidades
POR AFINIDAD.- La cromatografa por afinidad permite la separacin de
mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unin a un determinado ligan.
CROMATOGRAFIA DE GASES
Se utiliza para la separacin de sustancias gaseosas. La Fase Mvil es un
Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un slido
(Cromatografa Gas-Slido) o una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin
(Generalmente Polietiln-Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte
(Cromatografa Gas-Lquido). El cromatgrafo de gases est constituido
normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de
inyeccin, una columna normalmente localizada en el interior de una cmara
termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar,
registrar
e
imprimir
el
cromatgrama.
La muestra se introduce a travs del sistema de inyeccin dentro de la
columna que es el sitio donde ocurre la separacin. La columna de aluminio,
acero inoxidable, vidrio o tefln contiene la fase estacionaria slida o lquida y
est sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de slice. La
fase mvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a travs de
la columna, por esta razn debe ser inerte para evitar interacciones con la

muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusin gaseosa.

Al final de la columna existe el detector que permite la deteccin y
cuantificacin de las sustancias, midiendo conductividad trmica y
electronegatividad de las sustancias eludas. Se produce una seal tipo
elctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un
integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los
componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatgrama en
forma de picos y se determinan medidas como la
altura y el rea del pico.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA
1. Tecnologa de alimentos y Productos
Naturales.Puede
realizarse
la
caracterizacin de Aceites Esenciales y
Aromas, los cuales son empleados en la
elaboracin de saborizantes, aromatizantes, licores, perfumes,
artculos de aseo, y como materias primas para productos
farmacuticos.
2.

Control Ambiental.- Dentro de los contaminantes posibles de ser

estudiados estn: los hidrocarburos aromticos, BTEX, pesticidas
organoclorados y organo-fosforados en muestras de aguas
superficiales, subterrneas, suelos y lodos.

3.

Qumica Forense.- Es posible la aplicacin de la cromatografa

de gases y la espectrometra de masas en la deteccin y
cuantificacin de analitos de inters en la qumica forense. Por
ejemplo la determinacin, cuantificacin de alcohol en sangre,
anlisis de licores, entre otros.