UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS

Francisco Garca Salinas

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS BIOLGICAS

TESIS
Identificacin molecular de variedades de Capsicum annuum

L. mediante marcadores RAPD

PARA OBTENER EL NIVEL DE

LICENCIADA EN BIOLOGA

PRESENTA

Valeria Bobadilla Larios

ZACATECAS, ZAC. FEBRERO DE 2016.

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS

Francisco Garca Salinas
UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS BIOLGICAS

TESIS

Identificacin molecular de variedades de Capsicum annuum

L. mediante marcadores RAPD

PARA OBTENER EL NIVEL DE
LICENCIADO EN BIOLOGA

PRESENTA
Valeria Bobadilla Larios

DIRECTORES:
Dr. en C. Edgar Len Esparza Ibarra
Dr. en C. Jorge Luis Ayala Lujn
ASESORES:
M. en C. Marisa Hernndez Barrales
M. en C. Perla Ivonne Gallegos Flores
Dra. en C. Josefina Huerta Garca
Dra. en C. Luca Delgadillo Ruz

CO-Delgadillo Ruz

Dr. en C. Francisco Javier Cabral Arellano

ZACATECAS, ZAC. FEBRERO DE 2016.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Autnoma de Zacatecas; de manera muy especial a la Unidad Acadmica De

Ciencias Biolgicas, dejando constancia de m ms sincero agradecimiento por haberme formado
profesionalmente, junto a todos aquellos docentes que otorgaron con dedicacin su tiempo y
conocimientos.

Al Laboratorio de Patologa y Diagnstico Molecular de la Universidad Autnoma de Zacatecas,

por permitirme el uso de sus instalaciones, adems del compaerismo y amistad brindados de
docentes y estudiantes.

A mis directores de tesis, al Dr. en C. Edgar Len Esparza Ibarra y al Dr. Jorge Luis Ayala
Lujn, gracias a su apoyo y conocimiento fue posible la realizacin de este trabajo.

A la Dra. en C. Luca Delgadillo y Dra. Josefina Huerta Garca por su apoyo y consejos
siempre presentes y en especial a las M. en C. Perla Ivonne Gallegos Flores y M. en C.
Marisa Hernndez Barrales que me brindaron gran cantidad de su tiempo, paciencia,
conocimientos y amistad que fueron de gran importancia para la realizacin de esta tesis.

A todas las personas que directa o indirectamente colaboraron con la realizacin de este trabajo,
les estar eternamente agradecida.

DEDICATORIA

A mi madre, porque eres la fortaleza que vive en m, la luz que gua mi camino y el amor que
reina en mi espritu, todo cuanto soy y cuanto espero llegar a ser te lo debo a ti.

A mis hermanas: Corina, Anglica, Maria y Marina, por su apoyo, nimo y alegra que me
brindan cada da, han sido y siguen siendo ejemplo de dedicacin y amor al conocimiento que
siempre me acompaara.

A mi hermano y colega Valentin, que comparte conmigo el mismo amor por la Biologa, que
siempre me apoyo y me hizo transitar este camino de forma ms liviana gracias a su cario y
buen sentido del humor.

A todos mis amigos, en especial a mi amiga y colega Jessica que me apoyo y comprendi
enormemente al avanzar por el mismo camino de estudio y amor por la vida

NDICE
LISTA DE FIGURAS. ............................................................................................................ i
LISTA DE TABLAS............................................................................................................ iii
LISTA DE UNIDADES, ABREVIACIONES y SIGLAS ................................................... iv
RESUMEN ............................................................................................................................. v
ABSTRACT .......................................................................................................................... vi
I.

INTRODUCCIN ........................................................................................................ 1

II.

ANTECEDENTES ....................................................................................................... 3
2.1.

Origen y Distribucin del Gnero Capsicum. ........................................... 3

2.2. Origen de Capsicum annuum L. .................................................................. 5

2.3. Importancia del gnero y la especie Capsicum annuum L. ............................... 8
2.3.1. Importancia Nacional. ................................................................................8
2.3.2. Importancia en Zacatecas. .........................................................................9
2.4. Clasificacin y etimologa del gnero Capsicum. ........................................... 9
2.5. Grupo de flores blancas, complejo Campsicum annuum. .......................... 11
2.5.2. Descripcin botnica. ...............................................................................12
2.5.3. Importancia gentica del taxn. ..............................................................14
2.5.4. Aspectos ecogeogrficos. ..........................................................................14
2.5.5. Distribucin puntual de C. annuum var. annuum en Mxico...............15
2.6. Clasificacin de los chiles a nivel regional y nacional. ................................. 16
2.7. Variedades segn su nivel Tecnolgico. ..................................................... 16
2.7.1. Variedades hbridas. .................................................................................16
2.7.2. Variedades de polinizacin libre. ............................................................17
2.7.3. Variedades criollas. ..................................................................................17
2.7.4. Variedades criollas de calidad. ................................................................17
2.8. Caracterizacin molecular. ........................................................................ 18
2.9. Marcadores Moleculares. .......................................................................... 18
2.10. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). ............................................. 20
2.11. Polimorfismo del ADN amplificado al azar (RAPDs). ................................ 21
2.11.1. Ventajas de los RAPDs. ..........................................................................23

2.11.2. Desventajas de los RAPDs. ....................................................................23

III.

JUSTIFICACIN ....................................................................................................... 24

IV.

HIPTESIS ................................................................................................................ 25

V. OBJETIVOS.................................................................................................................... 25
VI.

MATERIALES Y MTODOS ................................................................................... 26

6.1

Ubicacin de los experimentos. .................................................... 26

El presente trabajo se desarroll en el laboratorio de Biotecnologa de la Unidad

Acadmica de Ciencias Biolgicas de la Universidad Autnoma de Zacatecas, donde se
llev a cabo el anlisis e interpretacin de los datos obtenidos; y en el Laboratorio de
Patologa y Diagnstico Molecular de la Unidad Acadmica de Ciencias Qumicas de la
Universidad Autnoma de Zacatecas, donde se realiz la extraccin de ADN y su
amplificacin (PCR)....................................................................................... 26
6.2. Material vegetal. ...................................................................................... 26
6.3. Caractersticas del material vegetal. ........................................................... 26
6.5. Cuantificacin de ADN. ........................................................................... 27
6.6. Amplificacin del ADN. ........................................................................... 27
6.6.1. tubulina. ..................................................................................................27
6.6.2. RAPDs........................................................................................................28
6.6.3. Cebadores. .................................................................................................29
6.7.1. ADN extrado..........................................................................................30
6.7.2. Productos amplificados. ........................................................................30
6.8.

Anlisis de los datos obtenidos. ............................................................ 31

6.8.1. Estimacin del tamao, denominacin y anlisis de las bandas de ADN.
31
6.8.2. El anlisis de similitud y dendrograma................................................32

VII. RESULTADOS Y DISCUSIN. ................................................................................. 34

7.1. ADN extrado. ......................................................................................... 34
7.2 Productos de amplificacin ........................................................................ 35
7.2.1 tubulina. ...................................................................................................35
7.2.2 RAPDs.........................................................................................................36
7.2.2.1 Tamao, denominacin y anlisis de las bandas de ADN. ..................36

7.2.2.2. Anlisis de similitud y dendrograma. .................................................39

VIII. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 43
IX. LITERATURA CITADA .............................................................................................. 44
X. ANEXO 1 ........................................................................................................................ 51
XI. ANEXO 2....................................................................................................................... 54

LISTA DE FIGURAS.
Figura 1. rea ncleo de la regin de origen propuesta para el gnero Capsicum .................4
Figura 2. La distribucin de las especies domesticadas del Capsicum en la poca del
descubrimiento de las Amricas.....5
Figura 3. rea de distribucin precolombina de C. annuum en Amrica. ..............................7
Figura 4. Ilustracin de los caracteres de la especie Capsicum annuum (Khler's MedizinalPflanzen, 1887): A. Muestra de un espcimen en flor 1. Diseccin longitudinal de la flor; 2.
Diseccin de la corona con los estambres; 3. Estambres; 4. Granos de polen; 5. Gineceo; 6.
Pistilo, dentro del estilo, y estigma; 7. Diseccin transversal del ovario; 8. Fruto; 9.
Diseccin transversal del fruto; 10. Semilla; 11 y 12. Disecciones longitudinal y transversal
de la semilla, respectivamente..13
Figura 5. Mapa de distribucin puntual de C. annuum var. Annuum en Mxico..................15
Figura 6. Principio bsico de los RAPDs. Las flechas sealan la direccin de sntesis de la
cadena durante la reaccin de la PCR; el fragmento amplificado est representado a un lado
de las cadenas originales..23
Figura 7. Medicin de distancias migradas en milmetros haciendo uso de Adobe
Photoshop CS5. .....................................................................................................................32
Figura 8. Se muestra el perfil electrofortico del DNA genmico de las variedades M1, M2,
M3, A4, A5, A6 (carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7 respectivamente, el 8 corresponde al control
negativo), mostrando integridad en todas las muestras.........................................................35
Figura 9. Se muestra el perfil electrofortico de la amplificacin PCR de tubulina, en las
variedades M1, M2, M3, A4, A5, A6 (carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7 respectivamente, el 8
corresponde al control negativo), con un tamao molecular de 154 pb. ...............................36
Figura 10. RAPD con los cebadores OPA02 (1), OPA11 (2) y OPA20 (3). Electroforesis en
gel de agarosa 1.5% teido con BrEt. 1, marcador de tamao molecular. 2- Ancho Testigo
calera. 3- Ancho Tres venas Villista1. 4- Ancho Dos venasVillista2. 5- Mirasol 2 venas
INIFAP. 6- Mirasol Don Luis, SLP. 7- Mirasol Don Ramn, SLP. 8- Control Negativo. Los
nmeros dentro de cada gel indican las bandas analizadas. ..................................................37
Figura 11. Dendrograma resultante de las distancias genticas entre los genotipos de C.
annuum estudiados. Obtenidas por el anlisis RAPDs utilizando el ndice de similitud de
i

Jaccard (1908), y el mtodo de agrupamiento UPGMA. El nmero en los nodos,

corresponden al valor de robustez de los datos (Bootstrap) que soporta a la rama del rbol
despus de 5000 rplicas. ......................................................................................................46

ii

LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Especies silvestres, semidomesticadas y domesticadas de Capsicum ....................10
Tabla 2. Componentes de la reaccin de amplificacin PCR para tubulina. .....................28
Tabla 3. Componentes de la reaccin de amplificacin PCR para RAPD............................29
Tabla 4. Secuencias de cebadores OPA ................................................................................32
Tabla 5. Abreviaciones para las variedades de C. annuum en los geles de ADN y tubulina,
y concentracin obtenida y visualizada en el gel de ADN genmico...36
Tabla 6. Total de bandas amplificadas por los 3 cebadores en las 6 variedades de C.
annuum y el por ciento de polimorfismo. .............................................................................38
Tabla 7. Matriz de distancia gentica entre las seis variedades de Capsicum annuum como
se deduce de sus marcadores RAPD. ....................................................................................44
Tabla 8. Abreviaciones utilizadas para las variedades de C. annuum en el dendrograma
resultante de las distancias genticas obtenidas entre estas mismas.46

iii

LISTA DE UNIDADES, ABREVIACIONES y SIGLAS

Unidades

Significado

Abreviaciones

Significado

y Siglas
L

Microlitro(s)

UPGMA

Unweighted Pair Group Method using

Arithmetic averages

ng

Nanogramos(s)

ADN

cido desoxirribonucleico

mM

Milimolar

DNAasas

Deoxiribonucleasa

Micromolar

Br Et.

Bromuro de Etidio

nM

Nanomolar

SNICS

Servicio Nacional de Inspeccin y

Certificacin de Semillas

Unidad

SAGARPA

Secretara de Agricultura, Ganadera,

Desarrollo

Rural,

Pesca

Alimentacin
mm

milimetros

CEZAC

Campo Experimental Zacatecas

Molar

Taq

Thermus aquaticus

Voltio

UV

Ultra violeta

Log

Logaritmo

pH

Potencial

de

Hidrogeno

iv

RESUMEN
En Mxico existe una gran diversidad de especies y variedades de chile con gran
importancia cultural, gastronmica y econmica. La especie domesticada Capsicum
annuum agrupa la mayora de los tipos cultivados y es la ms importante en Mxico y el
mundo. Gran parte de esta importancia radica en la riqueza gentica que posee, la
problemtica recae en la necesidad de implementar ms estudios para su aprovechamiento y
conservacin, mediante la aplicacin de herramientas biotecnolgicas, que contienen
diversas estrategias de anlisis gentico, entre ellas los marcadores moleculares RAPD
(Polimorfismo del ADN Amplificado al Azar) que arrojan informacin gentica de manera
rpida y relativamente econmica. En este estudio se utilizaron seis variedades de C.
annuum, facilitadas por el INIFAP (Instituto Nacional de Investigaciones Forestales,
Agrcolas y Pecuarias), en el Campo Experimental Zacatecas (CEZAC), siendo de tipo
ancho y mirasol algunas clasificadas en variedades de polinizacin libre y otras en
variedades criollas, de acuerdo a su nivel tecnolgico. Estas variedades fueron sometidas a
un anlisis RAPD con los cebadores OPA 02, OPA 11 y OPA 20, con el fin de evaluar la
variacin gentica, y en base a esta analizar la agrupacin resultante de los materiales
utilizados y observar si se logra una identificacin correlacionada a una caracterstica
conocida, ya sea de nivel tecnolgico, tipo o morfologa, adems de medir la eficiencia de
los cebadores para encontrar polimorfismos. Los resultados obtenidos mostraron una escasa
variabilidad entre las seis variedades de C. annuum estudiadas, los tres cebadores
amplificaron, siendo el OPA 02 el cebador que aport mayor porcentaje de polimorfismo, y
el dendrograma construido a partir de los datos obtenidos mostro dos agrupaciones
principales, que correspondan a su nivel tecnolgico. Demostrando que los RAPD son una
herramienta til para la deteccin de variacin entre variedades de chile y adems poseen
un gran poder para la estimacin de las similitudes genticas.

ABSTRACT
Mexico has a great diversity of species and varieties of chili with great importance cultural,
culinary and economic importance. The domesticated specie Capsicum annuum brings
together the majority of cultivated types and is the most important in Mexico and the world.
Much of this importance lies in the genetic wealth it has, the problem lies in the need for
more studies to its exploitation and conservation, by implementing biotechnology tools,
containing various strategies for genetic analysis, including molecular markers RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA) that shed genetic information quickly and
relatively cheap. In this study they used six varieties of C.annum, facilitated by INIFAP, for
its acronym in spanish (Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y
Pecuarias), Experimental Field Zacatecas (CEZAC), it is of type ancho and mirasol
some classified into open-pollinated varieties and other in creole varieties, according to
their technological level. These varieties were subjected to RAPD analysis with primers
OPA 02, OPA 11 and OPA20, in order to evaluate the genetic variation and efficiency of
the primers to find polymorphisms, and the dendrogram constructed from data obtained
showed two major groups, corresponding to their technological level. Demonstrating that
the RAPD is useful for detecting genetic variation and has a great potential to estimate
genetic similarities.

vi

I.

INTRODUCCIN

La especie Capsicum annuum se encuentra ampliamente distribuida en Mxico y la que

presenta la mayor variabilidad morfolgica en tamao, forma, color de frutos (Pozo et al.
1991; Baltazar, 1997) y la mayor variabilidad gentica (Hernndez et al., 2001). El gnero
Capsicum se ha analizado y aun se estudia con base en descriptores morfolgicos y
agronmicos (Eshbaugh, 1975; Jensen et al., 1979; IPGRI, 1995). Con el advenimiento de
las herramientas biotecnolgicas, diversas estrategias de anlisis gentico estn disponibles
y se han aplicado en el estudio de tan importante recurso fitogentico. Entre estas
herramientas se encuentran los marcadores moleculares que han sido definidos como
cualquier diferencia no tpica controlada genticamente. Se puede considerar que cualquier
molcula orgnica e inorgnica, que sea caracterstica de un organismo o proceso sea un
marcador.
Los marcadores del ADN se basan fundamentalmente en el anlisis de las diferencias en
pequeas secuencias del ADN entre individuos. Las tcnicas empleadas para ello son muy
diversas y dan el nombre a los distintos tipos de marcadores, los cuales pueden ser de
carcter dominante o codominante (Rentara, 2007). Entre los anlisis con marcadores
moleculares de ADN se encuentran: a) RFLPs (Polimorfismos en la Longitud de los
Fragmentos de Restriccin), b) RAPDs (ADN Polimrfico Amplificado al Azar), c) APPCR (Amplificacin Arbitraria por Reaccin en Cadena de la Polimerasa), d) DAFs
(Huella Gentica de ADN Amplificado), e) RAMPOs (Polimorfismos de Microsatlites
Amplificados al Azar), f) AFLPs (Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos
Amplificados) y g) SSRs (Secuencias Simples Repetidas o Microsatlites), todas estas son
estrategias utilizadas en Capsicum para la caracterizacin (Lefebvre et al., 1993, 2001;
Hernndez et al. 2006; Oyama et al., 2006; Pacheco et al., 2012). Debido a que los
marcadores moleculares detectan variaciones directas en el ADN con las ventajas de ser
dominantes o codominantes, comportarse de manera estable, carecer de efectos
pleiotrpicos y de no ser afectados por el ambiente, se convierten en herramientas
extremadamente tiles comparados con los anlisis morfolgicos o de protenas. Estos
mtodos moleculares se basan en PCR y permiten caracterizar genomas de diferentes
organismos, detectar y aislar genes y diferenciar organismos relacionados genticamente
(Rentara, 2007).
1

Los marcadores RAPD, pronunciado rapids (Random amplified polymorphic DNA) son un
sistema de deteccin de polimorfismos en la secuencia de ADN, que consiste en la
amplificacin de ADN con cebadores pequeos (generalmente de 10 nucletidos de
longitud) de secuencias aleatorias no palindrmicas. La presencia o la ausencia de las
bandas entre individuos se deben a cambios en la secuencia (o la perdida) de los sitios a los
que se alinea el iniciador (Rentara, 2007). Son una tcnica poderosa para la identificacin
de variaciones en la secuencia de ADN entre individuos, por lo cual constituyen una
herramienta til para el estudio gentico entre y dentro de especies de Capsicum.
La especie C. annuum de inters en el presente estudio, cuenta con una gran importancia
econmica y alimentaria en Mxico y en el estado de Zacatecas, las variedades dentro de
esta especie se pueden clasificar en tres categoras segn su nivel tecnolgico (1)
variedades hibridas, (2) variedades de polinizacin libre, y (3) variedades criollas, los
hbridos mejorados representan, en teora, el nivel tecnolgico ms alto, y los criollos el
ms bajo.
El objetivo de este estudio fue analizar variedades de polinizacin libre y variedades
criollas entre s, mediante marcadores RAPD, y la eficiencia mostrada por los cebadores
(primers en ingls) OPA que fueron utilizados, los cuales fueron elegidos de la literatura en
base a su desempeo en la deteccin de polimorfismos en C. annuum.

II.

ANTECEDENTES

2.1. Origen y Distribucin del Gnero Capsicum.

Los botnicos, especialistas en el tema, concuerdan en afirmar que el gnero Capsicum es
una planta nativa de las zonas tropicales del Nuevo Mundo, se dice que el gnero Capsicum
es originario de Amrica del Sur y Central (Pickersgill, 1969a). Los hallazgos
arqueolgicos lo relacionan con las civilizaciones Maya y Azteca (Mxico y Centro
Amrica) y precolombinas de Amrica del Sur. Las evidencias se remontan hacia unos
7000 4000 aos en las cavernas de Tamaulipas y Tehuacan en Mxico, en Amrica
Central y en Per (Pickersgill, 1969a).
Una de las hiptesis ms aceptadas, sobre el centro de origen del gnero Capsicum, sugiere
que una porcin importante del gnero Capsicum se origin en un rea nucleo en Bolivia
surcentral (vase figura 1), con subsiguiente migracin a los Andes y tierras bajas de la
Amazona acompaada por radiacin y especiacin (McLeod et al., 1982; 1983, como se
cita en Montes, 2010). La hiptesis se basa en informacin geogrfica y datos de
electroforesis de la enzima glutamato oxalacetato transaminasa (GOT), que present un
patrn de bandeo similar a accesiones de C. eximiumy C. chacoense procedentes del rea
nuclear, siendo menor el nmero de bandas de accesiones de estas especies exteriores al
rea y las correspondientes a otras especies. Los autores proponen que C. chacoenseo un
ancestro suyo dio lugar tanto a los grupos de flores blancas como al grupo de flores prpura
(Montes, 2010).

Figura 1. rea ncleo de la regin de origen propuesta para el gnero Capsicum

Existen cinco especies cultivadas del gnero: C. annuum L., C. baccatum L., C. chinense
Jacq., C. frutescens L., y C. pubescens Pickersgill (1969b) reporta que las especies
cultivadas fueron domesticadas dentro de los ltimos 800 aos y ellas tienen tres centros de
origen: a) Mxico y Guatemala para C. annuum; b) Regin amaznica para C. chinense y
C. frutescens y c) Regiones altas de Bolivia y Per para C. baccatum y C. pubescens.
Cuando llegaron los espaoles al Nuevo Mundo, a fines del siglo XV, el Capsicum llevaba
miles de aos de ser domesticado y difundido desde su centro de orgen, como indica el
mapa trazado por Charles Heiser, mostrando la distribucin de las especies del Capsicum
en la poca de la llegada de los europeos (Long, 2009)(vase figura 2).

Figura 2. La distribucin de las especies domesticadas del Capsicum en la poca del

descubrimiento de las Amricas (Heiser, 1976, como se cita en Long, 2009).

2.2. Origen de Capsicum annuum L.

Dentro de las especies cultivadas de los chiles, Capsicum annuum L. es la ms ampliamente
conocida y la de mayor importancia econmica, ya que presenta una amplia distribucin
mundial (Pickersgill, 1969b). Pickersgill et al. (1979), apunta que Capsicum annuum tiene
una organizacin cromosmica poco usual, lo cual indica que las formas cultivadas
(Capsicum annuum var. annuum) slo pudieron haberse derivado de formas silvestres del
centro de Mesoamrica, con la misma estructura cromosmica.
Se ha especulado sobre el sitio en donde haya tomado lugar la domesticacin del Capsicum
annuum. Barbara Pickersgill (1977), en un estudio de la evolucin de las plantas cultivadas,
5

usando el mtodo de taxonoma numrica, lleg a la conclusin de que el rea de

domesticacin de esta especie tuvo lugar en el sur de Mesoamrica. Todos los tipos
cultivados cuentan con dos pares de cromosomas cortos, mientras que las especies
espontneas tienen solamente un par. Los Capsicum silvestres con dos pares de
cromosomas cortos, como las especies cultivadas, son comunes nicamente en Mxico, en
donde se extienden desde la costa de Sinaloa hasta la costa de Tabasco. La domesticacin
del C. annuum probablemente ocurri dentro de esta zona geogrfica. Adems se han
encontrado vestigios arqueolgicos donde se constata el cultivo de calabazas, chile y
amaranto en las cuevas de Ocampo en la sierra de Tamaulipas (fase Infiernillo, 7000-5000
a.C.), yacimientos del Valle de Tehuacn en Puebla (fase El Riego, 7000-5000 a.C.) y en la
cueva Guia Naquitz de Oaxaca (niveles inferiores fechados entre 8700-6000 a.C.)
(Pickersgill, 1969a).
Los restos ms antiguos de chile se han encontrado en Tehuacn, fechados entre 6500-5500
a.C. El chile es, por tanto, tambin una de las primeras plantas domesticadas en
Mesoamrica. El complejo C. annuum fue domesticado al menos dos veces, un tipo C.
annuum en Mxico y un tipo C. chinense en la Amazona (Pickersgill, 1969b). El centro de
diversidad para esta variedad (C. annuum var. annuum) incluye Mxico y Centroamrica,
con una distribucin en todo el continente (Figura 3), y los centros de distribucin
secundaria se reportan en Amrica del sur, parte central y sureste de Europa, frica y Asia
(IBPGR, 1983, como se cita en Long, 2009).

Figura 3. rea de distribucin precolombina de C. annuum en Amrica.

La evolucin de una planta no termina con su domesticacin. Al contrario, puede volverse

ms diversificada, una vez que ha pasado este proceso, por la presin de seleccin artificial
impuesta por manos del hombre, quien modifica la planta de acuerdo a los motivos que
tuvo para domesticarla. Las plantas domesticadas son sujetas a los mismos procesos de
seleccin natural que las silvestres. La variabilidad tambin est asociada con las
mutaciones genticas y las recombinaciones de stas. Otro cambio efectuado en el proceso
es que el Capsicum domesticado perdi su mecanismo natural para dispersar sus semillas y
tuvo que depender del hombre para su cultivo. Las plantas domesticadas son menos
agresivas y pierden su habilidad de competir con las plantas silvestres en zonas de
vegetacin natural. En consecuencia, la evolucin de las plantas domesticadas ha generado
la diversidad de tipos de chile que vemos en zonas regionales hoy en da (Long, 2009).

2.3. Importancia del gnero y la especie Capsicum annuum L.

2.3.1. Importancia Nacional.
En Mxico el chile (Capsicum spp.) forma parte fundamental de la dieta de sus habitantes,
el consumo de esta hortaliza est y estuvo presente a lo largo y ancho del pas, formando
parte de la historia, tradicin y cultura, por otra parte, en Mxico este gnero alberga la
mayor diversidad gentica en el mundo al igual que la especie Capsicum annuum, que ha
dado origen a un gran nmero de variedades o tipos de chile, entre los que destacan el
serrano, jalapeo, ancho, pasilla, guajillo y de rbol; adems de ser un producto agrcola
con alta demanda mundial.
El cultivo del chile se ubica entre las siete hortalizas ms cultivadas en el mundo con una
produccin mundial estimada en 24 millones de toneladas (Tm) (Aguilar y Esparza, 2010).
El gnero Capsicum incluye un promedio de 7 a 25 especies y al menos cinco de stas son
cultivadas en mayor o menor grado, pero en el mbito mundial, casi la totalidad del chile
que se consume est dado por la especie C. annuum L. (Aguilar y Esparza, 2010). Los
principales pases productores en el mundo, son: China, Espaa, Turqua, Nigeria y la
India; Mxico ocupa el 4 lugar en cuanto a la superficie cultivada de chile y el sexto en lo
que respecta a la produccin; en este Pas, el chile es el segundo cultivo hortcola ms
importante, despus del tomate (Bravo et al., 2010). La produccin de chile seco en
Mxico, corresponde aproximadamente al 40% del total de los chiles que se cultivan,
predominando los siguientes: Ancho, Mulato, Mirasol, Pasilla, Puya de rbol y otros de
menor importancia (ITESM, 1995, como se cita en Bravo et al., 2010). En Mxico son
cinco las entidades que concentran ms del 50% de la superficie de chile plantada, as como
60% de la produccin, stas son: Sinaloa, Chihuahua, Guanajuato, Sonora y Zacatecas
(Olvera et al., 1998, como se cita en Bravo et al., 2010).

2.3.2. Importancia en Zacatecas.

Zacatecas es el lder en la produccin de chile seco (Capsicum annuum L.) en Mxico; este
cultivo es el ms importante en el Estado, debido a su gran derrama econmica, ya que
aporta el 35% del valor total generado en el sector agrcola (Morales et al., 2005, como se
cita en Aguilar y Esparza, 2010). Participa con ms del 50% de la produccin de chiles
secos en Mxico, con una superficie anual dedicada a este cultivo que oscila entre las 30 y
40 mil hectreas (SAGARPA, 2008, como se cita en Bravo et al., 2006). El cultivo de chile
seco en Zacatecas, es una de las opciones que genera mayor ingresos a los productores y es
la fuente generadora de empleos ms importante en el medio rural, ya que se requiere mano
de obra desde la plantacin del cultivo, hasta el secado y empacado de los frutos. Se ha
determinado que cada hectrea plantada requiere aproximadamente de 150 jornales (Bravo
et al., 2002, como se cita en Bravo et al., 2006).
Esta hortaliza anualmente cubre alrededor del 25% del rea de riego y se cultiva en los
siguientes municipios de la regin central de la Entidad: Calera de V. R., Fresnillo, Villa de
Cos, Gral. Enrique Estrada, Morelos, Vetagrande y Guadalupe, as como en otros: Pnfilo
Natera, Ojocaliente, Luis Moya, Cuauhtmoc, Villa Gonzlez Ortega, Noria de ngeles y
Villa Hidalgo, principalmente (Aguilar y Esparza, 2010). El chile Mirasol es el ms
cultivado en Zacatecas, ya que aproximadamente 50% de los productores lo planta; le
siguen en importancia los chiles: Ancho, Puya, Mulato, de rbol, Pasilla y Guajn (Bravo
et al., 2006).

2.4. Clasificacin y etimologa del gnero Capsicum.

Capsicum es un gnero descrito por Carlos Linneo y que public en el ao 1753 en su
monumental obra Species Plantarum. Se cree que el nombre asignado deriva del griego
kapto, que significa picar que es su principal caracterstica (Salazar y Silva, 2004); sin
embargo, Riquelme menciona que significa caja, en alusin a que las semillas estn
encapsuladas en una especie de caja, al igual que Nee (1986) que lo denomina cpsula
derivado de Kapsakes, aunque, de acuerdo a su tipo, el fruto es clasificado como una baya.
El gnero Capsicum junto con otros 84 gneros ms, constituye la familia Solanceae; entre
las cuales se encuentran el tomate, la papa, el tabaco, la berenjena, el lulo, la uchuva y
9

medicinales (Jaramillo y Lobo, 1982, como se cita en Pardey, 2008). En general, las
especies del gnero Capsicum son diploides y poseen doce pares de cromosomas (Sihna,
1950, como se cita en Pardey, 2008).
El gnero Capsicum agrupa a ms de 26 especies, de las que slo 12, incluyendo algunas
variedades, son empleadas por el hombre, ya que la mayora son silvestres y
semidomesticadas (ver tabla 1). Slo cinco de las especies han sido domesticadas y se
cultivan (Lopz, 2003). Una de las clasificaciones ms aceptadas a nivel mundial es la del
Germplasm Resources Information Network (GRIN), la cual refiere 29 especies en total
(USDA, ARS, 2009, como se cita en Montes, 2010).

Tabla 1. Especies silvestres, semidomesticadas y domesticadas de Capsicum

Especie Silvestre

Especie Semidomesticada

Especie domesticada

C. buforum A. T. Hunz

C. annuum var labriusculum

C. annuum L.

C. campylopodium Sendt

C. baccatum var baccatum

C. baccatum L. var pendulum

(willd)

C. chacoense var tometosum

C. baccatum var

C. chinense jacq

praetermissum
C. ciliatum

C. chinense (forma silvestre)

C. frutescens L.

C. coocineatum

C. frutescens (forma silvestre)

C. pubescens Ruiz y pavn

C. cornutum (Hiern) A. T. Hunz

C. cardenasii Heiser & Smith

C. dimorphum (Miers)

C. eximium A. T. Hunz

C. flexuosum Send

C. tovari

C. dusenii Bitter

C. chacoense A. T. Hunz

C. geminifolium A. T. Hunz

C. galapagoense A. T. Hunz

C. hookerianum (Miers)

C. annuum var aviculares

C. lanceolatum (Morton &

standley)
C. minutiflorum

10

C. mirable Mart.
C. parvifolium Sendt
C. schottianum
C. scolnikianum A. T. Hunz
C. pendulum
C. villosum Send

Pickersgill, 1980
Los chiles domesticados y sus parientes silvestres forman un grupo conocido como chiles
verdaderos", que de manera informal son divididos en dos grandes grupos:
1) El grupo de flores blancas, el cual se divide en dos subgrupos: El constituido por C.
baccatum y el que agrupa a C. annuum, C. chinense, C. frutescens (Pickersgill, 1980)
2) El grupo de flores prpura donde se encuentran las especie C. eximium, C. cardenasii y
C. pubescens (Pickersgill, 1980), cuyos hbridos no se producen fcilmente y representan
dos linajes evolutivos diferentes.

2.5. Grupo de flores blancas, complejo Campsicum annuum.

2.5.1. Clasificacin taxonmica (Capsicum annuum ssp. annuum).
REINO : Plantae
DIVISIN : Magnoliophyta
CLASE : Magnoliopsida
ORDEN : Solanales
FAMILIA : Solanaceae
GNERO : Capsicum L., 1753
ESPECIE : annuum L., 1753
VARIEDAD : annuum NA
(CONABIO, 2015)

11

2.5.2. Descripcin botnica.

Los autores recientes han aceptado a esta especie y ha habido tambin bastante acuerdo en
reconocer sus lmites, aunque en un tiempo fue confundida con C. frutescens (Heiser y
Pickersgill, 1969, como se cita en Montes, 2010). Capsicum annuum var. annuum con este
nombre se reconoce toda la diversidad domesticada de esta especie. Su descripcin
botnica es la siguiente:
Plantas herbceas o arbustivas de 1.5 m de alto, perennes o anuales, algunas veces llegando
a ser fruticosas en la base con la edad, glabra o pubescente. Hojas generalmente ovadas,
hasta de 10 cm o ms de largo, glabras o esparcidamente pubescentes. Flores solitarias en
las axilas foliares; pedicelos erectos en floracin con el pice nutante, en el fruto erectos o
pndulos, a menudo agrandados hasta de 4 cm ms de largo y 4 mm ms de dimetro, el
pice expandido; cliz truncado, con 5 ms costillas y apndices pequeos, a menudo
agrandado en el fruto, hasta de 2 cm de ancho, sin una constriccin entre la base y el
pedicelo; corola (5-)6-9 mera, color blanco a azul, raramente violeta, de 1-1.5 cm de ancho;
anteras verde-azulosas, de filamentos cortos. Fruto una baya, muy variable en tamao,
forma, color y sabor entre los cultivares diferentes, desde ovada y escasamente ms grande
que los frutos de la var. glabriusculum, hasta globosa, lanceolado-ovada, cilndrica o
cuadrado-lobada, hasta de 15 cm de dimetro o an ms grande, roja, anaranjada, amarilla,
verde o blanca, con sabor picante de diferentes grados o no picante; semillas amarillas,
hasta de 5 mm de largo. (Nee, 1986). El sistema de races llega a profundidades de 0.70 a
1.20 m, y lateralmente hasta 1.20 m, las flores son perfectas (hermafroditas), formndose en
las axilas (Montes, 2010). Para mayor comprensin de las estructuras de C. annuum ver
figura 4.

12

Figura 4. Ilustracin de los caracteres de la especie Capsicum annuum (Khler's

Medizinal-Pflanzen, 1887): A. Muestra de un espcimen en flor 1. Diseccin longitudinal
de la flor; 2. Diseccin de la corona con los estambres; 3. Estambres; 4. Granos de polen; 5.
Gineceo; 6. Pistilo, dentro del estilo, y estigma; 7. Diseccin transversal del ovario; 8.
Fruto; 9. Diseccin transversal del fruto; 10. Semilla; 11 y 12. Disecciones longitudinal y
transversal de la semilla, respectivamente.

13

2.5.3. Importancia gentica del taxn.

Capsicum annuum es la especie ms importante de este gnero en Mxico y el mundo, con
el gran nmero de tipos de chile que posee, representa la mayor diversidad morfolgica y
gentica de la misma. Entre los tipos ms importantes desde el punto de vista econmico se
encuentran: Jalapeo, Serrano, Ancho y Guajillo, otros de menor importancia son Pasilla,
Carricillo, de rbol y Mirador, sin embargo, existen muchos otros tipos de importancia
regional o local, la aparicin de nuevas formas, nuevos genotipos o hbridos se debe
principalmente al intercambio de germoplasma entre agricultores as como a las cruzas intra
o inter-especficas que ocurren (Prez et al., 2015). Adaptadas a las diversas condiciones
ambientales y con un alto potencial para usarse de forma directa por sus caractersticas
particulares, y como fuente de germoplasma en programas de mejoramiento gentico
(Lujan 1986; Pozo et al., 1991, como se cita en Montes, 2010). Este mejoramiento
constituye una alternativa viable y econmica para resolver problemas de produccin del
chile que tiene impacto en la economa agrcola de Mxico y el mundo.

2.5.4. Aspectos ecogeogrficos.

Generalmente en vegetacin secundaria derivada de selva alta perennifolia y
subperennifolia, selva baja caducifolia y bosque caducifolio; tambin como ruderal (Nee,
1986). De todas las especies domesticadas de chile, C. annuum es la ms ampliamente
distribuida, se cultiva en lugares templados, tropicales y subtropicales de Amrica, Europa,
Asia y frica y es la ms importante desde el punto de vista econmico. El grupo C.
annuum de flores blancas, asociado con hbitats ms hmedos, parece haber sido
distribuido originalmente a travs de tierras bajas tropicales de Amrica del Sur y Central
(Montes, 2010)
Su distribucin y cultivo, va desde cerca del nivel del mar, hasta ms de 2,500 msnm,
abarcando diferentes regiones del pas, razn por la cual se encuentra chile en el mercado
todo el ao. Es una planta sensible a las temperaturas bajas de preferencia libre de heladas.
En trminos generales, para esta especie el periodo del cultivo de chile requiere una
temperatura media diaria de 24 C. Los suelos ms adecuados para su cultivo son de textura
ligera: areno-arcillosos; con alta retencin de humedad, en general los chiles son poco
14

tolerantes a la salinidad; en cuanto a los valores del pH los rangos de adaptacin son de 6.3
a 7.0. La humedad relativa ptima se encuentra entre el 50 y 70% (Montes, 2010).
2.5.5. Distribucin puntual de C. annuum var. annuum en Mxico.
Con base en la informacin que se tiene dentro de las bases de datos del Sistema Nacional
de Informacin de la Biodiversidad (SNIB) y de la Red Mundial de Informacin de la
Biodiversidad (REMIB) que maneja la Comisin Nacional de la Biodiversidad
(CONABIO), y con apoyo de la misma CONABIO se realiz un mapa sobre la distribucin
puntual en Mxico de esta especie (Figura 5), sin embargo a esta base de datos le hacen
falta registros sobre todo de esta variedad, caso especfico de los estados de Zacatecas y
San Luis Potos, entre otros (como se cita en Montes, 2010).

Figura 5. Mapa de distribucin puntual de C. annuum var. Annuum en Mxico.

15

2.6. Clasificacin de los chiles a nivel regional y nacional.

A nivel regional y nacional, los chiles pueden clasificarse segn el destino de la cosecha,
reconocindose dos categoras principales: (1) chiles para el mercado en fresco o para corte
en verde o verdeo (ej. ancho, poblano, gero, hngaro, serrano, jalapeo, pimiento) y (2)
chiles para el mercado en seco (ej. pasilla, guajillo, de rbol, cascabel). Sin embargo, en el
mercado internacional los chiles se clasifican y comercializan como (1) chiles picosos y (2)
chiles dulces o pimientos. Estas cuatro categoras (fresco, seco, picoso y dulce) definen en
cierta medida la manera en que las empresas semilleras clasifican y comercializan sus
variedades. Sin embargo, estas cuatro categoras no necesariamente ayudan a definir,
clasificar y distinguir con claridad la enorme diversidad de chiles que se cultivan y
comercializan en Mxico (Luna, 2010).
Por ello, una opcin es agrupar a los chiles en tipos y variedades. Se usa el trmino tipo o
razas de chile, al nombre que le asignan los agricultores, comerciantes y consumidores a
nivel regional (Rodrguez, 1988, como se cita en Bravo, 2006). Son categoras de chiles
ms o menos bien definidas como los chiles tipo Ancho, Jalapeo, Serrano,
Pasilla, y Pimiento. Cada tipo puede clasificarse a su vez en diferentes variedades; por
ejemplo, las variedades Corcel, Caballero y San Luis son todas de tipo Ancho, en
tanto que las variedades Yolo Wonder y Aristoteles pertenecen al tipo Pimiento (Luna,
2010).

2.7. Variedades segn su nivel Tecnolgico.

Las variedades a su vez pueden clasificarse por lo menos en tres categoras segn su nivel
tecnolgico: (1) variedades hbridas, (2) variedades de polinizacin libre, y (3) variedades
criollas (Luna, 2010).

2.7.1. Variedades hbridas.

La semilla hibrida proviene de una cruza controlada entre dos progenitores con alta pureza
gentica, que al combinarse producen un hbrido F1, cuyas caractersticas principales son
alto vigor hbrido y alta uniformidad. Lo anterior implica evaluar un gran nmero de
hbridos experimentales y combinaciones entre progenitores de diferente origen y
16

constitucin gentica, que han sido desarrollados para este propsito. Los progenitores por
lo general estn representados en la cruza por dos lneas puras (A x B); una lnea pura y un
hbrido (A x F1); o dos hbridos (F1 x F1) (Luna, 2010).

2.7.2. Variedades de polinizacin libre.

Las variedades de polinizacin libre (PL) tambin se conocen como variedades OP (Open
Pollinated) que significa de polinizacin libre, o polinizacin abierta. Esta variedad
proviene de la autofecundacin controlada de un solo progenitor con alta pureza gentica.
El desarrollo de estas implica un proceso continuo de seleccin y evaluacin de plantas,
familias y poblaciones sobresalientes a travs de varios ciclos de seleccin y
autofecundacin (autopolinizacin) de las plantas seleccionadas. Los ciclos de seleccin y
autofecundacin se hacen bajo diferentes condiciones ambientales (riego, sequa, calor,
enfermedades, plagas) con el fin de seleccionar las plantas ms sobresalientes por su
resistencia, rendimiento, precocidad, uniformidad y calidad. Este proceso implica la
evaluacin de miles de plantas de un mismo tipo (ej. Ancho) en diversos ambientes y
localidades, y durante varios ciclos de seleccin y autofecundacin (Luna, 2010).

2.7.3. Variedades criollas.

Las variedades criollas provienen de cultivares nativos (criollos) o introducidos de otras
regiones, que se cultivan y establecen por aos en una regin (acriollados), y se utilizan en
plantaciones comerciales; de estos se obtiene semilla para las siguientes generaciones, sin
utilizar tcnicas eficientes de produccin: lo anterior no implica ningn conocimiento, sino
simplemente intuicin (Marquz, 1985, como se cita en Bravo, 2006). Las variedades
criollas no tienen dueo ni patente, y por lo tanto son accesibles a cualquier persona o
productor que quiera conservarlas, sembrarlas, producirlas, mejorarlas, y distribuirlas.

2.7.4. Variedades criollas de calidad.

Dada la escasez de materiales mejorados de chile, se recomienda que el productor
implemente prcticas para obtener gradualmente mejores materiales genticos, se
selecciona un lote o rea de la parcela para dedicarla a la obtencin de semilla (Reveles et
17

al., 2013). Se deben identificar caracteres agronmicos relevantes para la produccin de

chile de acuerdo con el inters de cada sistema de produccin (Moreno-Prez et al., 2011,
como se cita en Reveles et al., 2013).

2.8. Caracterizacin molecular.

Existen tcnicas que permiten detectar diferencias a nivel de las secuencias de ADN.
Mediante el anlisis molecular se puede evitar la influencia del ambiente en la variabilidad,
a este efecto se lo conoce como neutralidad de los caracteres moleculares (Ferreira y
Grattapaglia, 1998). Entre las numerosas aplicaciones de estas tcnicas se puede conocer y
caracterizar el contenido gentico de los organismos. As tambin resulta ser til en
estudios de mapeo gentico, filogenia, sistemtica molecular, mejoramiento asistido por
marcadores moleculares, e identificacin varietal (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
En los ltimos aos, la clasificacin taxonmica as como la descripcin morfolgica y
agronmica han sido acompaadas de estudios directos del genoma por medio de anlisis
de marcadores moleculares. Con el uso de estas herramientas se obtienen medidas
genotpicas de variacin y esto a su vez permite hacer un muestreo amplio de diversidad,
incrementando la resolucin generada por los mtodos tradicionales. Los marcadores del
ADN se basan fundamentalmente en el anlisis de las diferencias en pequeas secuencias
del ADN entre individuos. Las tcnicas empleadas para ello son muy diversas y dan el
nombre a los distintos tipos de marcadores, los cuales pueden ser de carcter dominante o
codominante (Karp y Edwards 1998, como se cita en Delgado, 2006).

2.9. Marcadores Moleculares.

Existen dos clases de marcadores genticos: los morfolgicos y los moleculares (Tanksley
1983). Un marcador molecular es cualquier fenotipo molecular, oriundo de la expresin de
un gen o de segmentos especficos de ADN que puede ser detectado y su herencia
monitoreada. Es as que un marcador molecular recibe el nombre de marcador gentico
cuando su comportamiento se rige de acuerdo con las leyes bsicas de la herencia
mendeliana. (Ferreira y Grattaplaglia 1998).
18

As tambin un marcador molecular es cualquier caracterstica qumica o molecular

medible que es heredada segn el Modelo Mendeliano Simple, incluyendo tanto a los que
analizan directamente los cidos nucleicos (ADN y RNA), como tambin a los que analizan
los productos del ADN como son las protenas (principalmente las isoenzimas) (Prez, s.f.).
Los marcadores moleculares presentan algunas ventajas sobre los morfolgicos ya que son
fenotpicamente neutros, presentan mayor segregacin o polimorfismo que los
morfolgicos, pueden ser evaluados desde los primeros estados de desarrollo de las
plntulas, son aplicables a cualquier tipo de material vegetal, son independientes de la
poca del ao en que se realiza el anlisis, permiten la identificacin correcta de la variedad
sin necesidad de muchos caracteres y estn libres de los efectos epistticos (Tanksley 1983;
Powell 1992; Phillips et al., 1995; Rallo et al., 2002, como se cita en Delgado, 2006). Un
buen marcador molecular debe reunir una serie de caractersticas para maximizar su
utilidad: as por ejemplo, debe tener buena distribucin a lo largo del genoma, un alto grado
de polimorfismo, as como tambin la tcnica para analizar el marcado debe ser rpida,
prctica y debe poder repetirse con fiabilidad en otros laboratorios.
Dentro de los marcadores moleculares los idneos son los de ADN, ya que ofrecen algunas
ventajas: 1) Muestran niveles de variacin ms altos y pueden observarse mutaciones no
detectables a otros niveles. 2) Mucha de la variacin a nivel de nucletidos es
selectivamente neutra (desde luego ms que la de las protenas). 3) Se pueden analizar tres
genomas distintos, nuclear, mitocondrial, y de cloroplasto, que evolucionan segn modos y
ritmos distintos. 4) Los polimorfismos a nivel de nucletidos no se ven afectados por
modificaciones post-transcripcionales (a nivel de cDNA es posible) o post-traduccionales.
5) El ADN de todas las clulas y tejidos es el mismo y su extraccin no depende de una
expresin previa. El segundo punto debe considerarse slo como una ventaja relativa. Cada
marcador DNA representa la existencia de una secuencia diferente variable o no, pero que
pueden expresarse o no (ADN repetitivo, pseudogenes, etc.), por lo que representan mejor
al conjunto del genoma (Prez, s.f.).
Los marcadores del ADN se basan fundamentalmente en el anlisis de las diferencias en
pequeas secuencias del ADN entre individuos (Delgado, 2006). Los diferentes tipos de
marcadores se distinguen por su capacidad de detectar polimorfismos en loci nicos o
19

mltiples y son de tipo dominante o co-dominante (Simpson, 1997, como se cita en

Rentara, 2007) Algunos ejemplos de ellos son: Polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restriccin (RFLP) y los marcadores basados en la Reaccin de la cadena de
la Polimerasa (PCR), Amplificacin aleatoria del ADN polimrfico (RAPD), Polimorfismo
en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP), Microsatlites o Secuencias simples
repetidas (SSR), Amplificacin aleatoria del polimorfismo de microsatlites (RAMPO) etc.
(Delgado, 2006).
2.10. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
La reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una tcnica desarrollada por Kary
Mulliseb 1983, misma que consiste en la sntesis enzimtica in vitro de secuencias
especficas de ADN, en presencia de la enzima Taq polimerasa, esta enzima es un tipo de
ADN polimerasa termoestable aislada de la eubacteria termoflica Thermus aquaticus. La
PCR, se basa en el apareamiento y polimerizacin enzimtica de un par de oligonucletidos
utilizados como cebadores o iniciadores primers en ingls delimitando la secuencia de
ADN de doble cadena de la amplificacin (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
Cuando se realiza una reaccin de PCR se simula lo que sucede en una clula cuando se
sintetiza el ADN. Para la reaccin in vitro es necesario: El templado o molde (ADN o
ADNc), la enzima, los oligonucletidos o cebadores, los desoxirribonucletidos
trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el in magnesio (Mg +), una
solucin amortiguadora o buffer y H2O (Espinosa, 2007). Todos estos elementos
interactan en tres etapas principales de las que se compone la tcnica de PCR:
Desnaturalizacin. En esta etapa, el ADN de doble cadena se desnaturaliza al incrementar
la temperatura a rangos de 92 a 95C. Es aqu donde los enlaces de hidrgeno, que unen las
cadenas y que individualmente son dbiles, se rompen, luego las dos cadenas de ADN
disociadas permanecen libres hasta que la temperatura sea reducida para facilitar el
alineamiento de los cebadores.
Hibridacin. En esta etapa, los cebadores se alinean al extremo 3 del templado
previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el
complejo templado-primers, es importante que la temperatura de hibridacin o temperatura
melting (Tm) sea la ptima; sta generalmente oscila entre 50-60 C. Si el diseo de los
20

cebadores es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del

complejo ser eficiente.
Extensin. En esta etapa, la Taq polimerasa acta sobre el complejo templado-primers y
empieza su funcin cataltica a una velocidad muy rpida; agrega dNTPs complementarios
para crear las cadenas completas de ADN. La extensin de las cadenas es en direccin de la
sntesis del ADN, es decir, de 5 a 3. La temperatura ptima para la reaccin es de 72 C,
ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al final del ciclo, se habrn formado los
amplicones con un tamao dictado por el nmero total de pares de bases (pb) que deber
ser conocido por el investigador.
Luego de 30 ciclos de amplificacin se obtiene aproximadamente 10 6 molculas de una
secuencia especfica de nucletidos. Para visualizar los fragmentos amplificados se realiza
una electroforesis en gel de agarosa tiendo los fragmentos con bromuro de etidio, que
produce fluorescencia de color naranja cuando se expone a la luz ultravioleta (Ferreira y
Grattapaglia, 1998; Tamay et al., 2013; Rocha et al., s.f; Espinosa, 2007).
2.11. Polimorfismo del ADN amplificado al azar (RAPDs).
Este anlisis fue descrito por primera vez en 1990 por dos grupos de investigadores
independientes Williams et al. (1990) y Welsh y McClelland (1990) (Delgado, 2006).
Phillips et al. (1995) menciona que en esencia es la misma metodologa que la PCR, por lo
que a veces se le refiere con este nombre. Los RAPDs (del ingls Random Amplified
Polymorphic DNA o ADN polimorfico amplificado al azar) (Williams et al. 1990), son
marcadores que amplifican aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de
especies.
La modificacin en relacin a la tecnologa PCR, consisti en sustituir el uso de un par de
cebadores cuidadosamente diseados y un poco largos, por un solo cebador corto, de
alrededor de 10 nucletidos de longitud y de secuencia arbitraria, con la capacidad de
unirse a regiones especficas en el genoma (Waugh y Powell 1992; Valadez y Kahl 2000,
como se cita en Rentara, 2007). En el anlisis PCR los dos cebadores son usados para
amplificar una secuencia especfica del genoma, y en el anlisis RAPD, el cebador se usa
para amplificar secuencias al azar de un patrn complejo de ADN (Phillips et al., 1995).
Los RAPDs se basan en la probabilidad estadstica de que se presenten sitios
complementarios al oligonucletido de 10 pares de bases (pb) a lo largo del genoma, la
21

secuencia del cebador es elegida a priori de manera arbitraria y solo se utiliza un cebador
por reaccin, que actuara al mismo tiempo como iniciador sentido y antisentido (Figura 6).
El polimorfismo de las bandas entre los individuos se debe a cambios en la secuencia de los
nucletidos en los sitios de acoplamiento del oligonucletido y por insercin o delecin de
los fragmentos en estos sitios (Williams et al., 1990).
Estos marcadores son dominantes, es decir, no pueden discernir los homcigotos
dominantes de los hetercigotos para un segmento particular (Whitkus et al., 1994;
Backeljau et al., 1995, como se cita en Rentara, 2007), por lo que la estimacin de las
frecuencias allicas se debe hacer de manera indirecta, asumiendo equilibrio de HardyWeinberg.

Figura 6. Principio bsico de los RAPDs. Las flechas sealan la direccin de sntesis de la
cadena durante la reaccin de la PCR; el fragmento amplificado est representado a un lado
de las cadenas originales.
La repetibilidad es un problema en el uso de RAPDs ya que puede ser muy sensitiva a las
condiciones en las que se lleva a cabo. Es por eso que se debe estandarizar todas las
condiciones experimentales utilizadas durante la amplificacin con el fin de reducir la falta
de repetibilidad inherente a la tcnica.
El anlisis RAPD requiere de cinco elementos bsicos:
1) ADN molde: ADN proveniente de la muestra a analizar. 2) El iniciador: que es un
oligonucletido, con la propiedad de localizar y unirse a sitios complementarios del ADN
desnaturalizado. Debe tener un contenido de al menos un 50% de guanina-citocina para
funcionar correctamente. 3) Desoxirribonucletidos: se requieren en concentraciones
adecuadas de dATP, dGTP, dCTP y de dTTP para la sntesis de la cadena. 4) Solucin
buffer. 5) Taq-polimerasa: es una enzima ADN polimerasa termoestable. Tiene la
propiedad de restituir la doble cadena de ADN usando una cadena simple como molde a
22

partir de un punto determinado, fijado en este caso, por el iniciador (Phillips et al. 1995,
como se cita en Rentara, 2007).

Durante el anlisis RAPD se dan una serie de reacciones qumicas en forma cclica de
manera similar a lo que ocurre en una reaccin PCR, pero contemplando la modificacin
mencionada anteriormente. La eficiencia de los marcadores RAPDs puede estar
influenciada por varios factores, entre ellos: el nmero de ciclos de amplificacin, la
cantidad de ADN inicial, la longitud del ADN, el iniciador y la temperatura (Rentara,
2007).
2.11.1. Ventajas de los RAPDs.
Entre las principales ventajas de los RAPDs, est que amplifican regiones tanto
codificantes del ADN como las no codificantes y revelan niveles de variacin ms altos que
los RFLPs e isoenzimas (Williams et al., 1990; Lynch y Milligan, 1994; Otero et al., 1997;
Russell et al., 1997; Parker et al., 1998, como se cita en Rentara, 2007); es una tcnica
relativamente fcil que no necesita conocimiento previo de la secuencia de ADN, no
requiere la construccin o el mantenimiento de una librera genmica, el nmero de loci
que puede ser examinado es ilimitado y no requiere pruebas radiactivas (Reiter et al., 1992;
Whitkus et al. 1994, como se cita en Rentara 2007). Adems de su bajo costo ya que no se
requiere de instalaciones de laboratorio sofisticados (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Los
segmentos RAPDs una vez amplificados y separados por electroforesis pueden ser
fcilmente aislados del gel (Ferreira y Grattapaglia, 1998; Yaguachi y Medina, 2003).
2.11.2. Desventajas de los RAPDs.
La corta longitud de los iniciadores demanda que la amplificacin por PCR se d con una
temperatura de alineacin relativamente baja, lo cual aumenta la probabilidad de un
alineamiento no especfico y la generacin de informacin ambigua. As mismo es un
problema la reproducibilidad de los resultados y la comigracin de bandas (Williams,
1990). Sin embargo empleando una metodologa controlada y constante (termociclador,
tipo y concentracin de reactivos, etc) se puede conseguir resultados satisfactorios
(Farinango, 2007). Por otro lado, como los loci son dominantes, los RAPDs dan menos
informacin gentica por locus que los marcadores codominantes.
23

III.

JUSTIFICACIN

La especie C. annuum, cuenta con una gran importancia econmica y alimentaria en

Mxico y el estado de Zacatecas, adems de ser bsica en nuestra historia y cultura. A
pesar de ello, el chile ha sido poco estudiado en nuestro pas, desde aspectos nutricionales,
biomdicos,

bioqumicos

industriales;

as

como

mejoramiento

gentico

comercializacin. Mxico cuenta con una enorme riqueza en la diversidad gentica de esta
especie, y existe una gran importancia del impacto producido por el manejo humano,
cambios que se ven reflejados genticamente entre y dentro de las especies de C. annuum,
por ello el estudio de este recurso mediante anlisis genticos ha tomado gran relevancia,
con los objetivos principales de caracterizacin, conservacin, evaluacin y mejoramiento.
Gracias a el advenimiento de las herramientas biotecnolgicas, diversas estrategias de
anlisis gentico estn disponibles y se han aplicado en el estudio de tan importante recurso
fitogentico, entre ellos los anlisis con marcadores moleculares, donde se incluyen los
RAPD que constituyen una herramienta til para el estudio gentico entre y dentro de
especies de Capsicum, debido a que son una tcnica eficaz para la identificacin de
variaciones en la secuencia de ADN entre individuos.
Por ello a travs de esta investigacin mediante RAPD, se puede establecer la variacin
gentica entre los diferentes tipos y variedades de C. annuum utilizados en este estudio, y
analizar la agrupacin resultante de los materiales utilizados para ver si se logra una
identificacin en base a una caracterstica conocida, ya sea nivel tecnolgico, tipo o
morfologa. El nivel tecnolgico ser de importancia en la identificacin, ya que los
mtodos de seleccin y reproduccin a los que son sometidos las variedades segn su
categora tecnolgica, tiene un impacto gentico. Lo cual es de importancia ya que aumenta
el conocimiento en el campo del anlisis gentico de este recurso, otorgando ms
informacin sobre el potencial de este marcador molecular como herramienta en el estudio
de genotipos estrechamente emparentados, adems de incrementar el conocimiento sobre el
desempeo de los cebadores seleccionados, al ser comparados con resultados obtenidos en
investigaciones donde tambin fueron utilizados.

24

IV.

HIPTESIS

Las variedades analizadas de C. annuum, mediante RAPD, presentan variacin gentica y

se diferencian en base a su nivel tecnolgico (criollas o polinizacin libre).

V. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Identificar molecularmente, a travs de anlisis RAPD, variedades de Capsicum annuum L.

OBJETIVOS ESPECFICOS
1.- Obtener las variedades de C. annuum cultivadas en Zacatecas, diferenciando el grupo de
genotipos criollos y los de polinizacin libre.
2.- Amplificar el gen constitutivo de B-tubulina en los ADN extrados de las diferentes
variedades de C. annuum.
3.- Analizar molecularmente las seis variedades de C. annum obtenidas, mediante la tcnica
de amplificacin al azar (RAPD).

25

VI.

MATERIALES Y MTODOS

6.1 Ubicacin de los experimentos.

El presente trabajo se desarroll en el laboratorio de Biotecnologa de la Unidad Acadmica
de Ciencias Biolgicas de la Universidad Autnoma de Zacatecas, donde se llev a cabo el
anlisis e interpretacin de los datos obtenidos; y en el Laboratorio de Patologa y
Diagnstico Molecular de la Unidad Acadmica de Ciencias Qumicas de la Universidad
Autnoma de Zacatecas, donde se realiz la extraccin de ADN y su amplificacin (PCR).

6.2. Material vegetal.

El material vegetal que se utiliz para estos ensayos fueron plntulas de C. annuum
facilitadas por el INIFAP Campo Experimental Zacatecas (CEZAC). Las Variedades
utilizadas en la presente investigacin son de dos tipos; Ancho y Mirasol.
Tipo Ancho con las variedades:
1. Testigo calera. (criollo)
2. Tres venas Villista 1. (criollo)
3. Dos venas Villista 2. (criollo)
Tipo Mirasol con las variedades:
4. 2 venas INIFAP. (criollo)
5. Don Luis, SLP. (polinizacin libre)
6. Don Ramn, SLP. (polinizacin libre)

6.3. Caractersticas del material vegetal.

Las plntulas se desarrollaron y mantuvieron bajo las condiciones de invernadero del
CEZAC, contaban con 18 semanas de desarrollo y 6 semanas para la variedad Mirasol 2
venas INIFAP. Las variedades de tipo Ancho se clasifican en la categora de variedades
criollas de calidad.
Las variedades de tipo Mirasol estn en la categora de variedades de polinizacin libre,
liberadas por el INIFAP, se encuentran registradas en el Catlogo Nacional de Variedades
Vegetales (CNVV) de la SAGARPA-SNICS y cuentan con registro de Ttulo de Obtentor.
26

6.4. Extraccin de ADN vegetal.

Se obtuvo una cantidad suficiente de material vegetal usando solo el tejido foliar, este se
desprendi con pinzas metlicas evitando en todo momento el contacto directo con las
hojas para no contaminar con las DNAasas de la piel. El tejido foliar se deposit en un
mortero con pistilo y fue molido con nitrgeno lquido (-195C para evitar la degradacin
del tejido). Inmediatamente se pesaron 100 mg de tejido pulverizado un Eppendorf,
utilizando una balanza semi-analtica, y se procedi a la extraccin de ADN utilizando el
kit DNeasy Plant Mini de QIAGEN TM, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Este procedimiento fue realizado para cada variedad de chile utilizada.

6.5. Cuantificacin de ADN.

La cuantificacin del cido nucleico obtenido de cada muestra se llev a cabo en un
espectrofotmetro (Quawell UV spectrophotometers Q5000); su pureza fue determinada
considerando las relaciones de absorbancia de 260/280 y 260/230 nm.

6.6. Amplificacin del ADN.

El ADN extrado se us como molde para su amplificacin en las subsecuentes reacciones
en cadena de la polimerasa (PCR: Polymerase Chain Reaction).

6.6.1. tubulina.
Para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se us el cebador tubulina con las
siguientes secuencias forward y reverse (tub 1:5' ATG CAA GAA AGC CTT GCG
AC3'; tub 2: 5'TTT GCA GTA TCT CAG TGT TC3') que amplifican el gen
tubulina de expresin constitutiva (housekeeping) con el fin de verificar la viabilidad de
amplificacin del ADN genmico extrado, la PCR se llev a cabo con las mezclas de
reaccin conteniendo: 50-78 ng de ADN genmico aproximadamente, 2 mM de MgCl2, 0.4
M dNTPs (Fermentas), 0,6mM de B Tubulina, 1.25U de Taq ADN polimerasa
(Fermentas), 1X Buffer de KCl (Promega), en un volumen final de 25 l. Para evitar
27

contaminacin con ADN exgeno, la mezcla de la reaccin se llev a cabo en una campana
de PCR con luz UV integrada (PCR Chamber By Plas Labs) antes de iniciar a trabajar con
ella, todo el material a utilizar se debe irradiar con luz UV para destruir la existencia de un
posible ADN remanente en ellos y as asegurar que el ADN que se amplifica es el que
corresponde a las muestras a analizar, posteriormente el ADN fue amplificado en un
termociclador Personal Thermal Cycler (Labnet Multi Gene II). El perfil de amplificacin
fue; 2 minutos a 95 C, seguido por 39 ciclos a; 95 C por 30 segundos, 30 segundos a 58
C, 45 segundos a 72 C, y un paso final a 72 C por 5 minutos, en un termociclador
Personal Thermal Cycler (Labnet MultiGene II). El molde resultante se almaceno en
refrigeracin hasta su uso. Los componentes con su concentracin Stock y concentracin
final se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Componentes de la reaccin de amplificacin PCR para B tubulina.
Componente

Concentracin

Concentracin

Volumen en la

Stock

final en la reaccin

reaccin en l

H2O

VNP

Buffer (NH4)2SO4

10X

1X

2.5 l

MgCl2

25mM

2 mM

2 l

DNTPs

10mM

0.4mM

1 l

Cebador

10mM

0.6mM

1 l

Taq. Polimerasa

5U/ l

1.25U

0.25 l

ADN

50-78 ng

6 l

*VNP: Volumen necesario para un volumen final de 25 l

6.6.2. RAPDs.
Se llev a cabo la PCR con las mezclas de reaccin conteniendo: 50-78 ng de ADN
genmico aproximadamente, 2mM de MgCl2, 0.4 M dNTPs (Fermentas), 0.4 M de cada
cebador, 1 Unidad de Taq ADN polimerasa (ACTGene), 1X Buffer de (NH4)2SO4
(Promega), en un volumen final de 25 l. Para evitar contaminacin con DNA exgeno, la
mezcla de la reaccin se llev a cabo en una campana de PCR con luz UV integrada (PCR
Chamber By Plas Labs) llevando a cabo las recomendaciones ya mencionadas en

28

tubulina, posteriormente el ADN fue amplificado en un termociclador Personal Thermal

Cycler (Labnet Multi Gene II). El perfil de amplificacin fue; 2 minutos a 95C, seguido
por 44 ciclos a; 95C por 30 segundos, 1 minuto a 36C, 45 segundos a 72C, y un paso
final a 72C por 5 minutos. El molde resultante se almaceno en refrigeracin hasta su uso.
Los componentes con su concentracin Stock y concentracin final se muestran en la tabla
3.
Tabla 3. Componentes de la reaccin de amplificacin PCR para RAPD.
Componente

Concentracin

Concentracin

Volumen en la

Stock

final en la reaccin

reaccin en l

H2O

VNP

Buffer (NH4)2SO4

10X

1X

2.5 l

MgCl2

25mM

2 mM

2 l

DNTPs

10mM

0.2mM

0.5 l

Cebador

10M

0.4M

1 l

Taq. Polimerasa

2U/ l

1U

0.5 l

50- 78ng

6 l

ADN

*VNP: Volumen necesario para un volumen final de 25 l

6.6.3. Cebadores.
En base a la literatura de mejoramiento gentico y caracterizacin molecular de Capsicum
annuum, se eligieron tres cebadores (OPA 02, OPA 11 y OPA 20) sintetizados por
invitrogen (Tabla 4), los cuales mostraron en otras investigaciones un buen grado de
polimorfismos.
Tabla 4. Secuencias de cebadores OPA
Nombre del

Secuencia de los

Cebador

cebadores (5-3)

OPA 02

TGC CGA GCT G

OPA 11

CAA TCG CCG T

OPA 20

GTT GCG ATC C

29

6.7. Electroforesis en geles de agarosa.

6.7.1. ADN extrado.
Complementario al espectrofotmetro el grado de pureza e integridad fsica de ADN fue
evaluada mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, en un sistema continuo a base
de TAE 1X (Tris 0.04 M; cido actico glacial 0.1 % v/v; EDTA 0.5 M) con bromuro de
etidio. Para ello se usaron cmaras de electroforesis horizontal (Pharma Biotech modelo
GNA-100). El corrimiento se realiz durante 50 min a 80 V/cm constantes. Los geles
fueron visualizados mediante irradiacin con luz ultravioleta en un transiluminador (Wise
Uv wuv-L50). Se document el patrn electrofortico logrado, en un documentador
electrofortico (EDAS Electrophoresis Documentation and Analysis Sistem. 120
KODAK ds digital sistem) con sistema de anlisis (kodak 1200 digital science).

6.7.2. Productos amplificados.

Los productos amplificados fueron visualizados con una cmara de electroforesis horizontal
(Pharma Biotech modelo GNA-100) en geles de agarosa al 1.5% en tampn TAE 1X con
bromuro de etidio, para estos fue usado el Wide Range DNA Marker (SIGMA) como
marcador de referencia.
La electroforesis para la amplificacin de tubulina se realiz por 30 min a 85V seguidas
por 20 min a 95V, en el caso de los RAPDs se llev a cabo por 60 min a 90V. Finalmente
las bandas fueron visualizadas bajo un transilumidador UV (Wise Uv wuv-L50) y
procesadas digitalmente en un documentador electrofortico (EDAS Electrophoresis
Documentation and Analysis Sistem. 120 KODAK ds digital sistem) con sistema de
anlisis (kodak 1200 digital science).

30

6.8.

Anlisis de los datos obtenidos.

6.8.1. Estimacin del tamao, denominacin y anlisis de las bandas de ADN.

A partir de la fotografa o la captura de la imagen realizada al gel de electroforesis de
agarosa se procede a la estimacin del tamao y la denominacin de las bandas obtenidas.
Se us la tcnica matemtica llamada regresin lineal. Los cientficos usan la regresin
lineal para derivar una lnea recta de mejor ajuste y su correspondiente ecuacin. En este
caso, la relacin a la que se aplic la regresin lineal fue entre la longitud de fragmentos del
marcador de peso molecular de ADN y la distancia de migracin de los fragmentos a travs
del gel de agarosa. Una vez determinada la ecuacin de la lnea de mejor ajuste, se us para
calcular las longitudes de cada banda obtenida.
Para esta tcnica se calcularon las distancias migradas desde el pozo de cada fragmento de
ADN del marcador de peso molecular y de igual forma para los fragmentos desconocidos,
mediante Adobe Photoshop CS5 (versin 12.0 x 32), usando la herramienta llamada
Informacin que da la opcin de medir en milmetros la imagen, dando el parmetro de
coordenadas X y Y, siendo Y el vector usado para medir la distancia migrada, tomando un
punto de referencia definido en los pozos (ver figura 7).
Despus de obtener la distancia viajada de cada banda, se hizo uso de Microsoft Excel 2010
en un equipo, para calcular la ecuacin de la recta de regresin que describe la curva
estndar para cada cebador OPA, y mediante esta ecuacin se calcul el tamao de cada
fragmento desconocido. La ecuacin para la lnea de regresin que describe la curva
estndar tiene la siguiente frmula general:

y = ax +b
Dnde:
y =el logaritmo del tamao de los fragmentos
a =la pendiente de la lnea
x= distancia desde el pozo (en mm)
b =el punto donde la lnea de regresin intercepta el eje

31

Figura 7. Medicin de distancias migradas en milmetros haciendo uso de Adobe

Photoshop CS5.

Se denominaron las bandas RAPD con el nombre del cebador y a continuacin el nmero
de pares de bases que se calcularon (ejemplo: OPA20- 788), que corresponde a una banda
de 788 pares de bases obtenida a partir de un cebador OPA20 (Invitrogen).

6.8.2. El anlisis de similitud y dendrograma.

Se elabor para las bandas RAPDs de todas las muestras una matriz de resultados 0/1
donde se evalu las bandas como ausente (0) o presente (1) para cada uno de los materiales
estudiados. Solamente se utilizaron bandas de ADN claramente distinguibles para el
anlisis gentico. Las estimaciones de similitud gentica mediante la matriz de resultados
0/1 obtenida se calcularon de acuerdo al ndice de similitud de Jaccard (1908). La base
molecular para la presencia de una banda RAPDs an no est claramente entendida, sin
embargo se considera que la ausencia de una banda compartida no necesariamente implica
un ancestro comn o similitud gentica entre muestras, clones o accesiones. Es as que el
coeficiente de Jaccard fue considerado como el mejor algoritmo para obtener una matriz de
32

similitud y distancia en este estudio, debido a que no se considera a la ausencia de banda

entre dos muestras como elemento a favor de la similitud entre ellas.
El coeficiente de Jaccard se expresa de la siguiente manera:

F = Coeficiente de Jaccard
Mxy= Nmero de fragmentos compartidos entre dos accesiones
Mt = Nmero total de bandas en la matriz de datos
Mxyo = Nmero de bandas en la matriz
Sobre la matriz obtenida se aplic la tcnica Cluster anlisis empleando el mtodo de
agrupamiento UPGMA (media Aritmtica No Ponderada) (Sneath & Sokal, 1973). Adems
se realiz una prueba estadstica Boostrap, que realiza un remuestreo aleatorio de los datos,
contribuyendo a probar la consistencia de los rboles, mediante la robustez, que es el grado
de confianza de la rama (Felsenstein, 1985). Normalmente se pide un mnimo de 1000 hasta
5000 remuestreos para este anlisis. Para este anlisis se realizaron 5000 remuestreos.
Todos los anlisis estadsticos, visualizacin y edicin de dendrograma (rbol o fenograma)
se llevaron a cabo mediante tres softwares Free Tree, Tree View y FigTree (Hampl et al.,
2001).
6.8.3. Anlisis de los polimorfismos obtenidos por cada cebador.
A partir de la matriz de 0/1 creada por los patrones de bandas se identificaron las bandas
comunes o monomrficas (que aparecen en todos las variedades) y bandas polimrficas
(que aparecen slo en algunas variedades) amplificadas por un cebador. En base a esto se
calcul el por ciento de polimorfismo que se obtuvo con cada cebador, adems se
determin el % de eficiencia de un cebador, esto se estim como un porcentaje del nmero
total de bandas amplificadas por el cebador entre el nmero total de bandas amplificadas
por todos los cebadores a travs de todas las variedades, el cual representa la disponibilidad
de secuencias complementarias al cebador en el genoma.

33

VII. RESULTADOS Y DISCUSIN.

7.1. ADN extrado.
Los datos arrojados por el espectrofotmetro (NanoDrop ND-1000 LabTech), fueron
analizados para determinar el grado de pureza del ADN extrado, los valores obtenidos se
aproximaron a 1.8 lo cual indica pureza para las relaciones de absorbancia 260/280nm
indicadoras de la posible presencia de protenas, y una proporcin de 1.8 a 2.2 para las
relaciones 260/230 nm, hallndose en ambos casos en los rangos recomendados.
El kit DNeasy Plant Mini de QIAGEN TM, para la extraccin de ADN a partir del tejido
foliar fue suficiente para el presente trabajo, donde se obtuvo ADN genmico a una
concentracin promedio de 14 ng/l (ver tabla 5).
La visualizacin en gel de agarosa no presento degradacin, mostrndose integro el ADN
en las seis muestras utilizadas, como se puede observar en la figura 8.

Tabla 5. Abreviaciones utilizadas para las variedades de C. annuum en los geles de ADN y
tubulina, y concentracin obtenida y visualizada en el gel de ADN genmico.
Abreviacin

Variedad

Concentracin

Concentracin

de ADN

utilizada en el gel
de ADN

A1

Ancho Testigo calera

14 ng/l

42 ng (3l)

A2

Ancho Tres venas Villista 1

12 ng/l

36 ng (3l)

A3

Ancho Dos venas Villista 2

13 ng/l

39 ng (3l)

M4

Mirasol Dos venas INIFAP

15 ng/l

45 ng (3l)

M5

Mirasol Don Luis, SLP.

13 ng/l

39 ng (3l)

M6

Mirasol Don Ramn, SLP.

18 ng/l

54 ng (3l)

34

Figura 8. Se muestra el perfil electrofortico del ADN genmico de las variedades M1,
M2, M3, A4, A5, A6 (carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7 respectivamente, el 8 corresponde al control
negativo; con agua en lugar de ADN), mostrando integridad en todas las muestras.

7.2 Productos de amplificacin

7.2.1 tubulina.
Se obtuvo una amplificacin satisfactoria para la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) usando el gen tubulina de expresin constitutiva, los amplificados contaron con un
peso molecular de 154 pb, correspondiente al peso aproximado de la tubulina,
confirmando la viabilidad de amplificacin del ADN genmico extrado (ver figura 9).

35

Figura 9. Se muestra el perfil electrofortico de la amplificacin PCR de tubulina que

presenta un tamao molecular de 154 pb, con 8 l de carga para cada ADN amplificado, 2
l de buffer de carga Blue Juice (Invitrogen), 3 l de marcador (DirectLoad TM Wide Range
DNA Marker) en el carril 1, las variedades A1, A2, A3, M4, M5, M6 (carriles 2, 3, 4, 5, 6 y
7 respectivamente, el 8 corresponde al control negativo; con agua y no ADN).
7.2.2 RAPDs.
7.2.2.1 Tamao, denominacin y anlisis de las bandas de ADN.
Se realizaron los ensayos de tipo RAPD empleando 3 iniciadores, antes descritos (OPA 02,
OPA 11, OPA 20). La Fig. 10 muestra el patrn de bandeo obtenido con los iniciadores
para todas las variedades empleadas. Con todos los iniciadores se obtuvieron productos de
amplificacin. En el presente estudio, refirindonos a los patrones gnicos obtenidos con
cada cebador con las variedades de C. annuum, llamamos a una banda polimrfica como
aquella que est presente a una frecuencia mayor al 1% y menor al 100% Lewin (1997).
Por lo tanto una banda que est presente en todos los patrones gnicos tendr una
frecuencia del 100% y es llamada no polimrfica. Para el anlisis matemtico realizado,
solo se consideraron aquellas bandas que fueron capaces de ser distinguibles como
presentes o ausentes dadas las condiciones propias de cada gel. Se tomaron como idnticas
las bandas que tuvieron el mismo tamao, la intensidad de las bandas no fue considerada un
factor de polimorfismo.

36

Figura 10. RAPD con los cebadores OPA 02 (1), OPA 11 (2) y OPA 20 (3). Electroforesis
en gel de agarosa 1.5% teido con BrEt. 1, marcador de tamao molecular (DirectLoadTM
Wide Range DNA Marker). 2- Ancho Testigo calera. 3- Ancho Tres venas Villista1. 4Ancho Dos venasVillista2. 5- Mirasol 2 venas INIFAP. 6- Mirasol Don Luis, SLP. 7Mirasol Don Ramn, SLP. 8- Control Negativo (amplificacin con agua sin ADN). Los
nmeros dentro de cada gel indican las bandas analizadas.

Los tres cebadores empleados amplificaron satisfactoriamente y produjeron un total de 30

bandas, con un promedio de 10 bandas por cebador. El cebador OPA 20 amplific un total
de 11, OPA 02 amplific 11 y OPA 11 solo 8. De las 30 bandas amplificadas, slo 9 fueron
polimrficas, siendo el OPA 02 el cebador que aport mayor porcentaje de polimorfismo
con el 45.45% debido a la amplificacin de 5 de estas bandas (Tabla 6).
Estos resultados difieren de los obtenidos en otras investigaciones (Gonzlez et al., 2011)
donde fueron utilizados estos cebadores, y se obtuvo un alto por ciento de polimorfismo
37

para el OPA 11 y OPA 20, con un 66,7 % y 81,25 % respectivamente, siendo este ltimo el
que aport mayor polimorfismo, concordante para Bhadragoudar y Chandrasherkhar (2011)
con un 75 por ciento para el OPA 11, muy contrario a lo obtenido en esta investigacin
donde ambos cebadores muestran un bajo porcentaje. Esto podra derivar de variaciones del
mtodo realizado por las investigaciones citadas y las presente, aunque a esto se le
contrapone en parte los resultados obtenidos por el OPA 02 que se asemejan a mismo
estudio Gonzlez et al. (2011) con valores entre 40 % de polimorfismo y 50% obtenido por
Tilahun et al. (2013). Por lo que otra posible explicacin a esta variacin en el
polimorfismo obtenido podra deberse a la diferencia de los genotipos utilizados en este
estudio con el de las investigaciones comentadas, as como por la naturaleza arbitraria de
estos marcadores.

Tabla 6. Total de bandas amplificadas por los 3 cebadores en las 6 variedades de C.

annuum y el por ciento de polimorfismo, eficiencia de amplificacin.
Cebadores

Secuencia de los

Total de

Total de

Por ciento de

Eficiencia

cebadores (5-3)

bandas

bandas

polimorfismo

del cebador

amplificadas

Polimrficas

(%)
(%)

OPA 02

TGC CGA GCT G

11

45.45

36.66

OPA 11

CAA TCG CCG T

12.5

26.66

OPA 20

GTT GCG ATC C

11

27.27

36.66

30

30

Total

La eficiencia correspondiente a la amplificacin de los cebadores oscila entre 26.66%

(OPA 11) y 36.66% (OPA 02 y OPA20) (Tabla 6). La alta eficiencia de un cebador es
indicativo de una amplia zona del genoma que complementa y permite el apareamiento de
bases entre el cebador y el ADN genmico (Karp y Edwards, 1997). Adems se ha sugerido
(Frist et al., 1993) que la alta eficiencia se correlaciona positivamente con el alto contenido
38

de GC de la imprimacin. Esta sugerencia, sin embargo, no es apoyada por los resultados

del presente trabajo como se observa en el OPA 02 (con 70% GC) y el cebador OPA 20
(con 60% GC) tienen eficiencias equivalentes (36.66% cada uno). La eficiencia depende
del nmero total de bandas amplificadas por el cebador y esto incluye las ms comunes
(monomorficas) que representan secuencias conservadas, siendo un parmetro poco
informativo para la diferenciacin, siendo las bandas polimrficas las esenciales para
identificar, por lo tanto a pesar de poseer la misma eficiencia de amplificacin OPA 20 y
OPA 02, este ltimo posee el poder discriminatorio ms alto.

7.2.2.2. Anlisis de similitud y dendrograma.

El anlisis de los patrones de bandeo obtenidos con los 3 iniciadores empleados es
representado por una matriz de similitud. Dicha matriz de similitud fue construida de
acuerdo al ndice de similitud de Jaccard (1908). El rango de este ndice va desde cero (0)
cuando no hay fragmentos compartidos entre dos accesiones, hasta uno (1) cuando las dos
accesiones comparten los mismos fragmentos. Este ndice mide diferencias en la presencia
o ausencia de bandas. El coeficiente de similitud vari desde 0.74074 hasta 0.96154 con un
valor medio de 0.85114 (Tabla 7). El grado de similitud entre (Ancho Tres venas Villista y
Mirasol Don Luis, SLP) y (Ancho Testigo calera y Mirasol Don Luis, SLP) mostr la
variacin gentica ms alta con el valor para los coeficientes de similitud de 0.74074 y
0.75000, respectivamente (Tabla 7). Considerando que se encontr que el valor de similitud
ms alto de 0.96154 entre Mirasol Don Luis, SLP y Mirasol Don Ramn, SLP.
Los resultados de similitud que se obtuvieron indican poca variabilidad, una posible
respuesta est dada por la estrecha relacin filogentica de los materiales empleados, as
como la eleccin de los cebadores y la naturaleza de este tipo de marcadores los cuales al
ser arbitrarios, pudieron hibridar en regiones del ADN que no estaban relacionadas con el
carcter diferenciador. A pesar de esto los valores que se obtuvieron, tienen una
correspondencia con el nivel tecnolgico de estas variedades, como se puede observar en
los grupos de mayor variacin en donde se contraponen variedades criollas con variedades
de polinizacin libre, y en el grupo de mayor similitud donde se comparte el nivel
tecnolgico de polinizacin libre. Demostrando la capacidad de la tcnica para diferenciar y
39

agrupar variedades segn su nivel tecnolgico a pesar de la alta similitud gentica

presentada por los materiales, los RAPD ya han demostrado en otras investigaciones la gran
capacidad que poseen para medir la variabilidad gentica, pero con diferentes enfoques que
el presente en esta investigacin, en su mayora sobre el estudio de la diversidad, estos
presentan diferentes objetivos, desde la colecta, caracterizacin, multiplicacin,
conservacin, evaluacin, enriquecimiento gentico, mejoramiento de cultivos e
intercambio de germoplasma (Latournerie et al. 2002, Alonso et al. 2008, Aguilar et al.
2009, Castan et al. 2010, Pacheco et al. 2012, Kraft et al. 2013, 2014; como se cita en
Prez et al., 2015), y usando principalmente materiales silvestres o procedentes de
programas de mejoramiento y bancos de germoplasma, a diferencia de los materiales
utilizados en la presente investigacin, que son de uso comn entre los agricultores como es
el caso de los materiales criollos y un poco ms restringidos los de polinizacin libre pero
disponibles en calidad de certificados.

Tabla 7. Matriz de distancia gentica entre las seis variedades de Capsicum annuum como
se deduce de sus marcadores RAPD.
1

0.91304

0.88000

0.87500

0.84615

0.84000

0.88462

0.75000

0.74074

0.85185

0.82143

0.77778

0.76923

0.88462

0.85185

0.96154

1- Ancho Testigo calera, 2- Ancho Tres venas Villista 1, 3- Ancho Dos venas Villista 2,
4- Mirasol 2 venas INIFAP, 5- Mirasol Don Luis, SLP, 6- Mirasol Don Ramn, SLP.

Mediante la similitud de Jaccard (1908), se gener un dendrograma que agrupa a las

variedades utilizando el mtodo de anlisis UPGMA (Unweighted Pair Group Method
using Arithmetic averages) (Sneath y Sokal, 1973), que dividi a las 6 variedades de C.
annuum en 2 grupos principales con los cdigos (A) y (B) en la figura 11. El grupo (B) se
40

conforma de las variedades criollas de calidad, presentando un 36% de robustez en el

agrupamiento, el cual se divide en 2 subgrupos con los cdigos (C) y (D) mostrando un
54% y 26% de robustez respectivamente, el primero conformado con las variedades Ancho
Testigo Calera y Ancho Tres venas Villista, y el segundo con Mirasol 2 venas INIFAP y
Ancho Dos venas Villista 2. El grupo (A) posee la rama ms fuerte, con un 87%, se
conforma con las variedades de polinizacin libre, las cuales son Mirasol Don Luis, SLP y
Mirasol Don Ramn, SLP (ver figura 11).
A pesar que no se obtuvo una alta variacin gentica entre variedades, en el dendrograma
obtenido se observa que los cebadores OPA utilizados en este estudio lograron agrupar
coherentemente a las variedades diferenciando a variedades de polinizacin libre (P.L)
grupo (A), y a las variedades criollas de calidad grupo (B), denotando variabilidad entre
materiales debido a su nivel tecnolgico, que implica la capacidad de identificar a base de
RAPD los materiales con mayor uniformidad gentica, debida a su proceso de seleccin y
mejoramiento, el subgrupo (D), de variedades criollas con la caracterstica dos venas se
agrupo a pesar de pertenecer a diferentes tipos, una perteneciente al tipo mirasol y la otra a
tipo ancho, esta agrupacin resulta interesante, ya que comparten el mismo carcter
morfolgico (dos venas), tomando en cuenta que est se utiliza como una caracterstica para
lograr uniformidad al llevar a cabo la seleccin de criollos de calidad, el proceder de un
origen de seleccin parecido puede ser motivo de la similitud presente entre este grupo,
aunque el hecho de que la variedad mirasol no se agrupara con las variedades de su mismo
tipo se puede deber a que estas son de polinizacin libre, y provienen de la autofecundacin
controlada de un solo progenitor con alta pureza gentica, con subsiguientes selecciones,
que derivan de una alta homologa entre las mismas. Por ltimo el subgrupo (C), con
Ancho Testigo calera y Ancho Tres venas villista, la primera no paso por el proceso de
seleccin de lculos o venas, esta fue la agrupacin con el segundo nivel de ms alto
similitud con un coeficiente de 0.91304 (tabla 6). Todas estas agrupaciones denotan alta
similitud gentica en la secuencia de estas variedades, reflejada en la poca variabilidad
obtenida,

pero se logran diferenciar, corroborando que estos marcadores moleculares

poseen potencial en el anlisis molecular de C. annuum.

41

Tabla 8. Abreviaciones utilizadas para las variedades de C. annuum en el dendrograma

resultante de las distancias genticas obtenidas entre estas mismas.
Abreviacin

Nombre completo

C. annuum - ATC

Ancho Testigo Calera

C. annuum - AV3V1

Ancho 3 venas Villista1

C. annuum - AV2V2

Ancho 2 venas Villista2

C. annuum MV2I

Mirasol 2 venas INIFAP

C. annuum - MDLSLP

Mirasol Don Luis, SLP

C. annuum - MDRSLP

Mirasol Don Ramn, SLP

Figura 11. Dendrograma resultante de las distancias genticas entre los genotipos de C.
annuum estudiados. Obtenidas por el anlisis RAPDs utilizando el ndice de similitud de
Jaccard (1908), y el mtodo de agrupamiento UPGMA. El nmero en los nodos,
corresponden al valor de robustez de los datos (Bootstrap) que soporta a la rama del rbol
despus de 5000 rplicas.
42

VIII. CONCLUSIONES
El anlisis RAPD, mostr variacin gentica entre las variedades utilizadas de C. annuum,
y las agrupaciones generadas en el dendrograma identifican a los materiales de acuerdo a su
nivel tecnolgico (criollo o polinizacin libre), todos los cebadores empleados generaron
bandas, siendo el OPA 02 el ms polimrfico y el OPA 20 el que ms fragmentos gener.
La amplificacin de las muestras con tubulina antes de la amplificacin RAPD, es un
buen mtodo de control, para garantizar que el ADN se encuentre en condiciones adecuadas
para ser amplificado.

43

IX. LITERATURA CITADA

Aguilar, H. R. y Esparza, F. G. (2010). Situacin y perspectivas de la produccin de chile
seco en Zacatecas [Versin electrnica], Revista de Geografa Agrcola, estudios
relacionados de la agricultura mexicana, No. 45/19.

Baltazar, B. (1997). Diversidad gentica del cultivo del chile (Capsicum spp.) determinada
por isoenzimas y RFLPs tipos: serrano, jalapeo, manzano y silvestre en su rea de
distribucin, (p. 26). Mxico. : Comisin Nacional para el Conocimiento y Uso de la
Biodiversidad (CONABIO), proyecto No. G026. Mxico.

Bhadragoudar, M. & Chandrasherkhar, P. (2011). Assessment of genetic diversity among

Capsicum annuum L. genotupes using RAPD markers. African Journal of Biotechnology,
10 (76), 17477-17483.

Bravo L. A., Cabaas, B. B., Mena, C. J., Velsquez, V. R., Rubio, D. S., Mojarro, D. F. &
Medina, G. G. (2002). Gua para la produccin de chile seco en el Altiplano de Zacatecas.
(Publicacin Tcnica Nm. 1, p. 2).Secretara de Agricultura, Ganadera, Desarrollo Rural,
Pesca y Alimentacin (SARPA), Instituto Nacional de Investigaciones Forestales,
Agrcolas y Pecuarias (INIFAP),
Campo Experimental Zacatecas. Calera de V. R., Zac., Mxico.

Bravo, L. A., Galindo, G. G. y Amador, R. M. (2006). Tecnologa de produccin de chile

seco. Zacatecas, Mxico. : Instituto Nacional de Investigacin Forestal, Agrcolas y
Pecuarias.

Bravo, L. A., Lara, H. A., Lozano, G. J. & Espaa, L. M. (2010). Importancia del cultivo
del chile. Primer foro para productores de chile (pp. 10-22). Zacatecas, Mxico. : Consejo
Estatal de Productores de Chile.

44

CONABIO. (2015). Capsicum annuum annuum. Recuperado el 3 septiembre, 2015:

http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/bioseguridad/pdf/21864_sg7.pdf

Delgado, A. A. (2006). Uso de marcadores moleculares en plantas; aplicaciones en frutales

del trpico. Agronoma mesoamericana, 17 (2), 221-242.

Eshbaugh, W. H. (1975). Genetic and biochemical systematic studies of chili peppers

(Capsicum-Solanacea). Bulletin of the Torrey Botanical Club, 102, 396-403.

Espinosa, A. L. (2007). Gua prctica sobre la tcnica de PCR. Eguarte, L. E., Souza, V. &
Aguirre, X. (comps.). Ecologa molecular. (pp. 517-536). Distrito Federal, Mxico. :
Secretara de medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT), Instituto Nacional de
Ecologa (INE), Universidad Nacional Autnoma de Mxico (UNAM) y Comisin
Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO).

Farinango, C. D. (2007). Caracterizacin molecular de la coleccin de ajies (Capsicum

spp.) y calabazas (Cucurbita spp.) del banco de germoplasma del Instituto Nacional
Autnomo de Investigacin Agropecuaria (INIAP). Tesis de ingeniera no publicada,
Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Ibarra, Ecuador.

Felsenstein, J. (1985). Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap.

Evolution. 39,783-791.

Ferreira, M. & Grattapaglia, D. (1998). Introduccin al uso de Marcadores Moleculares en

el anlisis gentico. Brasilia DF. : EMBRAPA

Fristch, P., Hanson, M. A., Spore, C. D., Pack, P. E. & Riseberg, L. H. (1993). Constancy
of RAPD primer amplification strength among distantly related taxa of flowering plants.
Plant Mol. Boil. Res., 11, 10-20.

45

Gonzlez, I., Arias, Y., Quiones, M., Miranda, I., Rodrguez, Y. & Peteira, B. (2011).
Variabilidad molecular de genotipos de pimiento (Capsicum annuum L.) del programa de
mejoramiento gentico para la resistencia a PVY. Proteccin Vegetal, 26 (2), 69-72.

Hampl, V., Pavlcek, K. y Flegr J. (2001). Construction and bootstrap analysis of ADN
fingerprinting-based phylogenetic tres with the freeware program Free Tree: application to
trichomonad parasites. International journal of systematic and evolutionary microbiology,
51, 731-73.

Hernndez-Verdugo, S., Gonzlez, A., Snchez, P., Casas, A. & Oyama, K. (2006).
Estructura y diferenciacin gentica de poblaciones silvestres y domesticadas de chile del
noreste de Mxico analizadas con isoenzimas y RAPDs. Fitotecnia Mexicana, 29, 25-29.

Hernndez-Verdugo, S. Luna-Reyes, R. & Oyama, K. (2001). Genetic structure and

differentiation of wild and domesticated populations of Capsicum annuum from Mexico.
Plant Systematics and Evolution, 226, 129-142.

IPGRI (1995) Descriptores para Capsicum (Capsicum spp.), (p.51). International Plant
Genetic Resources Institute. Roma, Italia. Centro Asitico para el Desarrollo y la
Investigacin relativos a los Vegetales, Taipei, Taiwn y Centro Agronmico Tropical de
Investigacin y Enseanza, Turrialba, Costa Rica.

Jaccard, P. (1908). Nouvelles recherches sur la distribution florale. Bulletin de la Socit

Vaudoise des Sciences Naturelles, 44, 223-270.

Jensen, R. M. , McLeod, M. J., Eshbaugh, W. H. & Guttman, S. I. (1979). Numerical

taxonomy analysis of allozymic variation in Capsicum (Solanaceae). Taxon, 28, 315-327.

Karp, A. & Edwards, K. J. (1997). DNA markers a global overview. In: G. CaetanoAnolles and P.M. Gresshoff, (eds DNA Markers Protocols , Application and Overviews).
Wiley, New York. pp. 1-13.
46

Khlers

medizinal-pflanzen

(1887).

Recuperado

el

15

de

septiembre,

2015:

https://es.wikipedia.org/wiki/K%C3%B6hler%27s_MedizinalPflanzen#/media/File:Capsicu
m_annuum_-_K%C3%B6hler%E2%80%93s_Medizinal-Pflanzen-027.jpg

Lefebvre, V., Goffinet, B., Chauvet, J. C., Caromel, B., Signoret, P., Brand, R. & Palloix,
A. (2001). Evaluation of genetic distances between pepper inbred lines for cultivar
protection purposes: comparison of AFLP, RAPD and phenotypic data. Theoretical and
Applied Genetics, 102, 741-750.

Lefebvre, V., Palloix, A., & Rives, M. (1993). Nuclear RFLPs between pepper cultivars
(Capsicum annuum L.). Euphytica, 71, 189-199.

Lewin, B. (1997). Genes VI. Oxford University Press and Cell Press. Printing in U.S.A.

Luna, R. J. (2010). Variedades de chile y produccin de semilla. Primer foro para

productores de chile (pp. 23-43). Zacatecas, Mxico. : Consejo Estatal de Productores de
Chile.

Lpez-Riquelme, OG. (2003). Chilli: La especia del nuevo mundo. Ciencias (Mx.). 069,
66-75.

Recuperado

el

de

septiembre,

2015:

http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/644/64406912.pdf

Long, T. J. (2009). Los senderos prehispnicos del Capsicum. Recuperado el 26 de agosto,

del 2015, del sitio Web de la Universidad Nacional Autnoma de Mxico:
http://www.historicas.unam.mx/publicaciones/publicadigital/libros/caminosymercados/mer
cados.html

Montes, H. S. (2010). Recopilacin y anlisis de la informacin existente de las especies

del gnero Capsicum que crecen y se cultivan en Mxico. (Proyecto, Informe final, pp. 221). Bajo, Mxico. : Instituto Nacional de Investigacin Forestal, Agrcolas y Pecuarias.

47

Nee, M. (1986). Flora de Veracruz, fascculo 49. Sosa, V. (ed.). Intituto de Ecologia.
Xalapa, Veracruz, Mxico.

Oyama, K., Hernndez-Verdugo, S., Snchez, C., Gonzlez-Rodrguez, A., Snchez-Pea,

P., Garzn-Tiznado, J. A. & Casas, A. (2006). Genetic structure of wild and domesticated
populations of Capsicum annuum (Solanaceae) from northwestern Mexico analized by
RAPDs. Genetic Resources and Crop Evolution, 53, 553-562.

Pacheco-Olvera, A., Hernndez-Verdugo. S., Rocha-Ramrez, V., Gonzlez-Rodrguez, A.

& Oyama, K. (2012). Genetic diversity and structure of pepper (Capsicum annuum L.)
from northwestern Mexico analyzed by microsatellite markers. Crop Science, 52, 231-241.

Pardey, R. C. (2008). Caracterizacin y evaluacin de accesiones de Capsicum del banco

de germoplasma de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira y determinacin
del modo de herencia de la resistencia a potyvirus (PeepDMV). Tesis de doctorado no
publicada, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia,
Palmira, Colombia.

Prez, C. L., Castan, N.G., Ramrez, M. M. & Mayek, P. N. (2015). Avances y

perspectivas sobre el estudio del origen y la diversidad gentica de Capsicum spp.
Ecosistemas y recursos agropecuarios, 2 (4), 117-128.

Prez, V. M. (s. f.). Marcadores moleculares, variabilidad gentica y evolucin. (pp. 247267). III Simposio Cientfico en Biologa Celular y Molecular.

Phillips-Mora, W., Rodrguez, R. H. & Fritz, P. (1995). Marcadores de ADN: Teora,

aplicaciones y protocolos de trabajo. Con ejemplos de investigaciones en cacao
(Theobroma cacao), (Serie tcnica. Informe tcnico no. 252, p. 183). Unidad de
Biotecnolig, Turrialba, Costa Rica. : CATIE

48

Pickersgill, B., Charles, B. & Heiser, Jr. (1977). Origins and Distribution of Plants
Domesticated in the New World Tropics. Origins of Agriculture. Charles A. Reed, ed., The
Hague-Paris, Mouton Publishers, p. 803-835.

Pickersgill, B., Heiser Jr. & McNeill, J. (1979). Numerical Taxonomic Studies on Variation
and Domestication in Some Species of Capsicum. Linnean Society Symposium Series. 7,
679-700.
Pickergsill, B. (1980a). Some aspects of interspecific hybridization in Capsicum (pp. 2-6).
IV Eucarpia Capsicum meeting Wageningen.

Pickersgill, B. (1969b). The archeological record of chili peppers (Capsicum spp.) and the
secuence of the domestication in Peru. America Antiquity. 34:54-61.

Pickersgill, B. (1969). The domestication of chili peppers. En: Ucko P.J. y Dimbley G.W.
Eds. The domestication and exploration of plants and animals. Duckwor, London, pp. 443450.

Rentara, A. M. (2007). Breve revisin de los marcadores moleculares. Eguarte, L. E.,

Souza, V. & Aguirre, X. (comps.). Ecologa molecular. (pp. 541-556). Distrito Federal,
Mxico. : Secretara de medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT), Instituto
Nacional de Ecologa (INE), Universidad Nacional Autnoma de Mxico (UNAM) y
Comisin Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO).

Reveles, H. M., Velsquez, V. R., Reveles, T. L. & Mena, C. J. (2013). Seleccin y

conservacin de semilla de chile: primer paso para una buena cosecha. (Disponible por el
Instituto Nacional de Investigacin Forestal, Agrcola y Pecuaria [INIFAP], Centro de
Investigacin Regional Norte Centro Campo Experimental Zacatecas, Calera de V. R., Zac.
Folleto tcnico nm. 51, ISBN: 978-607-37-0139-6).

49

Rocha, M. M., Gonzlez, G. A. & Aguirre, D. X. (s. f.). ADN Polimrfico Amplificado al
Azar (RAPD) y regiones intermedias entre secuencias simples repetidas. Herramientas
moleculares aplicadas en ecologa. pp. 101-127.

Salazar, L., & Silva, C. (2004). Efectos farmacolgicos de la Capsicaina, el principio

pungente del chile. Biologa Scripta. 1 (1), 7-14.

Sneath, H. A. & Sokal, R. R. (1973). Numerical taxonomy. The principles and practice of
numerical classification. San Francisco, California, E.U.A.: W. H. Freeman and Company.
Sistema de Informacin de Organismos Vivos Modificados (SIOVM) Proyecto GEFCIBIOGEM de Bioseguridad. CONABIO (s. f.). Recuperado el 30 de agosto, 2015:
www.conabio.gob.mx/conocimiento/bioseguridad/pdf/21864_sg7.pdf

Tamay, D. L., Ibarra, C. & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reaccin en cadena

de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigacin en Discapacidad. 2 (2),
70-78.
Tanksley, S. 1983. Molecular markers in plant breeding. Plant Molecular Biology Reporter
1:3-8.

Williams J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A. &. Tingey, S. V. (1990).
DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic
Acids Research 18, 6531-6535.

Yaguachi, B. & Medina, D. (2003). Diversidad gentica y filogenia de los gneros Carica y
Vasconcellea del Sur del Ecuador. Tesis de Ingeniera, Universidad Nacional de Loja,
Ecuador.
Pozo O, Montes, S. & Redondo, E. (1991). Chile (Capsicum spp.). Ortega P. R.; Palomino
G., Castillo F., Gonzlez, V. A. & Livera, M. (Eds.) Avances en el Estudio de los Recursos
Fitogenticos en Mxico. (pp. 217-238). Chapingo, Mxico. : SOMEFI

50

X. ANEXO 1
Clculo y determinacin del tamao de las bandas.
PCR Cebador OPA 02
Lnea de regresin con el marcador DirectLoad TM Wide Range DNA Marker

Distancia
(mm)

Log pb

10000

31.4
34.7
37.7
45.3
53.5
56.2
68.7
80.9
98.1
107.4
118.9
132.8

4
3.6020
3.4771
3.3010
3.1903
3.1461
3
2.8750
2.6989
2.6020
2.4771
2.3010

4000
3000
2000
1550
1400
1000
750
500
400
300
200

Recta de regresin con DirectLoad Wide

Range DNA Marker
5
4

Ln pb

Tamao
(pb)

3
2

y = -0.0136x + 4.0404
R = 0.9181

0
0

50

100

150

dist mm

Tamao en pares de bases (pb) de las bandas obtenidas con OPA 02

Bandas
obtenidas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Distancia
(mm)
44.9
48.9
53
54.2
57.6
64.8
76
78.3
83.6
89.5
94.8

Tamao
(pb)
2690
2373
2087
2010
1807
1443
1016
945
801
666
564

51

PCR Cebador OPA 11

Lnea de regresin con el marcador DirectLoad TM Wide Range DNA Marker
Distancia
(mm)

Log pb

10000

25.8
28.4
30.7
37
44.6
46.6
58.8
71.1
89.6
99.2
111.1
125.9

4
3.6020
3.4771
3.3010
3.1903
3.1461
3
2.8750
2.6989
2.6020
2.4771
2.3010

4000
3000
2000
1550
1400
1000
750
500
400
300
200

Recta de regresin con DirectLoad Wide

Range DNA Marker
5
4

Ln pb

Tamao
(pb)

3
2
y = -0.0171x + 4.1432
R = 0.9094

1
0
0

20

40

60

80

100

dist mm

Tamao en pares de bases (pb) de las bandas obtenidas con OPA 11

Bandas
obtenidas
1
2
3
4
5
6
7
8

Distancia
(mm)
40.3
61.1
69.7
73.2
76.7
80.2
98.2
106.4

Tamao
(pb)
2845
1254
894
779
679
591
291
211

52

120

PCR Cebador OPA 20

Lnea de regresin con el marcador DirectLoadTM Wide Range DNA Marker
Distancia
(mm)

Log pb

10000

25.8
28.4
30.7
37
44.6
46.6
58.8
71.1
89.6
99.2
111.1
125.9

4
3.6020
3.4771
3.3010
3.1903
3.1461
3
2.8750
2.6989
2.6020
2.4771
2.3010

4000
3000
2000
1550
1400
1000
750
500
400
300
200

Recta de regresin con DirectLoad Wide

Range DNA Marker
5
4

Ln bp

Tamao
(pb)

3
2
y = -0.0136x + 3.9273
R = 0.8998

1
0
0

50

100

150

dist mm

Tamao en pares de bases (pb) de las bandas obtenidas con OPA 20

Bandas
obtenidas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Distancia
(mm)
37.3
39.3
42.3
47.9
54.9
60.8
66.8
71.7
75.8
79.7
85.9

Tamao
(pb)
2630
2471
2249
1887
1516
1260
1044
896
788
697
574

53

XI. ANEXO 2
Matriz de Resultados.

Muestras

C. annuum C. annuum C. annuum C. annuum C. annuum C. annuum

ATC

AV3V1

AV2V2

MV2I

MDLSLP

MDRSLP

OPA02-2690

OPA02-2373

OPA02-2087

OPA02-1807

OPA02-1443

OPA02-1016

OPA02-945

OPA02-801

OPA02-666

OPA02-564

OPA11-2845

OPA11-1254

OPA11-894

OPA11-779

OPA11-679

54

OPA11-591

OPA11-291

OPA11-211

OPA20-2630

OPA20-2471

OPA20-2249

OPA20-1887

OPA20-1516

OPA20-1260

OPA20-1044

OPA20-896

OPA20-788

OPA20-697

OPA20-574

55