Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas

Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences

vol. 40, n. 2, abr./jun., 2004

Avaliao da toxicidade oral subcrnica da bixina para ratos

Ana Rita Pedreira Lapa Bautista1*, Maria Spnola Miranda2, Mrcio Santos Batista3, Eduardo Luiz
Trindade Moreira4, Iracema Moreira da Silva5, Iolanda Cirne Sena Gomes6
1

Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrcola S. A. EBDA,2Departamento de Anlises Bromatolgicas, Faculdade

de Farmcia, Universidade Federal da Bahia, 3Agncia Estadual de Defesa Agropecuria da Bahia ADAB,
4
Laboratrio de Patologia, Escola de Medicina Veterinria, Universidade Federal da Bahia, 5Centro Mdico lvaro
Lemos, Fundao Jos Silveira, 6Laboratrio de Anatomia Patolgica, Fundao Jos Silveira.

*Correspondncia:
A. R. P. L. Bautista
Empresa Baiana de Desenvolvimento
Agrcola S. A. EBDA
CLA/Laboratrio de Toxicologia
Av. Adhemar de Barros, 967. Ondina
40170-110. Salvador, Bahia

A bixina em p (30% de bixina), proveniente das sementes de

urucum (Bixa orellana L.), foi administrada, por gavagem, a ratos
Wistar, 10 animais de cada sexo, na concentrao de 0,010,006%
de bixina/dia, em leo de milho, cinco dias por semana, durante
13 semanas, com o objetivo de verificar a toxicidade da substnciateste para essa espcie animal. A grupos controle (10 animais por
sexo), foi administrado leo de milho, para comparao. Durante
o perodo de exposio, foram registrados o peso absoluto
corpreo, o ganho de peso, o consumo de rao e a eficincia
alimentar, bem como realizadas as avaliaes clnica e
oftalmoscpica. Antes da eutansia, os animais foram anestesiados
(ter etlico) e submetidos a exames hematolgicos de rotina e
bioqumicos (glicose, creatinina, colesterol total, triglicrides,
asparagina transaminase e g-glutamil transaminase). Durante o
exame necroscpico, fgado, rins, bao, adrenais e testculos foram
excisados e pesados. O estudo histolgico foi realizado em amostras
de fgado e rins dos animais expostos e respectivos controles. A
anlise estatstica dos parmetros de peso, hematolgicos e
bioqumicos mostrou algumas diferenas significativas entre os
grupos teste e controle, as quais no parecem estar relacionadas
exposio. No foram observadas alteraes clnicas, comportamentais, necroscpicas e histolgicas. Nas condies do estudo,
a bixina no produziu efeitos txicos nos animais expostos.

Unitermos
Bixina
Bixa orellana L.
Urucum
Toxicidade subcrnica
Carotenides

E-mail: ebda.cla@bahia.ba.gov.br

INTRODUO
O corante obtido do urucum participa com
percentual expressivo, dentre os corantes naturais utilizados em alimentos, em funo de ser constitudo, principalmente, de carotenides como a bixina (lipossolvel), com

grande aplicao nas indstrias de massas, raes animais,

produtos oleosos e, a norbixina (hidrossolvel), em laticnios, embutidos e cereais (Giraldini, 1994).
A substituio crescente dos corantes artificiais por
aqueles de origem natural exige que os dados toxicolgicos disponveis para os estudos de avaliao de risco

230

A. R. P. L. Bautista, M. S. Miranda, M. S. Batista, E. L. T. Moreira, I. M. Silva, I. C. S. Gomes

sade humana e animal sejam to bem conhecidos quanto os dos corantes sintticos, o que nem sempre acontece
(WHO, 2000; Paumgartten, 2000). No caso da bixina,
nem todos os estudos toxicolgicos exigidos para a referida avaliao foram feitos ou, se o foram, necessitam ser
repetidos com a incluso de novos parmetros, como o
caso do estudo subcrnico (WHO, 1982).
A presente avaliao foi realizada com a bixina em p,
produzida comumente pelas indstrias do setor, de forma
padronizada a partir das sementes do urucum e cuja anlise
forneceu o teor de 30% de bixina. Teve como objetivo avaliar os efeitos txicos decorrentes da exposio subcrnica
(90 dias), por via oral, em ratos de ambos os sexos, com
enfoque nos parmetros de peso, alteraes clnicas,
hematolgicas, bioqumicas, necroscpicas e histolgicas.

MATERIAL E MTODOS
A cada semana, em funo da dose e do ajuste das
mdias de peso dos animais de cada subgrupo teste, a bixina
em p, fornecida pela Baculer Agro Industrial Ltda (Lote
1599001), com teor de bixina de 30,03% (min. 27,00%) e
umidade de 1,70% (max. 10,00%), foi misturada com leo
de milho, na proporo de 1:2, agitada periodicamente e
mantida ao abrigo da luz, em frasco de vidro, hermeticamente fechado, temperatura de aproximadamente 22 C.
A estabilidade da bixina no leo de milho foi determinada
a cada nova preparao e aps a ltima exposio semanal,
de acordo com a NBR N18632 (ABNT, 1996).
A bixina no leo de milho foi administrada por
gavagem, cinco dias por semana, durante 13 semanas. O
volume mximo administrado no excedeu a 0,5 mL/100/g
de peso absoluto corpreo. Tomando por base o volume
oferecido por mdia de peso dos animais, foi administrado 0,010,006% de bixina/dia.
A metodologia adotada foi baseada no teste 408
Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Rodents
(adopted: 21st September 1998) (OECD, 1999).
Foram utilizados ratos Wistar albinos (Rattus
norvegicus albinus), de ambos os sexos, procedentes do
biotrio sem barreiras da Fundao Jos Silveira, Salvador, Bahia.
Os 40 animais, 10 por sexo (grupo teste e grupo
controle), com idade inicial de 5/6 semanas (aproximadamente 100 g de peso absoluto corpreo), foram pesados no
primeiro dia da exposio (d0) e distribudos aleatoriamente em subgrupos de cinco, mantidos em gaiolas de
propileno translcido (40x32x16 cm), com tampa de arame zincado e cama de maravalha. Os pesos mdios iniciais, entre os grupos teste e controle, no diferiram estatisticamente.

Os animais foram mantidos sob temperatura

(220,9 C) e umidade (76 5,4%) controladas, fotoperodo de 12 horas claro/escuro. Os animais receberam,
durante o estudo, rao Nuvilab CR-1 e gua filtrada,
ambos ad libitum.
Os procedimentos operacionais seguidos pelo laboratrio foram fundamentados nos Princpios ticos na
Experimentao Animal, recomendados pelo Colgio
Brasileiro de Experimentao Animal e de acordo com a
Associao Americana de Medicina Veterinria (Andrews
et al., 1993).
De acordo com a metodologia adotada e com as atividades de rotina praticadas no Laboratrio, foram realizados os procedimentos que seguem:
1. Pesagem, dos animais e da rao fornecida, a cada 7 dias;
clculos do ganho de peso e do consumo alimentar; aps
o perodo de exposio foram calculados o ganho de peso
total e o ganho de peso, o consumo alimentar e a eficincia alimentar (gramas de peso corpreo ganho para cada
100 g de rao consumida) mdios;
2. Avaliao clnica (modificaes na pele, plos, olhos,
mucosas, alteraes respiratrias, circulatrias e dos
sistemas nervosos central e perifrico) realizada diariamente, exceto nos finais de semana; avaliao de efeitos gerais (Almeida et al., 1983), ou seja, alteraes no
estado consciente e disposio, no sistema motor, no
tono muscular, no sistema nervoso central (tremores,
convulso e sedao) e no sistema nervoso autnomo
(lacrimejamento, salivao, ptose, piloereo e respirao);
3. Exame oftalmoscpico realizado ao final do perodo de
exposio (91 dia);
4. Ao final do perodo experimental (92 dia), os animais
foram anestesiados (ter etlico) e a coleta de sangue
realizada na veia porta-heptica, em animais sob jejum
de aproximadamente 20 horas. Foram realizados os
seguintes exames: contagem de hemceas (Hm), concentrao de hemoglobina (Hb), hematcrito (Ht),
volume globular mdio (VGM), hemoglobina globular
mdia (HGM), concentrao de hemoglobina globular
mdia (CHGM), contagem de plaquetas (Plaq),
leuccitos, segmentados (Seg), linfcitos (Lin),
moncitos (Mono) e eosinfilos (Eos) utilizando
analisador automtico (Coulter Counter T-890 da
Coulter Eletronics, INC., Hialeah, FL); e glicose,
colesterol, triglicrides, asparagina transaminase, gglutamil transaminase e creatinina utilizando
analisador automtico (DADE Dimension AR da
DADE International INC. Newaek, DE 19714, USA);
5. Aps a coleta, procedeu-se eutansia por aprofundamento da anestesia e necrpsia. A avaliao

Avaliao da toxicidade oral subcrnica da bixina para ratos

necroscpica incluiu exames externos do corpo e orifcios e das cavidades craniana, torxica, abdominal e
de seus contedos. Durante a necrpsia, fgado, bao,
rins, adrenais e testculos foram excisados e pesados.
O peso relativo dos rgos foi expresso em percentual
de peso corpreo;
6. Fragmentos de crebro, cerebelo, hipfise, tireide,
pulmo, corao, aorta, glndula salivar, fgado, bao,
adrenais, rins, pncreas, testculo, ovrio, tero, estmago, duodeno, leo, ceco, reto, bexiga, linfonodo
mesentrico, musculatura esqueltica, citico e medula
ssea (fmur) foram fixados e reservados para o caso
de serem observadas alteraes macroscpicas em
animais pertencentes aos subgrupos avaliados em datas diferentes;
7. Estudo histolgico do fgado e rins dos animais dos
grupos teste e controle, considerando o envolvimento
desses rgos no metabolismo e excreo de muitos
xenobiticos. Os fragmentos foram fixados em
formaldedo tamponado (10%), processados, infiltrados e includos em parafina, laminados a 5/6 micra
e corados em hematoxilina-eosina.
O teste de Bartlett foi empregado para testar a
homogeneidade de varincia entre os grupos teste e controle. Empregou-se ANOVA apenas para os dados com
distribuio normal e o teste de Kruskal-Wallis, quando as
varincias diferiram. As diferenas entre grupos foram
verificadas pelos testes t de Student e Mann-Witney. Os
nveis de significncia utilizados foram de P <0,05 e P
<0,01 (WHO, 1991).

RESULTADOS E DISCUSSO
Testes preliminares mostraram que houve estabilidade na preparao da bixina no leo de milho no intervalo de

231

tempo entre a preparao e a ltima exposio semanal.

Embora as mdias de consumo de rao, dos grupos
teste de machos e fmeas, tenham diferido estatisticamente (P <0,01), no foi atribuda importncia biolgica, considerando que as demais variveis de peso no diferiram,
especialmente, a eficincia alimentar (Tabela I).
O grupo teste de machos apresentou mdia de peso
relativo de adrenais significativamente superior (P <0,01),
quando comparada do grupo controle (Tabela II).
Foram observadas diferenas significativas (P <0,05)
em hemceas, hemoglobina e hematcrito do grupo teste de
machos e na concentrao de hemoglobina globular mdia
(P <0,01), do grupo teste de fmeas (Tabela III).
No grupo teste de fmeas, as mdias de AST e glicose
diferiram significativamente (P <0,05) (Tabela IV).
Os exames necroscpicos dos animais dos grupos
teste e controle no revelaram alteraes na mucosa gstrica e nos demais rgos e tecidos examinados. Os dois
bitos em fmeas no foram relacionados a efeitos txicos
e, sim, por trauma durante a introduo da sonda. O estudo microscpico do fgado e rins de animais de ambos os
sexos no revelou alteraes.
As diferenas estatisticamente significativas observadas em alguns parmetros hematolgicos e bioqumicos
no parecem estar associadas a efeito txico, considerando-se que se encontraram dentro das faixas de normalidade para os referidos parmetros do controle histrico do
laboratrio (Tabela V) e aquelas apresentadas por
Harkness e Wagner (1985). As diferenas observadas entre os valores de hemceas, hemoglobina e hematcrito
dos grupos teste de machos, embora muito discretas e
dentro das faixas de normalidade mencionadas, podem
sugerir ao hemoltica, que no pode ser excluda por no
terem sido avaliados reticulcitos e bilirrubina bem como
o transporte de ferro.

TABELA I - Mdias e desvios padro do ganho de peso total (GPt), do ganho de peso (GP), do consumo de rao (CR)
e da eficincia alimentar (EA) mdios, de ratos machos e fmeas expostos, por via oral, concentrao de 0,010,006%
de bixina/dia e respectivos controles
Sexo
Grupos

Machos

Fmeas

Teste

Controle

Teste

Controle

10
228,616,79
17,61,29
794,210,28*
2,20,19

10
222,935,14
17,12,70
771,210,28
2,30,39

08
115,711,00
8,90,84
547,67,16*
1,50,15

10
122,710,68
9,40,82
590,510,82
1,50,14

Parmetros
N
GPt
GP
CR
EA

N = nmero de animais; *P <0,01 comparado ao grupo controle

232

A. R. P. L. Bautista, M. S. Miranda, M. S. Batista, E. L. T. Moreira, I. M. Silva, I. C. S. Gomes

TABELA II - Mdias e desvios padro do peso relativo de rgos de ratos machos e fmeas expostos, por via oral, dose
de 0,010,006% de bixina/dia e respectivos controles
Sexo
Machos
Grupos
Teste
Controle
rgos
N
10
10
Fgado
3,00,11
2,80,17
Rins
0,60,05
0,60,06
Adrenais
0,020,003*
0,010,005
Testculos
0,80,08
0,70,22
Bao
0,20,05
0,10,05
N = nmero de animais; *P <0,01 comparado ao grupo controle

Fmeas
Teste

Controle

08
2,80,15
0,60,03
0,030,007
0,20,00

10
2,70,06
0,60,06
0,030,005
0,20,00

TABELA III - Mdias e desvios padro dos valores hematolgicos de ratos machos e fmeas expostos, por via oral,
concentrao de 0,010,006% de bixina/dia e respectivos controles
Sexo
Machos
Fmeas
Grupos
Teste
Controle
Teste
Controle
Parmetros
N
10
10
08
10
Hm (x106/mm3)
8,50,30*
8,80,39
7,70,38
7,81,06
Hb (g/dL)
16,00,61*
16,70,67
14,60,57
15,90,48
Ht (%)
45,41,67*
47,11,86
41,81,50
44,51,16
VGM (fl)
53,60,73
53,20,52
54,41,06
54,61,00
HGM (pg)
18,12,58
18,90,20
19,90,48
19,50,46
CHGM (g/dL)
35,30,56
35,50,23
35,10,57**
35,80,28
Leu (x103/mm3)
4,90,99
5,40,83
4,50,85
4,10,68
Seg (%)
22,64,97
20,64,97
19,44,66
21,84,49
Lin (%)
73,05,18
75,65,04
75,96,98
73,95,42
Mono (%)
2,71,57
2,61,78
1,20,46
2,11,29
Eos (%)
1,71,57
1,21,32
3,53,29
2,21,40
Plaq(x103/mm3)
1051,063,97
1245,0168,40
1107,980,96
1191,5111,91
N = nmero de animais; * P <0,05; * * P <0,01 comparado ao grupo controle
TABELA IV - Mdias e desvios padro dos valores bioqumicos plasmticos de ratos machos e fmeas expostos, por via
oral, concentrao de 0,010,006% de bixina/dia e respectivos controles
Sexo
Machos
Grupos
Teste
Controle
Parmetros
N
10
10
AST (/L)
43,85,59
47,85,59
Glicose (mg/dL)
71,79,18
75,510,32
Gama GT (/L)
1,80,92
2,01,56
Creatinina (mg/mL)
0,20,06
0,20,08
Colesterol (mg/dL)
40,23,85
42,73,50
Triglicrides (mg/dL)
33,48,34
33,47,12
N = nmero de animais; *P <0,05 comparado ao grupo controle

Fmeas
Teste

Controle

08
39,01,00*
74,714,65*
2,21,16
0,30,10
41,14,45
22,97,47

10
43,42,37
57,613,48
2,81,81
0,30,10
40,26,30
23,011,27

Avaliao da toxicidade oral subcrnica da bixina para ratos

TABELA V - Faixas de normalidade para alguns parmetros do controle histrico (1992-2000)*

Sexo/Parmetros
Faixas de normalidade
MACHOS
Adrenais (%)
0,01 0,04
Hm (x106/mm3)
69
Hb (g/dL)
11 17
Ht (%)
37 49
FMEAS
CHGM (g/dL)
33 37
AST (u/L)
33 77
Glicose (mg/dL)
26 112
*Faixas obtidas a partir das mdias das determinaes de
aproximadamente 300 animais.
O estudo oftalmoscpico dos animais de ambos os
sexos, dos grupos teste e controle, no mostrou alteraes.
Para concluir, observou-se que a exposio bixina em
p, por via oral, na concentrao de 0,010,006% de bixina/
dia, por um perodo de 90 dias, no produziu, em ratos machos e fmeas, alteraes clnicas, de efeitos gerais,
necroscpicas e histolgicas. No foram observadas diferenas significativas entre os grupos teste e controle segundo o
protocolo utilizado. Assim, sob as condies do estudo, a
bixina no produziu efeitos txicos nos animais expostos.

AGRADECIMENTOS

233

transaminase and g-glutamyl transaminase) and

hematological examination was carried out. All the
animals were subjected to a gross-pathological
assessment followed by liver, kidney, adrenals, spleen and
tests weight. A histopathological analysis (liver and
kidney) was performed. From the weight parameters
clinical, clinical chemistry and haematology, necroscopy
and histology viewpoints, it can be said that annatto,
under the chosen test condition, was no toxic to the rat.
UNITERMS: Bixin. Annatto. Bixa orellana L. Subchronic
Toxicity. Carotenoids.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ALMEIDA, R.N.; ALMEIDA, J.A.; LACET, M.A.A.;
THOMAS, G. Triagem farmacolgica de plantas do
nordeste brasileiro. In: SIMPSIO DE PRODUTOS
NATURAIS, 2., 1983. Anais. Joo Pessoa: Universidade
Federal da Paraba, Ed. Universitria, 1983. p.345-356.
ANDREWS E.J.; BENNET B.T.; CLARK J.D. Report on
the AVMA panel on euthanasia. J. Amer. Vet. Med.
Assoc., v. 202, p. 230-247, 1993.
OECD. 408 Repeated dose 90-day oral toxicity study in
rodents. In: OECD Guidelines for testing of chemicals.
Paris: OECD, 1999. p.1-10.

Baculer Agroindustrial Ltda, pela amostra de

bixina em p utilizada no estudo. Ao Ncleo de Corantes
Naturais da Universidade Federal de Viosa, Minas Gerais, e Fundao Jos Silveira, pelo suporte financeiro
para a realizao dos exames hematolgicos, bioqumicos
e preparao das lminas para o estudo microscpico.

GHIRALDINI, E. Corantes naturais mais comumente

utilizados na indstria de alimentos. Rev. Bras. Cor. Nat.,
v.2, n.1, p.83-87, 1994.

ABSTRACT

PAUMGARTTEN, F.J.R. Toxicologia de corantes naturais.

In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CORANTES
NATURAIS, 4., 2000. Anais. Joo Pessoa: Sociedade
Brasileira de Corantes Naturais, 2000. p.25.

Oral toxicity assessment of annatto in rats

The aim of the investigation was to determine the possible
health hazards of bixin (30%) from annatto (Bixa orellana
L.) origin to rats. A concentration of 0.010.006%/day of
bixin in corn oil was administered to 20 Wistar rats (10
per sex), through the oral route (gavage) over a period of
13 weeks. A group of untreated animal (10 per sex) acting
as a control (corn oil) was used for comparision. Body
weight, body weight gain, feed consumption and feed
efficiency were determined. The health of the animals was
checked. At the end of the study a biochemistry (glucose,
creatinine, total cholesterol, triglyceride, asparagine

HARKNESS, J.E.; WAGNER, J.E. Biologia e clnica de

coelhos e roedores. So Paulo: Roca, 1985. 230 p.

WHO. International Programme on Chemical Safety-IPCS

(Switzerland). Toxicological evaluation of certain food
additives. Geneva, 1982. 355 p.
WHO. Safety evaluation of certain food additives and
contaminants. Evaluation of natural assessments of
intake of annatto extracts (bixin). Geneve, 2000. n.44, p.
485-492 (Food Additive Series).
Recebido para publicao em 02 de dezembro de 2002.