INTRODUCCION

La cromatografa, es la tcnica de anlisis qumico utilizada para separar sustancias puras de

mezclas complejas.
Actualmente cromatografa es el nombre que se le da a un grupo de tcnicas utilizadas en la
determinacin de la identidad de sustancias, en la separacin de componentes de las
mezclas y en la purificacin de compuestos. Esta tcnica es muy efectiva y por lo tanto se
utiliza tanto a nivel de investigacin como a nivel industrial.
Este mtodo puede variar de tcnica en tcnica, pero siempre se basa en el mismo principio:
Todos los sistemas de cromatografa contienen una fase estacionaria y una fase mvil.
Se clasifican en:
Cromatografa plana.- La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un
papel. Las principales tcnicas son:
Cromatografa en papel.
Cromatografa en capa fina
Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el
fluido empleado como fase mvil se distinguen:
Cromatografa de lquidos.
Cromatografa de gases .
Cromatografa de fluidos supercrticos.
La cromatografa de gases.- es til para gases o para compuestos relativamente voltiles,
lo que incluye a numerosos compuestos orgnicos.
Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta resolucin.

OBJETIVOS

Conocer la cromatografa como una tcnica de separacin de mezclas de sustancias,

sus caractersticas y sus factores que en ella intervienen,
Estudiar la incidencia del coeficiente de reparto entre la fase mvil y la fase
estacionaria.
Analizar la influencia del solvente en la separacin cromatografa.
Dar a conocer como obtuvimos los colores naturales de las sustancias.
Observar distintas reacciones ya que los disolventes tiene diferentes acciones.

DESARROLLO DEL TEMA.

Qu es la Cromatografa?
Es la tcnica para separar componentes de una mezcla, y su posterior anlisis, basadas en
que las distintas sustancias que forman los componentes de una mezcla se dejan arrastrar a
diferentes velocidades sobre un soporte. El soporte puede ser papel, un gas, otro lquido, etc.
Es un mtodo fsico de separacin de componentes.
Para qu se utiliza la Cromatografa?
La cromatografa se utiliza para lograr la separacin de los componentes de una mezcla
como para medir la proporcin de cada elemento en la mezcla.
FASES DE LA CROMATOGRAFA:
LA FASE ESTACIONARIA.- Consiste en partculas, generalmente slidas, pequeas y

con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo

superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de

capa. En ocasiones es necesario un tratamiento qumico de la fase estacionaria para
conseguir unas partculas de tamao y poro adecuados.

FASE LIGADA.-Una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las

partculas de soporte o a la pared interior de la columna. (Lugar donde se produce la

separacin).
FASE MVIL.- Fluido que se filtra a travs o a lo largo del lecho estacionario, en una

direccin definida. Puede ser un lquido (Cromatografa Lquida), un gas (Cromatografa

de Gases) o un fluido supercrtico (Cromatografa con Fluido Supercrtico). En la
cromatografa de gases se uede usar la expresin Gas Portador para la fase mvil. En
la cromatografa de elucin se usa tambin para la fase mvil la expresin Eluyente.
FLUIR.- Proceso en el que la fase mvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria

transportando los componentes a separar. El proceso de elucin se puede detener

mientras todos los componentes de la muestra estn an en el lecho cromatogrfico, o
continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se prefiere el trmino "Eluir" a
"Desarrollar", trmino usado en nomenclaturas anteriores de cromatografa plana.
EFLUENTE.- La fase mvil que abandona la columna.

MUESTRA.- Mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya separacin se

pretende en el lecho cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos por la fase mvil.

Componentes de la Muestra. Los constituyentes qumicamente puros de la muestra.
Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos
parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se
aceptan tambin los trminos Eluito y Analito para un componente de la muestra.
SOLUTO.- termino que se refiere a los componentes de la muestra en la cromatografa
de reparto.
DISOLVENTE.- termino que en ocasiones se refiere a la fase estacionaria liquida en la

cromatografa de reparto.
Nota: en la cromatografa liquida, el trmino disolvente se ha usado a menudo para la fase
mvil. Este uso no se recomienda.

ZONA.- Regin del lecho cromatogrfico donde se localizan uno o ms componentes

de la muestra. Se puede usar para ello tambin el termino banda.

CROMATGRAMA.- Una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un

detector, la concentracin de un analito en el efluente u otra magnitud usada como

medida de la concentracin en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo.

En la cromatografa plana, "cromatgrama" puede referirse al papel o capa con las
zonas separadas.

CROMATOGRAFIAR.- separar por cromatografa.

CROMATGRAFO.- El instrumento empleado para realizar una separacin

cromatogrfica.

TIPOS DE CROMATOGRAFA
Existen diferentes criterios de clasificacin de la cromatografa:
Por la naturaleza de sus fases:
Cromatografa lquido - lquido
Cromatografa gas - lquido
Cromatografa lquido -. slido
Cromatografa gas - slido

Atendiendo al proceso qumico-fsico que va a protagonizar el proceso

de separacin:
Siendo este el criterio ms coherente de clasificacin:

Cromatografa de Adsorcin (lquido - slido o cromatografa de fases

normales).
Cromatografa de Reparto (o lquido - lquido), se basa en las
caractersticas de solubilidad relativa de los solutos entre la fase mvil y
una fase estacionaria de un lquido no polar. La fase lquida se impregna a
un soporte inerte de slice o, en el caso de cromatografa de fase
invertida, se une qumicamente.
Cromatografa de Intercambio inico.
Cromatografa de Exclusin.
Con base en la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase
estacionaria:
Cromatografa plana:
Cromatografa en papel
Cromatografa en capa fina (TLC)
Cromatografa en columna:
Cromatografa de gases (GC)
Cromatografa lquida (LC), pueden ser:
-

cromatografa lquido lquido.

cromatografa slido lquido.

CLASIFICACION DE LAS TECNICAS CROMATOGRAFICAS:

1. DE ACUERDO CON LA FORMA DEL LECHO CROMATOGRFICO:

CROMATOGRAFIA PLANA:
Se realiza sobre papel u otro material slido. Suele llamarse en capa fina o en capa delgada
porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rgido.
CROMATOGRAFIA EN PAPEL:
La cromatografa en papel es una tcnica ampliamente
laboratorio debido a su bajo costo y la rapidez del anlisis.

utilizada en el

Se realiza colocando el pimento sobre una hoja de papel de

posteriormente este se coloca en un disolvente
un disolvente fcil de vaporar).

filtro
y
(generalmente

El resultado del anlisis ser una separacin de colores

identificar los componentes de la sustancia en caso de que
deben utilizarse tcnicas de revelado.

donde se puede
esto no ocurra

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA.

La tcnica es similar a la cromatografa en papel, a
excepcin que
en este caso el anlisis se realizara en una placa de plstico, aluminio o vidrio cubierta de una capa
de sustancia absorbente como almina o gel de slice.

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA.
La cromatografa en columna es quizs
el
mtodo
ms general utilizado para la separacin, a la vez que para la purificacin, de diferentes compuestos
orgnicos que se encuentren en estado slido o liquido.
Tcnica de separacin en la que el lecho estacionario esta contenido dentro de un tubo.

Las partculas de fase estacionaria solida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria liquida
pueden llenar por completo el tubo (columna empaquetadora) o estar concentradas sobre o a lo
largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no restringida, para el paso de la fase mvil por
el centro del tubo (columna tubular abierta).

2. DE ACUERDO CON EL ESTADO FSICO DE LAS FASES:

CROMATOGRAFIA DE GASES.
Para esta tcnica se utiliza un cromatgrafo de gases el cual volatiliza e inyecta los gases dentro de
una columna.
La fase mvil est formada por gas inerte.
Existen dos tipos; de gas solido y gas liquido.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA.
En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que
contiene a la fase fija. La separacin cromatografa en HPLC es el resultado de las interacciones
especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y estacionaria.
A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento, no
est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra.
Cromatografa lquida de alta presin o de alta eficacia (cuando se emplean partculas de fase
estacionaria muy pequeas y una presin de entrada relativamente alta).

3. De acuerdo con el mecanismo de separacin:

CROMATOGRAFIA DE ADSORCION.
(Atencin: es adsorcin, no absorcin).

La separacin se basa principalmente en la diferente afinidad en trminos de adsorcin de

los componentes de la muestra sobre la superficie de un slido activo.
La fuerza con que es adsorbido un componente depende de las interacciones (tipo y
magnitud) existentes entre, o bien, el componente y la fase estacionaria, o el componente y
la fase mvil, es decir de la polaridad de los componentes, de la actividad del absorbente
(fase estacionaria) y de la polaridad de la fase mvil.
La cromatografa de adsorcin, es una tcnica particularmente til para separar compuestos
de polaridad baja o media. La separacin de compuestos muy polares mediante
cromatografa de adsorcin requiere, debido a la gran retencin que ofrecen, la utilizacin de

adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos qumicos previos a fin de reducir su
polaridad.

CROMATOGRAFIA DE REPARTO.
Donde la separacin se basa en las diferentes
solubilidades de los componentes que conforman la
mezcla en las distintas fases estacionarias, y mviles,
que en este caso, son ambas lquidas. Cuando la fase estacionaria es menos polar que la fase mvil,
esta se llamar cromatografa en fase inversa.
Ejemplos: en cromatografa plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados a la celulosa (papel) o al
soporte slido que forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra de diatomeas, gel de
slice, celulosa en polvo.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.

La fase estacionaria es un slido que tiene anclados distintos grupos funcionales fijos ionizables,
cuyas cargas se encuentran contrabalanceadas por distintos iones mviles que pueden ser
intercambiados por los iones presentes en la fase mvil.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION.
Tambin se llama de exclusin molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamao, forma
o carga entre las molculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo ms habitual es
aprovechar las diferencias de forma y tamao. En este caso, se la llama tambin cromatografa
de exclusin por tamao, de filtracin en gel, de permeacin en gel o de tamiz molecular.
Esquema de la separacin de molculas de distinto tamao durante una cromatografa de exclusin.

Ejemplos: para la separacin de

protenas y polisacridos
se usan como F.E. polmeros lineales entrecruzados (es decir, que forman enlaces transversales). Los
ms comunes son dextranos (marca comercial: Sephadex), agarosa (Sepharosa y Biogel A) y
poliacrilamida (Biogel P). Estos materiales, en forma de pequeas esferas, se expanden o hinchan al
sumergirlos en disoluciones acuosas, generando un retculo o matriz tridimensional, con poros de
tamao definido.
Aplicaciones:

Para la purificacin de una protena (al igual que otras tcnicas cromatografas).

Se puede establecer una correlacin entre el tamao molecular y la movilidad en la columna

de exclusin, por lo que esta tcnica se emplea para determinar masas moleculares.

Para eliminar sustancias de pequeo tamao molecular de una muestra proteica (ejemplo, las
sales inorgnicas en un desalado de la muestra, eliminacin del exceso de reactivos tras
tratar una protena en el laboratorio, eliminacin de inhibidores enzimticos). El resultado es
similar a una dilisis, pero ms rpido.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD.
Variedad particular de cromatografa en la que la separacin se basa en la especificidad biolgica
singular de interaccin entre un componente de la muestra y otra molcula unida a la F.E.; los
ejemplos ms comunes son las interacciones enzima-sustrato, antgeno-anticuerpo y ligandoreceptor.
F.E.: un soporte inerte (micro esferas de vidrio o plstico, gel de agarosa) al que se une
covalentemente el ligando de afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor de
una enzima, anticuerpo, antgeno, heptano, sustancia transportada, hormona, oligosacridos,
lectinas (protenas con afinidad por oligosacridos).

CROMATOGRAFIA BIDIMENCIONAL.
Es una variante de considerable poder de separacin, ya que se emplean dos diferentes solventes
aplicados secuencialmente para desplazar un solo compuesto.
La gota del compuesto (generalmente un aminocido o un pptido) se revela como una mancha en
papel. Y el material revelador es usualmente ninhidrina o permanganato de potasio.

4. Mtodos de anlisis:
CROMATOGRAFIA DE ELUCION:
Procedimiento en el que la fase mvil pasa de forma continua a travs o a lo largo del lecho
cromatogrfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequea
cantidad en un tiempo breve. Esta tcnica presenta la desventaja de que los componentes con
retenciones muy altas puedan no ser observados.

CROMATOGRAFIA FRONTAL:
Procedimiento en el que la muestra
( liquida o gaseosa) se alimenta de
forma continua al lecho
cromatografico. No se utiliza
ninguna fase mvil adicional. Se
utiliza la diferencia de afinidad del
adsorbente por cada una de las
sustancias a preparar. Se utiliza una
pequea columna, que se satura sucesivamente por cada una de las
sustancias a separar, emergiendo de ella el primer componente puro
hasta que la columna se satura del segundo componente, momento
en el que empezara a emerger este mezclado con el primero. El
anlisis frontal tiene su principal aplicacin como tcnica
preparativa en la purificacin de sustancias.

CROMATOGRAFIA POR DESPLAZAMIENTO:

Procedimiento en el cual la fase mvil
compuesto (el desplazante) que es
fuertemente que el resto de los
muestra analizada. La muestra se
discreta, como una pequea cantidad en
Este mtodo se utiliza tanto para
analticas como preparativas, siendo muy
cromatografa de cambio inico.

Etapas en la realizacin de una cromatografa.

CROMATOGRAFA EN COLUMNA:
1.- Preparacin del soporte y fase estacionaria.
1.1.- Equilibrado de la columna.
2.- Aplicacin de la muestra.
3.- Elucin:

contiene un
retenido ms
componentes de la
alimenta en forma
un intervalo breve.
separaciones
utilizada en

a) Lavado de componentes no retenidos.

b) Liberacin, desplazamiento o elucin propiamente dicha de los componentes retenidos.
4.- Recoleccin de fracciones o anlisis del efluente en continuo.
5.- Anlisis, cuantificacin o revelado.
6.- Regeneracin de la fase estacionaria.

CROMATOGRAFA PLANA (PAPEL O CAPA FINA):

1.- Preparacin del soporte y fase estacionaria.

2.Secado.

Aplicacin

de

la

muestra.

3.- Desarrollo de la cromatografa.

4.- Secado de la placa.
5.- Revelado y cuantificacin en su caso.

RECOGIDA DEL EFLUENTE:

El efluente de una columna se suele recoger en
porciones o fracciones, comnmente con la ayuda
mecnico llamado colector de fracciones.

forma de pequeas
de un dispositivo

Esquema de un colector de fracciones. En cada tubo cae un nmero determinado de gotas o un

cierto volumen. A continuacin el soporte gira, de modo que el tubo siguiente queda colocado bajo la
salida del efluente. Las gotas se detectan mediante una clula fotoelctrica; cada gota interrumpe el
haz de luz y as se cuenta.

PAPEL DE LA CROMATOGRAFA COMO MTODO ANALTICO DE REFERENCIA EN EL

LABORATORIO

INTRODUCCION

La cromatografa es una tcnica analtica muy especfica en la que una mezcla de componentes es
separada aprovechando la reparticin diferencial de los mismos entre dos fases: una mvil y otra
estacionaria. La fase mvil puede ser un gas o un lquido, mientras que la fase estacionaria, est
constituida por un slido o un lquido (unido a una base slida). Tras su separacin, los distintos
analitos se pueden identificar mediante un revelado en el caso de la cromatografa en capa fina o
bien mediante un detector acoplado a la salida de los sistemas cromatogrfico lquidos o gaseosos.

CROMATOGRAFA DE LABORATORIO
El trmino cromatografa se identifica, aunque no etimolgicamente con el procedimiento en el que
una disolucin de sustancia puede separarse por paso en una direccin determinada sobre un
sistema que contiene un slido orgnico o inorgnico insolubles, de mayor o menor grado de divisin,
obtenindose como resultado la retencin de los componentes de la mezcla a diferentes distancias
del punto de partida. El mecanismo bsico es la particin de los componentes mviles entre dos
fases lquidas y la formacin de uniones lbiles sobre la superficie del adsorbente. Si en ltima
instancia se producen retenciones debidas &lo a fuerzas fsicas superficiales, el proceso se denomina
adsorcin cromatografa. Prcticamente existe una combinacin de los dos fenmenos y se
clasifican segn el predominio del uno sobre el otro. Existe un tercer tipo llamado de intercambio
inico que solo citaremos brevemente. Un cuadro resumen de los tipos de procesos que estn
implicados en la cromatografa en general se resume a continuacin situando debidamente la
cromatografa de capa fina (T. L. C.) adecuadamente.

FASES DEL PROCESO CROMATOGRFICO

1. Preparacin de la fase estacionaria

2. Introduccin de la muestra vehiculada por una fase mvil
3. Paso a travs de una fase estacionaria donde se producen las interacciones que ms tarde
llevarn a su separacin
4. Elucin (segn en qu tcnica)
5. Lectura de los resultados para obtener el cromatograma.

MECANISMOS IMPLICADOS:

1.
2.
3.
4.
5.

Adsorcin
Reparto
Intercambio inico
Exclusin molecular
Afinidad

APLICACIONES
CROMATOGRAFIA

DE

LA

A. Tecnologa de alimentos y
Productos
Naturales.- Puede realizarse la caracterizacin de Aceites Esenciales y Aromas, los cuales son
empleados en la elaboracin de saborizantes, aromatizantes, licores, perfumes, artculos de aseo,
y como materias primas para productos farmacuticos.

B. Control Ambiental.- Dentro de los contaminantes posibles de ser estudiados estn: los
hidrocarburos aromticos, BTEX, pesticidas rgano-clorados y rgano-fosforados en muestras de
aguas superficiales, subterrneas, suelos y lodos.
C. Qumica Forense.- Es posible la aplicacin de la cromatografa de gases y la espectrometra de
masas en la deteccin y cuantificacin de analitos de inters en la qumica forense. Por ejemplo
la determinacin, cuantificacin de alcohol en sangre, anlisis de licores, entre otros.
CAMPOS DE APLICACIN DE LA CROMATOGRAFIA
Asesoramiento en el desarrollo de
mtodos
cromatogrfico.
Sntesis de nuevos solventes para la
extraccin selectiva de
contaminantes orgnicos
Implementacin
de
mtodos
analticos para determinar
compuestos orgnicos de inters
ambiental en distintas
muestras de aguas, sedimentos y lodos
Determinacin de compuestos de
inters farmacolgico en
tejidos de origen animal
Imparticin de cursos Servicios analticos,
para la investigacin y al
desarrollo, en el mbito del anlisis radioqumico ambiental (URAIS:
Unidad
Radioqumica
Ambiental
y
Sanitaria)
Anlisis de parmetros radioactivos segn
la Normativa 98/83/EC,
relativa a los requisitos sanitarios de la calidad de las aguas para el consumo humano
Anlisis de diferentes istopos radioactivos en productos alimenticios de acuerdo con la
normativa en vigor.
LA CROMATOGRAFIA COMO ANALISIS CUANTITATIVO EN EL LABORATORIO
Un anlisis cromatogrfico puede dar una amplia informacin cualitativa si se escoge el sistema de
deteccin adecuado para determinar y evaluar los analitos separados, as si se utiliza un detector
que permita obtener un espectro de cada compuesto separado y a su vez contenga una base de
datos que pueda realizar su comparacin con una biblioteca de espectros se podra, de una forma
muy precisa, establecer la identidad de los componentes de una muestra, de hecho esto se logra
fcilmente con cromatografas que contienen sistema de deteccin como el Infrarrojo (IR), el de
Resonancia Magntica Nuclear (RMN) o el espectrmetro de Masas (MS). Sin embargo, estos sistemas
son muy costosos, es por ello que la mayora de los laboratorios cuentan con cromatografas con
sistemas de deteccin sencillos como el detector de ionizacin a la llama (siglas en ingls, FID) o el
detector de conductividad trmica (siglas en ingls (TCD) en el caso de cromatografa de gases o
detectores de absorbancia o ndice de refraccin para los casos de cromatografa de lquidos. La
nica informacin cualitativa que pueden ofrecer estos sistemas es el tiempo de retencin del
analitos, el cual, solo puede ser usada controlando bien las condiciones cromatogrficas como: flujo,
temperatura, tipo de fase estacionaria en el caso de gases o composicin qumica de la fase mvil
adems de las otras variables mencionadas anteriormente para el caso de cromatografa de liquida,
adems de que se debe tener conocimiento de los posibles compuestos de la muestra y una amplia
variedad de patrones para realizar comparaciones. Sin embargo, se puede dar el caso que dos
compuestos tengan el mismo tiempo de retencin, lo que imposibilita su identificacin. Por supuesto
que, a partir de cromatograma obtenidos con diferentes fases mviles (para cromatografa liquida) y
estacionarias y a diversas temperaturas de elusin (para cromatografa gaseosa), se puede obtener
datos adicionales.

CONCLUSIONES.
Se observo en esta prctica que por medio de la cromatografa es posible identificar de
que sustancias est compuesta una mezcla.
Como la polaridad de los solventes utilizados para la cromatografa determinan el
resultado mostrndonos sus diferentes compuestos.
Se puede observar como las diferentes caractersticas de la mezcla pueden tener
diferentes manchas como resultado.
Como ciertos factores se puede restar en distintas prcticas.

BIBLIOGRAFIAS.

Valcarcel, M. 1988. Tcnicas analticas de separacin. Editorial Revert.

Lawrence, A., Kaplan, y Pesce, J. 1986. Quimica clinica: Tcnicas de laboratorio, fisiopatologa,
mtodos de anlisis. Teora, anlisis y correlacin. Editorial Mdica Panamericana.1739

Murray p. Deutscher. 1990. Lehninger Principles of Biochemistry,(2000). Edicin en

castellano. Principios de Bioqumica. (2002).

C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Arhen. Prentice Hall, Pearson. Bioqumica. (3 Ed.).
Educacion, Madrid. (2002).

Ruben Dario Cortez. Tcnicas de separacin, cromatografa. Seccin de La Red

Latinoamericana de Qumica. Barquisimeto Lara.

Linda Amrica Serrano Falcon. Apuntes qumica cromatografa [En lnea] Sitio de estudiantes
y docentes universitarios Copyright 1999-2001
<http://www.lafacu.com/apuntes/quimica/cromatografia/default/.htm.>