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ESPECTROFOTOMETRIA
La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones
biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin
absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de
soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
TCNICAS UV-VIS.
Espectrometra ultravioleta-visible
La espectrometra ultravioleta-visible o espectrofotometra UV-Vis implica la
espectroscopia de fotones en la regin de radiacin ultravioleta-visible. Utiliza la luz en
los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo (IR) cercano.
En esta regin del espectro electromagntico, las molculas se someten a transiciones
electrnicas.
Esta tcnica es complementaria de la espectrometra de fluorescencia, que trata con
transiciones desde el estado excitado al estado basal, mientras que la espectrometra
de absorcin mide transiciones desde el estado basal al estado excitado.
APLICACIONES
La espectrometra UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinacin cuantitativa de
soluciones de iones metlicos de transicin y compuestos orgnicos muy conjugados.
Soluciones de iones metlicos de transicin
Las soluciones de iones metlicos de transicin pueden ser coloreadas (es decir,
absorben la luz visible) debido a que los electrones en los tomos de metal se pueden
excitar desde un estado electrnico a otro. El color de las soluciones de iones metlicos
se ve muy afectado por la presencia de otras especies, como algunos aniones o
ligandos. Por ejemplo, el color de una solucin diluida de sulfato de cobre es muy azul;
agregando amonaco se intensifica el color y cambia la longitud de onda de absorcin
mxima.
Compuestos orgnicos
Los compuestos orgnicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugacin,
tambin absorben luz en las regiones del espectro electromagntico visible o
ultravioleta. Los disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para los
compuestos solubles en agua, o el etanol para compuestos orgnicos solubles. Los
disolventes orgnicos pueden tener una significativa absorcin de UV, por lo que no
todos los disolventes son adecuados para su uso en espectrometra UV. El etanol
absorbe muy dbilmente en la mayora de longitudes de onda. La polaridad y el pH del
disolvente pueden afectar la absorcin del espectro de un compuesto orgnico. La
tirosina, por ejemplo, aumenta su mximo de absorcin y su coeficiente de extincin
molar cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando disminuye la polaridad de los
disolventes.
Aunque los complejos de transferencia de carga tambin dan lugar a colores, stos son
a menudo demasiado intensos para ser usados en mediciones cuantitativas.
La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solucin es directamente
proporcional a la concentracin de la solucin. Por tanto, la espectrometra UV/VIS
puede usarse para determinar la concentracin de una solucin. Es necesario saber
con qu rapidez cambia la absorbancia con la concentracin. Esto puede ser obtenido
a partir de referencias (las tablas de coeficientes de extincin molar) o, con ms
exactitud, determinndolo a partir de una curva de calibracin.
El espectrofotmetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografa
Lquida de Alta Resolucin (CLAR). La presencia de un analito da una respuesta que
puede ser proporcional a la concentracin. Para resultados precisos, la respuesta del
instrumento al analito debe compararse con la respuesta a un estndar, lo que es muy
similar al uso de curvas de calibracin. La respuesta (por ejemplo, el pico de altura)
para un concentracin particular se conoce como factor de respuesta.
LEY DE BEER-LAMBERT
La espectrometra UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para
determinar las concentraciones de especies absorbentes en solucin, usando la Ley de
Beer-Lambert:
donde A es la absorbancia medida, I0 es la intensidad de la luz incidente a una
determinada longitud de onda, I es la intensidad de transmisin, L la longitud de ruta a
travs de la muestra, y c la concentracin de las especies absorbentes. Para cada
especie y longitud de onda, es una constante conocida como absortividad molar o
coeficiente de extincin. Esta constante es una propiedad fundamental molecular en un
solvente dado, a una temperatura y presin particular, y tiene como unidades 1/M *
cm o, a menudo, U/M * cm.
La absorbancia y extincin a veces son definidas en trminos de logaritmo natural en
lugar de logaritmo de base 10.
La ley de Beer-Lambert es til para la caracterizacin de muchos compuestos, pero no
sirve como relacin universal para la concentracin y absorcin de todas las
sustancias. En molculas complejas de gran tamao, como los tintes orgnicos
(Xylenol Naranja o Rojo Neutro, por ejemplo), a veces se encuentra una relacin
polinmica de segundo orden entre la absorcin y la concentracin.