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2 DETECCIN Y CARACTERIZACIN
Los mtodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos
pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, segn persigan
demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes
(antgeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos especficos
por parte del husped en el curso de la infeccin.
Gran parte de las tcnicas utilizadas en el diagnstico clnico se basan
en pruebas serolgicas que identifican anticuerpos especficos frente a
diversas protenas antignicas. Sin embargo, existen circunstancias en
las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la
infeccin viral (tratamientos especficos, medidas profilcticas, etc.)
En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de
antgenos virales previamente al desarrollo de la seroconversin, siendo
esta prueba la nica evidencia de la exposicin al virus cuando no existe
aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes
inmunodeprimidos).
PRINCIPALES TCNICAS
METODOS DIRECTOS
Son aquellos que detectan:
1) El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).
2).La presencia de cidos nucleicos virales (PCR, etc.).
3)El virus como partcula viral (microscopa electrnica).
1) Aislamiento Viral - Cultivos Celulares
La base del diagnstico viral es la deteccin del virus o de sus
componentes. El aislamiento del virus era la tcnica standard de oro
sobre la cual se medan todas las otras pruebas de diagnstico viral,
pero hoy en da con el desarrollo de las nuevas tcnicas de Biologa
Molecular ya no es la ms sensible. De igual forma el aislamiento de
virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy alta. Debido a que
slo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la
especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en el
aislamiento del virus: El proceso suele ser lento, ya que demanda das a
semanas para la identificacin, y en consecuencia puede no estar
disponible a tiempo para influir en la atencin del paciente. Adems, es
un proceso laborioso y caro. Por otra parte requiere el uso de sistemas
de cultivos adecuados, por ejemplo, se necesitan varias lneas celulares
para la deteccin ptima de virus.
Los cultivos celulares son, pues, los biosubstratos ms corrientemente
empleados para la propagacin de los virus.
Un cultivo celular es obtenido, de ex plantes de rganos o de embriones
de animales.
Estas clulas obtenidas aspticamente se disocian tratndolas con una
enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspensin de
clulas libres as obtenidas se coloca en la superficie plana de un
recipiente de vidrio o plstico en donde las clulas se adhieren y
multiplican formando una fina capa de clulas que se llama MONOCAPA
CELULAR.
Esta monocapa de clulas crece en un medio de cultivo complejo que
contiene albmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer.
Se previene la contaminacin bacteriana adicionndole a los medios
antibiticos adecuados.
2).
Tcnicas
de Biologa
Molecular
METODOS INDIRECTOS
Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por
parte del husped: Deteccin de anticuerpos especficos antivirales por
tcnicas inmunolgicas (EIA, IFI, WB, etc.). Produccin de anticuerpos in
vitro.
En el curso de una infeccin varan las poblaciones de anticuerpos frente
al agente infectante. En una primera fase la clase predominante suele
ser IgM, mientras que con el transcurso del tiempo las IgM disminuyen
hasta desaparecer o quedar a baja concentracin residual y, en cambio,
aumentan las IgG. La bsqueda de anticuerpos clase IgM es de utilidad
para hacer diagnstico de infeccin reciente en una sola muestra de
suero extrada en el perodo agudo de la enfermedad. Este mtodo se
emplea para el diagnstico de enfermedades como: Rubola,
Citomegalovirus, Hepatitis a virus A, etc.
La bsqueda de anticuerpos clase IgG en una sola muestra se utiliza
como tcnica de tamizaje, por ejemplo, para el diagnstico de la
infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Posteriormente los hallazgos positivos son confirmados en la misma
muestra de suero por otra metodologa.
La seroconversin es el aumento del ttulo de anticuerpos cuatro veces o
ms observado en dos muestras pareadas de suero. La primera muestra
se obtendr en el perodo agudo de la enfermedad y la segunda, 15 a 21
das despus de la primera, en el perodo de convalecencia.
INDIRECTA
(IFI)
INDIRECTO
(EIA)
Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia en los ltimos aos al
diagnstico de anticuerpos virales.
Tiene las ventajas de ser un mtodo verstil, relativamente econmico,
sensible y de lectura objetiva (instrumental).
La metodologa es la siguiente: Los antgenos virales se inmovilizan
sobre una fase slida (esferita, policubetas para microtitulacin u otros
elementos de plstico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban,
se lavan y se revela la reaccin Ag-Ac por el agregado de una
inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el
substrato apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un
espectrofotmetro y en algunos casos de forma visual.
TEST DE AGLUTINACION
DE
ANTICUERPOS IN
VITRO