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5.4.

2 DETECCIN Y CARACTERIZACIN
Los mtodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos
pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, segn persigan
demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes
(antgeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos especficos
por parte del husped en el curso de la infeccin.
Gran parte de las tcnicas utilizadas en el diagnstico clnico se basan
en pruebas serolgicas que identifican anticuerpos especficos frente a
diversas protenas antignicas. Sin embargo, existen circunstancias en
las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la
infeccin viral (tratamientos especficos, medidas profilcticas, etc.)
En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de
antgenos virales previamente al desarrollo de la seroconversin, siendo
esta prueba la nica evidencia de la exposicin al virus cuando no existe
aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes
inmunodeprimidos).

Igualmente la deteccin del genoma viral puede favorecer la precocidad


del diagnstico viral y su confirmacin. En la ltima dcada se han
desarrollado una serie de tcnicas para el diagnstico viral basadas en la
deteccin de cidos nucleicos. De ellas la Reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) es la ms utilizada.

En el momento actual, la tendencia en el diagnstico virolgico consiste


en emplear nuevas y ms sensibles tecnologas de deteccin de
antgenos y de investigacin de cidos nucleicos con el propsito de
lograr un diagnstico viral ms rpido. El desarrollo de quimioterapia
antiviral efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la
identificacin rpida, sensible y especfica de los virus, una necesidad.

PRINCIPALES TCNICAS
METODOS DIRECTOS
Son aquellos que detectan:
1) El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).
2).La presencia de cidos nucleicos virales (PCR, etc.).
3)El virus como partcula viral (microscopa electrnica).
1) Aislamiento Viral - Cultivos Celulares
La base del diagnstico viral es la deteccin del virus o de sus
componentes. El aislamiento del virus era la tcnica standard de oro
sobre la cual se medan todas las otras pruebas de diagnstico viral,
pero hoy en da con el desarrollo de las nuevas tcnicas de Biologa
Molecular ya no es la ms sensible. De igual forma el aislamiento de
virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy alta. Debido a que
slo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la
especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en el
aislamiento del virus: El proceso suele ser lento, ya que demanda das a
semanas para la identificacin, y en consecuencia puede no estar
disponible a tiempo para influir en la atencin del paciente. Adems, es
un proceso laborioso y caro. Por otra parte requiere el uso de sistemas
de cultivos adecuados, por ejemplo, se necesitan varias lneas celulares
para la deteccin ptima de virus.
Los cultivos celulares son, pues, los biosubstratos ms corrientemente
empleados para la propagacin de los virus.
Un cultivo celular es obtenido, de ex plantes de rganos o de embriones
de animales.
Estas clulas obtenidas aspticamente se disocian tratndolas con una
enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspensin de
clulas libres as obtenidas se coloca en la superficie plana de un
recipiente de vidrio o plstico en donde las clulas se adhieren y
multiplican formando una fina capa de clulas que se llama MONOCAPA
CELULAR.
Esta monocapa de clulas crece en un medio de cultivo complejo que
contiene albmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer.
Se previene la contaminacin bacteriana adicionndole a los medios
antibiticos adecuados.

Los cultivos celulares en monocapa son los ms usados, aunque hay


otros sistemas (cultivos en suspensin, explantos, cultivos de rganos,
cultivos en microcarriers, etc.).
Los cultivos celulares se dividen en:
Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de clulas, tejidos u rganos
tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos
veces.
Lneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes
sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo
menos en un 75% el cariotipo correspondiente a la especie de que
provienen.
Lneas Celulares Continuas: Permite un nmero finito de subcultivos y
son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una
lnea continua, esta debe de haber sido subcultivada por lo menos 70
veces. Las lneas celulares continuas ofrecen las siguientes ventajas:

Disponibilidad para todos los investigadores de stocks de


clulas idnticas, ya sea congelada en ampollas o en
monocapa de botella de cultivos, con la posibilidad de
reconstituirlas cuando sea necesario.

Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los


laboratorios.

Libre de contaminacin con agentes extraos.


Los distintos cultivos celulares varan en cuanto a su susceptibilidad a
los diferentes virus, ya que existe una relacin especfica husped-virus,
y es en funcin de los datos clnicos y del tipo de muestra que se elige el
cultivo para inocular el material.
Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37 C por un
perodo de hasta 14 das promedio, esperando la aparicin de efecto
citoptico, toxicidad o degeneracin celular, observando el cultivo al
microscopio a las 24, 48, 72hs y luego 2 veces por semana. Se usan
cultivos celulares no inoculados para control y comparacin con
cualquier cambio morfolgico observado en los cultivos inoculados. El
efecto citoptico es la visualizacin de cambios morfolgicos ms o

menos caractersticos en las clulas inoculadas producidas por la accin


del virus sobre el cultivo celular.
Cuando los virus no producen efecto citoptico, se puede recurrir a
tcnicas que ponen en evidencia la presencia de aquel en el cultivo. Las
ms usadas son: hemadsorcin, hemaglutinacin y tinciones con
anticuerpos monoclonales. (Ver 2)
Hemadsorcin: Hay virus que durante su multiplicacin intracelular,
expresan en la membrana de la clula husped elementos estructurales
virales llamados hemaglutininas, glicoprotenas capaces de unirse a
receptores especficos en la membrana de glbulos rojos de diferentes
especies animales. De modo que si se agregan glbulos rojos a un
cultivo inoculado, se puede poner en evidencia la infeccin de esas
clulas a travs de la unin de los glbulos rojos a la superficie celular.
Hemaglutinacin: Las hemaglutininas pueden ponerse en evidencia en el
sobrenadante de los cultivos utilizando el mismo fundamento que para
la hemadsorcin.

2).

Tcnicas

de Biologa

Molecular

Investigacin de cidos nucleicos virales


Las tcnicas de estudio y diagnstico que a continuacin se presentan,
constituyen una herramienta ingeniosa desarrollada a partir de los
estudios de la Biologa Molecular.
SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS
Actualmente es posible extraer secuencias especficas de un fragmento
de ADN por medio de las endonucleasas de restriccin. Luego estas
secuencias extradas, se pueden desnaturalizar y marcar ya sea con una
enzima o con un istopo radioactivo. A estas cadenas marcadas y que
tienen una secuencia conocida se llaman sondas de cidos nucleicos.
Hoy en da se estn produciendo sondas de cidos nucleicos sintticas,
con lo que se obtiene sondas de oligonucletidos de muy alta
especificidad que estn disponibles comercialmente y son las ms
usadas en los laboratorios.

DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES POR SONDA


SINTETICA
Es un ensayo de hibridacin molecular con una sonda marcada. Las
hibridaciones pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA.
Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y
desnaturalizan los cidos nucleicos. Posteriormente se aade un DNA
marcado, complementario del DNA del virus y se incuba en condiciones
para que se produzca la hibridacin. La muestra se pasa entonces por
una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al DNA
viral hibridado de la no hibridada.
Dependiendo de cmo este marcada la sonda, se detecta la hibridacin:
Si est marcada con un istopo radiactivo se puede hacer una lectura en
un contador gamma de manera que la cantidad de radiacin medida en
la columna es directamente proporcional a la cantidad de DNA viral
presente en el suero problema o tambin se puede realizar la
electroforesis del DNA hibridado con la sonda marcada en gel de
poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la sonda
mediante la aplicacin de una placa de rayos X (Autoradiografa). Si est
marcada con una enzima se detecta por una simple evaluacin
colorimtrica.
AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES MEDIANTE UNA
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Una nueva tcnica, llamada Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR),
fue desarrollada por Saiki et al., para incrementar el nmero de
molculas de DNA blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan
alta que puede amplificar una nica molcula de DNA y una sola copia
de genes puede ser extrada, de mezclas complejas de secuencias
genmicas y visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa.
La PCR es, por tanto, una amplificacin de secuencias especficas del
DNA. Se basa en la utilizacin de secuencias cortas de nucletidos
sintticos llamados primers o cebadores, que se hibridan de forma
especfica con cada una de las cadenas de DNA , previamente

desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reaccin


tenga lugar se usa una enzima, Taq pol (ADN Polimerasa termoestable
obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucletidos
trifosfatos. La funcin natural de la DNA polimerasa consiste en reparar
y replicar el DNA. Los deoxinucletidos trifosfatos se necesitan como
ladrillos para la construccin. El nucletido al cual se una la polimerasa
ser complementario de la base en la posicin correspondiente de la
cadena templada. Se sintetiza as una cadena simple de DNA,
complementaria y alineada a cada "primer.
Se realiza una serie repetida de ciclos cada uno compuesto por 3 pasos
bsicos:
a. Desnaturalizacin del ADN doble cadena por la elevada temperatura
(95C).
b. Acoplamiento de los primeros, desciende la temperatura (entre 55C72C).
c. Elongacin de los primeros, aqu se eleva la temperatura a 72C
permitiendo la incorporacin de los deoxinucletidos.
Mientras tanto se van deplecionando los primeros y los deoxinucletidos,
y se van sintetizando nuevas cadenas de DNA. Al final se consiguen
miles de copias de DNA del fragmento de DNA limitado por los
"primeros. Los fragmentos de DNA as obtenidos se pueden identificar
por varias tcnicas: visualizacin en geles de agarosa o poliacrilamida
mediante tincin con bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta, o
hibridacin con una sonda marcada. La combinacin de la PCR y las
sondas de cidos nucleicos marcadas promete ser el mtodo ms
sensible para la deteccin e identificacin de los virus.
3). Microscopa Electrnica
Mediante el microscopio electrnico es posible observar la morfologa de
los viriones presentes en muestras clnicas. La limitacin del mtodo
adems del costo del microscopio, es que necesita de una alta
concentracin de viriones (aproximadamente 109 partculas virales/ml,
dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco
sensible. Esto hace que sea una tcnica poco utilizada, ms an con el
desarrollo de tcnicas alternativas de utilidad similar.
Si la concentracin de virus en la muestra clnica es baja, y por tanto no
visible directamente por microscopio electrnico, se pueden utilizar
tcnicas
que
aumenten
la
visualizacin,
por
ejemplo,
la
inmunoelectromicroscopa, que consiste en el agregado de anticuerpos

especficos antivirales y la formacin de agregados de partculas que son


ms fcilmente visibles que las partculas solas.

METODOS INDIRECTOS
Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por
parte del husped: Deteccin de anticuerpos especficos antivirales por
tcnicas inmunolgicas (EIA, IFI, WB, etc.). Produccin de anticuerpos in
vitro.
En el curso de una infeccin varan las poblaciones de anticuerpos frente
al agente infectante. En una primera fase la clase predominante suele
ser IgM, mientras que con el transcurso del tiempo las IgM disminuyen
hasta desaparecer o quedar a baja concentracin residual y, en cambio,
aumentan las IgG. La bsqueda de anticuerpos clase IgM es de utilidad
para hacer diagnstico de infeccin reciente en una sola muestra de
suero extrada en el perodo agudo de la enfermedad. Este mtodo se
emplea para el diagnstico de enfermedades como: Rubola,
Citomegalovirus, Hepatitis a virus A, etc.
La bsqueda de anticuerpos clase IgG en una sola muestra se utiliza
como tcnica de tamizaje, por ejemplo, para el diagnstico de la
infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Posteriormente los hallazgos positivos son confirmados en la misma
muestra de suero por otra metodologa.
La seroconversin es el aumento del ttulo de anticuerpos cuatro veces o
ms observado en dos muestras pareadas de suero. La primera muestra
se obtendr en el perodo agudo de la enfermedad y la segunda, 15 a 21
das despus de la primera, en el perodo de convalecencia.

La seroconversin es til para establecer el diagnstico retrospectivo,


pero no para el diagnstico temprano de una infeccin, puesto que
debemos esperar al perodo de convalecencia para obtener la segunda
muestra del suero.
Este tipo de diagnstico es til para estudios epidemiolgicos.
Las diferencias de ttulos deben ser mayores de cuatro veces para tener
valor
estadstico
y
se
debera
estudiar
ambas
muestras
simultneamente.
Las determinaciones serolgicas tambin nos pueden informar sobre el
estado inmune del paciente frente a muchas infecciones virales, como
paperas, sarampin y rubola, donde la presencia de anticuerpos
especficos indica que el individuo ha estado expuesto previamente al
virus y que es inmune para una nueva infeccin.
A veces el diagnstico serolgico tiene dificultades, por ejemplo: cuando
se realiza en recin nacidos para identificar la causa de una infeccin
congnita. La evaluacin de los resultados en este caso es difcil porque
los ensayos serolgicos detectan ante todo IgG, y mucha de la IgG
presente en el suero del nio provino de la madre por va
transplacentaria y no es posible diferenciar la IgG del nio de la IgG de
la madre.
Tradicionalmente, el diagnstico de las enfermedades virales congnitas
se realiza mediante determinaciones seriadas de IgG en el suero. El
descenso del titulo de anticuerpos indica que los anticuerpos eran
maternos y que el nio no est infectado. El aumento en el ttulo de
anticuerpos indica que el nio est produciendo anticuerpos y por lo
tanto est infectado. Sin embargo, hoy en da el diagnstico serolgico
viral se ha simplificado con las nuevas tcnicas que detectan IgM, ya
que la deteccin de IgM especfica en el suero del nio confirma que el
nio est infectado, porque la IgM no atraviesa la placenta y por tanto
no puede ser de origen materno.
A continuacin, se describirn los mtodos serolgicos ms comnmente
usados en el diagnstico viral.
Los mtodos tradicionales para el diagnstico serolgico de las
infecciones virales incluyen: la neutralizacin, la inhibicin de la
hemaglutinacin (IHA) y la hemaglutinacin indirecta (HAI). La
confirmacin serolgica de una infeccin aguda por cualquiera de estas
tcnicas tradicionales est dada por un aumento de cuatro veces o
mayor en el titulo de anticuerpos cuando se emplean diluciones al doble
seriadas.

En los ltimos aos se han desarrollado nuevos mtodos para la


deteccin de anticuerpos virales, y en muchos casos han demostrado
ser mejores que las pruebas tradicionales en trminos de economa,
sensibilidad, especificidad y rapidez.
INMUNOFLUORESCENCIA

INDIRECTA

(IFI)

La IFI, es un mtodo rpido y confiable para la determinacin de


anticuerpos antivirales en el suero del paciente. Se basa en la unin de
anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los
antgenos virales expresados en la superficie y citoplasma de clulas
infectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control
de especificidad se usan clulas no infectadas.
El procedimiento es el que sigue: Se incuba el suero del paciente con las
clulas infectadas y no infectadas. Luego se realiza un lavado con PBS y
se agrega posteriormente anticuerpo anti IgG humana conjugada con
isotiocianato de fluorescena. El isotiocianato de fluorescena es una
sustancia que se vuelve fluorescente a la exposicin de la luz
ultravioleta y emite una luz verde caracterstica. El conjugado se unir a
los anticuerpos del paciente si la reaccin es positiva, leyndose la
prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia de Ac se
evidencia por la aparicin de fluorescencia en el citoplasma y superficie
de las clulas infectadas, mientras que las clulas control no fluorescen.
ENZIMOINMUNOANALISIS

INDIRECTO

(EIA)

Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia en los ltimos aos al
diagnstico de anticuerpos virales.
Tiene las ventajas de ser un mtodo verstil, relativamente econmico,
sensible y de lectura objetiva (instrumental).
La metodologa es la siguiente: Los antgenos virales se inmovilizan
sobre una fase slida (esferita, policubetas para microtitulacin u otros
elementos de plstico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban,
se lavan y se revela la reaccin Ag-Ac por el agregado de una
inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el
substrato apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un
espectrofotmetro y en algunos casos de forma visual.
TEST DE AGLUTINACION

El fundamento y el procedimiento de esta tcnica ya fueron descriptas


para el estudio de Ag viral (mtodo directo).
Ahora lo que buscamos es detectar anticuerpos antivirales, por eso se
usan partculas de ltex recubiertas con Ag viral. Fig. 8.
WESTERN BLOT (WB)
Las tcnicas inmunolgicas de Inmunoblot estn encontrando amplias
aplicaciones en el diagnstico virolgico. Son particularmente tiles para
el diagnstico del HIV.
La tcnica de WB se basa en la separacin electrofortica de protenas
virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa
con el objeto de determinar la presencia de anticuerpos especficos
contra cada una de esas protenas.
Esta tcnica se realiza esquemticamente en 3 pasos:
1. Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de virus que
luego son tratados qumicamente para su disgregacin e inactivacin.
Los antgenos resultantes del lisado viral se separan por electroforesis
en gel de Poliacrilamida.
2. Se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag
separados a membranas de nitrocelulosa.
3. Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de nitrocelulosa.
Posteriormente se aaden anticuerpos anti-inmunoglobulina humana
unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y, por ltimo, se
agrega el substrato enzimtico para la visualizacin de las bandas
reactivas con un producto final coloreado.
La tcnica es muy similar a un EIA, menos sensible pero ms especfica
que esta.
En la prctica slo el 3er paso es el que se realiza en los laboratorios de
diagnstico, ya que los equipos comerciales proveen de las tirillas con
los antgenos. (Esto facilita la estandarizacin de las determinaciones).
PRODUCCION

DE

ANTICUERPOS IN

VITRO

Se trata de una tcnica nueva que ha sido aplicada para el diagnstico


de la infeccin perinatal. Este procedimiento revela la presencia de
anticuerpos antivirales producidos in vitro a partir de los linfocitos B

extrados de sangre total, lo que indicara que el sistema inmune del


paciente ha sido estimulado por el virus.
La produccin de Ac antivirales in vitro promete ser de gran valor en el
diagnstico temprano de nios infectados por VIH.